CN107820430A

CN107820430A - 线粒体疾病的治疗

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Publication number: CN107820430A
Application number: CN201680039230.6A
Authority: CN
Inventors: R·马蒂·塞韦斯; E·冈萨雷斯·韦奥奎; C·布拉兹凯·贝尔梅霍; J·托雷斯·托龙特拉斯; R·卡布雷拉·佩雷兹; Y·卡梅拉·纳瓦罗
Original assignee: Centro de Investigacion Biomedica en Red en Bioingenieria Biomateriales y Nanomedicina CIBERBBN; Fundacio Hospital Universitari Vall dHebron Institut de Recerca FIR VHIR
Current assignee: Centro de Investigacion Biomedica en Red en Bioingenieria Biomateriales y Nanomedicina CIBERBBN; Fundacio Hospital Universitari Vall dHebron Institut de Recerca FIR VHIR; Centro de Investigacion Biomedica en Red CIBER
Priority date: 2015-06-05
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2018-03-20
Also published as: AU2016273340A1; JP6885544B2; JP2018516923A; RS64273B1; SI3302499T1; IL255988B; JP2023123444A; LT3302499T; AU2016273340B2; US11337980B2; CY1126058T1; PT3302499T; MX2017015566A; AU2021282462B2; US20180161332A1; ES2944551T3; FI3302499T3; EP3302499B1; PL3302499T3; JP2021121594A

Abstract

本发明提供一种用于治疗线粒体DNA损耗和/或多重缺失综合征的包含一种或多种脱氧核糖核苷的组合物，条件是该综合征不是由脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)代谢中的缺陷引起。通过利用本发明，线粒体DNA水平恢复，与患者疾病的严重性无关，这赋予本发明很大的治疗价值。

Description

线粒体疾病的治疗

本发明涉及医药领域，特别是涉及线粒体疾病的治疗，更特别是涉及由线粒体DNA(mtDNA)的缺失/损耗引起的那些线粒体疾病。

背景技术

线粒体基因组(mtDNA)是16.5kb的DNA分子，其通常在单个线粒体中以多个拷贝存在。

一组重要的孟德尔线粒体疾病是由其产物参与线粒体DNA复制或维持的核基因的突变引起的。这些罕见疾病也被称为基因组间通讯缺陷、mtDNA损耗疾病、mtDNA多重缺失疾病或线粒体损耗和缺失疾病(MDDS)。这些实体具有特定的孤儿编码：线粒体DNA损耗综合征的为ORPHA35698，多重线粒体DNA缺失综合征的为ORPHA254807，并且也在OMIM数据库中被识别为http://www.omim.org/phenotypicSeries/PS603041(对于线粒体DNA损耗)和http://www.omim.org/phenotypicSeries/PS157640(对于多重线粒体DNA缺失)。这些疾病是一组复杂的遗传和临床异质性疾病，其特征是在一个或多个受影响组织(例如骨骼肌、肝、脑)中存在mtDNA畸变。

这些疾病的严重性和进展也是高度可变的，从轻度临床表现(例如进行性外部眼肌麻痹)到可能导致婴儿期或幼儿期死亡的严重表型，如在经典mtDNA损耗综合征中观察到的那样。

迄今与基因间通讯中缺陷相关的大多数基因要么直接参与mtDNA复制，要么涉及脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的代谢，所述脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)是DNA合成的构建模块。然而，在通过尚未知的病理机制导致mtDNA不稳定性的基因(OPA1，MPV17，FBXL4等)中识别了越来越多的导致MDDS的突变。通常认为某些基因中的缺陷特异性地导致损耗或多重mtDNA缺失。例如，DGUOK缺陷通常导致mtDNA损耗，而OPA1缺陷通常导致多重mtDNA缺失。然而，越来越多的证据表明，线粒体DNA损耗和多重缺失可以被认为是影响线粒体DNA复制和修复的相同致病途径的临床表现。对于直到最近才发现仅与婴儿发作的线粒体DNA损耗有关的基因(TK2，DGUOK)中的突变，现在已经发现其另外引起多重mtDNA缺失，并且在一些情况下成人发病。

由于MDDS是多器官功能障碍，需要包括不同专家的多学科小组，从而为相关并发症提供支持护理和对症治疗。

迄今为止尚未开发出治疗这些如此复杂疾病的有效疗法。这主要是由于缺乏关于引起所述疾病的机制的确切因素的信息，以及由于一个综合征与另一个综合征之间的变异性。

尽管如此，已经进行一些尝试来找到用于由已知dNTP可用性受到损害的dNTP代谢缺陷引起的MDDS的适当疗法。例如，最近的实验研究已经表明，绕过脱氧核糖核苷酸生物合成中的缺陷步骤，可以克服mtDNA损耗。具体而言，据报道添加嘌呤dN单磷酸(dNMP)可挽救TK2-KO小鼠中的mtDNA损耗[1]。此外，Camara Y.等[2]报道，使用脱氧核糖核苷和/或其分解代谢的特异性抑制剂可能是用于治疗由于dNTP体内平衡缺陷导致的不同MDDS的有效的药理学方法。

尽管进行了努力，但仍然需要针对这些和其它MDDS变体的治疗方法。

发明内容

本发明人已经发现，施用脱氧核糖核苷允许恢复不是由dNTP代谢中的缺陷引起的MDDS疾病中的mtDNA水平。

迄今为止，普遍认为施用核苷只能有效治疗由dNTP代谢中的缺陷引起的线粒体疾病。事实上，现有技术已经假定可以通过施用“缺陷”核苷来克服由dNTP代谢中的缺陷引起的疾病[2]。因此，直到现在，预期只有由特定核苷酸缺陷引起的疾病才能通过施用足够量的所讨论的“缺陷”核苷酸/核苷而治疗。

