CN107748093B - 一种适用于酶联免疫法检测土壤中重金属离子的前处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于酶联免疫法检测土壤中重金属离子的前处理方法。本发明是用稀酸浸提土壤，去除不溶性物质，得到溶液I；用氨水调节溶液I的pH值，得到溶液II；根据土壤质量等级对溶液II进行如下处理：当土壤按土壤环境质量标准划分，是三级土壤时，在溶液III中加入EDTA二钠进行螯合，得到能用胶体金试纸检测的溶液；当土壤按土壤环境质量标准划分，是二级以下土壤时，在溶液II中加入吸附剂进行吸附，固液分离，在固体中加入EDTA二钠溶液进行解吸附，得到能用胶体金试纸检测的溶液。本发明能全方位对各种土壤进行前处理，并结合胶体金试纸进行检测，可在2h内完成对土壤样品中重金属离子(如镉离子)的测定，大大缩短了检测时间，而且无需大型仪器与专业实验人员，操作过程简单，是一种高效、快速、简便的重金属检测方法。
Description
技术领域
本发明属于土壤重金属检测领域，特别涉及一种适用于酶联免疫法检测土壤中重金属离 子的前处理方法。
背景技术
土壤是人类赖以生存的物质条件，是人类宝贵的自然资源。近年来，随着我国城镇化、 工业化进程的加快，加之化肥、农药的大量生产与使用，我国土壤污染愈发严重，尤其是重 金属污染。这对环境生态和人们生命安全构成潜在的威胁。
对土壤进行修复的前提是了解土壤重金属污染的状况。传统的重金属检测方法大都具有 准确度高、灵敏度高、选择性好等优点，但也存在很多缺点：如大多方法都需要大型仪器， 价格昂贵，分析成本高，部分样品需要进行复杂的前处理过程，分析时间长等，无法进行重 金属的连续监测及现场测定。近年来，随着重金属污染问题日益突出，传统的重金属检测方 法已经难以满足人们的要求，简便、快速、高效并适于现场操作的重金属检测方法成为人们 研究的热点。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种适用于酶联免疫法检测土 壤中重金属离子的前处理方法。
本发明的另一目的在于提供所述前处理方法的应用。
本发明的再一目的在于提供一种检测土壤中重金属离子的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种适用于酶联免疫法检测土壤中重金属离子的 前处理方法，包括如下步骤：
(1)用稀酸浸提土壤，接着去除不溶性物质，得到溶液I；
(2)用氨水调节溶液I的pH值，得到溶液II；
(3)对溶液II进行方式①或方式②的处理：
①当土壤按土壤环境质量标准划分，是三级土壤时，在溶液III中加入EDTA二钠进行螯 合，得到能用胶体金试纸检测的溶液；
②当土壤按土壤环境质量标准划分，是二级以下土壤时，在溶液II中加入吸附剂进行吸 附；接着固液分离，在固体中加入EDTA二钠溶液进行解吸附，得到能用胶体金试纸检测的 溶液。
所述的重金属离子优选为镉离子、铅离子和铜离子中的至少一种。
步骤(1)中所述的土壤优选为能过100目筛的土壤。
步骤(1)中所述的稀酸指的是浓度小于6mol/L的酸溶液；优选浓度为0.5～4mol/L的 酸溶液；更优选为2～4mol/L的酸溶液。
所述的稀酸为盐酸溶液、硫酸溶液和硝酸溶液中的至少一种；优选为盐酸溶液、硫酸溶 液和硝酸溶液中的两种溶液形成的混合酸溶液；更优选为硫酸溶液或硝酸溶液中的一种和盐 酸溶液形成的混合酸溶液。
步骤(1)中所述的用稀酸浸提土壤的具体操作优选如下：每0.2000±0.0005g土壤配比 4mL稀酸溶液，振荡30s，浸提；其中：
1)当所述的重金属离子为镉离子时，稀酸溶液为2～4M盐酸和2～4M硫酸按体积比1:3 得到的稀酸溶液，浸提的条件为：于40～60℃下反应20min；
2)当所述的重金属离子为铅离子时，稀酸溶液为4M盐酸和4M硝酸按体积比1:1得到 的稀酸溶液，浸提的条件为：于60～80℃下反应50～60min；
3)当所述的重金属离子为铜离子时，稀酸溶液为4M盐酸和4M硫酸按体积比1:3得到 的稀酸溶液，浸提的条件为：于80℃下反应60min。
步骤(1)中所述的去除不溶性物质的方式优选为离心。
所述的离心的条件优选为于8000rpm离心10～20min。
步骤(1)中所述的溶液I的体积优选为每0.2000±0.0005g土壤用稀酸溶液浸提后，用 水定容至10mL。
步骤(2)中所述的氨水为浓氨水，即浓度为22～25％的氨水。
步骤(2)中所述的pH值为8～10；优选为8.5～9.5。
步骤(3)①中所述的EDTA二钠的用量优选为按EDTA二钠加入溶液II后的终浓度为0.1～0.4M；优选为0.1～0.2M。
步骤(3)②中所述的吸附剂优选为多聚磷酸铝或二氧化钛。
所述的多聚磷酸铝优选为三聚磷酸铝。
所述的二氧化钛优选为平均粒径是5-10nm的二氧化钛。
所述的吸附剂为多聚磷酸铝时，所述的吸附剂的用量优选为每50mL溶液II配比0.5g多 聚磷酸铝。
所述的吸附剂为二氧化钛时，所述的吸附剂的用量优选为每50mL溶液II配比50mg二 氧化钛。
步骤(3)②中所述的吸附的方式为振荡吸附。
所述的振荡吸附的条件优选为振荡5～10min，静置20min。
