CN107727704B - 一种利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电化学生物传感领域，具体是指一种基于微生物表面可控共展示顺序酶，构建顺序酶电化学传感器检测糖的方法。将葡萄糖氧化酶(GOx)单展示于酵母菌株表面，或将糖化酶(GA)和GOx按比例共展示于酵母菌株表面；再将表面单展示或共展示的酵母菌株分别修饰到经处理的电极获得电化学传葡萄糖感器或电化学淀粉传感器，分别实现对样液中葡糖糖或淀粉的定量检测。本发明获得的传感器，为单酶传感器难以进行的组分检测提供了一条有效途径，可望广泛应用于生物质原料预处理、生物能源、食品发酵、医药、化工等工业生物过程的优化与控制及临床检验等领域。
Description
技术领域
本发明属于电化学生物传感领域，具体是指一种基于微生物表面可控共展示顺序酶，构建顺序酶电化学传感器检测糖的方法。
背景技术
电化学生物传感器自上世纪60年代酶电极问世以来，其技术研究和应用获得了巨大的发展。固定化酶电化学生物传感器具有特异性强、稳定性好、准确度高、响应速度快、测定成本低、结果准确的优点，可实现对复杂样品(浊度、颜色等)中特定生化组分的快速测定。顺序酶传感器(sequential enzyme biosensor)指通过多种相关酶顺序、协调的完成一系列催化反应，并结合换能器完成单酶传感器难以实现的检测的装置。顺序酶传感器的制备一般是通过化学交联法、包埋法等将几种酶同时固定在电极上，由于不同酶与交联分子的亲和性不一样，导致固定之后各种酶之间的比例难以控制，检测结果的准确度易受影响。并且多种酶之间的空间位置和取向难以控制，固定之后酶的活性中心的分布呈现无序状态，影响总反应的速率。近几年，通过改善酶的固定方式，发展了多种双酶传感器，并一定程度上提高了传感器的稳定性。但是过度的化学交联会部分损失酶的活性，降低检测的灵敏度。通过分子水平操控，可以有效的保留酶固定时的活性和控制酶的空间位置，然而目前的研究仅用在单个酶分子上，对顺序酶传感器的改善效果微乎其微。
多种酶随机共展示体系，相对于传统的将商品化的酶通过化学交联固定在电极上，避免了过度的化学交联，使酶的稳定性得到改善，保证功能酶之间有效的比率和在空间上有效的取向及距离，使传感器的性能得到了一定的改善。但是酶随机共展示体存在明显的不足，如融合蛋白的构建复杂，酶表达效率低，顺序酶融合蛋白固定在电极时仍然使用化学交联剂，如此所构建的传感器的灵敏度低，检测限较高。因此，发展一种更为简易的、多种酶比例可控的顺序酶共展示全细胞，是解决顺序酶电化学传感器瓶颈问题的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用细胞表面可控展示顺序酶构建的顺序酶传感器检测糖的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，将葡萄糖氧化酶(GOx)单展示于酵母菌株表面，或将糖化酶(GA)和GOx 按比例共展示于酵母菌株表面；再将表面单展示或共展示的酵母菌株分别修饰到经处理的电极获得电化学传葡萄糖感器或电化学淀粉传感器，分别实现对样液中葡糖糖或淀粉的定量检测。
采用所述酵母细胞单展示或共展示顺序酶修饰的电极为工作电极,以饱和甘汞电极(SCE)为参比电极、铂丝为对电极，以柠檬酸盐缓冲溶液作为电解液，三电极连接至电化学工作站，在施加电位–0.4V vs SCE下，利用i–t法测定传感器对淀粉标准溶液的电流。
所述电化学淀粉传感器中共展示酶分别来源于扣囊复膜酵母的糖化酶(GA)编码基因和黑曲霉的葡萄糖氧化酶(GOx)编码基因与具有不同特异性的dockerin结构域DocC和DocT编码基因进行融合。
较佳的，所述可控的顺序酶共展示系统，其特征在于，利用毕赤酵母分别分泌表达融合蛋白GA-DocC和GOx-DocT。
较佳的，所述可控的顺序酶共展示系统，利用a凝集素锚定蛋白将具有不同特异性的支架蛋白cohesin结构域CohC和CohT按照可控的比例共展示在酿酒酵母细胞的表面。
酵母表面单展示GOx的制备参见(Hongwei Wang,Qiaolin Lang,Liang Li,BoLiang,Xiangjiang Tang,Lingrang Kong,Marco Mascin,and Aihua Liu,Yeast surfacedisplaying glucose oxidase as whole-cell biocatalyst:Construction,characterization and its electrochemical glucose sensing application,Analytical Chemistry 2013,85,6107–6112.)
