CN106987519A - 一种微阵列芯片、使用方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种微阵列芯片、使用方法及用途。在芯片上将具有二级结构的寡核苷酸探针固定在固相支持物上，使用本芯片可以完成包括核酸扩增标记、微阵列芯片杂交、芯片扫描检测等全部过程，整个过程不需要人工操作，极大简化了微阵列芯片操作和设备需求，降低成本。

Description

一种微阵列芯片、使用方法及用途
技术领域
本发明属于生物检测领域，特别涉及微阵列芯片领域，具体涉及一种微阵列芯片、使用方法及用途。
背景技术
微阵列芯片技术是一种通过在固相支持物（例如玻璃基片等）上固定探针阵列，通过杂交来对样品中的多种不同生物分子（例如核酸、蛋白质）进行高通量检测的技术，阵列中的每个探针都有不同的坐标（例如第一行第一列），通过探针坐标实现对大量探针的特异性标识，从而实现对探针杂交对象的特异性标识，实现对样品中大量不同的生物分子进行高通量检测。
目前微阵列芯片技术已经广泛用于基因表达谱检测、基因突变谱检测、蛋白质生物标志物高通量检测以及小分子化合物等高通量检测领域。微阵列芯片技术不仅广泛应用于科研，许多基于微阵列芯片技术的体外诊断产品已经获得了世界各国管理机构的临床应用许可证书，进入临床应用。
现有微阵列芯片技术及其产品主要包含：核酸扩增和标记、微阵列芯片杂交、清洗、扫描，四个主要步骤，每个步骤都需要专门设备，例如用于核酸扩增和标记的PCR仪，用于核酸杂交的芯片杂交仪或水浴锅，用于清洗的芯片洗干仪，用于芯片扫描的微阵列芯片扫描仪。因此，目前现有微阵列芯片技术和产品存在操作繁琐、设计设备较多和成本较高的缺点。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种微阵列芯片、使用方法及用途。该芯片在固相支持物（例如玻璃基片等）上，完成包括核酸扩增标记、微阵列芯片杂交、芯片扫描检测等全部过程，整个过程不需要人工操作，极大简化了微阵列芯片操作和设备需求，降低成本。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。
本发明提供了一种微阵列芯片，在芯片上固定有具有二级结构的寡核苷酸探针301，并形成阵列302。所述具有二级结构的寡核苷酸探针301标记有荧光基团305和荧光淬灭基团308。
为保证具有二级结构的寡核苷酸探针301在未杂交前没有荧光信号，本芯片的寡核苷酸探针需要特别的考虑。如图1所示，本芯片的寡核苷酸探针具有“环+一侧颈”的颈环结构，包括环状杂交区域307和侧颈306，在侧颈306的末端，两条核酸链上分别标记荧光基团305和荧光淬灭基团308，在其中一条核酸链的末端再连接一个“linker”309，linker 309的另一端进行相应的化学修饰310，用于和固相支持物（例如玻璃基片）进行连接。
在没有单链核酸分子与具有二级结构的寡核苷酸探针301的环状杂交区域307的单链杂交时，寡核苷酸探针301的侧颈306的双链结构不会被打开，荧光基团305和荧光淬灭基团308靠近，荧光淬灭基团308将荧光基团305淬灭，二级结构的寡核苷酸探针301不能产生发光信号，故荧光扫描仪扫描结果无荧光信号；当反应体系中有单链核酸分子与具有二级结构的寡核苷酸探针301的环状杂交区域307的单链杂交时，寡核苷酸探针301的侧颈306的双链结构被打开，同时颈部3ˊ端寡核苷酸序列与扩增产生的单链核酸分子结合，使得荧光淬灭基团308远离荧光基团305，荧光淬灭基团308无法将荧光基团305淬灭，二级结构的寡核苷酸探针301产生发光信号，故荧光扫描仪扫描结果有荧光信号。
本发明提供了一种微阵列芯片，在芯片上进行核酸的恒温扩增反应303，产生单链核酸扩增产物304。单链核酸扩增产物304会和所述的微阵列芯片上固定的具有二级结构的寡核苷酸探针301发生杂交，杂交后探针中的荧光基团305和荧光淬灭基团308空间远离，探针发射荧光305。
本发明提供的一种微阵列芯片，在检测全过程不需要清洗，可以直接进行荧光扫描检测。因为在芯片上探针发生杂交之前，探针没有荧光信号，芯片上的核酸恒温扩增体系也没有荧光背景。只有芯片上的核酸恒温扩增体系扩增出了目的核酸片段，并成功和芯片上的探针发生杂交，才在探针所在位置产生荧光信号，芯片其他位置没有荧光信号，芯片反应液也没有荧光背景，所以芯片不需要清洗，可以直接进行荧光扫描检测。
在本发明的一些实施例中，所述荧光基团305和荧光淬灭基团308，分别是FAM和BHQ。
在本发明的一些实施例中，所述“linker”309，为一段无关寡核苷酸序列，如polyT。
本发明提供了一种微阵列芯片，所述芯片固相支持物透光，可以直接进行荧光检测。
本发明还提供了上述微阵列芯片的使用方法，在所述微阵列芯片上，加入待检测样品和核酸恒温扩增反应液，恒温加热一定时间进行恒温扩增反应，然后将芯片置于微阵列芯片扫描仪中进行荧光扫描，如图2所示。
微阵列芯片上进行所述核酸的恒温扩增反应可以是基于NASBA恒温扩增技术的恒温扩增反应，产生的核酸序列为单链RNA序列，与寡聚单链DNA核酸分子的结合能力更强，能够更有效的与具有二级结构的寡核苷酸探针301的环状杂交区域307的单链杂交，将寡核苷酸探针301的侧颈306的双链结构打开。
在本发明的一些实施例中，所述核酸的恒温扩增反应303，是一种基于T7 RNA聚合酶的核酸扩增反应，或者链置换扩增反应等。
本发明还提供了上述微阵列芯片在生物检测和医疗检测中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述生物检测和医疗检测为病原微生物检测、基因突变检测等。
本发明提供的微阵列芯片，将传统微阵列芯片需要的核酸扩增标记、芯片杂交、芯片清洗、芯片扫描等多个环节整合在一起，避免的复杂操作和多种设备，并可以应用于微阵列芯片的常见领域，例如细菌鉴定、基因突变检测等。
附图说明
图1为微阵列芯片排布和探针结构示意图。
图2为微阵列芯片使用方法示意图。
图3为实施例1的微阵列芯片扫描结果。
图4为实施例2的微阵列芯片扫描结果。
具体实施方式
本发明公开了一种微阵列芯片、使用方法及用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。
本发明提供的微阵列芯片上固定了具有二级结构的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针在未杂交状态不产生荧光信号；本发明提供的微阵列芯片上进行核酸的恒温扩增反应，所述核酸恒温扩增反应能够产生单链核酸产物，并和上述寡核苷酸探针杂交，导致寡核苷酸探针产生荧光信号；本发明提供的微阵列芯片不需要清洗，可以直接进行荧光检测。
实施例1、用于病原微生物检测
1、寡核苷酸探针
针对3种细菌16s rRNA保守序列设计的探针和通用引物序列如表1所示。
表1 针对3种细菌16s rRNA保守序列设计的探针和通用引物
2、核酸恒温扩增引物和扩增体系
反应体系配方：40mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM dNTP , 10mM NTP，15%DMSO，5 uM T7-27F，5 uM 1492R，5ul 模板，65℃水浴5min，41℃水浴5min后迅速加入5ul酶混合物（40U T7 RNA聚合酶，8U AMV反转录酶，0.2U 核糖核酸酶H，2.6ug BSA），120 mMKCl。41℃水浴2小时。
3、芯片使用方法和结果
使用博奥晶芯LuxScan 10K微阵列芯片扫描仪完成扫描，并根据扫描结果按照如下方法确定待测DNA样品中是否含有表1中涉及的3种细菌：用于检测某细菌的探针在芯片上的固定位置处如果检测到荧光信号，则判定对应的待测DNA样品中含有对应的细菌；否则则不含有对应的细菌。
4、芯片扫描结果如图3所示。
实施例2、用于基因突变检测
1、寡核苷酸探针
针对3个基因突变设计的引物序列如表2所示。
表2 针对3个基因突变设计的引物
2、核酸恒温扩增引物和扩增体系
反应体系配方：40mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM dNTP , 10mM NTP，15%DMSO，5 uM T7-K15-F1，5 uM T7-K16-F1，5 uM T7-K24-F1，5 uM R12-R1，5 uM R8-R1，5ul模板，65℃水浴5min，41℃水浴5min后迅速加入5ul 酶混合物（40U T7 RNA聚合酶，8U AMV反转录酶，0.2U 核糖核酸酶H，2.6ug BSA），120 mM KCl。41℃水浴2小时。
3、芯片使用方法和结果
使用博奥晶芯LuxScan 10K微阵列芯片扫描仪完成扫描，并根据扫描结果按照如下方法确定待测DNA样品中是否含有表2中涉及的3种突变：用于检测某突变的探针在芯片上的固定位置处如果检测到荧光信号，则判定对应的待测DNA样品中含有对应的碱基突变；否则则不含有对应的碱基突变。
4、芯片扫描结果如图4所示。

