CN107746844A - 一种花生几丁质酶J11‑AhHevamine‑A基因的克隆方法 - Google Patents

一种花生几丁质酶J11‑AhHevamine‑A基因的克隆方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107746844A
CN107746844A CN201711134412.4A CN201711134412A CN107746844A CN 107746844 A CN107746844 A CN 107746844A CN 201711134412 A CN201711134412 A CN 201711134412A CN 107746844 A CN107746844 A CN 107746844A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peanut
ahhevamine
chitinase
genes
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711134412.4A
Other languages
English (en)
Inventor
赵小波
李春娟
王娟
闫彩霞
单世华
张�浩
谢宏峰
石程仁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Peanut Research Institute
Original Assignee
Shandong Peanut Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Peanut Research Institute filed Critical Shandong Peanut Research Institute
Priority to CN201711134412.4A priority Critical patent/CN107746844A/zh
Publication of CN107746844A publication Critical patent/CN107746844A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请提供了一种花生几丁质酶J11‑AhHevamine‑A基因的克隆方法，属于基因克隆技术领域；在RACE扩增基因全长过程中采用新型引物，并采用Clontech的SMART‑RACE试剂盒作为RACE过程中采用的试剂盒，RACE扩增基因全长过程所选用的引物可以很好的与带有抗黄曲霉菌基因的花生种皮cDNA相结合，可以保证从带有抗黄曲霉菌基因的花生种皮中提取的花生几丁质酶基因的长度和完整度，并且可以很好的保持提取到的花生几丁质酶基因的抗霉菌特性，进而将该花生几丁质酶基因用于改良花生基因，可以提高花生的抗霉菌特性，进而提高花生生长的抗逆境能力，增强花生的抗黄曲霉侵染能力，还可以保证几丁质酶在花生基因中的表达活力。

Description

一种花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法
技术领域
本申请实施例涉及基因克隆技术领域，特别涉及一种花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法。
背景技术
花生又名落花生，属于一年生草本植物，由于其含油量高，被人们誉为“植物肉”。花生除了用于食用外，还可用于印染、造纸工业等，是我国重要的油料和经济作物。我国的花生种植面积和生产总量均居世界前列在国际上具有很强的竞争力。但是，我国目前花生的种质资源相对有限，一些抗病抗逆的种质资源相对缺乏，尤其是抗黄曲霉品种更加缺乏。
常规的杂交育种、诱变育种虽然可以对花生的遗传基因进行一定的改良，但是都很难实现有目的性地进行花生遗传基因改良。而转基因育种可以任意选择生产上的当家品种进行外源基因的导入，达到目的性状基因的转移和种质改良的目的。
但是花生产业的进一步发展深受黄曲霉毒素污染的影响。黄曲霉菌易侵染花生等富含油脂的作物，并引起黄曲霉毒素污染(Bampton.1963;Payne and Widstrom, 1992)。黄曲霉毒素污染问题可发生在花生全产业链的各个环节，如生长、收获、晾晒、储藏和加工等过程，并容易进入食物链形成累积效应(Brown et al., 1999)，从而危害食品安全。
在我国，南方产区黄曲霉毒素污染主要发生在生产环节，而北方产区污染主要发生在收获、加工等过程中。近年来欧盟、日本等花生进口大国纷纷提高了花生黄曲霉毒素的检测标准，加之我国花生产区黄曲霉毒素污染问题长期得不到有效解决，花生原料及制品黄曲霉毒素含量超标，已严重影响我国花生的正常出口。
1905年Benecke分离得到了能够利用几丁质作为其营养物的微生物，并将其定名为Baci llus chi tinov irous(溶几丁质芽孢杆菌)，此后人们相继从更多的微生物、植物、动物中分离、纯化了几丁质酶。在高等植物中几丁质酶认为是一种防卫蛋白。很多植物病原真菌细胞壁的主要成分是几丁质，体外抑菌试验证明，几丁质酶能抑制一些病原真菌的孢子萌发和菌丝生长。而植物受到病原菌侵染后会产生一系列主动防御反应，其中就包括几丁质酶的活性增强，因此几丁质酶一直被看作是植物抗真菌病害的潜在物质。 20世纪80年代以来，科学家陆续将细菌和植物几丁质酶基因转移到烟草、番茄、大豆、马铃薯、莴苣、葡萄及甜菜等植物中，获得了表达几丁质酶活性的转基因植物。与非转基因植物相比，转基因植物不仅抗真菌，而且转基因植株对线虫、昆虫和其它一些病原生物也有一定的抗性。
虽然经过了长久的技术发展和技术积累，目前，还没有方法找到可以用于提高花生的抗霉菌特性的几丁质酶，因此，亟待开发一种花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，用于得到完整性较好且可以用于显著提高花生的抗霉菌特性的几丁质酶。
发明内容
本申请实施例提供了一种花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，旨在实现可以用于提高花生抗霉菌特性的几丁质酶基因的克隆，进而提高花生生长的抗逆境能力，增强花生的抗黄曲霉侵染能力，保证几丁质酶在花生基因中的表达活力。
本发明提供了一种花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，所述方法包括：
取2株~5株花生植株在田间栽培环境下培育，在培育过程中，对所述花生植株进行胁迫处理，并在收获前24天分三次对所述花生植株接种黄曲霉菌，其中，所述花生植株为生长2周的三叶期花生幼苗；