步骤(3)②中所述的固液分离的方式优选为离心。
所述的离心的条件优选为于4000rpm离心8min
步骤(3)②中所述的解吸附的方式优选为振荡解吸附。
所述的振荡解吸附的条件优选为振荡至少15min；优选为15min。
步骤(3)②中所述的EDTA二钠溶液的浓度优选为0.01～0.4M；更优选为0.1～0.4M； 最优选为0.1～0.3M。
所述的吸附剂为多聚磷酸铝时，步骤(3)②中所述的EDTA二钠溶液的浓度优选为0.3M。
所述的吸附剂为二氧化钛时，步骤(3)②中所述的EDTA二钠溶液的浓度优选为0.1M。
所述的适用于酶联免疫法检测土壤中重金属离子的前处理方法与胶体金试纸联用，检测 土壤中重金属离子。
所述的检测为定性或定量检测。
一种检测土壤中重金属离子的方法，包括如下步骤：将通过上述适用于酶联免疫法检测 土壤中重金属离子的前处理方法得到的能用胶体金试纸检测的溶液上样到胶体金试纸，根据 胶体金试纸的结果，得知土壤中是否含有重金属或是重金属的含量。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过优化稀酸浸提土壤的条件，能用稀酸较好地将土壤中的重金属(铅、镉、 铜)提取出来，克服了现有技术反应时间长、温度高、酸溶液浓度较大等局限。
(2)对于污染较严重的土壤，通过稀酸浸提后得到的溶液，用浓氨水调节pH值、加EDTA 二钠络合后即可直接用胶体金试剂条检测，克服了现有技术用酸提取土壤后由于pH太低， 不能用胶体金试纸条检测的不足。
(3)本发明通过使用浓氨水调节pH值，而不用强碱，避免了胶体金试纸的假阴性结果。
(4)本发明首次使用多聚磷酸铵和二氧化钛在稀酸浸提土壤重金属离子溶液进行吸附和 解吸附，有效对土壤重金属离子进行富集，增加了不同污染程度土壤的处理方式。
综上所述，本发明能全方位对各种土壤进行前处理，并结合胶体金试纸进行检测，可在2h内完成对土壤样品中重金属离子(如镉离子)的测定，大大缩短了检测时间，而且无需大 型仪器与专业实验人员，操作过程简单，是一种高效、快速、简便的重金属检测方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、土壤样品的采集与制备
2015年6月，在暨南大学生科院附近进行土壤采样。土壤采样方法和程序参考《土壤环 境监测技术规范》(HJ/T 166-2004)中的原则和方法进行。采样部位均为0-20cm的表层土壤， 利用蛇形采样法进行，将10个取样点的土壤混合为一个土壤样品，除去土样中的石子和动植 物残体，利用四分法取1kg左右土壤于聚四氟乙烯密封袋中。将土壤样品于90℃的鼓风干燥箱 中烘干，利用四分法取0.25kg左右的土壤，用玛瑙棒碾碎，过2mm尼龙筛，混匀，继续研磨， 过0.154mm(100目)检验筛，于阴凉干燥处保存备用。
2、标准土壤和现场采集土壤样品理化性质的测定
本文所使用的标准土壤Gss-7来自国家标准物质中心，现场样品采自暨南大学生科院附近 地表，分别对两者的pH、有机质含量、阳离子交换量以及镉、铅、铜等离子全量等基本参数 进行测定，具体参数由广州分析测试中心测定。
标准土壤与现场采样土壤的基本参数见表1。从表中可知：两者的pH整体在7以下，且 标准土壤的pH、有机质含量低于现场采样土壤，阳离子交换量高于现场采样土壤；现场采样 土壤中的镉离子含量超过了我国《土壤环境质量标准》(GB 15618-1995)中的一级标准0.20 mg·kg-1，铅离子含量低于《土壤环境质量标准》中的一级标准35mg·kg-1，而铜离子含量超 过了《土壤环境质量标准》中的二级标准100mg·kg-1。
表1土壤的基本参数表
3、浸提土壤样品
(1)试验过程
1)稀酸浓度对土壤中重金属提取率的影响
分别称取0.2000±0.0005g标准土壤或现场土壤于50mL离心管中，依次加入0.5、1、2、 3、4M的硝酸溶液、盐酸溶液、硫酸溶液或是混合酸溶液4mL，振荡30s，常温下反应20min， 然后于8000rpm转速下离心10min，取上清液，用超纯水定容至10mL，每组设三个平行和一 组空白对照。用石墨炉原子吸收仪检测其中镉、铅离子的含量，用ICP(原子发射光谱分析) 检测其中铜离子的含量，利用公式①计算提取率：
2)反应时间对稀酸浸提土壤中重金属的影响
称取0.2000±0.0005g标准土壤或现场土壤于50mL离心管中，加入稀酸溶液4mL，振荡 30s，分别在常温下反应10、20、30、40、50、60min，然后于8000rpm转速下离心10min，取上清液，用二次水定容至10mL，每组设三个平行和一组空白对照。用石墨炉原子吸收仪检测其中镉、铅离子的含量，用ICP检测其中铜离子的含量，利用公式①计算提取率。
3)反应温度对稀酸浸提土壤中重金属的影响
称取0.2000±0.0005g标准土壤或现场土壤于50mL离心管中，加入稀酸溶液4mL，振荡 30s，分别于20、40、60、80℃下反应20min，然后于8000rpm转速下离心10min，取上清液， 用二次水定容至10mL，每组设三个平行和一组空白对照。用石墨炉原子吸收仪检测其中镉、 铅离子的含量，用ICP检测其中铜离子的含量，利用公式①计算提取率。
4)最佳浸提条件下提取率的验证
