CN107823201A - 一种金刚烷胺‑栀子酰胺a杂合体化合物在治疗帕金森疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金刚烷胺‑栀子酰胺A杂合体化合物在治疗帕金森疾病治疗药物中的应用，该化合物的结构如式I所示。本发明所述化合物在帕金森细胞模型中能提高DA水平，其可通过抑制NR1的蛋白表达，抑制NMDA受体的合成，进而抑制胞外Ca²⁺内流，使i‑NOS的活性和蛋白水平降低，NO水平显著降低，细胞坏死减少，同时可以抗神经细胞凋亡，发挥神经保护作用。在小鼠帕金森模型上该化合物可改善小鼠的运动障碍。本发明所述化合物可作为DA调控剂、iNOS调控剂和NMDA受体拮抗剂；并可应用于治疗帕金森病尤其是行为障碍以及由神经元凋亡所导致疾病的药物。

Description

一种金刚烷胺-栀子酰胺A杂合体化合物在治疗帕金森疾病药 物中的应用

技术领域

本发明属于药物领域，具体涉及金刚烷胺-栀子酰胺A杂合体化合物在治疗帕金森疾病治疗药物中的应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)也被称为震颤性麻痹，是一种严重危害患者生活质量和生命健康的神经退行性疾病，在临床上常见且难以治愈。PD的发病率很高，在普通人群中，可达0.3％。疾病的主要病理变化为黑质纹状体通路多巴胺能神经元的损伤和神经元胞体出现的路易小体。主要临床特征表现为肢体震颤麻痹、僵直、运动迟缓、运动自主性差等，严重影响患者的生活质量。因此，帕金森病的药物治疗一直是药物研发者关注的重要领域。

PD的发病机制复杂，至今仍未被完全阐明。在多种机制中，兴奋性毒性假说是备受关注的一种。该假说阐述了当帕金森产生时，DA水平下降，导致平衡被打破，细胞内Ca ²⁺水平持续升高，引起一氧化氮(NO)的大量产生、导致线粒体功能受损等一系列细胞毒性事件的发生，最终造成神经元细胞的死亡。而介导该兴奋性毒性的主要受体为N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-Aspartate receptor，NMDAr)，该受体与Ca ²⁺内流，诱导一氧化氮合成酶iNOS产生NO有关。大量实验显示，抑制谷氨酸兴奋性毒性的药物可拮抗PD。因此，探索可阻止谷氨酸兴奋性毒性的药物，以保护多巴胺能神经元是治疗PD的一种重要途径，值得关注。

现有的治疗PD的药物主要有左旋多巴、司来吉兰、金刚烷胺等，这些药物具有改善PD临床症状的功效。但这些药物都存在不同程度的副反应，部分已经渐渐退出了临床应用。所以，开发安全有效的治疗PD药物是值得关注和急需解决的课题。帕金森发病机制十分复杂，仅靠单一靶标的药物治疗难以治愈，且伴随有副作用，因此多靶标导向药物治疗逐渐成为治疗上的新趋势。

因此，以提高多巴胺(Dopamine，DA)的含量、拮抗介导兴奋性毒性的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate，NMDA)活性和降低细胞凋亡为目标的多靶标化合物具有潜在的治疗前景。

发明内容

本发明的目的在于一种金刚烷胺-栀子酰胺A杂合体化合物在治疗帕金森病药物中的应用。

在本发明的方案中，该金刚烷胺-栀子酰胺A杂合体化合物化合物命名为F1，其结构式如下：

本发明通过以下实验证明上述化合物F1对帕金森病的神经保护作用：

考察待试药物F1和其前体化合物金刚烷胺(ATD)、栀子内酰胺A(GA)以及ATD与GA的联合用药(1:1摩尔配比)对细胞活力的影响。通过MTT法检测药物对正常SH-SY5Y细胞的影响。结果发现，在0.1-100μM范围内，F1及其前体药物均无显著毒性。在MPP⁺损伤的SH-SY5Y细胞模型中，通过CCK8法在0.1-100μM范围测得待试药物F1的EC₅₀值为6.24μM，说明F1有一定的神经保护作用且比前体和联合用药的药效要好。同时发现20μM的F1对损伤细胞的保护作用最为显著。