与现有技术的教导相反，本发明人将脱氧核糖核苷施用至先前诊断具有MDDS的患者的成纤维细胞样品，所述MDDS携带影响聚合酶γ蛋白1(参与mtDNA复制机构的一种酶)的催化亚基的某些突变。令人惊讶地发现，对那些样品施用脱氧核糖核苷使得mtDNA水平恢复到“正常”(健康)水平，而无论患者所携带的突变是怎么样的(参见下面的表3)。不可预期的是，通过对所有三种源自患者的细胞施用相同程度的脱氧核糖核苷，可以克服由不同突变引起的POLG1酶的功能异常(其最终负面影响复制机构的正确功能)。这表明通过施用脱氧核糖核苷恢复mtDNA水平与引起mtDNA复制机构缺陷的突变无关。

因此，本发明的第一方面提供一种用于治疗线粒体DNA损耗和/或缺失综合征的包含一种或多种标准脱氧核糖核苷的组合物，条件是所述综合征不是由脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)代谢中的缺陷引起。该方面还可以被制定为包含一种或多种标准脱氧核糖核苷的组合物在制备用于治疗线粒体DNA损耗和/或缺失综合征的药物中的应用，条件是所述综合征不是由脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)代谢中的缺陷引起。作为选择，这个方面可以制定为治疗不是由脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)代谢中的缺陷引起的线粒体DNA损耗和/或缺失综合征的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用有效治疗量的一种或多种标准脱氧核糖核苷。

在源自罹患由于POLG缺陷导致的不同临床表现的患者的细胞中获得了实验数据。

POLG是编码线粒体DNA聚合酶(称为DNA聚合酶γ)催化亚基的基因。在真核细胞中，线粒体DNA由DNA聚合酶γ复制，该聚合酶γ是由由POLG基因编码的140kDa的催化亚基和由POLG2基因编码的55kDa的二聚辅助亚基组成的三聚体蛋白复合物。催化亚基包含三种酶活性，即，DNA聚合酶活性，校正错误掺入的核苷酸的3'-5'核酸外切酶活性，和碱基切除修复所需的5'-dRP裂解酶活性。在下面提供的实例中，患者罹患由于在核酸外切酶或聚合酶结构域(R309C(在核酸外切酶结构域中)以及G848S和V1177L(在聚合酶结构域中))中和在接头区(W748S)中的突变而导致的POLG缺陷。

本发明人惊奇地发现，施用脱氧核糖核苷对于所有测试的POLG突变均“起作用”，并且不管突变是否影响POLG的功能或结构，突变的POLG形式的酶活性显著改善，达到mtDNA水平恢复并且与健康受试者所显示的数量级相同的程度。也就是说，施用脱氧核糖核苷过度刺激在所述施用之前部分缺乏聚合酶活性的POLG酶形式。

以下提供的实验数据(总结在以下表3中)可以推断出：施用脱氧核糖核苷能够足以加速mtDNA聚合速率，而无论POLG基因中的突变是怎么样的。而且，这些发现还表明，任何其它MDDS疾病也可以通过施用脱氧核糖核苷过度刺激POLG酶活性来有效治疗：通过增强POLG活性，mtDNA水平显著提高，这可以“中和”mtDNA的损失，而与所述损失的原因(特定蛋白的特定突变)无关，并且恢复“正常”水平，已知所述其它MDDS疾病的特征在于mtDNA减少(由于mtDNA拷贝数减少或通过多重mtDNA缺失导致)，并且这是由于来自复制机构本身的蛋白质(POLG1、POLG2，其编码聚合酶γ的辅助单元；PEO1、MGME1和DNA2，等等)或间接参与mtDNA复制的蛋白质(如MPV17)的突变导致的。

因此，基于dN的治疗策略通过提供部分或完全活性的聚合酶活性可由此部分或完全抵消其中mtDNA的复制受到挑战任何的缺陷中的mtDNA损耗。

从以下所示的实验中也可以推断出，线粒体DNA水平的恢复可能与患者疾病的严重程度无关，这对本发明赋予了很大的治疗价值。

本发明在MDDS对象治疗中与施用脱氧核糖核苷相关的其它优点是成本(廉价)，并且对其保存没有特殊的要求。另外，标准脱氧核糖核苷是通常存在于所有生物体中的天然化合物。

附图说明

图1：根据NCBI数据库的POLG1蛋白的氨基酸。突出显示以下突变：在309位->精氨酸取代为半胱氨酸，在748位->色氨酸取代为丝氨酸，在848位->甘氨酸取代为丝氨酸，在1143位->谷氨酸取代为甘氨酸，在1177位->缬氨酸取代为亮氨酸。

图2：表示涉及线粒体DNA损耗和缺失综合征(MDDS)的代谢途径。其功能异常与MDDS相关的蛋白质用数字1(参与dNTP代谢)、数字2(属于复制机构)或数字3(通过未知病理机制与MDDS相关)标记。尽管SUCLA2和SUCLG1与核苷酸二磷酸激酶的关联已有记载，但它们与dNTP代谢的关系尚未清楚地证实。还描述了涉及dNTP代谢但尚未与MDDS和脱氧核糖核苷分解酶的特异性抑制剂相关的其它蛋白质：四氢尿苷(THU)；5-氯-6-[1-(2-亚氨基吡咯烷基)甲基]尿嘧啶盐酸盐(TPI)，免疫素(Immucilin)H(IH)和赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)。缩写：ABAT：4-氨基丁酸转氨酶；ADA：腺苷脱氨酶；ANT1：腺嘌呤核苷酸转位蛋白1；CDA：胞苷脱氨酶；cdN：胞质脱氧核糖核酸酶；dAdo：脱氧腺苷；dCK：脱氧胞苷激酶；dCTD：dCMP脱氨酶；dCtd：脱氧胞苷；dGK：脱氧鸟苷激酶；dGuo：脱氧鸟苷；dIno：脱氧肌苷；DNA2：DNA复制解旋酶2；dThd：胸苷；dUrd：脱氧尿苷；ENT1：平衡型核苷转运蛋白1；FBXL4：富含F-box和亮氨酸重复的蛋白4；mdN：线粒体脱氧核糖核酸酶；MFN2：线粒体融合蛋白(Mitofusin)-2；MGME1：线粒体基因组维持核酸外切酶1；MPV17：线粒体内膜MPV17；NDPK：核苷酸二磷酸激酶；NMPK：核苷酸单磷酸激酶；OPA1：视神经萎缩1；PNP：嘌呤核苷磷酸化酶；POLG1：聚合酶γ亚基1；POLG2：聚合酶γ亚基2；RNR：核糖核苷酸还原酶；SAMHD1：含有SAM结构域和HD结构域的蛋白质1；SUCLA2：β-亚基，琥珀酸-辅酶A连接酶；SUCLG1：α-亚基，琥珀酸-辅酶A连接酶；TK1：胸苷激酶1；TK2：胸苷激酶2；TP：胸苷磷酸化酶；TS：胸苷酸合酶；Twinkle：线粒体Twinkle解旋酶。