利用a凝集素锚定蛋白将所述展示酶可控展示于酿酒酵母细胞的表面，GA和GOx摩尔比例为1:1、2:1或3:1。优选，所述GA和GOx摩尔比例为2:1。
将酵母表面按比例共展示GA和GOx(yeast–GA&GOx)的菌株分别修饰在经还原氧化石墨烯(RGO)滴涂的玻碳电极(GCE)上,所得传感器表示为yeast–GA&GOx(n:1)/RGO/GCE，其中n为1、2或3。
另一方面，利用所述顺序酶共展示系统构建了电化学传感器，所述电化学传感器具有高灵敏度、极好的重现性，并实现了对实际样品中淀粉、葡萄糖含量的精确检测。
所述经处理的电极为：
1)将玻碳电极用氧化铝粉末打磨，然后将电极分别在超纯水，乙醇中超声清洗，放在氮气下吹干，备用；
2)将2mg还原氧化石墨烯(RGO)加入1mL的聚丙烯酸水溶液(1mg/mL) 中，超声分散均匀，将配好的悬浮液离心分离收集沉淀并清洗,然后重新超声分散均匀备用；
3)将上述获得分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，得表示为 RGO/GCE的电极；然后滴涂yeast–GA&GOx菌株，获得 yeast–GA&GOx(n:1)/RGO/GCE传感器。
优选的，步骤如下：
步骤一，将玻碳电极依次用粒径为1.0-,0.2-,0.05-μm的氧化铝粉末打磨至镜面，然后将电极分别在超纯水，乙醇中超声清洗1min，放在氮气下吹干备用。称取一定质量的还原氧化石墨烯(RGO)和聚丙烯酸 (PAA)，加入水中配成2mg/ml的悬浮液，超声分散30min，使分散均匀。将配好的悬浮液离心分离收集沉淀并清洗，洗去过多的PAA,然后重新超声分散均匀备用。取5μL RGO分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，制备的电极表示为RGO/GCE。
步骤二，取10μL yeast–GA&GOx(n:1,n＝1,2,3,下同)滴涂到步骤一所得RGO/GCE表面，置于4度冰箱过夜晾干，修饰好的电极表示为 yeast–GA&GOx(n:1)/RGO/GCE。
步骤二中电极使用之前，滴涂5μL 0.05％wt的全氟磺酸树脂膜 (Nafion)到电极表面。
采用本发明传感器进一步的描述为：
步骤一)，构建支架蛋白的酵母表面展示系统：利用a凝集素锚定蛋白将具有不同特异性的cohesin结构域CohC和CohT展示在酵母细胞的表面。克隆来源于C.cellulolyticumH10和C.thermocellum ATCC27405的Coh-Doc蛋白，基因片段分别为cohc/docc和coht/doct。编码Coh的基因与a凝集素的C端融合，得到质粒pYD1-cohC-cohT，pYD1-cohC-cohT-cohC和pYD1-cohC-cohC-cohT-cohC，这些重组质粒转化SaccharomycescerevisiaeEBY100，在不含有色氨酸的SD平板上挑选转化子，利用半乳糖诱导表达融合蛋白。收集细胞，用缓冲液进行洗涤。利用Coh C端的His标签来标记蛋白，通过荧光显微镜观察，支架蛋白Coh正确地展示在细胞的表面。阴性对照是未展示支架蛋白的细胞，与之相比，含有质粒pYD1-cohC-cohT，pYD1-cohC-cohT-cohC和 pYD1-cohC-cohC-cohT-cohC的细胞均有明显的荧光，这说明支架蛋白成功地展示在了酵母细胞的表面。得到三株酵母，展示由cohesin结构域组成的支架蛋白，CohC和CohT的比列分别是1:1、2:1和3:1；
步骤二)，酵母表达dockerin结构域融合的GA和GOx：将编码GA的基因与docc基因进行融合，同时将编码GOx的基因与doct基因融合，分别插入毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA的多克隆位点中，得到质粒 pPICZαA-ga-docC和pPICZαA-gox-docT。转化Pichiapastoris X-33，在YPDS平板上挑选转化子，利用甲醇进行融合蛋白的诱导表达。收集上清液，进行SDS-PAGE蛋白变性电泳的分析；
