CN107750514A - 一种烟草多倍体的快速加倍方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草多倍体的快速加倍方法，由已知发芽率的烟草种子，在发芽前一天，用0.4%的秋水仙素处理种子，处理后的种子经漂洗后直接点在沙子培养基上，筛选矮壮的小苗直接种植在漂浮育苗盘上，长大后进行倍性鉴定。该方法一次可以处理几万粒种子，筛选过程操作简单，无需种子、幼苗消毒处理和建立组织培养体系；一次处理可以得到不同倍性的植株体系，用药剂量较少，操作简单，完全实现了低成本、高通量、快速加倍烟草染色体组的目的。

Description

一种烟草多倍体的快速加倍方法

技术领域

本发明涉及烟草育种技术领域，具体涉及一种烟草多倍体的快速加倍方法。

背景技术

单倍体加倍育种，在不同作物育种中已经得到广泛应用。利用多倍体培育新材料，因部分植物多倍体以其器官巨大、生长快速、无籽、有效成分含量高、对逆境的适应能力强等特性在育种中得到广泛应用。大面积推广的三倍体甜菜、西瓜即为四倍体与二倍体杂交而成，这种方法近来亦被用于三倍体丹参的培育，因此多倍体植株的获得对育种工作显得尤为重要。

目前，烟草新品种选育，除了常规育种外，分子手段的应用，是育种目标定位更加准确，品种选育效率更高。但烟草为异源四倍体物种，染色体组成为2n=4x=SSTT=48，其具明显的二倍化特征。因此，烟草八倍体可能具有与普通二倍体物种的四倍体植株相似的特征，其与四倍体烟草杂交可能会获得大量六倍体烟草。十二倍体的获得，在育种中也用相应的育种价值。染色体组的研究，对进一步做功能基因模块定位也具有重要的意义。

目前染色体加倍的方法较多，如温度、射线、化学物质等，其中秋水仙素处理，是目前常用的单倍体加倍方法。烟草染色体的加倍，主要集中在单倍体的加倍，主要花药的染色体加倍，对体细胞多倍体的加倍研究较少，其主要方法是处理茎尖加倍和处理幼苗加倍。这些加倍方法虽然有效，但操作麻烦，一般都需要组织培养，周期较长，工作量非常大。

发明内容

鉴于现有烟草染色体加倍技术存在的不足，本发明提供一种用药剂量少，操作简单，低成本的烟草多倍体快速加倍方法，具体技术方案如下：

一种烟草多倍体的快速加倍方法，包括以下步骤：

步骤一、烟草种子的预备处理：

将优质的烟草种子点在正常的沙子培养基上，在培养箱内培养，记录每个品种的发芽时间和发芽率，确定种子发芽所需要的时间n天；

步骤二、烟草种子处理：

在5 mL的离心管中，加入0.1 g左右已知发芽时间的种子，加入少量的水使其湿润，在27 ℃培养箱里平放培养n-1天，期间要保持种子湿润，可以喷1-2次水；

步骤三、秋水仙素处理：

在步骤二培养n-1天（即将发芽的前一天）的种子中，加入2 mL0.4%的秋水仙素，直接在离心管内处理24小时，此时胚处于快速生长期，有利于染色体加倍，而胚根还没有伸出种皮，在反复冲洗和移栽周转过程中对种子的伤害最小，有利于种子成活；处理后用蒸馏水冲洗3次，并浸泡2次，每次2 h，清除种子体内残留的秋水仙素；

步骤四、清洗后的种子，点在沙子培养基的培养皿中，利于种子生根，每个培养皿里点100粒，有利于统计发芽率，在28 ℃培养箱内培养5天，子叶完全打开；

步骤五、调查每一个培养皿中种子的发芽率，并选取矮壮的变异植株，种植在装有基质的漂盘中培养；

步骤六、当幼苗长到5-7片叶子时，取心叶片用流式细胞仪进行倍性鉴定，确认为加倍成功的8倍体和12倍体的植株，移栽到盆子中，即可获得加倍成功的8倍体和12倍体植株。

本发明提供的烟草多倍体的加倍方法，与现有技术相比具有以下有益效果：

1. 本发明提供的烟草多倍体的加倍方法与处理幼芽、在培养基中生长相比：由于烟草种子非常小，处理幼芽每一步骤操作都非常困难，用镊子或其它工具转移，都会接触到幼芽，导致人为地死亡率较高或幼芽畸形，而本发明提供的烟草多倍体的加倍方法直接利用种子诱导加倍，可以在离心管中直接完成秋水仙素对烟草种子倍性的诱导，比出芽后诱导芽减少了冲洗、转移到培养基等步骤，与处理幼芽相比，处理浓度增加，温度提高，时间缩短，更有利于染色体的加倍；把初步筛选到的粗壮的苗直接移栽的漂浮育苗的盘上，与其他的把幼苗再消毒接到培养基上相比，操作简单，成活率高，这是因为幼苗在消毒处理的过程中，工具的夹取会对幼苗有较大的伤害，消毒液对幼苗也有不同的伤害，另外，组配体系费工费时，对成活率也有一定的影响。

