CN107751187A

CN107751187A - 一种可诱导鱼类雌核发育的失活精子液的制备方法

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Publication number: CN107751187A
Application number: CN201711268311.6A
Authority: CN
Inventors: 黄镇; 陈多; 岑万; 周翊涛
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2017-12-05
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2018-03-06
Anticipated expiration: 2037-12-05
Also published as: CN107751187B

Abstract

本发明是属于鱼类人工生殖发育技术领域，具体涉及一种可诱导鱼类雌核发育的失活精子液的制备方法。本发明首先将雄性亲鱼用高锰酸钾水溶液进行鱼体消毒，之后采用二次注射法进行催产排精；采集雄性亲鱼精液配成精子处理液；通过育种机进行精子AＲTP失活处理，之后在精子处理液中加入5μL 0.6M甘露醇、10μL Hank's液,即得到失活精子液，供于雌核发育的卵子进行受精使用。采用常压室温等离子体作为鱼类精子的灭活剂制备可诱导鱼类雌核发育的失活精子液，可有效地对同源或异源雌性亲鱼的卵,诱导雌核发育进行“受精”，其受精率达到40‑67%，孵化率20‑45%。

Description

一种可诱导鱼类雌核发育的失活精子液的制备方法

技术领域

本发明是属于鱼类人工生殖发育技术领域，具体涉及一种采用常压室温等离子体为灭活剂，可诱导鱼类雌核发育的失活精子液的制备方法。

背景技术

1947年加洛维卡姬在银鲫的繁殖细胞学研究, 及kallman 在美洲帆鱼中进行的组织移植技术实验都进一步证实了鱼类的雌核发育现象。除了天然的雌核发育外, 生物学家对人工雌核发育一直在进行探索与实践。国内学者如1983年, 蒋一硅等对鲫鱼的人工诱导雌核发育进行了研究, 成功得到二倍体鱼。

根据鱼类天然雌核发育的原理, 人工诱导雌核发育必须作两个方面的技术处理:(一)使精子遗传物质失活。(二)人工诱导二倍体的形成。使精子遗传物质失活有物理和化学两种方法。物理方法有Coγ射线和紫外线照射。γ射线具有较大的穿透力, 便于大量精子的处理, 其作用是导致染色体断裂。紫外线的作用是破坏精子头部DNA 的结构。化学方法常用的药物有甲苯胺蓝(Toluidine blue ), 己烯脲(Ethyleneurea)和二甲基硫酸(Dimethysulfate)等。无论是物理诱变所用的各种辐射源还是化学诱变药剂对人体基本上都有致癌、致突变和致畸等远期效应。因此，这些传统的理化诱变剂在其制备、运输、存储及实验操作等实际应用中存在诸多不便。

在关于鱼类雌核发育的研究报道中，几乎全部都是通过对同源或者异源精子的遗传物质进行紫外照射灭活，然后用失活精子刺激卵子来实现雌核发育。这种方法的缺点是，对精子进行紫外照射会导致卵子受精率大幅下降，以致雌核二倍体孵化率大幅下降；紫外照射处理同源精子，由于光修复效应等因素的存在, 用紫外线辐射处理不能绝对保证所有精子达到完全的遗传失活。因此所得后代仔鱼也不能保证全部都是由雌核发育而来。因而寻找一种安全有效的诱变剂对于使精子遗传物质失活的应用将显得特别重要。

常压室温等离子体（ARTP）中含有多种带电粒子、自由基等活性基团以及高频电场等物理因素。这些众多的理化因子可以使活细胞受到损伤、突变, 甚至死亡。与传统理化诱变剂相比, 它具有安全、无污染、无残留以及操作简单等特点。通过一系列试验的验证：常压室温等离子体可以作为同源或者异源鱼类精子的灭活剂。

发明内容

本发明通过系列实验的验证:常压室温等离子体（ARTP）中含有多种带电粒子、自由基等活性基团以及高频电场等物理因素。使鱼类精子细胞受到损伤，破坏鱼类精子头部DNA的结构, 将常压室温等离子体作为同源或者异源鱼类精子的灭活剂，成为可以诱导鱼类雌核发育的失活精子的新技术。