获取所述花生植株的花生种子的花生种皮2克~10克，研磨之后提取所述花生种皮的RNA，并采用所述RNA进行cDNA的合成；
采用RACE法进行花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆，并对采用RACE法克隆获得的克隆产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，并对经过琼脂糖凝胶电泳分离后的克隆产物采用UNIQ-10 PCR Purification Kit试剂盒进行纯化，纯化产物连接pGEM-T Easy载体并转化至感受态大肠杆菌，然后在LB培养基中培养预设时间，培养预设时间之后随机挑选预设数量的培养产物进行扩大培养，并对扩大培养的产物进行PCR扩增检测和测序，其中，RACE过程中采用的试剂盒为Clontech的SMART-RACE试剂盒，RACE扩增基因全长过程中所用引物为3-GPS-J11-AhAhHevamine-A：5’-CCAATATAGTAACGGCGACGCG-3’、5-J11-AhAhHevamine-A：5’-CATAAACACCGTGTTGTTGATC-3’。
可选的，所述培养预设时间之后随机挑选预设数量的培养产物进行扩大培养，并对扩大培养的产物进行PCR扩增检测和测序，具体为：
培养预设时间之后随机挑选中10个阳性培养产物，并采用预先设置的菌液进行全长PCR扩增预检测，以判断所述阳性培养产物中是否有插入片段并测序，其中，全长PCR扩增过程中使用的扩增引物为J11-AhHevamine-A-S1：5’-TTATTGTAACCATTATAAATTAC-3’和J11-AhHevamine-A-S2：5’-TTAAAGTAGGTCTACGTGAAACC-3’。
可选的，全长PCR扩增过程所用的聚合酶为TAKARA PCR MIX，全长PCR扩增过程的反应体系包含10μL TAKARA PCR MIX、1μL总 cDNA、0.5μL J11-AhHevamine-A-S1、0.5μLJ11-AhHevamine-A-S2和8μL无菌双蒸水；全长PCR扩增过程的反应条件为：（a）94℃，5 min；（b）94℃，1min；57℃，1 min； 72℃，4 min；三种温度和对应时间长度循环执行30次；（c）72℃，10 min。
可选的，所述在培育过程中，对所述花生植株进行胁迫处理具体为：
在培育过程中，采用NaCl溶液和PEG6000溶液对所述花生植株进行胁迫处理。
可选的，所述花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的开放阅读框为1020bp，所述花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因编码有339个氨基酸序列。
可选的，所述花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的核苷酸序列为序列表中的SEQUENCE1。
可选的，所述花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的核苷酸序列为序列表中的SEQUENCE2。
可选的，所述对所述花生植株接种黄曲霉菌，具体为：
取2株~5株花生植株在田间栽培环境下培育，在所述花生植株收获前24天，在花生垄间设置深度为3cm~4cm的垄沟，且所述垄沟不能触及所述花生植株的根部；
将黄曲霉撒施在所述垄沟内，并在所述黄曲霉的上部覆盖3cm~4cm的土层；
采用喷水壶按照100g~150g/m2在所述土层上均匀喷洒水。
可选的，所述在收获前24天分三次对所述花生植株接种黄曲霉菌，具体为：
在所述花生植株收获前24天，按照8天为一个周期重复接种三次，在接种过程中在花生垄间设置深度为3cm~4cm的垄沟，且所述垄沟不能触及所述花生植株的根部；将黄曲霉撒施在所述垄沟内，并在所述黄曲霉的上部覆盖3cm~4cm的土层；采用喷水壶按照100g~150g/m2在所述土层上均匀喷洒水。
可选的，所述研磨之后提取所述花生种皮的RNA，并采用所述RNA进行cDNA的合成，具体为：
用TAKARA的MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒方法分离提取研磨之后的所述花生种皮的RNA；
将所述花生种皮的RNA去除DNA污染后，用SMART-RACE试剂盒方法进行cDNA 合成，并将所述cDNA 合成产物存储在零下20℃低温冰箱中保存备用，其中，RNA提取和cDNA 合成过程中使用的器皿采用0.1%的DEPC浸泡12小时并采用高温灭菌。
本申请实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
本发明实施例提供的一种花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，采用RACE法进行花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆，对采用RACE法克隆获得的克隆产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，并对经过琼脂糖凝胶电泳分离后的克隆产物采用UNIQ-10 PCRPurification Kit试剂盒进行纯化，纯化产物连接pGEM-T Easy载体并转化至感受态大肠杆菌，然后在LB培养基中培养预设时间，培养预设时间之后随机挑选预设数量的培养产物进行扩大培养，并对扩大培养的产物进行PCR扩增检测和测序，并且RACE扩增基因全长过程中采用3-GPS-J11-AhAhHevamine-A：5’-CCAATATAGTAACGGCGACGCG-3’、5-J11-AhAhHevamine-A：5’-CATAAACACCGTGTTGTTGATC-3’作为所用引物，并采用Clontech的SMART-RACE试剂盒作为RACE过程中采用的试剂盒，RACE扩增基因全长过程所选用的引物可以很好的与带有抗黄曲霉菌基因的花生种皮cDNA相结合，可以保证从带有抗黄曲霉菌基因的花生种皮中提取的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的长度和完整度，并且可以很好的保持提取到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的抗霉菌特性，进而将该花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因用于改良花生基因，可以提高花生的抗霉菌特性，进而提高花生生长的抗逆境能力，增强花生的抗黄曲霉侵染能力，还可以保证几丁质酶在花生基因中的表达活力。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的一种花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法的流程图；