图3:为了确定在指定时间(t0、t7、t14、t21和t26)收集的细胞中的mtDNA水平而遵循的实验设计方案。在培养2-3天后(t16-t17)，在细胞培养基中监测dN的稳定性。

具体实施方式

本发明基于这样的发现，即当对罹患由除dNTP代谢中的缺陷以外的缺陷引起的MDDS的患者施用脱氧核糖核苷时，可以实现mtDNA水平的恢复。

核苷是可以被认为是没有磷酸基团的核苷酸的糖基胺。核苷仅由核碱基(也称为含氮碱基)和5碳糖(核糖或脱氧核糖)组成，而核苷酸由核碱基，五碳糖和一个或多个磷酸基团组成。在核苷中，碱基通过β-糖苷键与核糖或脱氧核糖结合。核苷的实例包括胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸苷和肌苷。

如上述已经解释的，MDDS疾病是由线粒体DNA(mtDNA)复制缺陷引起的一组疾病，并且包括以mtDNA拷贝数减少(mtDNA损耗综合征)或多重mtDNA缺失(mtDNA缺失综合征)为特征的疾病。他们在orphaned和在线人类孟德尔遗传目录(它们是这些类型的病理学技术人员的参考网站)中是公知的实体。

这组线粒体疾病构成了一组众所周知的由定义组的基因中的突变引起的疾病，因此它是线粒体疾病专家所熟知的。在某些情况下，这组疾病的名称可能是可变的：mtDNA损耗和缺失综合征[3,4]；基因间通讯(或信号传导)缺陷[5]；mtDNA复制缺陷[6]；等等。这些名称中的两个或多个名称有时会共存在同一个出版物中。

由mtDNA复制缺陷引起的疾病可归因于以下突变：

A-编码属于mtDNA复制机构的蛋白质的基因(在图2中用数字“2”标记)[7,8,9,10,11]

B-编码参与核苷/核苷酸分解代谢或合成代谢的蛋白质的基因(在图2中用数字“1”标记)[12,13,14,15]

C-编码具有未知功能或其功能不属于A类或B类且不能与mtDNA复制过程在生物化学上关联的蛋白质的基因(在图2中用数字“3”标记)[16,17,18,19,20,21,22,23,24]

该分类已经由本领域技术人员明确认可[3,4,6,25,26,27]。

在复制叉处需要dNTP作为DNA合成的底物。哺乳动物细胞从两个不同的代谢来源(胞质从头合成和补救途径)获得DNA合成和修复的前体，补救途径基于位于细胞质和线粒体基质中的两组平行的酶。当细胞对DNA前体的需求最高时，dNTP的合成与核DNA复制相偶联。一旦复制期(S期)结束，或在非分裂细胞中，dNTP库显著减少。从头合成基于核糖核苷酸还原酶(RNR)的胞质活性(除了最近已经鉴定为线粒体胸苷酸合酶的dTMP之外。RNR催化所有四种核糖核苷二磷酸变构平衡还原为相应的脱氧核糖核苷(dN)，在细胞周期的S期为细胞提供高浓度的dNTP。RNR是含有两个拷贝的大亚基(R1)和两个小亚基(R2或p53R2)的异源四聚体。虽然R2在有丝分裂晚期中发生蛋白酶体依赖性降解，但p53R2存在于整个细胞周期中，并且其表达在非分裂细胞中也保持稳定。不同于核基因组复制，mtDNA合成独立于细胞分裂而发生。虽然在S期过程中p53R2支持的胞质从头合成与由R2提供的相比低得多，但是由于p53R2基因的突变导致mtDNA消耗，已经证明其对于mtDNA维持是必需的。

补救合成途径基于将前体核苷顺序地磷酸化成dNMP、dNDP和最终的dNTP。该途径中的第一步和限速步骤由脱氧核苷激酶不可逆地催化。胸腺嘧啶激酶1(TK1)和脱氧胞苷激酶(dCK)在胞浆中起作用，而胸苷激酶2(TK2)和脱氧鸟苷激酶(dGK)定位在线粒体内。参与补救途径的线粒体激酶的突变，引起严重的MDDS，证明线粒体依赖于dNTP的补救供应以用于其DNA维持和修复。另外的核苷酸激酶完成将所有四种dNMP磷酸化成DNA合成所需的最终相应的dNTP。胞浆和线粒体基质是独立的区室，但是它们主动通讯，通过迄今为止未良好表征的载体跨越线粒体内膜双向交换库组分。由于该交叉串连，认为dNTP库大小的变化在两个区室平行发生。因此在有丝分裂后的细胞(其中胞浆库已经大量减少)中，线粒体对于其自身补救供应dNTP的缺陷变得更容易受损。

dNTP库的大小取决于上述合成代谢途径、并入到DNA中的速率和导致dNTP降解的分解代谢过程之间的平衡。

在复制叉处需要dNTP作为通过线粒体聚合酶γ(POLG)整合到DNA中的底物。尽管mtDNA复制的确切模式目前是有争议的，但通过聚合酶γ(由由POLG1编码的催化亚基和由POLG2编码的两个辅助亚基组成)、Twinkle解旋酶和单链结合(SSB)蛋白形成的基本线粒体复制体已经在体外重建[28]。其它未充分表征的活性对于mtDNA分子(例如引发酶，拓扑异构酶)的完全体内复制和对于响应于不同刺激和应激的过程的启动和调节而言是必需的。一些实例是编码蛋白质的MGME1和DNA2基因，所述蛋白质在一定程度上参与复制过程(分别为7S RNA的成熟，解旋酶活性)，并且其突变最近与MDDS相关联。