为实现本发明目的而采用技术方案如下：

1、催产排精

选择体质健壮、无病无伤、达性成熟年龄的雄性亲鱼，首先将雄性亲鱼用10 ～ 20 mg/L 的高锰酸钾水溶液进行1 ～1.5小时的鱼体消毒，之后采用二次注射法进行催产排精，第一次用2μg促黄体素释放激素类似物（LHＲH－A2）预备针注射雄性亲鱼；16小时后，按照每kg鱼重注射3～5mg复配催熟剂进行第二次注射。

所述的复配催熟剂，其配方为每10mg复配催熟剂中含有2mg地欧酮（DOM）、6mg 鲤鱼脑垂体（PG）、800国际单位IU人绒毛膜促性腺激素（HCG）。

所述的雄性亲鱼是指雄性鲫鱼或雄性鲤鱼。

2、精子处理液制备：

采集雄性亲鱼精液，按精液：精子稀释液为1：5的体积比配成精子处理液，备用。

所述的精子稀释液，其配方为：NaCl 2.5～4.0g，KCl 1.0～1.6g，CaCl₂ 0.1～0.2g，MgSO₂.7H₂O 0.1～0.2g，NaHCO₃ 0.2～0.4g，无菌水定容至500ml，即配即用。

3、精子失活处理

利用常压室温等离子体作为鱼类精子的灭活剂，通过育种机( AＲTP)对精子处理液进行精子AＲTP失活处理。所述的AＲTP失活处理条件为：上样量为20μL精子处理液，处理输出功率为125 W、气体流速为10 L·min^{－ 1}，辐照距离为2 mm，处理时间为20～60 s；

在AＲTP处理后的精子处理液中，加入5μL 0.6M 甘露醇、10μL Hank's 液,随后用玻璃棒蘸取加甘露醇、Hank's 液的精子处理液，滴在载玻片上，加上盖玻片，在显微镜下用暗视野进行观察，此时可观察到精子活力下降，80～90%的精子处于慢速运动（非直线前进运动）状态，即得到失活精子液。

当雄性亲鱼为雄性鲫鱼时得到的是鲫鱼失活精子液，当雄性亲鱼为雄性鲤鱼时得到的是鲤鱼失活精子液。

精子活力主要是指精子的运动情况，精子的运动有直线前进运动、旋转运动和振摆运动。评定精子活力是指直线运动精子占精子总数的百分数。精子失活处理后活力下降，观察80～90%的精子处于慢速运动（非直线前进运动）即达到精子失活处理要求。

4、失活精子液的保存

取30μL失活精子液，加入25μL的0.2M 三磷酸腺苷（ATP）、5μL 30%甘油溶液，混合后储存于冰块中，供于雌核发育的卵子进行受精备用。

采用常压室温等离子体作为鱼类精子的灭活剂制备可诱导鱼类雌核发育的的失活精子液，可有效地对同源或异源雌性亲鱼的卵,诱导雌核发育进行“受精”，其受精率达到40-67%，孵化率20-45%。

具体实施方式

实施例1

1、催产排精

选择体质健壮、无病无伤、达性成熟年龄的雄性鲤鱼，首先将雄性鲤鱼用15 mg /L 的高锰酸钾水溶液进行1.2小时的鱼体浸泡消毒，之后采用二次注射法进行催产排精，第一次用2μg促黄体素释放激素类似物（LHＲH－A2）预备针注射雄性亲鱼；16小时后，按照每kg鲤鱼鱼重注射5mg复配催熟剂进行第二次注射。