考察待试药物F1对MPP+损伤SH-SY5Y细胞模型中的神经保护作用。通过显微镜观察细胞形态发现给予F1后，相比于前体药物，细胞形态改善最为显著，细胞密度增大。通过检测帕金森中主要神经递质多巴胺(DA)及其代谢产物高香草酸(HVA)和3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)的水平。结果表明，F1能显著改善MPP⁺损伤导致的DA水平下降，同时通过(DOPAC+HVA)与DA的比值，即DA的翻转率，评价DA的代谢水平，显示F1能降低DA的翻转率，抑制DA的代谢，其效果优于前体药物及联合药物。

通过蛋白免疫印迹技术发现，F1能上调酪氨酸羟化酶(TH)表达水平，该酶为DA合成的限速酶。同时，F1能降低细胞中的Ca ²⁺浓度，还下调i-NOS的蛋白活性和表达水平，抑制NO的产生。相比于前体药物及联合药物，F1显著下调NMDA受体亚基NR1的蛋白表达。另外，通过流式细胞检测表明F1有显著的抗凋亡作用。

考察待试药物F1在MPTP诱导损伤的C57BL/6小鼠帕金森模型的神经保护作用。通过小鼠爬杆实验、转棒实验、Catwalk步态实验，结果表明，F1能显著改善MPTP诱导的帕金森模型小鼠的行为障碍，对其行走时间步频等均有显著改善作用，效果与阳性药司来吉兰相当。

本发明通过细胞以及动物实验证明上述的金刚烷胺-栀子酰胺A杂合体化合物可用于制备治疗神经系统疾病，尤其是帕金森病的药物，尤其可用于制备改善帕金森病行为障碍，保护神经元细胞的药物。

本发明相比于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明所述的金刚烷胺-栀子酰胺A杂合体化合物及其在制备治疗帕金森疾病药物中的应用为首次报道。相比于其它现有技术，本发明所述化合物具有比帕金森临床用药金刚烷胺更强且安全有效的神经保护作用，相比于阳性药司来吉兰，其药性相当但安全性更高；相比于联合药物ATD/GA，本发明所述杂合体化合物可以作用于多个相关性靶点而产生协同作用效果。

附图说明

图1为F1及其前体药物对SH-SY5Y细胞毒性结果。

图2为F1及其前体药物对MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞保护作用的EC₅₀值。

图3为不同浓度的F1对MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞的保护作用。

图4为20μMF1与它的前体药物作用于MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞中的形态结果。

图5为DOPAC、DA、HVA的高效液相电化学检测色谱图。

图6为DOPAC、DA、HVA含量以及DA反转率统计图。

图7为药物对MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞中TH蛋白表达水平的影响。

图8为药物对MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞中Ca ²⁺浓度的影响。

图9为药物对MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞中NR1蛋白表达水平的影响。

图10为药物对i-NOS活性的影响。

图11为药物对i-NOS蛋白表达的的影响。

图12为药物对NO水平的影响。

图13为Annexin V-FITC/PI双染法检测F1拮抗凋亡的作用。

图14为药物对MPTP诱导小鼠帕金森模型中爬杆行为的影响。

图15为药物对MPTP诱导小鼠帕金森模型中转棒行为的影响。

图16为药物对小鼠帕金森模型Catwalk步态分析的脚印直观图。

图17为药物对小鼠帕金森模型Catwalk步态分析的行走时间、步频以及速度变化率的影响。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

