CN107727732B - 一种用于蛋白相互作用组单分子力谱方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于蛋白相互作用组单分子力谱方法，用于高效测量多种不同生物分子间单分子相互作用。该方法通过磁场对待测生物分子微阵列表面所有磁性物质产生作用力，使磁性物质对连接在其与基底间的生物分子或生物分子对产生作用力；通过磁性物质在微阵列上位置，获得对应的与该磁性物质连接的生物分子或生物分子对种类，再通过检测记录磁性物质空间运动轨迹，来分析获得该生物分子或生物分子对的物理化学参量的表征信息。本发明具有高效、连续、高通量测量等优点。

Description

一种用于蛋白相互作用组单分子力谱方法

技术领域

本发明属于平行大通量生物样品力学性质测量技术领域，具体涉及一种用于蛋白相互作用组单分子力谱方法。

背景技术

蛋白质相互作用网络的研究是系统生物学和蛋白质组学研究中的重要内容之一。如果可以建立它们之间相互作用网络的动力学模型，则可预测细胞在不条件下的状态和行为，从而在分子层次理解生理过程及人类疾病。目前可用于蛋白-蛋白相互作用研究的主要实验手段有：双杂交系统、噬菌体展示、串联亲和纯化/质谱、蛋白质芯片、表面等离子共振、生物膜光干涉技术等。其中大部分方法主要侧重于对目标蛋白的筛选，能够对蛋白间的相互作用做出定性的描述。而蛋白质芯片是基于芯片上固定的蛋白质与待分析样品中目标分子的较强的非共价健结合而实现测量，然后利用芯片上固定的蛋白质的可寻址的特性而对最终的结果进行终点判读。由此可见，虽然通过改变蛋白质浓度可以测量获得相互作用的亲和常数。但是，蛋白质芯片往往只能测量平衡态下蛋白质之间的相互作用。而对于相互作用的动态过程，通常不能或至多只能给出近似的推测。而表面等离子共振及生物膜光干涉技术等技术虽然可用于动力学参数测量，但是其在进行大通量探测时，对一些过程较快及亲和性较低的相互作用很难进行可靠测量。同时，上述方法依赖于大量分子的平均，因此对于分子在探测过程中的重复解离与再结合，以及具有复杂相互作用景观的体系，如含有多个势垒的系统，并不十分有效，从而限制了其对蛋白间相互作用做精确定量描述的能力。

单分子力谱技术是直接测量相互作用动力学参数的最有效手段之一，但单分子力谱实验测量的范围在纳米与皮牛的水平，而在常温下热运动的能量约为4pN·nm。因此，单分子测量结果受热涨落影响较大，随机性是常温下单分子力谱的测量必然特征。由此，为了获得可靠准确的实验结果，单分子力谱实验往往需要进行大量的重复统计；而已有的大部分单分子力谱实验手段只能每一次对一个分子进行测量，从而在研究单分子力学过程，特别是不可逆过程时，耗时耗力，工作量巨大；对于分子间相互作用组学的研究，使用已有的单分子方法很难完成。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种高效、连续且动态测量的用于蛋白相互作用组单分子力谱方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于蛋白相互作用组单分子力谱方法，该方法通过磁场对待测生物分子微阵列表面所有磁性物质产生作用力，使磁性物质对连接于其与基底间的生物分子或生物分子对产生作用力；再通过检测记录磁性物质在微阵列中位置以及其空间运动轨迹，来分析获得该生物分子或生物分子对的种类与物理化学参量的表征信息。

具体包括以下步骤：

S1：将N种待测生物分子固定在基板上制成至少一个待测生物分子微阵列(可通过芯片点样仪制做)，以每种待测生物分子作为一个样品点，并记录各种待测生物分子在待测生物分子微阵列中对应的位置，再将磁性物质分散连接到待测生物分子微阵列表面；其中，N为≥1的整数。

S2：对当前待测生物分子微阵列表面的磁性物质施加磁场，使其产生恒定或可控变化的作用力。所述磁场是通过驱动电磁线圈或永磁体产生磁场，进而对磁性物质产生作用力。

S3：所述磁性物质对与其连接的生物分子或生物分子对产生作用力，该作用力大小已知且可控。通过磁场力控制磁性物质运动轨迹及其连接分子(对)所受作用力(恒定或可控变化的力)，根据控制线圈中电流的大小或永磁体与磁性物质的距离得到不同大小的作用力。

S4：获取所述磁性物质在当前待测生物分子微阵列中位置及其空间运动轨迹。

S5：根据S3获取的所述磁性物质的位置及其空间运动轨迹，来分析获得该生物分子或生物分子对的种类与物理化学参量的表征信息。即：通过磁性物质在微阵列上位置，获得对应的与该磁性物质连接的分子(对)种类，结合分析该磁性物质所受磁场力与其运动轨迹的关系，获得该磁性物质连接分子(对)有关的物理化学参量的表征(如寿命，力谱等)。