步骤三)，酶活的测定：对上清液进行了酶活测定，GA酶活测定的条件是在含有0.1％淀粉的HAc-NaAc缓冲液(50mM，pH 5.0)中，60度下反应15分钟，利用葡萄糖检测试剂盒测定生成的葡萄糖的含量，活力单位U定义为每分钟催化产生1μmol葡萄糖所需的酶量。GOx酶活测定的条件是在磷酸钾缓冲液中(100mM，pH 7.4)加入终浓度为10mM的葡萄糖、0.17mM的联大茴香胺和2U/mL的过氧化氢酶，室温下反应，测定500nm处的吸光值，活力单位U定义为每分钟催化1μmol葡萄糖转化所需的酶量；
步骤四)，GA和GOx细胞表面共展示系统的构建：将GA-DocC和 GOx-DocT融合蛋白与展示有支架蛋白的细胞进行4小时的孵育，洗涤细胞，悬浮在反应缓冲液中，测定总体反应速率，条件是在含有0.1％淀粉的HAc-NaAc缓冲液(50mM，pH 5.0含有0.17mM的联大茴香胺和2U/mL 的过氧化氢酶)中，50度条件下反应10分钟，测定500nm处的吸光值；
步骤五)，基于GA和GOx在酵母表面可控共展示的电化学顺序酶生物传感器：将酵母表面按比例共展示GA和GOx(yeast–GA&GOx,n:1, n＝1,2,3)修饰到电极上，制备电化学淀粉传感器。
步骤六)，所述步骤五中电化学淀粉传感器的制备：将玻碳电极依次用粒径为1.0,0.2,0.05μm的氧化铝粉末打磨至镜面，然后将电极分别在超纯水，乙醇中超声清洗1min，放在氮气氛下吹干备用。称取2mg 还原氧化石墨烯(RGO)加入1mL的聚丙烯酸水溶液(1g/L)中，超声分散30 min，使分散均匀。将配好的悬浮液离心分离收集沉淀并清洗，洗去过多的PAA，然后重新超声分散均匀备用。移取5μL RGO分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，制备的电极表示为RGO/GCE。然后取10μL yeast–GA&GOx滴涂到RGO/GCE表面，修饰好的电极表示为 yeast–GA&GOx/RGO/GCE(顺序酶传感器)。取10μL yeast–GOx滴涂到RGO/GCE表面，修饰好的电极表示为yeast–GOx/RGO/GCE(葡萄糖传感器)。传感器置于4度冰箱过夜晾干。
本发明所具有的优点：
本发明基于顺序酶共展示系统将GA和GOx按可控比例、高效、稳定地共展示在酵母细胞表面，得到三种酵母表面共展示全细胞 (yeast–GA&GOx(n:1,n＝1,2,3)，然后制备系列传感器检测淀粉。顺序酶可控共展示的酵母全细胞明显优于其他随机组合的传感器。特别地， yeast–GA&GOx(2:1)/RGO/GCE具有最快的灵敏响应，进而用于淀粉的简单、灵敏检测。结合葡萄糖传感器，可实现实际样品中淀粉、葡萄糖含量的精确检测，并具有极好的重现性。本发明为实现单酶传感器难以进行的组分检测提供了一条有效途径。
附图说明
图1为本发明实施例提供的不同比例共展示GA和GOx的酵母细胞 yeast–GA&GOx(n:1)的示意图。(a),n＝1；(b),n＝2；(c),n＝3。
图2为本发明实施例提供酵母细胞的荧光显微镜观察图。EBY：没有展示外源蛋白的酵母细胞；EBY-C1T1：展示支架蛋白CohC-CohT的酵母细胞；EBY-C1T1C1：展示支架蛋白CohC-CohT-CohC的酵母细胞； EBY-C2T1C1：展示支架蛋白CohC-CohC-CohT-CohC的酵母细胞。
图3A为本发明实施例提供的系列共展示顺序酶的不同传感器在0.1 M柠檬酸盐缓冲溶液(pH 5.0)中检测淀粉的电流-时间曲线的电流响应图，其中 free-GA/free-GOx/RGO/GCE(a)；yeast-GA/yeast-GOD/RGO/GCE(b)； yeast–GA&GOx(1:1)/RGO/GCE(c)；yeast–GA&GOx(3:1)/RGO/GCE(d) 和yeast–GA&GOx(2:1)/RGO/GCE(e)，图中标注的淀粉浓度为溶液中的淀粉终浓度(％w/v)，施加电位：–0.4V vs.SCE。
图3B为本发明实施例提供的系列共展示顺序酶的不同传感器在0.1 M柠檬酸盐缓冲溶液(pH 5.0)中检测淀粉的工作曲线。