化合物F1对正常SH-SY5Y的细胞毒性。

实验材料：人神经母瘤细胞SH-SY5Y，购自上海中国科学院细胞库

实验步骤：将对数期的SH-SY5Y细胞进行消化、离心、以含10％胎牛血清FBS的完全培养基将细胞重悬后，接种5×10³/孔的SH-SY5Y细胞于96孔板中，每孔细胞悬液体积为100μL，设置空白组、对照组、ATD组、GA组、ATD+GA组和F1组，每组设0.1、1、10、100μM四个浓度，各8个复孔，于恒温培养箱内培养24h。加入不同浓度的药液预处理3h后，弃旧药液，PBS洗涤一次，向每孔中加入25μL浓度为5mg/mL的MTT，孵育3h后，吸去MTT溶液，每孔加入150μL新鲜DMSO，振摇10min，采用酶联免疫酶标仪检测各孔的吸光度值，检测波长为570nm，根据公式计算细胞的增殖抑制率。计算公式为：

细胞增殖抑制率(％)＝(A_对照组–A_样品)/(A_对照组–A_空白)×100，其中，A为570nm下的吸光度值。

实验结果见图1，结果显示，在0.1～100μM的范围内，F1及其前体药物均无显著毒性(P>0.05)。

实施例2

采用CCK8法检测F1对MPP⁺损伤的SH-SY5Y细胞活力的影响。

实验步骤：于96孔板中设置空白组、对照组、ATD组、GA组、ATD+GA组和F1组，每组设2.5、5、10、20、40、80和160μM七个浓度，加入2mM的造模药物MPP⁺处理24h。直接向每孔中加入10μL的CCK8溶液，最后置于酶标仪中测定，波长为450nm，计算抑制率。

根据实验结果，以样品浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制抑制曲线，依据曲线求出不同样品的半最大效应浓度EC₅₀。实验结果见图2，表明F1及其前体药物对MPP⁺损伤的SH-SY5Y细胞均有一定程度的神经保护作用，EC₅₀值从小到大的次序依次为F1组>ATD+GA组>GA组>ATD组。可见在MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞模型中，F1的神经保护作用比它的所有前体药物组都强。

同时从图3可以看出，F1对此帕金森病细胞模型有显著的神经细胞保护作用，且呈剂量依赖关系，以浓度为20μM时的作用最为显著(P<0.01)。

实施例3

考察F1对MPP⁺损伤的SH-SY5Y细胞形态的影响。

按实施例2步骤，取正常细胞以及加药细胞于相同的显微镜、同一镜头下观察并记录细胞的形态。

实验结果见图4。结果显示，正常的SH-SY5Y细胞体积较大，间隙较小，形态为饱满多突触形。当其受MPP⁺损伤后，细胞数目变少，形态呈现为长梭形。当预先给予20μM的F1保护细胞后，相对于模型组，其细胞形态和细胞密度显著改善；而ATD组的细胞形态无显著变化，GA和ATD+GA组均有一定程度的保护作用。结果显示F1的神经保护作用比它的前体药物及其联合药物更优。

实施例4

F1对MPP⁺损伤的SH-SY5Y细胞内多巴胺DA及其代谢产物水平的影响。

实验步骤：细胞处理及分组同实施例2。利用高效液相-电化学和蛋白印迹法的方法检测了细胞内多巴胺DA及其代谢产物水平的影响以及TH的蛋白表达，结果如图5及图6所示。如图6A所示，与正常组相比，MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞后，DOPAC水平显著下降(P<0.001)。与模型组相比，分别给予药物F1、ATD、GA、ATD+GA后，均可显著改善这一现象(P<0.001)；药物对细胞DA水平的影响如图6B所示，与Control组相比，MPP+损伤SH-SY5Y细胞后，细胞内DA水平显著下降(P<0.001)。相比于模型组，给药组的DA水平均显著上升(P<0.001)，其中F1组水平上升最多；图6C为DA主要代谢产物HVA的变化情况，与Control组相比，模型组的HVA含量显著下降(P<0.01)。与模型组相比，F1组的HVA水平均无显著变化(P>0.05)。翻转率(DOPAC+HVA)/DA的结果见图6D。结果显示，与正常组相比，MPP⁺组的DA翻转率显著上升(P<0.001)，与模型组相比，F1组的DA翻转率显著下降(P<0.001)，其水平均低于前体药物和联合药物组，说明F1逆转MPP⁺损伤的效果最好。