在一个实施方式中，综合征的治疗通过增加聚合酶γ活性来实现。

在一个实施方式中，一种或多种脱氧核糖核苷是标准脱氧核糖核苷。有利的是，通过使用此类脱氧核糖核苷，由于不需要对代谢物进行额外的处理，可以更早地开始获得效果。此外，由于标准脱氧核糖核苷与内源性脱氧核糖核苷基本上相同，所以可以降低与治疗该疾病相关的副作用风险。

在本发明第一方面的一个实施方式中，综合征由线粒体DNA复制机构中的缺陷导致。

在本发明第一方面的另一实施方式中，缺陷由线粒体DNA复制机构的一种或多种蛋白质中的一个或多个突变导致。

在又一实施方式中，蛋白质选自由下述蛋白质组成的组：DNA聚合酶亚基γ-1(POLG1)、DNA聚合酶亚基γ-2(POLG2)、Twinkle蛋白(PEO1)、线粒体基因组维持核酸外切酶1(MGME1)和人解旋酶/核酸酶DNA 2蛋白。在另一实施方式中，所述蛋白质是DNA聚合酶亚基γ-1(POLG1)和Twinkle蛋白。

聚合酶γ是由一个催化亚基(由POLG1编码)和作为持续因子和DNA结合的调节剂的两个辅助亚基(由POLG2编码)构成的异源三聚体。其在NCBI数据库中的登录号是NP_001119603.1(也如图1和SEQ ID NO：1所提供)。

POLG相关障碍呈现出从幼儿期到成年晚期呈现的连续广泛和重叠表型。POLG相关疾病的临床表型包括：常染色体隐性和显性成年发作PEO、肌阵挛性癫痫、肌病、感觉性共济失调(MEMSA)综合征、共济失调-神经病谱(包括线粒体隐性共济失调综合征(MIRAS)和感觉性共济失调)、神经病、构音障碍、眼肌麻痹(SANDO)综合征和肝脑MDS(Alpers-Huttenlocher综合征)。最近，在具有MNGIE临床特征但没有白质脑病的个体中鉴定出POLG突变。

Alpers-Huttenlocher综合征的发病率估计约为1：50,000。这是与POLG突变相关的最严重的表型，其特征在于具有顽固性癫痫的进行性脑病(progressiveencephalopathy with intractable epilepsy)和精神运动性迟缓、神经病和肝衰竭。受影响的个体通常在2至4岁之间出现癫痫发作(局灶性、广泛性、肌阵挛性、癫痫部分持续性或癫痫持续状态)，通常与视觉或视觉光环相关的头痛，张力减退和精神运动性退化。在疾病早期呈现无反射和张力减退，随后出现痉挛性截瘫，这种截瘫会在几个月至几年内发生，导致精神运动性衰退。受影响的个体出现肝功能障碍，伴随有转氨酶升高、低蛋白血症、凝血障碍、低血糖和高氨血症。肝受累(Liver involvement)可能会在几个月内迅速发展到末期肝衰竭。CSF蛋白质一般升高。神经成像可能显示神经胶质增生和全脑萎缩。肝组织学可能表现出大和小泡性脂肪变性、小叶中心性坏死、纤维化、肝硬化、胆管增生和线粒体增生。肝中mtDNA含量降低。疾病进展是可变的，预期寿命从症状发作起3个月～12年。

在一个实施方式中，线粒体DNA损耗和/或缺失综合征由线粒体复制途径中的缺陷引起，所述缺陷由POLG1蛋白中的一个或多个以下突变导致：在309位的精氨酸突变为半胱氨酸[29]、在748位的色氨酸残基突变为丝氨酸(rs113994097)、在848位的甘氨酸突变为丝氨酸(rs113994098)、在1143位的谷氨酸突变为甘氨酸(rs2307441)和在1177位的缬氨酸突变为亮氨酸。

作为选择，在本发明第一方面的另一个实施方式中，所述缺陷由选自由以下组成的组中的一种或多种蛋白质中的一个或多个突变导致：ANT1、MPV17、SUCLA2、FBXL4、ABAT、SUCLG1、MFN2和OPA1。在第一方面的另一个实施方式中，所述缺陷由选自由以下组成的组中的蛋白质中的一个或多个突变导致：OPA1、SUCLA2和SUCLG1。

在另一个实施方式中，所述一个或多个脱氧核糖核苷是标准脱氧核糖核苷。在另一个实施方式中，所述一种或多种脱氧核糖核苷选自由以下组成的组：脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷。在又一个实施方式中，组合物包含四种标准脱氧核糖核苷。组合物包含四种标准脱氧核糖核苷并且不含任何其它核苷(这意味着该组合物独特地包含这四种脱氧核糖核苷作为“脱氧核糖核苷组分”，但可以包括赋形剂、载体等)。在又一个实施方式中，组合物包含脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷。在又一个实施方式中，组合物包含脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷，并且不含任何其它核苷(这意味着组合物独特地包含这四种核苷作为“核苷组分”，但可以包括赋形剂，载体等)。