利用最佳的稀酸浸提条件，按步骤1)对土壤样品进行处理，每组设6个平行，得出最 佳浸提条件下的提取率。
(2)试验结果
1)稀酸浓度对土壤中重金属提取率的影响：
①标准土壤中，不管是使用一种酸提取，还是用混合酸提取，镉、铅、铜离子的提取率 随稀酸浓度的升高而升高，增加趋势随浓度增加而逐渐减小；或是超过一定浓度时，提取率 稍有下降，如，对镉的提取，3M硝酸和4M硝酸的提取率略低于2M硝酸，但提取率还是在90％。
同浓度下，三种稀酸对镉离子的提取率的大小顺序为稀硝酸＞稀硫酸＞稀盐酸，2M的 硝酸溶液对镉离子的提取率高达92％，远高于2M的盐酸(58％)和硫酸溶液(70％)；同浓 度下，三种稀酸对铅离子提取率的大小顺序为稀盐酸＞稀硝酸＞稀硫酸，4M的盐酸溶液对 铅离子的提取率高达60％，高于4M的硝酸(57％)和硫酸(8％)；三种稀酸对铜离子的提取率都不高，4M的硝酸、盐酸、硫酸的提取率分别为9％、11％、9％。
3M的盐酸、硝酸按浓度比1:1混合的稀酸溶液对镉离子的提取率明显高于其他组，达 60％；4M的盐酸、硝酸按浓度比1:1混合的稀酸溶液对铅离子的提取率高达60％，显著高于同浓度下的其他两组混合稀酸；铜离子的提取率依然很低，最高仅为10％。盐酸、硫酸混合稀酸对镉离子的提取率都比较高，2M的盐酸、硫酸按浓度比1:3混合的稀酸溶液的提取率最高，达97％；3M的盐酸、硫酸按浓度比3:1混合的稀酸溶液对铅离子的提取率最高， 达30％；铜离子的提取率依然很低，仅11％。硫酸、硝酸混合稀酸的对镉离子的提取率随酸 浓度的变化不大，0.5M的硫酸、硝酸按浓度比1:1混合的稀酸溶液的提取率可达63％，4M的 硫酸、硝酸按浓度比1:1混合的稀酸溶液的提取率最高，达71％；硫酸、硝酸混合稀酸的对 铅离子的提取率不如其他组稀酸的高，且当浓度大于2M以后随浓度增加呈下降趋势，2M的 硫酸、硝酸按浓度比1:3混合的稀酸溶液的提取率最高，接近20％；重金属铜离子的提取率 依然不高，在10％左右。
上述结果进行总结，如表2所示：
表2标准土壤中提取率较高的两组稀酸溶液
表中盐硫表示盐酸和硫酸，盐硝表示盐酸和硝酸，下同
②现场采样土壤中，不管是使用一种酸提取，还是用混合酸提取，镉、铅、铜离子的提 取率随稀酸浓度的升高而升高，增加趋势随浓度增加而逐渐减小；或是超过一定浓度时，提 取率稍有下降。
4M的硝酸、盐酸、硫酸对镉离子的提取率分别为67％、48％、69％，4M的硝酸、盐酸、硫酸对铅离子的提取率分别为45％、33％、12％，4M的硝酸、盐酸、硫酸对铜离子的提取率分别为7.3％、10.95％、10.43％。
4M盐酸、4M硝酸按体积比3:1混合的稀酸溶液对镉离子的提取率最高，显著高于同浓 度下的另外两组混合稀酸，接近60％；4M盐酸、4M硝酸按体积比1:1混合的稀酸溶液对铅离子的提取率最高，显著高于同浓度下的另外两组混合稀酸，达50％；4M盐酸、4M硝酸按 体积比1:1得到的混合稀酸对铜离子的提取率都不高，均低于8％，三者没有显著性差异。4M盐酸、4M硫酸按体积比1:3混合的稀酸溶液对镉离子的提取率显著高于同浓度下的其他稀酸溶液，达95％，相对而言，盐酸、硫酸按不同体积比例混合的稀酸溶液对铅、铜的提取率都不高，均低于20％。3M硫酸、3M硝酸按体积比3:1混合的稀酸溶液对镉的提取率显著高 于同浓度下其他混合稀酸，达68％；相对而言，重金属铅、铜的提取率都不高，均在20％以 下。
上述结果进行总结，如表3所示：
表3采样土壤中提取率较高的两组稀酸溶液
2)反应时间对稀酸浸提土壤中重金属的影响
采用结果1)中的表2和表3的提取率较高的酸溶液在常温(20℃)下反应分别进行浸 提，结果如下：
①标准土壤中，随反应时间延长，三种重金属离子的提取率逐渐升高。就镉离子而言， 20min后，2M的盐酸、硫酸按浓度比1:3混合的稀酸溶液对镉离子的提取率未有显著提高； 30min后，2M的硝酸溶液对镉离子的提取率未有显著提高，分别选择20、30min为两者的最佳反应时间。针对铅离子而言，4M的盐酸溶液对铅离子的提取率在40min后基本不发生改变，达65％，4M盐酸、硝酸按浓度比1:1混合的稀酸溶液对铅离子的提取率随反应时间 延长一直增加，60min时达70％，分别选择40、60min为两者最佳的反应时间。针对铜离子 而言，4M盐酸、硝酸按浓度比1:3混合的稀酸溶液对铜离子的提取率随反应时间的增加而 逐渐变大，但变化趋势很小，反应时间为60min时提取率仅为15.2％；4M的盐酸溶液对铜 离子的提取率随反应时间增加而变大，变化趋势也很小，反应时间为60min时提取率仅为14.1％。
②采样土壤中，随反应时间的延长，三种重金属镉、铅、铜的提取率逐渐升高，但增长 幅度逐渐变小。就镉离子而言，20min时4M盐酸、硫酸按浓度比1:3混合的稀酸溶液对镉的提取率最高，且随反应时间延长不再发生显著性变化；40min时4M盐酸、硫酸按浓度比 1:1混合的稀酸溶液对镉的提取率最高，且随反应时间延长不再发生显著性变化，分别选择20、40min为两者的最佳浸提时间。针对铅离子而言，60min时4M的硝酸溶液对铅离子的 提取率最高，达61％，50min时4M盐酸、硝酸按浓度比1:1混合的稀酸溶液对铅离子的提 取率可达61％，而且随时间延长不再显著增大，分别选择60min、50min为两者的最佳浸提 时间。针对铜离子而言，其提取率随反应时间的延长增加幅度不明显，60min时4M盐酸、 硫酸按浓度比1:3、1:1混合的稀酸溶液对铜的提取率均低于20％。