实施例5

F1对MPP⁺损伤的SH-SY5Y细胞内酪氨酸羟化酶(TH)蛋白表达水平的影响。

TH是脑内DA合成的限速酶，是脑内多巴胺能神经元的定位蛋白之一。因此，TH的蛋白表达水平在一定程度上可反映机体合成多巴胺的功能和多巴胺能神经元的数量。本实施例利用免疫蛋白印迹及免疫组化技术考察MPP⁺损伤以及用药后，SH-SY5Y细胞内酪氨酸羟化酶(TH)蛋白表达变化情况，结果如图7所示。实验结果显示，与Control组相比，MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞后，TH蛋白水平显著下调(P<0.001)。与MPP⁺组相比，F1能上调MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞模型中的TH表达水平，但它的所有前体药物以及联合药物均无此作用。

实施例6

F1对MPP⁺损伤的SH-SY5Y细胞内NR1、i-NOS蛋白表达水平，i-NOS活性，NO含量以及Ca²⁺浓度变化的影响。

本实施例利用激光共聚焦扫描仪检测细胞内Ca²⁺浓度，Fluo-3AM作荧光剂；利用一氧化氮合成酶(NOS)分型的试剂盒检测各组总NOS和i-NOS活性；利用免疫蛋白印迹及免疫组化技术考察MPP⁺损伤以及用药对SH-SY5Y细胞内NR1、i-NOS蛋白表达水平的影响。

实验结果如图8所示。MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞后，使细胞内Ca²⁺浓度显著上调(P<0.001)。与模型组相比，F1和它的前体药物都具有抑制MPP⁺造成的Ca²⁺超载现象。其中F1能更好地抑制MPP⁺造成的胞外Ca²⁺内流，降低Ca²⁺胞内浓度。

NR1是组成NMDAr的必需亚基，而NMDA受体则是帕金森病治疗的靶点之一。从图9可以看到，与正常组相比，MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞后，NR1的蛋白水平显著上调(P<0.001)；与模型组相比，ATD组NR1的蛋白表达水平无显著变化(P<0.05)；GA可使MPP+损伤SH-SY5Y细胞中的NR1水平显著下降；而当ATD和GA联合用药后，并未能使NR1的蛋白表达的水平下调水平继续降低，反而出现了显著比单独使用GA时表达量更高的现象(P<0.05)；F1使NR1的蛋白表达水平下降的效果与GA组相当(P<0.05)。

更进一步地，如图10、11、12所示，MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞后，细胞内i-NOS的蛋白表达及活性显著增高(P<0.001)，NO水平显著提高；而给药F1后，细胞内i-NOS蛋白及活性均显著减少，最终NO水平相对于前体及联合用药更显著降低。

实施例7

F1对MPP⁺损伤的SH-SY5Y细胞凋亡的拮抗作用。

本实施例以Annexin-V/PI双染法检测药物对MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞凋亡的影响，实验结果如图13所示。可以看到，正常组细胞的凋亡率为4％，MPP⁺损伤后，细胞凋亡率升高至32％。给予药物ATD后，细胞凋亡率为25.6％；给予GA后细胞凋亡率为22.2％；ATD+GA组的细胞凋亡率为14.4％；而F1组的细胞凋亡率为10.8％，可见F1可以显著降低MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞模型中的细胞凋亡率。

实施例8

F1对MPTP诱导的帕金森小鼠模型中对小鼠行为的影响。

实验材料：SPF级3-4周龄雄性C57BL/6小鼠，体重10-12g，来自广东省医学实验动物中心。

实验步骤：8周龄雄性C57BL/6小鼠，随机分为空白对照组、MPTP模型组、MPTP+ATD、MPTP+GA、MPTP+FL、MPTP+FM、MPTP+FH和MPTP+Sele组，每组10只。