本领域技术人员能够确定用于恢复mtDNA水平的每种脱氧核糖核苷的量(即，改善线粒体疾病的体征和症状的治疗有效量)。在另一个实施方式中，当组合物包含多于一种标准脱氧核糖核苷时，核苷以等摩尔比存在。

在一个实施方式中，组合物包含由脱氧腺苷(dAdo)、脱氧胞苷(dCtd)、脱氧鸟苷(dGuo)和脱氧胸苷(通常称为胸苷，dThd)组成的组合，所有核苷为等摩尔比。

在另一个实施方式中，组合物还包含一种或多种药学上可接受的核苷降解抑制剂。

在现有技术中存在公知的核苷降解抑制剂。说明性的非限制性实例是：作为dGuo降解抑制剂的Inmucilin H或Forodesine，作为dCtd降解抑制剂的四氢尿苷，作为dThd降解抑制剂的5-氯-6-[1-(2-亚氨基吡咯烷基)甲基]尿嘧啶盐酸盐(TPI)和作为dAdo降解抑制剂的赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)。图1显示了这些抑制剂的作用模式。

本领域技术人员能够确定保证恢复mtDNA水平的核苷生物利用度所需的抑制剂的量。

在一个实施方式中，组合物还包含一种药学上可接受的核苷降解抑制剂。在另一个实施方式中，药学上可接受的抑制剂是脱氧腺苷降解抑制剂。在另一个实施方式中，抑制剂是赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)。

对于本文应用所述的活性组分可以与药学上合适的赋形剂或载体配制在一起，所述赋形剂或载体经选择以使得所述组合物能够适合于通过口服、直肠、肠胃外(例如，静脉内、肌内、动脉内和腹膜内等)或吸入途径、渗透泵、局部和眼部等递送。

软膏剂是由掺入脂肪、蜡质或合成基质中的活性成分组成的半固体制剂。

合适的乳膏剂的实例包括但不限于油包水和水包油乳剂。油包水乳膏剂可以通过使用适合的乳化剂来配制，所述乳化剂与诸如鲸蜡醇或鲸蜡硬脂醇等脂肪醇或者与乳化蜡(但不限于此)具有相似的性质。水包油乳膏剂可以使用乳化剂(例如聚西托醇乳化蜡)来配制。合适的性质包括改变乳液粘度的能力以及在宽范围pH下的物理和化学稳定性。水溶性或可混溶的乳膏剂基质可以含有防腐剂体系，也可以经缓冲以保持可接受的生理pH。

除了上述局部施用方法外，还存在各种全身施用本发明化合物的方法。一种此类手段涉及由活性化合物组成的可呼吸颗粒的气溶胶悬浮液，其可被受试者吸入。活性化合物将通过肺吸收到血流中，并以药物有效量接触全身循环。可呼吸颗粒可以是液体或固体，其粒径足够小，以便在吸入时通过口和喉。

将活性化合物全身施用于受试者的另一手段将涉及以液体制剂的滴鼻剂或受试者吸入的可吸入颗粒的鼻喷雾剂的形式施用液体/液体悬浮液。用于制备鼻喷雾剂或滴鼻剂的活性化合物的液体药物组合物可以通过将活性化合物与合适的载剂例如无菌无热原水或无菌盐水通过本领域技术人员已知的技术组合来制备。

将活性化合物全身施用至受试者的另一手段将涉及以液体制剂的滴鼻剂或受试者吸入的可呼吸颗粒的鼻腔喷雾剂的形式施用液体/液体悬浮液。用于制备鼻腔喷雾剂或滴鼻剂的活性化合物的液体药物组合物，可以通过本领域技术人员已知的技术通过将活性化合物与合适的载剂(例如无菌无热原水或无菌盐水)组合来制备。

活性化合物的全身施用的其它手段将涉及口服给药，其中含有式I化合物的药物组合物为固体、溶液、乳液、分散液、胶束和脂质体等形式，并且其中所得制剂含有考虑用于本文的活性化合物，与适用于鼻内、经肠内或肠胃外应用的有机或无机载体或赋形剂混合。活性成分可以与通常无毒的、药学上或生理学上可接受的载体一起混配，以用于片剂、丸剂、胶囊剂、糖锭剂、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散型粉剂或颗粒剂、栓剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、硬胶囊或软胶囊、囊片或糖浆剂或酏剂以及适合使用的任何其它形式。可以使用的载体包括阿拉伯胶、明胶、甘露糖醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石粉、玉米淀粉、角蛋白、胶体二氧化硅、马铃薯淀粉、脲、中等链长甘油三酯、右旋糖酐和适用于固体、半固体或液体形式制剂的其它载体。另外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂和着色剂。考虑用于本文的活性化合物以足以在施用时产生所需效果的量(即治疗有效量)包含在药物制剂中。

粉末剂、溶液、混悬液或片剂含有在生理学相容的载剂中的活性化合物，所述载剂是口服递送系统开发领域的技术人员可以使用常规标准来选择的。例如，此类制剂可以含有选自以下的一种或多种试剂：调味剂(如薄荷、冬青油或樱桃油)、着色剂和防腐剂等，以提供药学上优质和适口的制剂。含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂也可以通过已知的方法制造。所用的赋形剂可以例如是：(1)惰性稀释剂，例如碳酸钙、乳糖、磷酸钙和磷酸钠等；2)造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉和海藻酸等；(3)粘合剂，例如黄蓍胶、玉米淀粉、明胶和阿拉伯胶等；和(4)润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石等。片剂可以是未包衣的，或者它们可以通过已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，由此提供较长时期的持续作用。例如，可以采用延时材料，例如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。

当用于口服使用的制剂为硬明胶胶囊形式时，活性成分可以与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土等)混合。它们也可以是软明胶胶囊的形式，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油等)混合。