图2是本发明实施例提供的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的体外抑菌试验效果图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施方式作进一步地详细描述。
本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”、“第五”、“第六”、“第七”和“第八”等（如果存在）是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例例如能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。
此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
旨在实现可以用于提高花生抗霉菌特性的几丁质酶基因的克隆，本申请实施例提供了一种花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，该方法包括：取2株~5株花生植株在田间栽培环境下培育，在培育过程中，对花生植株进行胁迫处理，其中，花生植株为生长2周的三叶期花生幼苗；在收获前24天分三次对花生植株接种黄曲霉菌，获取接种黄曲霉菌的植株种皮2克~10克，研磨之后提取花生种皮的RNA，并采用RNA进行cDNA的合成，采用RACE法进行花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆，对采用RACE法克隆获得的克隆产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，并对经过琼脂糖凝胶电泳分离后的克隆产物采用UNIQ-10PCR Purification Kit试剂盒进行纯化，纯化产物连接pGEM-T Easy载体并转化至感受态大肠杆菌，然后在LB培养基中培养预设时间，培养预设时间之后随机挑选预设数量的培养产物进行扩大培养，并对扩大培养的产物进行PCR扩增检测和测序，并且RACE扩增基因全长过程中采用3-GPS-J11-AhAhHevamine-A：5’-CCAATATAGTAACGGCGACGCG-3’、5-J11-AhAhHevamine-A：5’-CATAAACACCGTGTTGTTGATC-3’作为所用引物，并采用Clontech的SMART-RACE试剂盒作为RACE过程中采用的试剂盒，RACE扩增基因全长过程所选用的引物可以很好的与带有抗黄曲霉菌基因的花生种皮cDNA相结合，可以保证从带有抗黄曲霉菌基因的花生种皮中提取的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的长度和完整度，并且可以很好的保持提取到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的抗霉菌特性，进而将该花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因用于改良花生基因，可以提高花生的抗霉菌特性，进而提高花生生长的抗逆境能力，增强花生的抗黄曲霉侵染能力，还可以保证几丁质酶在花生基因中的表达活力。
下面将参考图1~图2所示，对本发明实施例的一种花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法进行详细说明。
参考图1所示，本发明实施例的一种花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法包括：
步骤110：取2株~5株花生植株在田间栽培环境下培育，在培育过程中，对所述花生植株进行胁迫处理，并在收获前24天分三次对所述花生植株接种黄曲霉菌。
选取预先培育的花生植株幼苗2株~5株，在肥沃的田间土地中进行自然环境下的培育，其中，优选的，采用生长2周的三叶期花生幼苗植株进行田间培育。在花生植株收获前24天，在花生垄间设置深度为3cm~4cm的垄沟，且设置的垄沟不能触及花生植株的根部，也即距离花生植株一定距离设置垄沟，在垄沟的设置过程中不能将花生植株的根部裸漏。垄沟设置好之后，将黄曲霉撒施在该垄沟内，并在黄曲霉的上部覆盖3cm~4cm的土层；然后采用喷水壶按照100g~150g/m2在黄曲霉的上部覆盖的土层上均匀喷洒水，以便于营造适合黄曲霉菌生长的潮湿温暖环境，在该过程的执行过程中，需要保持黄曲霉的上部覆盖的土层的温度在15°~30°的范围内，优选的，保持黄曲霉的上部覆盖的土层的温度为25°，黄曲霉的上部覆盖的土层的相对湿度大于50%，在该温度和该湿度下的土层是最适宜黄曲霉菌繁殖的温湿度环境，可以保证黄曲霉菌的快速繁殖。
进一步的，完成上述步骤的第一次黄曲霉菌的接种之后，按照8天为一个周期，再次按照上述步骤进行第二次的黄曲霉菌接种，也即，分别间隔8天之后，按照上述步骤进行第二次和第三次的黄曲霉菌接种。需要说明的是，之所以对花生植株进行黄曲霉菌接种，是为了在花生植株的基因中培育和选择抗黄曲霉菌基因序列。
进一步的，花生植株在田间栽培环境下培育的过程中，采用NaCl溶液和PEG6000溶液对该花生植株进行胁迫处理。也即将该三叶期花生幼苗放置在4℃的低温光照培养箱中进行低温处理，以实现从该三叶期花生幼苗中选择抗低温基因，然后在采用NaCl溶液对该三叶期花生幼苗进行耐盐处理，示例的，可以将该三叶期花生幼苗的根部去除土壤之后放置在250mM NaCl溶液中浸泡一段时间，对于浸泡的时间长度本发明实施例不做限定，可以根据需要进行选择。最后在采用PEG6000溶液对该三叶期花生幼苗进行抗旱处理，示例的，可以将该三叶期花生幼苗的根部去除土壤之后放置在20%PEG6000溶液中浸泡一段时间，对于浸泡的时间大小本发明实施例不做限定，可以根据需要进行选择。
需要说明的是，本发明实施例的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，首先对三叶期花生幼苗进行抗低温抗旱抗盐处理，是为了在花生基因中克隆抗黄曲霉菌基因序列的过程中，还要优选的兼顾花生植株的抗低温抗旱抗盐特性，提高最终培育出的花生植株的生存活力，便于在各种自然条件下进行推广。
步骤120：获取所述花生植株的花生种子的花生种皮2克~10克，研磨之后提取所述花生种皮的RNA，并采用所述RNA进行cDNA的合成。