动物给药：根据组别连续7天给予相应的ATD、GA、F1和司来吉兰(Sele)，空白对照组和MPTP组对应给予生理盐水。然后以腹腔注射方式连续分别注射ATD、GA和F1，剂量分别为ATD11mg(72.5μmol)/kg/d；GA剂量为16mg(72.5μmol)/kg/d；F1低剂量30mg(72.5μmol)/kg/d，F1中剂量60mg(145μmol)/kg/d，F1高剂量120mg(290μmol)/kg/d；Sele给药方式为灌胃，剂量30mg/kg/d。除空白对照组外，在预保护给药两天后，开始在给药同时给其他组的小鼠连续5天腹腔注射MPTP造模，剂量30mg/kg/d。

给药后三天开始爬杆、转棒、Catwalk步态分析的行为学测试，爬杆实验结果如图14所示，爬杆实验中，把小鼠放在杆顶，记录小鼠从杆顶爬到底部所需时间。与空白对照组相比，MPTP模型组小鼠爬至杆底部所用时间显著延长(P<0.001)，表明MPTP诱导的PD模型小鼠爬杆行为障碍。阳性药Sele对MPTP诱导的PD模型小鼠爬杆行为障碍有明显的恢复作用(P<0.001)。与MPTP模型组相比，F1给药组(MPTP+FL、MPTP+FM和MPTP+FH)爬杆时间均明显缩短(P<0.001)，且呈现浓度依赖性，F1高剂量组效果接近Sele的给药效果。

转棒实验结果如图15所示。空白对照组相比，MPTP模型组小鼠在棒时间显著缩短(P<0.05)，表明MPTP诱导的PD模型小鼠在rotarod中运动能力下降。阳性药Sele对MPTP诱导的PD模型小鼠行为障碍有显著恢复作用(P<0.05)。与MPTP模型组相比，F1给药组(MPTP+FL、MPTP+FM和MPTP+FH)在棒时间缩短且呈浓度依赖性。

猫步实验结果如图16。从Catwalk脚印直观图看，空白对照组小鼠的脚印轨迹有很明显的规律性，脚步整齐，步长相对稳定，而MPTP模型组小鼠脚印变得凌乱，脚步细密而不稳定，步长不一，表明MPTP诱导的PD模型小鼠步态不稳。阳性药Sele对MPTP诱导的PD模型小鼠步态有明显的恢复效果，表现为步态恢复的规律性。与MPTP模型组相比，F1给药组(MPTP+FL、MPTP+FM和MPTP+FH)步态有一定的恢复，特别是高剂量组步态的规律性更加明显。

走玻璃板实验结果如图17。与空白对照组相比，MPTP模型组小鼠走完玻璃板全长所用的行走时间显著延长，步频降低，速度变化率增大(P<0.001)。阳性药Sele对MPTP诱导的PD模型小鼠时间、步频、变化率均有明显的改善作用(P<0.001)。与MPTP模型组相比，F1给药组(MPTP+FL、MPTP+FM和MPTP+FH)行走时间等均改善且呈现浓度依赖性，其中高剂量改善最为明显，接近阳性对照药效果。

综上所述，化合物F1不仅在体外细胞帕金森模型上表现出显著的神经保护作用，同时在小鼠帕金森模型表现出可恢复MPTP损伤所造成的小鼠运动障碍，其对小鼠行走时间、步频以及速度变化率等都有显著的改善。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种金刚烷胺-栀子酰胺A杂合体化合物在治疗帕金森疾病药物中的应用。

2.如权利要求1所述的金刚烷胺-栀子酰胺A杂合体化合物，其结构式如下：

该化合物命名为F1。

3.权利要求2所述的金刚烷胺-栀子酰胺A杂合体化合物作为调控多巴胺药物的应用。

4.权利要求2所述的金刚烷胺-栀子酰胺A杂合体化合物作为调控iNOS药物的应用。

5.权利要求2所述的金刚烷胺-栀子酰胺A杂合体化合物作为NMDA受体拮抗剂的应用。