将活性化合物对受试者全身施用的另外的手段将涉及活性化合物的栓剂形式，从而使治疗有效量的化合物到达全身循环。

取决于所施用的活性化合物的特定制剂的溶解度，可以将用于改善线粒体疾病的体征和症状的每日剂量分成一个或多个单位剂量施用。

在整篇说明书和权利要求书中，词语“包含”和该词语的变体旨在不排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，词语“包含”涵盖“由……组成”的情况。本发明另外的目标、优点和特征对于本领域技术人员来说通过研究本说明书将变得显而易见，或可以通过实施本发明而学习。提供下列实施例以用于说明，它们不是对本发明的限制。此外，本发明涵盖了本文所述具体的优选实施方式的所有可能的组合。

实施例

1.方法

患者

在研究中包括源自三名患有POLG缺陷的患者的细胞。根据我们的机构审查委员会和赫尔辛基宣言，所有受试者都给予了知情同意。通过Sanger测序在所有3名患者中鉴定出POLG(RefSeq NP_001119603.1)中的突变。使用QiaAMP Mini(Qiagen)从成纤维细胞中分离总DNA，并且通过常规PCR扩增包含目的突变位点的约500bp的片段，所述常规PCR利用如下列出的以下引物对和rTaq(Takara)：

所用引物是：

引物1(R309C,925c->t)

正向引物 GTCCACACCACCAAGCAGT(SEQ ID NO:2)

反向引物 GGTCCCAAGCACTATGCTCC(SEQ ID NO:3)

引物2(W748S c.2243G->C)

正向引物 CCTTGCTGAATGCAGGTGCT(SEQ ID NO:4)

反向引物 TGTGCCTGAAATCACACTCTGT(SEQ ID NO:5)

引物3(G848S c.2542G->A)

正向引物 ATGGTCTGCTGAGTGGTTGT(SEQ ID NO:6)

反向引物 CCCTCAGAGCCCAGTTTCTAC(SEQ ID NO:7)

引物3(E1143G c.3428A->G)

正向引物 CCCAGTTTATGACCAGCCGT(SEQ ID NO:8)

反向引物 CAAGGAACGCTCACCCAAAG(SEQ ID NO:9)

引物4(V1177L c.3529G->C)

正向引物 AGGGGAAGCCCTGCTCTAAG(SEQ ID NO:10)

反向引物 ACAAATGTGTTGTGCTCACCC(SEQ ID NO:11)

采用相同的引物和BigDye v3.1测序试剂盒(Life Technologies)进行测序反应，通过BigDye X-Terminator纯化试剂盒(Life Technologies)纯化，并在ABI 3130测序仪(Applied Biosystems)中测序。患者1(p.R309C突变的纯合子)罹患严重的神经表型(神经病、脑病、MNGIE样)，导致20岁时死亡；患者2(p.W748S和p.G848S突变的复合杂合子)罹患较不严重的表型，但也主要是神经性(神经病、精神病症状，MNGIE样)；患者3(顺式p.V1177L和p.E1143G中两个显性氨基酸改变的杂合子)呈现熟悉的PEO显性遗传模式(渐进性外部眼肌麻痹)、精神病症状和近侧肌肉无力。来自所有三名患者的骨骼肌都证明了线粒体DNA缺失的积累，但没有显著的损耗。

细胞培养

原代培养的成纤维细胞获自患者1-3和4个健康供体的皮肤活组织检查。根据我们的机构审查委员会和赫尔辛基宣言，所有受试者都给予了知情同意。

在加湿温育器中在37℃和5％CO₂下，将细胞接种在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中的9.5cm²的6孔板中，所述DMEM具有4.5g/L葡萄糖并且补充有2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和链霉素以及10％经透析的胎牛血清(FBS)(Invitrogen)。达到紧密汇合后，将FBS减少至0.1％以诱导静息，并且开始(第0天，t0)用5ng/ml EtBr(溴化乙锭，Merck)的同时处理。每2-3天以相同的处理更换细胞培养基，持续两周。在第14天(t14)，从细胞培养基中撤出EtBr，并用200μM全部四种脱氧核苷(dN)：dAdo(脱氧腺苷，Sigma)、dCtd(脱氧胞苷，Sigma)、dGuo(脱氧鸟苷，Sigma)、dThd(脱氧胸苷，Sigma)和5μMEHNA(Sigma)，开始处理包含所有细胞的组。一组细胞不经处理，并且所有参数都被平行监测。通过相同的处理每2-3天更换细胞培养基，持续另外12天。在第16或第17天，收集培养基并储存在-20℃直到进一步使用。对于DNA分析，通过胰蛋白酶消化在第0、7、14、21和26天收获细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，使成团并在20℃储存直至DNA分离(图2)。使用QiaAMP DNA微型试剂盒(Qiagen)分离总DNA。

在细胞培养基中脱氧核苷稳定性的评价

使用Acquity UPLC-MS/MS仪器(Acquity UPLC-Xevo^TMTQ Mass Spectrometer,Waters,Milford,MA)，如先前所描述的[2]，通过与串联质谱法(LC-MS/MS)耦合的液相色谱法测量dN和一些相关代谢物。通过超滤(3kDa Amicon Ultra filters,Millipore)在14,000×g和4℃下将细胞培养基去蛋白30分钟，然后注入LC-MS/MS系统中。

mtDNA调查

如之前所述[2]通过定量PCR评估mtDNA的拷贝数。

按照Nishigaki等[30]公开的PCR条件和引物，通过长程PCR印迹调查mtDNA缺失：

正向引物(F1142-1516)：ACCGCCCGTCACCCTCCTCAAGTATACTTCAAAGG(SEQ ID NO:12)

反向引物(R1180-1146):ACCGCCAGGTCCTTTGAGTTTTAAGCTGTGGCTCG(SEQ ID NO:13)