本实施例使用的复配催熟剂，其配方为每10mg复配催熟剂中含有2mg地欧酮（DOM）、6mg 鲤鱼脑垂体（PG）、800国际单位IU人绒毛膜促性腺激素（HCG）。

2、精子处理液制备：

采集雄性鲤鱼精液，按精液：精子稀释液为1：5的体积比配成精子处理液，备用。

本实施例采用的精子稀释液，其配方为： 2.5g NaCl， 1.6g KCl， 0.15g CaCl₂，0.15g MgSO₂.7H₂O，0.3g NaHCO₃，无菌水定容至500ml。

3、精子失活处理

利用常压室温等离子体的育种机( AＲTP)对精子处理液进行精子失活处理。所述的失活处理，其条件为：上样量为20μL精子处理液，处理输出功率为125 W、气体流速为10 L·min^{－ 1}，辐照距离为2 mm，处理时间为60 s；

在AＲTP处理后的精子处理液中，加入5μL 0.6M 甘露醇、10μL Hank's 液，用玻璃棒蘸取加甘露醇、Hank's 液的失活精子液，滴在载玻片上，加上盖玻片，在显微镜下用暗视野进行观察，此时可观察到精子活力下降，86.3%的精子处于慢速运动状态，即得到鲤鱼失活精子液。

4、鲤鱼失活精子液的保存

取30μL鲤鱼失活精子液，加入25μL的0.2M 三磷酸腺苷（ATP）、5μL 30%甘油溶液，混合后储存于冰块中备用。

采用本实施例技术方案制备的鲤鱼失活精子液，可有效地对雌性鲫鱼卵, 诱导雌核发育进行“受精”，其受精率达到67%，孵化率44.5%，2个月内平均成活率达到82%，4个月内平均成活率达到72%。

实施例2

1、催产排精

选择体质健壮、无病无伤、达性成熟年龄的雄性鲤鱼，首先将雄性鲤鱼用10 mg /L 的高锰酸钾水溶液进行1.5小时的鱼体浸泡消毒，之后采用二次注射法进行催产排精，第一次用2μg促黄体素释放激素类似物（LHＲH－A2）预备针注射雄性鲤鱼；16小时后，按照每kg鱼重注射4mg复配催熟剂进行第二次注射。

2、精子处理液制备：

所述的精子稀释液，其配方为： 4.0g NaCl，1.6g KCl， 0.1g CaCl₂， 0.1gMgSO₂.7H₂O ，0.4gNaHCO₃，无菌水定容至500ml。

3、精子失活处理

利用常压室温等离子体的育种机( AＲTP)对精子处理液进行精子失活处理。所述的失活处理，其条件为：上样量为20μL精子处理液，处理输出功率为125 W、气体流速为10 Lmin^{－ 1}，辐照距离为2 mm，处理时间为30 s；

在AＲTP处理后的精子处理液中，加入5μL 0.6M 甘露醇、10μL Hank's 液，用玻璃棒蘸取加甘露醇、Hank's 液的失活精子液，滴在载玻片上，加上盖玻片，在显微镜下用暗视野进行观察，此时可观察到精子活力下降，80～90%的精子处于慢速运动状态，即得到鲤鱼失活精子液。

4、鲤鱼失活精子液的保存

采用本实施例技术方案制备的鲤鱼失活精子液，可有效地对雌性鲤鱼卵, 诱导雌核发育进行“受精”，其受精率达到61.3%，孵化率42.1%， 2个月内平均成活率达到88%，4个月内平均成活率达到78%。

实施例3

1、催产排精

选择体质健壮、无病无伤、达性成熟年龄的雄性鲫鱼，首先将雄性鲫鱼用20 mg /L 的高锰酸钾水溶液进行1小时的鱼体浸泡消毒，之后采用二次注射法进行催产排精，第一次用2μg促黄体素释放激素类似物（LHＲH－A2）预备针注射雄性鲫鱼；16小时后，按照每kg鲫鱼鱼重注射3mg复配催熟剂进行第二次注射。

2、精子处理液制备：

采集雄性鲫鱼精液，按精液：精子稀释液为1：5的体积比配成精子处理液，备用。

所述的精子稀释液，其配方为： 2.5g NaCl，1.6g KCl， 0.2g CaCl₂， 0.1gMgSO₂.7H₂O， 0.3g NaHCO₃，无菌水定容至500ml。