进一步，当基板上的待测生物分子微阵列为2个以上时，还包括步骤S6：重复步骤S2-S5以测量同一基底上其他待测生物分子微阵列，直至基板上的待测生物分子微阵列全部测量完成，以实现连续测量。

进一步，在步骤S2中磁场产生的作用力在待测生物分子微阵列产生方向较一致、大小相同的磁场力，其大小不超过0-100皮牛；该磁场对待测生物分子微阵列以外区域产生的磁场力小于0.1皮牛。通过对电磁线圈供电或将永磁体靠近磁性物质，对分子微阵列表面待测区域内磁性物质产生方向较一致、大小基本相同的磁场力，对于距离待测区域一定距离以外分子微阵列表面磁性物质产生大小可忽略作用力。

进一步，所述的磁性物质为磁珠。

更进一步，所述磁性物质直接与生物分子连接。

更进一步，所述磁性物质的表面修饰有生物分子，该生物分子能与待测生物分子微阵中的生物分子相互连接。

更进一步，在一个所述的待测生物分子微阵列中N为≥40，每个样品点上连接至少100个微米级磁性物质。

进一步，在步骤S4中，使用显微系统通过衍射斑或荧光信号来记录磁性物质的形状图像、获得磁性物质运动轨迹，并结合所受磁场力分析获得与所述磁性物质连接的生物分子或生物分子对的物理化学参量的表征信息。

具体而言，通过使用显微成像系统和相机追踪记录磁性物质位置，从而获得分子形变以及相互作用信息；通过使用相机间隔设定时间成像，得到成像区域内多个不同分子在受到特定外力下随时间的形变过程以及两类分子之间的相互作用距离随时间的变化。

更进一步，所述的物理化学参量的表征信息包括生物分子或生物分子对的种类、寿命和力谱。

与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过蛋白质芯片技术，将不同的目标蛋白固定在基底的不同区域，使用带有相同蛋白的磁珠与其作用。然后利用的大通量单分子力谱系统同时测量所有样品区域的相互作用，利用蛋白质芯片的可寻址性将不同分子对间的相互作用区分开来，分类处理，从而同时获得每一种相互作用的可统计的单分子测量结果与动力学常数。为大规模系统研究生物分子对(如：蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-糖等)相互作用组提供新的、精确定量的手段。

附图说明

图1为本发明的步骤流程框图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

图1所示为本发明较佳实施例的适用于蛋白相互作用组单分子力谱方法流程图。本发明提出一种适用于蛋白相互作用组单分子力谱方法，包括下列步骤：

S1：待测分子微阵列制备，如：使用芯片点样仪在玻片表面制作多种不同受体蛋白微阵列；将表面修饰有特定配体蛋白的磁珠分散连接到微阵列表面，微阵列中每个样品点上结合数十至数百个磁珠；将包括磁珠与微阵列样品置于电磁线圈或永磁体附近。

S2：通过电磁线圈或永磁体产生磁场，对磁性物质产生作用力，如：通过直流稳压电源对电磁线圈供电从而产生一个稳定磁场，该磁场对分子微阵列表面待测区域内磁珠产生方向较一致、大小基本相同的磁场力，对于距离待测区域一定距离以外磁珠产生大小可忽略磁场力。

S3：磁场力使磁性物质对与其连接的分子产生一个恒定或可控变化的力，对于待测的每个磁性物质产生的作用力大小已知且可控，如：通过开启控制电磁线圈电流控制磁珠所受磁场力的大小。

S4：系统同时测量多个磁性物质的空间位置变化，记录磁性物质的运动轨迹，如：使用倒置荧光显微镜和相机追踪记录磁珠从受到一定磁场力到离开微阵列表面所间隔时间。

S5：通过磁性物质在微阵列上位置，获得对应的与该磁性物质连接的分子(对)种类，结合分析该磁性物质所受磁场力与其运动轨迹的关系，获得该磁性物质连接分子(对)有关的物理化学参量的表征(如寿命，力谱等)，如通过磁珠在微阵列上位置判断磁珠所连接分子对种类，对磁珠按其所连接分子对种类进行分类与统计计算，获得每一种分子对相互作用在一定外力下的解离时间(寿命)。

步骤S6：对一处分子微阵列测量结束后，可通过移动样品测量同一基底表面另一处的分子微阵列区域，实现对同一基底表面的分子微阵列连续测量，如在一处分子微阵列测量结束后，关闭电磁线圈供电，使磁场力下降至零，使用显微镜电动载物台移动其上的微阵列与磁珠样品至上一次测量时磁珠所受作用力可忽略不计处，开启磁场进行下一次测)。

根据本发明较佳实施例，所述步骤S1为使用芯片点样仪在同一环氧基修饰载玻片表面制备3组相同的生物素修饰的牛血清白蛋白微阵列，每组微阵列之间距离6毫米，每组微阵列内包含3行样品点，每行包含3个样品点，每个样品点直径为150微米，样品点之间距离100微米，第一行每个样品点依次含有5皮克(高密度)、1皮克(中密度)、0.2皮克(低密度)生物素修饰的牛血清白蛋白，第二、第三行样品点与第一行相同。将直径2.8微米，表面修饰有链霉亲和素的超顺磁珠置于芯片表面，室温孵育30分钟，使链霉亲和素与生物素基团充分结合，每个样品点包含数十至数百个磁珠，将整个载玻片置于磁场线圈下方，倒置显微镜载物台上。