2.结果

EtBr暴露诱导POLG缺陷型静息成纤维细胞中更大的mtDNA损耗

当测试mtDNA损耗的潜在治疗时，一个重要的限制是：在许多情况下，来自MDDS患者的细胞在细胞培养中不显示任何mtDNA异常。出于该原因，已经开发了不同的模型以证明影响mtDNA复制的分子缺陷。在现有技术中已经重复使用EtBr暴露来迫使培养细胞中的mtDNA损耗并分析它们恢复正常mtDNA水平的复制能力(Pontarin等，“Mammalianribonucleotide reductase subunit p53R2is required for mitochondrial DNAreplication and DNA repair in quiescent cells”,2012,PNAS,v.109(33),pages13302-13307)。通过暴露于5ng/ml EtBr 14天，在健康对照中和在POLG缺陷型静息细胞中均诱导mtDNA损耗。在所有细胞中观察到明显的mtDNA损耗。然而，与从健康对照获得的成纤维细胞系中观察到的相比，所有POLG缺陷细胞经历更高程度的线粒体DNA损耗(平均mtDNA残余水平百分比±SE：17.5±2.3％；在对照细胞中：39.68±6.6％)。该数据表明由POLG突变引起的分子缺陷可以加重EtBr对复制过程的干扰。

当用dN加EHNA的组合处理时，在EtBr强制损耗后，POLG缺陷型成纤维细胞完全恢复mtDNA水平

在EtBr停止后，研究了用全部四种dN补充细胞培养基对mtDNA水平恢复的影响。先前据报道dAdo对胞外和胞内酶促降解特别敏感，主要是被ADA(腺苷脱氨酶)降解[2]。因此，为了发挥dAdo分解代谢的部分抑制作用并提高其稳定性，用等摩尔浓度的所有四种标准dN(200μM dGuo、dAdo、dThd和dCtd)加上5μM EHNA(Sigma)补充培养基。在第16-17天，按照与Cámara Y.等，2014[2]中公开的一种方案相同的方案，在2-3天的条件培养基中测量添加的dN的浓度和它们的一些衍生代谢物。虽然部分降解，但在所有情况下所有dN的浓度仍保持高于初始添加的70％(表2)。在来自对照或患者来源的细胞的条件培养基之间没有观察到dN稳定性的显著差异。

表2：处理2-3天后培养基中的化合物浓度

	对照	患者
			dCtd	168.9±27.4	196±24.0
dUrd	46.7±27.6	6.2±3.4
			dThd	154.8±9.1	153.9±10.2
胸腺嘧啶	48.4±17.3	36.4±10.2
			dGuo	171.6±17.9	173.3±16.5
鸟嘌呤	71.0±27.5	57.9±12.1
			dAdo	140.4±15.7	142.9±17.5
dIno	50.7±22.1	30.7±10.7
			次黄嘌呤	23.7±8.8	22.7±8.3

结果是来自三种不同的POLG缺陷型和四种对照细胞系的平均值±SD。dUrd：脱氧尿苷；dIno：脱氧肌苷。

在存在或不存在dN补充的情况下，在EtBr停止之前和之后监测mtDNA恢复率(按照与Cámara Y.等，2014[2]的一种方案相同的方案)。来自对照细胞的mtDNA拷贝数在EtBr停止12天后达到高于初始水平的100％的值，而无论是否有dN处理(mtDNA残留水平的平均百分比±SE：未处理129.8±35.2％；处理153.9±40.6％)。与之相反，POLG缺陷细胞不能恢复正常的mtDNA水平(26.6±1.5％)，除非补充dN。

表3：在实验期间不同时间点的静息成纤维细胞中的mtDNA水平。

值表示为相对于第0天的mtDNA拷贝数的百分比。在EtBr诱导的损耗后，从实验第14天开始用dNs+EHNA处理或不处理细胞。

表3所示的结果可以得出结论：标准核苷的施用允许在MDDS患者中实现与健康受试者中相当的mtDNA水平(150.3±21.9％，表3)。因此，该数据表明，在罹患由除dNTP代谢缺陷之外的缺陷引起的MDDS的患者中，核苷的施用可以恢复的mtDNA水平，达到与“健康”状况相关的水平，这表明所述组合在治疗这种疾病中的治疗潜力。

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序列表

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生物医学网络研究中心

<120> 线粒体疾病的治疗

<130> P3332EP00

<150> EP15170825.2

<151> 2015-06-05

<160>

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1190

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ser Arg Leu Leu Trp Arg Lys Val Ala Gly Ala Thr Val Gly Pro

1 5 10 15

Gly Pro Val Pro Ala Pro Gly Arg Trp Val Ser Ser Ser Val Pro Ala

20 25 30

Ser Asp Pro Ser Asp Gly Gln Arg Arg Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln

35 40 45

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Gln Gln Pro Gln Val Leu Ser Ser

50 55 60

Glu Gly Gly Gln Leu Arg His Asn Pro Leu Asp Ile Gln Met Leu Ser

65 70 75 80

Arg Gly Leu His Glu Gln Ile Phe Gly Gln Gly Gly Glu Met Pro Gly

85 90 95

Glu Ala Ala Val Arg Arg Ser Val Glu His Leu Gln Lys His Gly Leu

100 105 110

Trp Gly Gln Pro Ala Val Pro Leu Pro Asp Val Glu Leu Arg Leu Pro

115 120 125

Pro Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Asp Gln His Phe Arg Leu Leu Ala Gln