3)反应温度对稀酸浸提土壤中重金属的影响
采用结果1)中的表2和表3的提取率较高的酸溶液分别进行浸提20min，结果如下：
①标准土壤中，随着反应温度的升高，重金属镉、铅、铜的提取率逐渐升高。60℃时， 2M硝酸与2M盐酸、2M硫酸按体积比1:3混合的稀酸溶液对镉离子的提取率较高，将近100％，不再随反应温度的增加发生显著变化，选择60℃为稀酸浸提镉离子的最佳温度；铅离 子提取率随温度的变化幅度不大，80℃时，4M盐酸与4M盐酸、4M硝酸按体积比1:1混 合的稀酸溶液对铅的提取率最高，分别为67％与72％，选择80℃为稀酸浸提铅离子的最佳温度；铜离子的提取率随温度升高而迅速增加，80℃时，4M盐酸、4M硫酸按体积比1:3混合 的稀酸溶液与4M盐酸对铜离子的提取率最高，分别为46％与41％，选择80℃为稀酸浸提铜 离子的最佳温度。
②采样土壤中，随反应温度的升高，重金属的提取率逐渐升高。就镉离子而言，4M盐 酸、4M硫酸按体积比1:3混合的稀酸溶液对镉的提取率在40℃后就不再发生显著变化；60℃ 后4M盐酸、硫酸按浓度比1:1混合的稀酸溶液对镉的提取率未发生显著变化，分别选择 40℃、60℃为两者的最佳浸提温度。针对铅离子而言，4M硝酸与4M盐酸、4M硝酸按体 积比1:1混合的稀酸溶液对铅的提取率随温度的增加一直增加，选择80℃为两者的最佳浸提温度。针对铜离子而言，其提取率随反应温度的增加趋势很明显，选择80℃为4M盐酸、4M 硫酸按体积比1:3、1:1混合的稀酸溶液的最佳浸提温度。
4)最佳浸提条件下提取率的验证，结果如表4所示：
①对于标准土壤：
1mL 2M盐酸和3mL 2M硫酸混合得到的稀酸溶液，振荡30s，于60℃下浸提土壤20min， 重金属镉的提取率都在95％以上，RSD＜4％，重现性良好，可以代替国标法。
2mL 4M盐酸和2mL 4M硝酸混合得到的稀酸溶液，振荡30s，于80℃下浸提土壤60min， 重金属铅的提取率都在70％以上，RSD＜4％，重现性良好，可以代替国标法。
1mL 4M盐酸和3mL 4M硫酸混合得到的稀酸溶液，振荡30s，于80℃下浸提土壤60min， 重金属铜的提取率较低，在50％左右，RSD＜5％，重现性良好。
②对于采样土壤：
1mL 4M盐酸和3mL 4M硫酸混合得到的稀酸溶液，振荡30s，于40℃下反应20min，重金属镉的提取率都在95％以上，RSD＜4％，重现性良好，可以代替国标法。
2mL 4M盐酸和2mL 4M硝酸混合得到的稀酸溶液，振荡30s，于60℃下反应50min，重金属铅的提取率都在70％以上，RSD＜4％，重现性良好，可以代替国标法。
1mL 4M盐酸和3mL 4M硫酸混合得到的稀酸溶液，振荡30s，于80℃下反应60min，重金属铜的提取率较低，在50％左右，RSD＜5％，重现性良好。
表4最佳浸提条件下的土壤样品重金属提取率
4、稀酸浸提的加标回收实验
(1)土壤样品的微波消解条件如表5所示，具体步骤如下：
1)称取0.2000±0.0005g的土壤样品三份于样品杯中，在通风橱中分别加入2mLHNO3、 2mL HF、1mL HCl，轻轻摇匀，保证样品全部浸泡在酸液中，并做空白对照。
2)将六联体微波消解罐安装好，放入微波消解仪中，按表5设定升压程序并启动。
3)消解结束后，取出六联体消解罐于通风橱中自然冷却，然后于150℃条件下进行赶酸， 当溶液剩余黄豆粒大小(约1mL)时停止赶酸。自然冷却后，将酸液转移至25mL的容量瓶 中，超纯水定容至25mL，用石墨炉原子吸收仪检测其中镉、铅离子的含量，用ICP检测其中铜离子的含量。
表5土壤样品的微波消解方法
| 步骤 | P(MPa) | T(min) | W(w) |
| 1 | 0.3 | 3 | 400 |
| 2 | 0.8 | 3 | 600 |
| 3 | 1.3 | 3 | 600 |
| 4 | 1.8 | 20 | 600 |
(2)选择最佳的稀酸浸提条件，对样品进行加标回收实验，验证稀酸浸提法的可行性， 公式如下：
采用加标回收的方式验证稀酸浸提法的可行性。由表6可知，国标法处理标准土壤Gss-7 中重金属镉、铅、铜的加标回收率为97-104％，稀酸浸提法的加标回收率为92％-102％；国 标法处理采样土壤中重金属镉、铅、铜的加标回收率为95-99％，稀酸浸提法的加标回收率为 92％-98％。整体看来，稀酸浸提法的回收率略低于国标法，但都在90％以上，尤其是重金属 镉的回收率，和国标法相当，结果可靠，但国标法使用的浓酸溶液对空白值影响较大而且需 要借助大型仪器完成操作，相比而言稀酸浸提法简单易行、操作简便，可以代替国标法。
表6稀酸浸提法与国标法的加标回收率
实施例2三聚磷酸铝对重金属离子的吸附与洗脱
1、三聚磷酸铝的预处理
三聚磷酸铝在使用前用5M的硝酸浸泡30min，然后于4000rpm下离心10min，去掉上清， 用二次水进行洗涤，直至将上清液洗至中性，对沉淀物进行抽滤，然后于100℃下烘干，研 磨过筛后于避光干燥处保存备用。