所述步骤S2具体为使用直流稳压电源对针对本实验设计加工的磁场线圈进行供电，对线圈正下方生物素修饰牛血清白蛋白微阵列中均匀磁珠产生20皮牛作用力，作用力方向与显微镜物镜光轴平行。同时，所开启磁场对距离6mm以外的另外两个生物素修饰牛血清白蛋白微阵列中的磁珠产生小于0.1皮牛的作用力。

所述步骤S3具体为受到磁场力后，磁珠对连接其上的链霉亲和素与生物素相互作用产生20pN的拉伸作用。

步骤S4具体为使用倒置显微镜20X物镜对电磁线圈下方的整个生物素修饰牛血清白蛋白微阵列中的磁珠进行成像，并使用连接与倒置显微镜上的相机以每秒10帧的速度记录磁珠受到磁场力后30秒内的空间位置。

步骤S5具体为通过磁珠在微阵列上位置确定磁珠连接生物素修饰牛血清白蛋白的密度，按照三种密度对磁珠进行归类，分别计算施加磁场力后三类磁珠在载玻片表面数量随时间的变化曲线，发现连接中密度生物素修饰牛血清白蛋白磁珠的曲线与低密度的一致，通过曲线拟合获得了链霉亲和素与生物素相互作用寿命分别为0.2秒和17秒。

步骤S6具体为对一处微阵列测量结束后，关闭电磁线圈供电，使磁场力下降至零，使用显微镜电动载物台移动6mm，使另一微阵列位于磁场正下方处，开启磁场进行，重复上述测量。

本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (8)

1.一种用于蛋白相互作用组单分子力谱方法，其特征在于，通过磁场对待测生物分子微阵列表面所有磁性物质产生作用力，使磁性物质对连接于其与基底间的生物分子或生物分子对产生作用力；再通过检测记录磁性物质在微阵列中位置以及其空间运动轨迹，来分析获得该生物分子或生物分子对的种类与物理化学参量的表征信息，可同时测量多种不同生物分子间的数十至数百个单分子相互作用；

所述方法包括以下步骤：

S1：将N种待测生物分子固定在基板上制成至少一个待测生物分子微阵列，以每种待测生物分子作为一个样品点，并记录各种待测生物分子在待测生物分子微阵列中对应的位置，再将磁性物质分散连接到待测生物分子微阵列表面；其中，N为≥1的整数；

S2：对当前待测生物分子微阵列表面的磁性物质施加磁场，使其产生恒定或可控变化的作用力；

S3：所述磁性物质对与其连接的生物分子或生物分子对产生作用力，该作用力大小已知且可控；

S4：获取所述磁性物质在当前待测生物分子微阵列中位置及其空间运动轨迹；

S5：根据S3获取的所述磁性物质的位置及其空间运动轨迹，来分析获得该生物分子或生物分子对的物理化学参量的表征信息；

在步骤S2中磁场产生的作用力在待测生物分子微阵列产生方向较一致、大小相同的磁场力，其大小不超过100皮牛；该磁场对待测生物分子微阵列以外区域产生的磁场力小于0.1皮牛。

2.根据权利要求1所述的用于蛋白相互作用组单分子力谱方法，其特征在于，当基板上的待测生物分子微阵列为2个以上时，还包括步骤S6：重复步骤S2-S5以测量同一基底上其他待测生物分子微阵列，直至基板上的待测生物分子微阵列全部测量完成，以实现连续测量。

3.根据权利要求1所述的用于蛋白相互作用组单分子力谱方法，其特征在于，所述的磁性物质为磁珠。

4.根据权利要求3所述的用于蛋白相互作用组单分子力谱方法，其特征在于，所述磁性物质直接与生物分子连接。

5.根据权利要求3所述的用于蛋白相互作用组单分子力谱方法，其特征在于，所述磁性物质的表面修饰有生物分子，该生物分子能与待测生物分子微阵中的生物分子相互连接。

6.根据权利要求3所述的用于蛋白相互作用组单分子力谱方法，其特征在于，在一个所述的待测生物分子微阵列中N≥40，每个样品点上连接至少100个微米级磁性物质。

7.根据权利要求1所述的用于蛋白相互作用组单分子力谱方法，其特征在于，在步骤S4中，使用显微系统通过衍射斑或荧光信号来记录磁性物质的形状图像、获得磁性物质运动轨迹，并结合所受磁场力分析获得与所述磁性物质连接的生物分子或生物分子对的物理化学参量的表征信息。

8.根据权利要求7所述的用于蛋白相互作用组单分子力谱方法，其特征在于，所述的物理化学参量的表征信息包括生物分子或生物分子对的种类、寿命和力谱。

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