具体的，在步骤110中培育的花生植株生长成熟之后，选取该花生植株的花生种子的花生种皮2克~10克，采用研砵研磨之后，用TAKARA的MiniBEST Universal RNAExtraction Kit试剂盒方法分离提取研磨之后的该花生种皮的RNA；将提取的该花生种皮的RNA去除DNA污染后，用SMART-RACE试剂盒方法进行cDNA 合成，并将cDNA 合成产物存储在零下20℃低温冰箱中保存备用，其中，RNA提取和cDNA 合成过程中使用的器皿采用0.1%的DEPC浸泡12小时并采用高温灭菌。
需要说明的是，在RNA的提取和cDNA的合成过程中，可以选用的试剂盒有很多种，本申请在经历过大量的试验和失败之后，根据待提取的花生种皮的RNA的特性，付出巨大的努力之后找到了提取效果最好的MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒和合成效果最好的SMART-RACE试剂盒。采用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒和SMART-RACE试剂盒分别进行花生种皮的RNA的提取和cDNA的合成，可以保证最终得到的cDNA 合成产物具有较好的基因完整度和基因长度，有利于提高最终克隆得到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的抗霉菌特性。
其次，需要说明的是，RNA提取和cDNA 合成过程中使用的器皿之所以采用0.1%的DEPC浸泡12小时并采用高温灭菌，是因为发明人在实现本发明的过程中，经过多次的失败之后，付出创造性的劳动发现如果不对RNA提取和cDNA 合成过程中使用的器皿进行上述处理，将会造成提取得到的RNA和合成得到的cDNA产物纯度极地，极大的降低了最终得到的cDNA 合成产物具有较好的基因完整度和基因长度，非常不利于提高最终克隆得到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的抗霉菌特性。
步骤130：采用RACE法进行花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆，并对采用RACE法克隆获得的克隆产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，并对经过琼脂糖凝胶电泳分离后的克隆产物采用UNIQ-10 PCR Purification Kit试剂盒进行纯化，纯化产物连接pGEM-TEasy载体并转化至感受态大肠杆菌，然后在LB培养基中培养预设时间，培养预设时间之后随机挑选预设数量的培养产物进行扩大培养，并对扩大培养的产物进行PCR扩增检测和测序。
具体的，在步骤120中利用提取的花生种皮的RNA进行反转录得到cDNA 合成产物之后，采用RACE法进行花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆，并对采用RACE法克隆获得的克隆产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，并对经过琼脂糖凝胶电泳分离后的克隆产物采用UNIQ-10 PCR Purification Kit试剂盒进行纯化，纯化产物连接pGEM-T Easy载体并转化至感受态大肠杆菌，然后在LB培养基中培养预设时间，培养预设时间之后随机挑选预设数量的培养产物进行扩大培养，并对扩大培养的产物进行PCR扩增检测和测序。其中，在RACE法进行花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆过程中采用的试剂盒为Clontech的SMART-RACE试剂盒，RACE扩增基因全长过程中所用引物为3-GPS-J11-AhAhHevamine-A：5’-CCAATATAGTAACGGCGACGCG-3’、5-J11-AhAhHevamine-A：5’-CATAAACACCGTGTTGTTGATC-3’。
进一步的，在步骤120中利用提取的花生种皮的RNA进行反转录得到cDNA 合成产物之后，采用Clontech的SMART-RACE试剂盒，并使用3-GPS-J11-AhAhHevamine-A：5’-CCAATATAGTAACGGCGACGCG-3’、5-J11-AhAhHevamine-A：5’-CATAAACACCGTGTTGTTGATC-3’作为RACE扩增基因全长过程中的引物，对cDNA 合成产物进行RACE法克隆花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因，其中，在采用RACE法进行花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆过程中，本发明实施例之所以采用Clontech的SMART-RACE试剂盒，并采用3-GPS-J11-AhAhHevamine-A：5’-CCAATATAGTAACGGCGACGCG-3’、5-J11-AhAhHevamine-A：5’-CATAAACACCGTGTTGTTGATC-3’作为RACE扩增基因全长过程中的引物与该试剂盒相配合，是因为发明人在实现本发明的过程中，发现Clontech的SMART-RACE试剂盒与3-GPS-J11-AhAhHevamine-A：5’-CCAATATAGTAACGGCGACGCG-3’、5-J11-AhAhHevamine-A：5’-CATAAACACCGTGTTGTTGATC-3’引物相互配合，才可以克隆得到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的全长序列，经过大量的试验证明，采用其他的试剂盒或者其他的引物，均不能克隆得到花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的全长序列。而且，本发明实施例的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆，所采用的Clontech的SMART-RACE试剂盒与3-GPS-J11-AhAhHevamine-A：5’-CCAATATAGTAACGGCGACGCG-3’、5-J11-AhAhHevamine-A：5’-CATAAACACCGTGTTGTTGATC-3’引物相互配合，也不是经过有限次的试验可以得到的，而是需要结合待克隆得到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的全长序列的特点和花生基因的特性，在结合该试剂盒和引物的特点，付出创造性的劳动才得到的该技术方案，并且该技术方案克隆得到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的全长序列的完整度最好且基因的表达活性最好。