Claims (7)

1.一种微阵列芯片，其特征在于，芯片上阵列固定具有二级结构的寡核苷酸探针（301），所述寡核苷酸探针（301）标记有荧光基团（305）和荧光淬灭基团（308）；在未发生杂交时，所述荧光基团（305）和所述荧光淬灭基团（308）空间接近，不发射荧光。
2.根据权利要求1所述的微阵列芯片，所述寡核苷酸探针（301）具有“环+一侧颈”的颈环结构，包括环状杂交区域（307）和侧颈（306），在所述侧颈（306）末端的两条核酸链上分别标记所述荧光基团（305）和所述荧光淬灭基团（308），在其中一条核酸链的末端上再连接一个linker（309），linker（309）的另一端经化学修饰（310）与固相支持物连接。
3.根据权利要求2所述的微阵列芯片，所述荧光基团和所述荧光淬灭基团分别是FAM和BHQ。
4.根据权利要求2或3所述的微阵列芯片，所述固相支持物透光。
5.权利要求1至4任一项所述微阵列芯片的使用方法，其特征在于，在所述微阵列芯片上加入待检测样品和核酸恒温扩增反应液进行恒温扩增反应，然后将微阵列芯片置于微阵列芯片扫描仪中进行荧光扫描。
6.根据权利要求5所述的微阵列芯片的使用方法，所述恒温扩增反应是基于NASBA恒温扩增技术的。
7.权利要求1至4任一项所述微阵列芯片在生物检测或医疗检测中的应用。
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