3、精子失活处理

利用常压室温等离子体的育种机( AＲTP)对精子处理液进行精子失活处理。所述的失活处理，其条件为：上样量为20μL精子处理液，处理输出功率为125 W、气体流速为10 L·min^{－ 1}，辐照距离为2 mm，处理时间为20s；

在AＲTP处理后的精子处理液中，加入5μL 0.6M 甘露醇、10μL Hank's 液，用玻璃棒蘸取加甘露醇、Hank's 液的失活精子液，滴在载玻片上，加上盖玻片，在显微镜下用暗视野进行观察，此时可观察到精子活力下降，80～90%的精子处于慢速运动（非直线前进运动）状态，即得到鲫鱼失活精子液。

4、鲫鱼失活精子液的保存

取30μL失活精子液，加入25μL的0.2M 三磷酸腺苷（ATP）、5μL 30%甘油溶液，混合后储存于冰块中备用。

采用本实施例技术方案制备的鲫鱼失活精子液，可有效地对雌性鲤鱼卵, 诱导雌核发育进行“受精”，其受精率达到53.8%，孵化率33.7%，2个月内平均成活率达到83%，4个月内平均成活率达到79%。

Claims

1.一种可诱导鱼类雌核发育的失活精子液的制备方法,其特征在于：

1）催产排精

选择体质健壮、无病无伤、达性成熟年龄的雄性亲鱼，首先将雄性亲鱼用高锰酸钾水溶液进行鱼体消毒，之后采用二次注射法进行催产排精；

2）精子处理液制备：

采集雄性亲鱼精液，按精液：精子稀释液为1：5的体积比配成精子处理液，备用；

3）精子失活处理

对精子处理液进行精子AＲTP失活处理，之后在精子处理液中加入5μL 0.6M 甘露醇、10μL Hank's 液,即得到失活精子液；

4）失活精子液的保存

取30μL失活精子液，加入25μL的0.2M 三磷酸腺苷（ATP）、5μL 30%甘油溶液，混合后储存于冰块中，供于雌核发育的卵子进行受精备用；

所述的雄性亲鱼是指雄性鲫鱼或雄性鲤鱼。

2.根据权利要求1所述的一种可诱导鱼类雌核发育的失活精子液的制备方法，其特征在于所述的鱼体消毒是将雄性亲鱼用10 ～ 20 mg /L 的高锰酸钾水溶液进行1 ～1.5小时的鱼体浸泡。

3.根据权利要求1所述的一种可诱导鱼类雌核发育的失活精子液的制备方法，其特征在于所述的二次注射法进行催产排精，具体为：第一次用2μg促黄体素释放激素类似物（LHＲH－A2）预备针注射雄性亲鱼；16小时后，按照每kg鱼重注射3～5mg复配催熟剂进行第二次注射。

4.根据权利要求3所述的一种可诱导鱼类雌核发育的失活精子液的制备方法，其特征在于所述的复配催熟剂，其配方为每10mg复配催熟剂中含有2mg地欧酮（DOM）、6mg 鲤鱼脑垂体（PG）、800国际单位IU人绒毛膜促性腺激素（HCG）。

5.根据权利要求1所述的一种可诱导鱼类雌核发育的失活精子液的制备方法，其特征在于所述的精子稀释液，其配方为：NaCl 2.5～4.0g，KCl 1.0～1.6g，CaCl₂ 0.1～0.2g，MgSO₂.7H₂O 0.1～0.2g，NaHCO₃ 0.2～0.4g，无菌水定容至500ml。

6.根据权利要求1所述的一种可诱导鱼类雌核发育的失活精子液的制备方法，其特征在于所述的AＲTP失活处理，其条件为：上样量为20μL精子处理液，处理输出功率为125 W、气体流速为10 L·min^{－ 1}，辐照距离为2 mm，处理时间为20～60s。