进一步的，对采用RACE法克隆获得的克隆产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，并对经过琼脂糖凝胶电泳分离后的克隆产物采用UNIQ-10 PCR Purification Kit试剂盒进行纯化，纯化产物连接pGEM-T Easy载体并转化至感受态大肠杆菌，然后在LB培养基中培养预设时间，培养预设时间之后随机挑选中10个阳性培养产物，并采用预先设置的菌液进行全长PCR扩增预检测，以判断所述阳性培养产物中是否有插入片段并测序，其中，全长PCR扩增过程中使用的扩增引物为J11-AhHevamine-A-S1：5’-TTATTGTAACCATTATAAATTAC-3’和J11-AhHevamine-A-S2：5’-TTAAAGTAGGTCTACGTGAAACC-3’。
具体的，全长PCR扩增过程所用的聚合酶为TAKARA PCR MIX，全长PCR扩增过程的反应体系包含10μL TAKARA PCR MIX、1μL总 cDNA、0.5μL J11-AhHevamine-A-S1、0.5μLJ11-AhHevamine-A-S2和8μL无菌双蒸水；全长PCR扩增过程的反应条件为：（a）94℃，5 min；（b）94℃，1min；57℃，1 min； 72℃，4 min；三种温度和对应时间长度循环执行30次；（c）72℃，10 min。
需要说明的是，同样为了提高克隆得到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的全长序列的完整度，本发明实施例在全长PCR扩增过程中使用的扩增引物为J11-AhHevamine-A-S1：5’-TTATTGTAACCATTATAAATTAC-3’和J11-AhHevamine-A-S2：5’-TTAAAGTAGGTCTACGTGAAACC-3’，该引物的选择也不是本领域技术人员的有限次试验就可以选定的，同样也是，本申请的发明人结合待克隆得到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的全长序列的特点和花生基因的特性，在结合该全长PCR扩增引物的特点，付出创造性的劳动才得到的。
其次，需要说明的是，全长PCR扩增过程所用的聚合酶设置为TAKARA PCR MIX，并且将全长PCR扩增过程的反应体系设置为包含10μL TAKARA PCR MIX、1μL总 cDNA、0.5μLJ11-AhHevamine-A-S1、0.5μL J11-AhHevamine-A-S2和8μL无菌双蒸水；全长PCR扩增过程的反应条件设置为：（a）94℃，5 min；（b）94℃，1min；57℃，1 min； 72℃，4 min；三种温度和对应时间长度循环执行30次；（c）72℃，10 min，是因为在该反应条件下，该扩增引物的扩增效率最高，如果更改全长PCR扩增过程所用的聚合酶或者更高全长PCR扩增过程的反应体系再或者更改全长PCR扩增过程的反应条件，均会降低该扩增引物的扩增效率，甚至导致全长PCR扩增失败。
进一步的，本发明实施例的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法克隆得到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的开放阅读框为1020bp，并且该花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因编码有339个氨基酸序列。
示例的，本发明实施例的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法克隆得到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的核苷酸序列为序列表中的SEQUENCE1。
示例的，本发明实施例的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法克隆得到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的核苷酸序列为序列表中的SEQUENCE2。
本发明实施例的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法克隆得到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的DNA序列如序列表所示。
本发明实施例的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法克隆得到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的蛋白序列如序列表所示。
参考图2所示，对本发明实施例的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因体外抑菌试验结果进行对比分析，其中，体外抑菌试验采用浓度为3.5 × 107 CFU/mL的黄曲霉菌菌液，同时取0.1 mL菌液涂布于固体察氏培养基中作为对照，如图2中a所示；处理实验同样取0.1 mL菌液涂布于固体察氏培养基，加入无菌滤纸片，在滤纸片上加入60µL 1.0mg/mL的纯化后的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因蛋白，如图2中b所示；将两者放置在28℃的环境中培养5天。培养5天之后的对比结果如图2所示，通过图2所示的体外抑菌实验对比结果，可以明显看出本发明实施例的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因蛋白可抑制黄曲霉菌生长，如图2中b所示，进而将该基因通过转基因手段导入花生中，转基因花生植株可以具有明显的抑制黄曲霉侵染特性，说明本发明实施例克隆得到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因能显著提高花生抗黄曲霉能力。