2、三聚磷酸铝对重金属离子的吸附与洗脱
1)试验步骤
(A)pH对三聚磷酸铝吸附率的影响
在50mL的具塞比色管中加入2mL 1μg·mL-1的镉离子标准溶液，然后加入40mL稀酸浸 提模拟液(即取4M的盐酸100mL、4M的硫酸300mL，用超纯水定容至1L)，充分混匀 后用浓氨水(25％)和稀盐酸(2M)调节至所需酸度(pH分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5，每个pH设3个平行和一个空白)，超纯水定容至 50mL，加入0.5g三聚磷酸铝，振荡10min，静置20min后于4000rpm下离心8min，移取上 清液(A)，沉积物用二次水充分洗涤后，加入1mL洗脱剂(0.1M EDTA·2Na溶液)，振荡 15min，静置20min后于4000rpm下离心8min，移取上清液(B)，用ICP-AES测定(A)与 (B)中镉离子的含量，分别按公式③和公式④计算吸附率和/或回收率。重金属铅、铜分别 参照此方法进行。
(B)加入三聚磷酸铝后的振荡时间对三聚磷酸铝吸附率的影响
试验方法基本同步骤(A)，区别仅在于：分别调节铅离子、镉离子、铜离子溶液的pH为8.5、9.5、9.5，分别振荡1、5、10、15、20min，每组设3个平行和一个空白。
(C)吸附剂质量对三聚磷酸铝吸附率的影响
试验方法基本同步骤(A)，区别仅在于：分别调节铅离子、镉离子、铜离子溶液的pH为8.5、9.5、9.5，分别加入0.125、0.25、0.5、0.75、1.0g的三聚磷酸铝，每组设3个平行和 一个空白。
(D)洗脱剂浓度的选择
试验方法基本同步骤(A)，区别仅在于：分别调节铅离子、镉离子、铜离子溶液的pH为8.5、9.5、9.5，分别加入1mL浓度分别为0.01、0.1、0.2、0.3、0.4M的EDTA·2Na溶液， 每组设3个平行和一个空白。
(E)加入洗脱剂后的振荡时间对洗脱效果的影响
试验方法基本同步骤(A)，区别仅在于：分别调节铅离子、镉离子、铜离子溶液的pH为8.5、9.5、9.5，加入1mL浓度为0.3M的EDTA·2Na溶液，分别振荡1、5、10、15、20min， 每组设3个平行和一个空白。
(F)不同的洗脱方式对洗脱效果的影响
试验方法基本同步骤(A)，区别仅在于：调节铅离子溶液的pH为8.5，加入1mL用浓氨水调节pH＝10.5的二次蒸馏水为洗脱剂，分别用振荡器和超声破碎仪对三聚磷酸铝中的铅 离子进行洗脱，考察两者对三聚磷酸铝中铅离子的洗脱效率。取1mL调节pH后的洗脱液于 三聚磷酸铝沉淀中，在普通振荡器上分别振荡10、20、30、40、50min，然后于4000rpm下离心8min，取上清。取1mL调节pH后的洗脱液于三聚磷酸铝沉淀中，用超声破碎仪提取 其中的铅离子，选择脉冲、暂停模式，提取时间分别设置为10、20、30、40、50min，间隔 时间为2s，输出功率为250W，放大振幅为40％，超声提取后于4000rpm下离心8min，取 上清。
上清用ICP-AES分别测定其中铅离子的含量，利用公式④计算铅离子的回收率。
2)试验结果
(A)pH对三聚磷酸铝吸附率的影响
试验结果表明，当pH＜8.5时，三聚磷酸铝对镉离子的吸附率随pH增加基本不发生变 化(在3％以下)，当pH＝9.5时，其吸附率迅速增大到82％，且随着pH值的增加，吸附率保持稳定；当pH＜6.5时，重金属铜的吸附率随pH增加的增长幅度也不大(在8％以下)， 当pH＞7.5时，其吸附率迅速增加(至30％)，同样当pH＝9.5时增加到最大，达73％；三 聚磷酸铝对铅离子的吸附率随pH的增加呈先增加后降低再增加又降低的趋势，在pH＝3.0和 8.5时出现两个极点，吸附率分别为69.65％和99.36％，pH＝8.5为重金属铅吸附的最佳pH。
(B)振荡时间对三聚磷酸铝吸附率的影响
试验结果表明，三者的吸附率随振荡时间的增加而增加然后趋于稳定，1-5min内增加趋 势最明显，当振荡时间为10min时重金属镉、铅、铜的吸附率达到最大(分别为82％、99％、 70％)，随反应时间的增加不再发生显著变化，选择10min为最佳的振荡时间。
(C)吸附剂质量对三聚磷酸铝吸附率的影响
试验结果表明，随三聚磷酸铝质量增加，镉、铅、铜的吸附率逐渐增大，当质量为0.5g 时，镉、铅、铜的吸附率达到最大，选择0.5g为最佳的吸附剂质量。
(D)洗脱剂浓度的选择
试验结果表明，浓度越大，EDTA对重金属的洗脱能力越强，本实验用EDTA·2Na溶液 对三聚磷酸铝中镉、铅、铜等重金属离子进行洗脱，不同EDTA·2Na浓度下的重金属回收率 见表7。从表中可知，随EDTA浓度增加，重金属离子的回收率逐渐增加，0.3M时镉、铅、 铜等重金属离子基本上可以定量洗脱，选择0.3M为最佳的洗脱剂浓度。
表7不同EDTA·2Na浓度下重金属的回收率(％)
| EDTA·2Na(mol·L<sup>-1</sup>) | 镉 | 铅 | 铜 |
| 0.01 | 35.28 | 38.68 | 43.45 |
| 0.1 | 68.45 | 67.37 | 78.81 |
| 0.2 | 90.73 | 86.49 | 96.36 |