2. 本发明提供的烟草多倍体的加倍方法与秋水仙素处理茎尖相比：秋水仙素处理茎尖，其处理方法是在植株茎尖直接用秋水仙素处理，处理后取发生形态变化的叶片灭菌，诱导增殖培养，再取不定芽用生根培养基中生根后做倍性鉴定；茎尖处理，一次只能处理一株，茎尖处理后，还需要二次灭菌和组织培养，灭菌消毒对已经加倍的材料伤害较大，甚至致死，组织培养也需要30-40天，费工费时，操作麻烦，历时较长；而本发明的方法是直接处理种子，一批可以处理上万粒，其处理效率非常高，不需消毒和组织培养，对加倍植株伤害小，省时省力。

3. 本发明提供的烟草多倍体的加倍方法用药剂量较少，操作简单，完全实现了低成本，高通量、快速加倍烟草染色体组的目的，更适宜于烟草育种研究中大批量种质材料的染色体加倍和种质创新，以加速染色体组研究、抗性遗传特性研究、抗病品种的育种与推广应用。

附图说明

图1为对照4倍体植株流式细胞仪检测结果图。

图2为8倍体植株流式细胞仪检测结果图。

图3为12倍体植株流式细胞仪检测结果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例及附图进行详细描述。

实施例1

一种烟草多倍体的快速加倍方法，包括以下步骤：

步骤一、烟草种子的预备处理：

将质量较好的豫烟7号烟草种子点在正常的沙子培养基上，在培养箱内培养，记录该品种发芽时间和发芽率；确定该品种的种子发芽所需要的时间5天；

步骤二、烟草种子处理：

取5 mL的离心管2个，分别加入0.1 g左右豫烟7号的种子，加入少量的水使其湿润，在27 ℃培养箱里培养4天，期间喷1次水，保持种子湿润；

步骤三、秋水仙素处理：

将已经培养4天豫烟7号种子的离心管，1个直接在离心管中加入2 mL0.4%的秋水仙素，27 ℃培养箱中处理24小时，处理后用蒸馏水冲洗3次，并浸泡2次，每次2 h，另1个不处理作为对照，27 ℃培养箱中处理24小时；

步骤四、清洗后的种子，点在以沙做培养基的培养皿中，有利于种子生根，每个培养皿里点100粒，共10个培养皿，有利于统计发芽率，没有处理的种子也点3个培养皿作为对照，在27 ℃培养箱内培养5天，子叶完全打开，没有处理的种子发芽率为98%，处理过的种子发芽率为55.4%；

步骤五、在处理过的培养皿中，选取矮壮的变异植株，移入装有基质的漂盘中培养，共选取植株200株，在基质中能正常生长的有42株，比例为21%，其它变黄，无新根生成；

步骤六、当正常生长的幼苗长到5-7片叶子时，取心叶片用流式细胞仪进行倍性鉴定，以对照4倍体植株作为标尺，确定四倍体的峰值出现在200道的位置（图1所示），在检测条件不变的情况下，成功加倍的8倍体的峰值在400道出现（图2所示），12倍体的峰值在600道出现（图3所示），未加倍的峰值在200道，确认为加倍成功的8倍体的有8株，加倍成功率为19%，加倍为12倍体的有2株，加倍成功率为14.8%，移栽到盆子中，即可获得加倍成功的8倍体和12倍体植株。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种烟草多倍体的快速加倍方法，其特征在于，由已知发芽率的烟草种子，在发芽前一天，用0.4%的秋水仙素处理种子，处理后的种子经漂洗后直接点在沙子培养基上，筛选矮壮的小苗直接种植在漂浮育苗盘上，长大后进行倍性鉴定。

2.一种烟草多倍体的快速加倍方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、烟草种子的预备处理：

将优质的烟草种子点在正常的沙子培养基上，在培养箱内培养，记录每个品种的发芽时间和发芽率，确定种子发芽所需要的时间n天；

步骤二、烟草种子处理：

在5 mL的离心管中，加入0.1 g左右已知发芽时间的种子，加入少量的水使其湿润，在27 ℃培养箱里平放培养n-1天，期间要保持种子湿润，可以喷1-2次水；

步骤三、秋水仙素处理：

在步骤二培养n-1天（即将发芽的前一天）的种子中，加入2 mL0.4%的秋水仙素，直接在离心管内处理24小时，处理后用蒸馏水冲洗3次，并浸泡2次，每次2 h，清除种子体内残留的秋水仙素；

步骤四、清洗后的种子，点在沙子培养基的培养皿中，利于种子生根，每个培养皿里点100粒，有利于统计发芽率，在28 ℃培养箱内培养5天，子叶完全打开；

步骤五、调查每一个培养皿中种子的发芽率，并选取矮壮的变异植株，种植在装有基质的漂盘中培养；

步骤六、当幼苗长到5-7片叶子时，取心叶片用流式细胞仪进行倍性鉴定，确认为加倍成功的8倍体和12倍体的植株，移栽到盆子中，即可获得加倍成功的8倍体和12倍体植株。