本发明实施例提供的一种花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，采用RACE法进行花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆，对采用RACE法克隆获得的克隆产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，并对经过琼脂糖凝胶电泳分离后的克隆产物采用UNIQ-10PCR Purification Kit试剂盒进行纯化，纯化产物连接pGEM-T Easy载体并转化至感受态大肠杆菌，然后在LB培养基中培养预设时间，培养预设时间之后随机挑选预设数量的培养产物进行扩大培养，并对扩大培养的产物进行PCR扩增检测和测序，并且RACE扩增基因全长过程中采用3-GPS-J11-AhAhHevamine-A：5’-CCAATATAGTAACGGCGACGCG-3’、5-J11-AhAhHevamine-A：5’-CATAAACACCGTGTTGTTGATC-3’作为所用引物，并采用Clontech的SMART-RACE试剂盒作为RACE过程中采用的试剂盒，RACE扩增基因全长过程所选用的引物可以很好的与带有抗黄曲霉菌基因的花生种皮cDNA相结合，可以保证从带有抗黄曲霉菌基因的花生种皮中提取的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的长度和完整度，并且可以很好的保持提取到的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的抗霉菌特性，进而将该花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因用于改良花生基因，可以提高花生的抗霉菌特性，进而提高花生生长的抗逆境能力，增强花生的抗黄曲霉侵染能力，还可以保证几丁质酶在花生基因中的表达活力。
上述本申请实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分步骤可以通过硬件来完成，也可以通过程序来指令相关的硬件完成，所述的程序可以存储于一种计算机可读存储介质中，上述提到的存储介质可以是只读存储器，磁盘或光盘等。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 山东省花生研究所
<120> 一种花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法
<141> 2017-11-16
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1191
<212> DNA
<213> J11-AhHevamine-A
<400> 1
<210> 2
<211> 339
<212> PRT
<213> 花生(Arachis hypogaea L.J11-AhHevamine-A 编码蛋白)
<400> 2
Met Ala Ser Asn Lys Ser Ser Ser Thr His Gln Pro Leu Thr Leu Leu
1 5 10 15
Leu Phe Phe Leu Leu Thr Leu Ser Ser Ala His Ala Lys Gly Gly Ile
20 25 30
Ala Ile Tyr Trp Gly Gln Asn Asn Gly Asp Gly Asn Leu Thr Ser Thr
35 40 45
Cys Asp Thr Gly Asn Tyr Glu Ile Val Leu Leu Ala Phe Leu Tyr Thr
50 55 60
Phe Gly Cys Gly Arg Thr Pro Asp Trp Asn Phe Ala Gly His Cys Gly
65 70 75 80
Ser Trp Ser Pro Cys Asp Lys Leu Gln Pro Glu Ile Glu His Cys Gln
85 90 95
Arg Asn Gly Val Lys Val Phe Leu Ser Leu Gly Gly Ala Val Gly Pro
100 105 110
Tyr Ser Leu Cys Ser Pro Glu Asp Ala Lys Ser Val Ser Asp Tyr Leu
115 120 125
Tyr Asn Asn Phe Leu Thr Gly Gln Lys Gly Pro Leu Gly Ser Val Tyr
130 135 140
Leu Asp Gly Ile Asp Phe Asp Ile Glu Gly Gly Ser Asn Leu Tyr Trp
145 150 155 160
Asp Asp Leu Ala Arg Glu Leu Asp Thr Arg Arg Lys Gln Asp Arg Tyr
165 170 175
Phe Tyr Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Phe Phe Thr Asp Tyr Tyr Leu
180 185 190
Asp Thr Ala Ile Arg Thr Trp Leu Phe Asp Tyr Leu Phe Val Gln Phe
195 200 205
Tyr Asn Asn Pro Pro Cys Gln Tyr Ser Asn Gly Asp Ala Ser Leu Leu
210 215 220
Leu Ser Ser Trp Asn Thr Trp Thr Ser Tyr Val Lys Ile Asn Asn Thr
225 230 235 240
Val Phe Met Gly Leu Pro Ala Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ser Gly Gly
245 250 255
Tyr Ile Ser Pro Gln Asp Leu Cys Thr Lys Val Leu Pro Thr Ile Lys
260 265 270
His Thr Pro Asn Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Arg Asp
275 280 285
Val Thr Asn His Tyr Ser Asp Gln Ile Lys Asp Cys Val Ile Val Asp
290 295 300
Asp Ser Val Arg Val Ser Gln Thr Val Met Ala Thr Leu Ser Asn Thr
305 310 315 320
Val Ser Gln Cys Val Ser Ala Ala Phe Asn Arg Ile Ile Pro Lys Leu
325 330 335
Arg Pro Phe

Claims (10)

1.一种花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，其特征在于，所述方法包括：