| 0.3 | 97.84 | 98.24 | 97.35 |
| 0.4 | 98.11 | 97.89 | 98.44 |
(E)振荡时间对洗脱效果的影响
试验结果表明，随振荡时间的增加EDTA·2Na溶液对三聚磷酸铝中镉、铅、铜等重金属 离子的洗脱率逐渐增大，当振荡时间为15min时，洗脱效果最好，选择15min为三聚磷酸铝 洗脱时的最佳振荡时间。
(F)不同的洗脱方式对洗脱效果的影响
由表8可知，在相同提取时间下，振荡器振荡的铅离子回收率显著低于超声提取下的铅 离子回收率，当提取时间为30min时，铅离子的超声提取回收率可达51.76％，之后随提取时 间延长，铅离子回收率增加幅度较小。所以可以选择30min为超声提取三聚磷酸铝中铅离子 的最佳时间。
表8不同条件下铅离子的回收率(％)
实施例3二氧化钛对重金属离子的吸附与洗脱
1、二氧化钛的预处理
二氧化钛(锐钛，亲水亲油型，5-10nm，纯度99.8％，广州化学试剂厂)在使用前用5M 的硝酸浸泡30min，然后于4000rpm下离心10min，去掉上清，用二次水进行洗涤，直至将上清液洗至中性，对沉淀物进行抽滤，然后于100℃下烘干，研磨过筛后于避光干燥处保存备用。
2、纳米TiO2对重金属离子的吸附与洗脱
1)试验步骤
(A)pH对纳米TiO2吸附率的影响
在50mL的具塞比色管中加入2mL 1μg·mL-1的镉离子标准溶液，然后加入40mL稀酸浸 提模拟液(即取4M的盐酸100mL、4M的硫酸300mL，用超纯水定容至1L)，充分混匀 后用浓氨水(25％)和稀盐酸(2M)调节至所需酸度(pH分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5，每个pH设3个平行和一个空白)，超纯水定容至 50mL，加入50mg纳米TiO2，振荡10min，静置20min后于4000rpm下离心8min，移取上 清液(A)，沉积物用二次水充分洗涤后，加入1mL洗脱剂(0.1M EDTA·2Na溶液)，振荡 15min，静置20min后于4000rpm下离心8min，移取上清液(B)，用ICP-AES测定(A)与 (B)中镉离子的含量，分别按公式③和公式④计算吸附率和/或回收率。重金属铅、铜分别 参照此方法进行。
(B)加入纳米TiO2后的振荡时间对纳米TiO2吸附率的影响
试验方法基本同步骤(A)，区别仅在于：分别调节铅离子、镉离子、铜离子溶液的pH为8.5，分别振荡1、5、10、15、20min，每组设3个平行。
(C)吸附剂质量对纳米TiO2吸附率的影响
试验方法基本同步骤(A)，区别仅在于：分别调节铅离子、镉离子、铜离子溶液的pH为8.5，分别加入10、25、50、75、100mg的纳米TiO2，每组设3个平行和一个空白。
(D)洗脱剂浓度的选择
试验方法基本同步骤(A)，区别仅在于：分别调节铅离子、镉离子、铜离子溶液的pH为8.5，分别加入1mL浓度分别为0.0001、0.001、0.01、0.1、0.2M的EDTA·2Na溶液，每组 设3个平行和一个空白。
(E)加入洗脱剂后的振荡时间对洗脱效果的影响
试验方法基本同步骤(A)，区别仅在于：分别调节铅离子、镉离子、铜离子溶液的pH为8.5，加入1mL浓度为0.1M的EDTA·2Na溶液，分别振荡1、5、10、15、20min，每组设 3个平行和一个空白。
(F)洗脱剂体积对镉离子洗脱效率的影响
试验方法基本同步骤(A)，区别仅在于：调节镉离子溶液的pH为8.5，固定洗脱剂浓度 为0.1M，分别加入0.5、0.75、1、1.5、2mL的EDTA·2Na溶液于吸附后的纳米TiO2沉淀中，振荡15min，静置20min后离心，每组设3个平行和一个空白。用ICP-AES测定(A)和(B) 中镉离子的含量，计算不同体积下EDTA·2Na对镉离子的回收率。
(G)纳米TiO2对镉离子静态吸附容量的测定
试验方法基本同步骤(A)，区别仅在于：调节镉离子溶液的pH为8.5。
2)试验结果
(A)pH对纳米TiO2吸附率的影响
试验结果表明，纳米TiO2对重金属镉、铅、铜等的吸附率随pH值的增加而增大，当pH 分别为4.0、7.5、8.5时，铅、铜、镉等重金属离子基本上可以被纳米TiO2完全吸附(即接近 100％)，为保证三种重金属离子可以被同时最大吸附，选择最佳的吸附pH为8.5。
(B)振荡时间对纳米TiO2吸附率的影响
试验结果表明，当振荡时间增加到5min时纳米TiO2对重金属离子的吸附率已经达到90％ 以上，10min后不再发生显著变化，基本达到完全吸附，选择10min为吸附时的最佳振荡时 间。
(C)吸附剂质量对纳米TiO2吸附率的影响
试验结果表明，当样品液体积为50mL、纳米TiO2的质量为50mg时，三者的吸附率最高，选择50mg为TiO2吸附的最佳质量。
(D)洗脱剂浓度的选择
试验结果(表9)表明，EDTA·2Na浓度越高，重金属离子的洗脱效果越好，0.1M的EDTA·2Na对三者的洗脱率可达97％以上，0.2M的EDTA·2Na对三者的洗脱率与0.1M时没有显著性差别，选择0.1M为EDTA·2Na的最佳洗脱浓度。
表9不同EDTA·2Na浓度下重金属的回收率(％)
(E)振荡时间对洗脱效果的影响