130 135 140

Lys Gln Ser Leu Pro Tyr Leu Glu Ala Ala Asn Leu Leu Leu Gln Ala

145 150 155 160

Gln Leu Pro Pro Lys Pro Pro Ala Trp Ala Trp Ala Glu Gly Trp Thr

165 170 175

Arg Tyr Gly Pro Glu Gly Glu Ala Val Pro Val Ala Ile Pro Glu Glu

180 185 190

Arg Ala Leu Val Phe Asp Val Glu Val Cys Leu Ala Glu Gly Thr Cys

195 200 205

Pro Thr Leu Ala Val Ala Ile Ser Pro Ser Ala Trp Tyr Ser Trp Cys

210 215 220

Ser Gln Arg Leu Val Glu Glu Arg Tyr Ser Trp Thr Ser Gln Leu Ser

225 230 235 240

Pro Ala Asp Leu Ile Pro Leu Glu Val Pro Thr Gly Ala Ser Ser Pro

245 250 255

Thr Gln Arg Asp Trp Gln Glu Gln Leu Val Val Gly His Asn Val Ser

260 265 270

Phe Asp Arg Ala His Ile Arg Glu Gln Tyr Leu Ile Gln Gly Ser Arg

275 280 285

Met Arg Phe Leu Asp Thr Met Ser Met His Met Ala Ile Ser Gly Leu

290 295 300

Ser Ser Phe Gln Arg Ser Leu Trp Ile Ala Ala Lys Gln Gly Lys His

305 310 315 320

Lys Val Gln Pro Pro Thr Lys Gln Gly Gln Lys Ser Gln Arg Lys Ala

325 330 335

Arg Arg Gly Pro Ala Ile Ser Ser Trp Asp Trp Leu Asp Ile Ser Ser

340 345 350

Val Asn Ser Leu Ala Glu Val His Arg Leu Tyr Val Gly Gly Pro Pro

355 360 365

Leu Glu Lys Glu Pro Arg Glu Leu Phe Val Lys Gly Thr Met Lys Asp

370 375 380

Ile Arg Glu Asn Phe Gln Asp Leu Met Gln Tyr Cys Ala Gln Asp Val

385 390 395 400

Trp Ala Thr His Glu Val Phe Gln Gln Gln Leu Pro Leu Phe Leu Glu

405 410 415

Arg Cys Pro His Pro Val Thr Leu Ala Gly Met Leu Glu Met Gly Val

420 425 430

Ser Tyr Leu Pro Val Asn Gln Asn Trp Glu Arg Tyr Leu Ala Glu Ala

435 440 445

Gln Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Gln Arg Glu Met Lys Lys Ser Leu Met

450 455 460

Asp Leu Ala Asn Asp Ala Cys Gln Leu Leu Ser Gly Glu Arg Tyr Lys

465 470 475 480

Glu Asp Pro Trp Leu Trp Asp Leu Glu Trp Asp Leu Gln Glu Phe Lys

485 490 495

Gln Lys Lys Ala Lys Lys Val Lys Lys Glu Pro Ala Thr Ala Ser Lys

500 505 510

Leu Pro Ile Glu Gly Ala Gly Ala Pro Gly Asp Pro Met Asp Gln Glu

515 520 525

Asp Leu Gly Pro Cys Ser Glu Glu Glu Glu Phe Gln Gln Asp Val Met

530 535 540

Ala Arg Ala Cys Leu Gln Lys Leu Lys Gly Thr Thr Glu Leu Leu Pro

545 550 555 560

Lys Arg Pro Gln His Leu Pro Gly His Pro Gly Trp Tyr Arg Lys Leu

565 570 575

Cys Pro Arg Leu Asp Asp Pro Ala Trp Thr Pro Gly Pro Ser Leu Leu

580 585 590

Ser Leu Gln Met Arg Val Thr Pro Lys Leu Met Ala Leu Thr Trp Asp

595 600 605

Gly Phe Pro Leu His Tyr Ser Glu Arg His Gly Trp Gly Tyr Leu Val

610 615 620

Pro Gly Arg Arg Asp Asn Leu Ala Lys Leu Pro Thr Gly Thr Thr Leu

625 630 635 640

Glu Ser Ala Gly Val Val Cys Pro Tyr Arg Ala Ile Glu Ser Leu Tyr

645 650 655

Arg Lys His Cys Leu Glu Gln Gly Lys Gln Gln Leu Met Pro Gln Glu

660 665 670

Ala Gly Leu Ala Glu Glu Phe Leu Leu Thr Asp Asn Ser Ala Ile Trp

675 680 685

Gln Thr Val Glu Glu Leu Asp Tyr Leu Glu Val Glu Ala Glu Ala Lys

690 695 700

Claims

1.一种用于治疗线粒体DNA损耗和/或缺失综合征的包含一种或多种脱氧核糖核苷的组合物，条件是所述综合征不是由脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)代谢中的缺陷引起。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述综合征的治疗通过增加聚合酶γ活性实现。

3.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种脱氧核糖核苷是标准核苷。

4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述综合征由线粒体DNA复制机构中的缺陷导致。

5.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述缺陷由所述线粒体DNA复制机构的一种或多种蛋白质中的一个或多个突变导致。

6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述一种或多种蛋白质选自由下述蛋白质组成的组：DNA聚合酶亚基γ-1(POLG1)、DNA聚合酶亚基γ-2(POLG2)、Twinkle蛋白(PEO1)、线粒体基因组维持核酸外切酶1(MGME1)和人解旋酶/核酸酶DNA 2蛋白(DNA2)。

7.如权利要求6所述的组合物，其中，所述综合征由DNA聚合酶亚基γ-1(POLG1)蛋白中的缺陷导致。

8.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述线粒体DNA损耗和缺失综合征由线粒体复制途径中的缺陷引起，所述缺陷由POLG1蛋白中的一种或多种以下突变导致：R309C、W748S、V1177L、G848S、E1143和E1143G，位置参照SEQ ID NO:1。

9.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种脱氧核糖核苷选自由下述组成的组：脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷。

10.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷。

11.如权利要求10所述的组合物，其不含有任何其它另外的核苷。

12.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含核苷降解的一种或多种药学上可接受的抑制剂。

13.如权利要求12所述的组合物，其中，所述组合物还包含核苷降解的一种药学上可接受的抑制剂。

14.如权利要求12-13中任一项所述的组合物，其中，所述药学上可接受的抑制剂是脱氧腺苷降解的抑制剂。

15.如权利要求14所述的组合物，其中，所述抑制剂是赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)。