取2株~5株花生植株在田间栽培环境下培育，在培育过程中，对所述花生植株进行胁迫处理，并在收获前24天分三次对所述花生植株接种黄曲霉菌，其中，所述花生植株为生长2周的三叶期花生幼苗；
获取所述花生植株的花生种子的花生种皮2克~10克，研磨之后提取所述花生种皮的RNA，并采用所述RNA进行cDNA的合成；
采用RACE法进行花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆，并对采用RACE法克隆获得的克隆产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，并对经过琼脂糖凝胶电泳分离后的克隆产物采用UNIQ-10 PCR Purification Kit试剂盒进行纯化，纯化产物连接pGEM-T Easy载体并转化至感受态大肠杆菌，然后在LB培养基中培养预设时间，培养预设时间之后随机挑选预设数量的培养产物进行扩大培养，并对扩大培养的产物进行PCR扩增检测和测序，其中，RACE过程中采用的试剂盒为Clontech的SMART-RACE试剂盒，RACE扩增基因全长过程中所用引物为3-GPS-J11-AhAhHevamine-A：5’-CCAATATAGTAACGGCGACGCG-3’、5-J11-AhAhHevamine-A：5’-CATAAACACCGTGTTGTTGATC-3’。
2.根据权利要求1所述的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，其特征在于，所述培养预设时间之后随机挑选预设数量的培养产物进行扩大培养，并对扩大培养的产物进行PCR扩增检测和测序，具体为：
培养预设时间之后随机挑选中10个阳性培养产物，并采用预先设置的菌液进行全长PCR扩增预检测，以判断所述阳性培养产物中是否有插入片段并测序，其中，全长PCR扩增过程中使用的扩增引物为J11-AhHevamine-A-S1：5’-TTATTGTAACCATTATAAATTAC-3’和J11-AhHevamine-A-S2：5’-TTAAAGTAGGTCTACGTGAAACC-3’。
3.根据权利要求2所述的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，其特征在于，全长PCR扩增过程所用的聚合酶为TAKARA PCR MIX，全长PCR扩增过程的反应体系包含10μL TAKARA PCR MIX、1μL总 cDNA、0.5μL J11-AhHevamine-A-S1、0.5μL J11-AhHevamine-A-S2和8μL无菌双蒸水；全长PCR扩增过程的反应条件为：（a）94℃，5 min；（b）94℃，1min；57℃，1 min； 72℃，4 min；三种温度和对应时间长度循环执行30次；（c）72℃，10 min。
4.根据权利要求1所述的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，其特征在于，所述在培育过程中，对所述花生植株进行胁迫处理具体为：
在培育过程中，采用NaCl溶液和PEG6000溶液对所述花生植株进行胁迫处理。
5.根据权利要求1所述的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，其特征在于，所述花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的开放阅读框为1020bp，所述花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因编码有339个氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，其特征在于，所述花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的核苷酸序列为序列表中的SEQUENCE1。
7.根据权利要求5所述的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，其特征在于，所述花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的核苷酸序列为序列表中的SEQUENCE2。
8.根据权利要求1所述的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，其特征在于，所述对所述花生植株接种黄曲霉菌，具体为：
取2株~5株花生植株在田间栽培环境下培育，在所述花生植株收获前24天，在花生垄间设置深度为3cm~4cm的垄沟，且所述垄沟不能触及所述花生植株的根部；
将黄曲霉撒施在所述垄沟内，并在所述黄曲霉的上部覆盖3cm~4cm的土层；
采用喷水壶按照100g~150g/m2在所述土层上均匀喷洒水。
9.根据权利要求8所述的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，其特征在于，所述在收获前24天分三次对所述花生植株接种黄曲霉菌，具体为：
在所述花生植株收获前24天，按照8天为一个周期重复接种三次，在接种过程中在花生垄间设置深度为3cm~4cm的垄沟，且所述垄沟不能触及所述花生植株的根部；将黄曲霉撒施在所述垄沟内，并在所述黄曲霉的上部覆盖3cm~4cm的土层；采用喷水壶按照100g~150g/m2在所述土层上均匀喷洒水。
10.根据权利要求1所述的花生几丁质酶J11-AhHevamine-A基因的克隆方法，其特征在于，所述研磨之后提取所述花生种皮的RNA，并采用所述RNA进行cDNA的合成，具体为：
用TAKARA的MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒方法分离提取研磨之后的所述花生种皮的RNA；
将所述花生种皮的RNA去除DNA污染后，用SMART-RACE试剂盒方法进行cDNA 合成，并将所述cDNA 合成产物存储在零下20℃低温冰箱中保存备用，其中，RNA提取和cDNA 合成过程中使用的器皿采用0.1%的DEPC浸泡12小时并采用高温灭菌。