试验结果表明，随振荡时间的增加，重金属回收率逐渐增加，当振荡时间增加到10min 时重金属回收率已经达到90％以上，15min以后纳米TiO2对三者的回收率未有显著提高，选 择15min为EDTA·2Na洗脱时的最佳振荡时间。
(F)洗脱剂体积对镉离子洗脱效率的影响
试验结果表明，随着体积的增大，EDTA·2Na对镉离子的回收率逐渐增大，当体积为1mL 时，回收率最大，基本上可以完全回收，选择1mL为EDTA·2Na洗脱时的最佳体积。纳米 TiO2对50mL的稀酸浸提模拟液中的镉离子进行吸附，最后可由1mL0.1M的EDTA·2Na溶液定量洗脱，可见纳米TiO2对镉离子的富集倍数高达50倍。
(G)纳米TiO2对镉离子静态吸附容量的测定
静态吸附容量是衡量吸附剂好坏的一个重要因素，在确定的最佳条件下对镉离子进行吸 附，通过原子吸收光谱测得镉离子的静态吸附容量为7.9mg·g-1。
实施例4稀酸浸提—胶体金免疫层析试纸条的验证
1、胶体金免疫层析试纸条检测限的确定
1)试验方法：以0.1mol·L-1的EDTA·2Na溶液为溶剂，将1g·L-1的镉离子标准溶液稀释 到150、300、600、900、1200μg·L-1等浓度：取80μL用镉离子胶体金免疫层析试纸条(深 圳三方圆生物科技有限公司)检测，3-5min内立即读值，观察结果并拍照，每个浓度重复5次， 考察镉离子胶体金免疫层析试纸条的检测限。
2)试验结果：本文定义胶体金免疫层析试纸条的定量下限：肉眼下能明显区别检测线(T) 比控制线(C)颜色浅，此时的浓度为试纸条的定量下限。实验结果表明，随镉离子浓度的 增加，T线的颜色逐渐变浅，150μg·L-1时T线颜色明显比C线颜色浅，600μg·L-1时T线完 全消失，确定胶体金试纸条的定量下限为150μg·L-1。
2、盐度对胶体金免疫层析试纸条的影响
1)试验方法：按步骤1中的方法配制600μg·L-1的镉离子试样溶液，加入氯化钠固体， 配制成下列盐度的试样溶液：5、10、20、30、40、50、60、70‰，用胶体金免疫层析试纸条进行检测，3-5min读值，观察结果并拍照，每个浓度重复5次，对比不同盐度下试纸条显色的变化，考察盐度对镉离子胶体金免疫层析试纸条的影响情况。
2)试验结果：600μg·L-1镉离子浓度下不同盐度对胶体金试纸条的影响如下：当盐度在 0-50‰之间时试纸条的T线没有明显的变化；当盐度高于50‰时，T线颜色发生变化，肉眼 可明显分辨出颜色的不同，此时按照之前方法进行判读则容易造成假阴性，所以检测液的盐 度应控制在50‰以内。
3、镉离子胶体金免疫层析试纸条的特异性
1)试验方法：按步骤1中的方法分别配制50、150、300、600、1200μg·L-1镉、铬、铜、汞、铁、铅、锌、镁、锰、钙等试样溶液，用胶体金层析试纸条进行检测，3-5min读值，观 察结果并拍照，每个浓度重复5次。
2)试验结果：用镉离子胶体金试纸条检测不同的重金属离子，3-5min读值，观察结果 并对比。表10的结果显示，试纸条检测非镉离子各个浓度下的结果都为阴性，无假阳性、假 阴性，说明镉离子胶体金试纸条的特异性良好。
表10不同金属离子对胶体金试纸条的影响
注：“-”阴性，“+”弱阳性，“++”阳性
4、镉离子胶体金免疫层析试纸条与ICP检测的符合率实验
1)试验方法：分别称取0.2000±0.0005g的标准土壤和实际采集的土壤样品于50mL离 心管中，加入1mL浓度为4M的盐酸和3mL浓度为4M的硫酸，振荡30s，常温下反应20min 后于8000rpm下离心10min，取上清液，然后用超纯水定容至10mL，4℃保存备用。按照前 述方法制备得到的稀酸浸提液，用氨水调节pH至9.5或是氨水调节pH至8.5(A)，分别取5、 10、25、50mL的样品液于50mL离心管中，加入50mg二氧化钛，振荡10min，静置20min 后于4000rpm下离心8min，加入1mL0.3M的EDTA·2Na溶液，振荡15min，静置20min 后于4000rpm下离心8min，取上清液(B)，分别用胶体金试纸条和ICP对B液进行检测， 比较两种方法的符合率。
2)试验结果：
使用胶体金试纸条检测土壤中的结果与ICP检测结果符合度良好，假阳性与假阴性率为0。 胶体金试纸条对样品中镉离子的定量下限达150μg·L-1，二氧化钛对镉离子的最高富集倍数为 50倍，所以胶体金试纸条对实际样品中镉离子的检测限可达3μg·L-1，可满足我国《无公害食 品水产品中有毒有害物质限量》中最低限量和《土壤环境质量标准》中一级土壤标准的检测要 求。
表11两种检测方法的符合率对比
注：“-”阴性，“+”弱阳性，“++”阳性
5、按实施例1选择最佳的稀酸浸提条件对标准土壤和采样土壤进行浸提，并按实施例1 表6进行加标。加标前的溶液和加标后得到的溶液分别用浓氨水、强碱溶液(5M氢氧化钠溶 液、5M氢氧化钾溶液)将pH值调节为9.5，接着加入EDTA二钠，使其终浓度为0.2mol/L， 用镉离子胶体金免疫层析试纸条(深圳三方圆生物科技有限公司)检测，结果显示，加标前的 溶液，不论是用浓氨水还是强碱溶液调节pH值，镉离子胶体金免疫层析试纸条检测不到镉离 子；加标后的溶液，用浓氨水调节pH值的溶液，镉离子胶体金免疫层析试纸条能检测到镉离 子；加标后的溶液，用强碱调节pH值的溶液，镉离子胶体金免疫层析试纸条不能检测到镉离 子。