CN201711134412.4A 2017-11-16 2017-11-16 一种花生几丁质酶J11‑AhHevamine‑A基因的克隆方法 Pending CN107746844A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711134412.4A CN107746844A (zh) 2017-11-16 2017-11-16 一种花生几丁质酶J11‑AhHevamine‑A基因的克隆方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711134412.4A CN107746844A (zh) 2017-11-16 2017-11-16 一种花生几丁质酶J11‑AhHevamine‑A基因的克隆方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107746844A true CN107746844A (zh) 2018-03-02

Family

ID=61251198

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711134412.4A Pending CN107746844A (zh) 2017-11-16 2017-11-16 一种花生几丁质酶J11‑AhHevamine‑A基因的克隆方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107746844A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113684197A (zh) * 2021-09-13 2021-11-23 山东省花生研究所 一种花生几丁质酶及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101768592A (zh) * 2009-07-10 2010-07-07 山东省花生研究所 花生种皮抗黄曲霉基因aw569086及其检测方法
CN105340603A (zh) * 2015-11-09 2016-02-24 山东省花生研究所 一种花生种子的黄曲霉田间侵染的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101768592A (zh) * 2009-07-10 2010-07-07 山东省花生研究所 花生种皮抗黄曲霉基因aw569086及其检测方法
CN105340603A (zh) * 2015-11-09 2016-02-24 山东省花生研究所 一种花生种子的黄曲霉田间侵染的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: ""PREDICTED: Arachis duranensis hevamine-A-like (LOC107467678), mRNA，GenBank：XM_016086834.1，1314bp"", 《NCBI GENBANK》 *
RATAN CHOPRA，ET AL.: ""Comparisons of de novo transcriptome assemblers in diploid and polyploid species using peanut (Arachis spp.) RNA-Seq data"", 《PLOS ONE》 *
曲明静等: "花生网斑病菌和黄曲霉菌对花生几丁质酶诱导的研究 ", 《花生学报》 *
鞠倩等: "与花生黄曲霉抗性相关的几丁质酶基因的克隆与分析 ", 《江西农业学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113684197A (zh) * 2021-09-13 2021-11-23 山东省花生研究所 一种花生几丁质酶及其应用
CN113684197B (zh) * 2021-09-13 2023-09-15 山东省花生研究所 一种花生几丁质酶及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106011167A (zh) 雄性不育基因OsDPW2的应用及水稻育性恢复的方法
CN104313034B (zh) 雄性不育基因OsLAP5的应用及恢复水稻雄性不育的方法
CN105821074A (zh) 水稻温敏雄性不育基因tms10的应用及育性恢复方法
CN107099540A (zh) 影响烟草色素含量的NtFERL基因及其应用
CN105950651A (zh) 雄性不育基因OsGEN的应用及育性恢复的方法
CN106222182B (zh) 编码甘薯ERF转录因子的IbERF5基因及应用
AU2021290228A1 (en) A method for improving the mean dry shoot weight, mean dry grain weight, and suppressing seed-borne infection in a cereal crop
CN110004154A (zh) 茶树CsJAZ1基因的应用
CN110358772A (zh) 提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因及制备方法与应用
CN101643745A (zh) 盐芥v-焦磷酸酶基因启动子序列和其缺失突变体的应用
CN105671058B (zh) 编码甘薯erf转录因子的基因及应用
CN107746844A (zh) 一种花生几丁质酶J11‑AhHevamine‑A基因的克隆方法
CN101845445A (zh) Cre重组酶重组基因及Cre/loxP介导的转基因安全性植物表达载体
CN105028173B (zh) 一种磷高效玉米的杂交育种方法
CN106818476A (zh) 天然三倍体漆树高效快速扩繁方法
CN115896045A (zh) 杜梨E3泛素连接酶基因PbrATL18在植物抗干旱和炭疽病遗传改良中的应用
CN105671055B (zh) 水稻生殖发育基因mmd2的应用及恢复水稻雄性不育的方法
CN103782687A (zh) 一种提高蒺藜苜蓿种子萌发率的处理方法
CN104206269B (zh) 大豆转基因株系混合生根方法
CN109337922A (zh) 激活标签载体与罗布麻种子突变体库的构建方法
CN103255155A (zh) 一种来源于矮沙冬青的磷脂酶Dα1的基因序列及其克隆方法
CN114317560B (zh) 大豆GmPRR1基因在调控大豆主茎节数中的应用
CN115181714B (zh) 一种植物免疫诱抗菌及其构建方法和应用
CN104450749A (zh) 黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体及其应用
CN114164228B (zh) 一种通过基因编辑提高水稻抗病性的方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180302