对比例1
1)试验方法：分别称取0.2000±0.0005g的标准土壤和实际采集的土壤样品于50mL离 心管中，加入1mL浓度为4M的盐酸和3mL浓度为4M的硫酸，振荡30s，常温下反应20min 后于8000rpm下离心10min，取上清液，然后用超纯水定容至10mL，4℃保存备用。按照前 述方法制备得到的稀酸浸提液，用强碱溶液(5M氢氧化钠溶液、5M氢氧化钾溶液)调节pH至9.5(A)，分别取5、10、25、50mL的样品液于50mL离心管中，加入0.5g三聚磷酸铝， 振荡10min，静置20min后于4000rpm下离心8min，加入1mL0.3M的EDTA·2Na溶液， 振荡15min，静置20min后于4000rpm下离心8min，取上清液(B)，分别用胶体金试纸条 和ICP对B液进行检测，比较两种方法的符合率。
2)试验结果：
使用胶体金试纸条检测，检测不出。ICP能有效检出，结果和实施例3相同。可见，在用 三聚磷酸铝进行富集时，用强碱调节pH值会干扰到最后胶体金试纸条的检测，而不影响ICP 的检测结果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其 他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等 效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种适用于酶联免疫法检测土壤中重金属离子的前处理方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）用稀酸浸提土壤，接着去除不溶性物质，得到溶液I；
（2）用氨水调节溶液I的pH值，得到溶液II；
（3）对溶液II进行方式①或方式②的处理：
①当土壤按土壤环境质量标准划分，是三级土壤时，在溶液II中加入EDTA二钠进行螯合，得到能用胶体金试纸检测的溶液；
②当土壤按土壤环境质量标准划分，是二级以下土壤时，在溶液II中加入吸附剂进行吸附；接着固液分离，在固体中加入EDTA二钠溶液进行解吸附，得到能用胶体金试纸检测的溶液；
步骤（3）②中所述的吸附剂为三聚磷酸铝；所述的重金属离子为镉离子、铅离子和铜离子中的至少一种；
步骤（1）中所述的用稀酸浸提土壤的具体操作如下：每0.2000±0.0005g土壤配比4mL稀酸溶液，振荡30s，浸提；其中：
1）当所述的重金属离子为镉离子时，稀酸溶液为2～4M盐酸和2～4M硫酸按体积比1:3得到的稀酸溶液，浸提的条件为：于40～60℃下反应20min；
2）当所述的重金属离子为铅离子时，稀酸溶液为4M盐酸和4M硝酸按体积比1: 1得到的稀酸溶液，浸提的条件为：于60～80℃下反应50～60min；
3）当所述的重金属离子为铜离子时，稀酸溶液为4M盐酸和4M硫酸按体积比1:3得到的稀酸溶液，浸提的条件为：于80℃下反应60min；
步骤（1）中所述的溶液I的体积为每0.2000±0.0005g土壤用稀酸溶液浸提后，用水定容至10mL；
步骤（3）①中所述的EDTA二钠的用量为按EDTA二钠加入溶液II后的终浓度为0.1～0.4M；
所述的吸附剂的用量为每50mL溶液II配比0.5g三聚磷酸铝，步骤（3）②中所述的EDTA二钠溶液的浓度为0.3M。
2.根据权利要求1所述的适用于酶联免疫法检测土壤中重金属离子的前处理方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的氨水是浓度为22～25%的氨水；
步骤（2）中所述的pH值为8～10。
3.根据权利要求1所述的适用于酶联免疫法检测土壤中重金属离子的前处理方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的去除不溶性物质的方式为离心；
步骤（3）②中所述的吸附的方式为振荡吸附；
步骤（3）②中所述的固液分离的方式为离心；
步骤（3）②中所述的解吸附的方式为振荡解吸附。
4.根据权利要求3所述的适用于酶联免疫法检测土壤中重金属离子的前处理方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的去除不溶性物质的方式为离心时，离心条件为于8000rpm离心10～20min；
步骤（3）②中所述的固液分离的方式为离心时，离心条件为于4000rpm离心8min；
所述的振荡吸附的条件为振荡5～10min，静置20min；
所述的振荡解吸附的条件为振荡至少15min。
5.权利要求1～4任一项所述的适用于酶联免疫法检测土壤中重金属离子的前处理方法的应用，其特征在于：将所述的前处理方法与胶体金试纸联用，检测土壤中重金属离子。
6.一种检测土壤中重金属离子的方法，其特征在于包括如下步骤：将通过权利要求1～4任一项所述的前处理方法得到的能用胶体金试纸检测的溶液上样到胶体金试纸，根据胶体金试纸的结果，得到土壤中是否含有重金属或者重金属含量的结果。
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