图4A为本发明实施例提供的yeast–GA&GOx(2:1)/RGO/GCE传感器在0.1M柠檬酸盐缓冲溶液(pH 5.0)中检测葡萄糖的电流-时间曲线的电流响应图，图中标识的葡萄糖浓度为加葡萄糖标准液后溶液中的葡萄糖终浓度(％w/v)。施加电位：–0.4V vs.SCE。
图4B为本发明实施例提供的yeast–GA&GOx(2:1)/RGO/GCE传感器在0.1M柠檬酸盐缓冲溶液(pH 5.0)中检测葡萄糖的工作曲线。
图5为本发明实施例提供根据优选实施例中基于不同酶组合制得的系列传感器在施加电位–0.4V vs SCE下检测相同质量浓度的淀粉和葡萄糖产生的电流比值对比。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明可控的顺序酶共展示系统将分别来源于扣囊复膜酵母的糖化酶(GA)编码基因和黑曲霉的葡萄糖氧化酶(GOx)编码基因与具有不同特异性的dockerin结构域DocC和DocT编码基因进行融合，利用毕赤酵母分别分泌表达融合蛋白GA-DocC和GOx-DocT；利用a凝集素锚定蛋白将具有不同特异性的支架蛋白cohesin结构域CohC和CohT按照可控的比例共展示在酿酒酵母(yeast)细胞的表面；将GA-DocC和 GOx-DocT融合蛋白与展示有支架蛋白的细胞进行孵育，通过 cohesin-dockerin的特异性作用将GA和GOx按可控比例、高效、稳定地共展示在酵母细胞表面，得到的酵母表面共展示全细胞(yeast–GA&GOx (n:1，n＝1,2,3))固定在还原氧化石墨烯(RGO)修饰的玻碳电极(GCE) 上,构筑了稳定、灵敏的yeast–GA&GOx/RGO/GCE顺序酶传感器。结合酵母表面单展示GOx制作yeast–GOx/RGO/GCE修饰电极(即葡萄糖电化学传感器)实现了葡萄糖和淀粉的检测。
实施例1
本发明顺序酶传感器为将酵母表面按比例共展示糖化酶(GA)和葡萄糖氧化酶(GOx)(yeast–GA&GOx(n:1,n＝1,2,3)并修饰到电极上(参见图1)。所述糖化酶(GA)来源于扣囊复膜酵母的糖化酶(GA)编码基因和葡萄糖氧化酶(GOx)来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶(GOx)编码基因与具有不同特异性的dockerin结构域DocC和DocT编码基因进行融合。
具体为：
步骤一，构建支架蛋白的酵母表面展示系统：利用a凝集素锚定蛋白将具有不同特异性的cohesin结构域CohC和CohT展示在酵母细胞的表面。克隆来源于C.cellulolyticumH10和C.thermocellum ATCC27405的Coh-Doc蛋白，基因片段分别为cohc/docc和coht/doct。编码Coh的基因与a凝集素的C端融合，得到质粒pYD1-cohC-cohT，pYD1-cohC-cohT-cohC和pYD1-cohC-cohC-cohT-cohC，这些重组质粒转化Saccharomycescerevisiae EBY100，在不含有色氨酸的SD平板上挑选转化子，利用半乳糖诱导表达融合蛋白。收集细胞，用缓冲液进行洗涤。利用Coh C端的His标签来标记蛋白，通过荧光显微镜观察，支架蛋白Coh正确地展示在细胞的表面。阴性对照是未展示支架蛋白的细胞，与之相比，含有质粒pYD1-cohC-cohT，pYD1-cohC-cohT-cohC和 pYD1-cohC-cohC-cohT-cohC的细胞均有明显的荧光，这说明支架蛋白成功地展示在了酵母细胞的表面。得到三株酵母，展示由cohesin结构域组成的支架蛋白，CohC和CohT的比列分别是1:1、2:1和3:1；
步骤二，酵母表达dockerin结构域融合的GA和GOx：将编码GA的基因与docc基因进行融合，同时将编码GOx的基因与doct基因融合，分别插入毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA的多克隆位点中，得到质粒 pPICZαA-ga-docC和pPICZαA-gox-docT。转化Pichia pastorisX-33，在YPDS平板上挑选转化子，利用甲醇进行融合蛋白的诱导表达。收集上清液，进行SDS-PAGE蛋白变性电泳的分析；
步骤三，酶活的测定：对上清液进行酶活测定，GA酶活测定的条件是在含有0.1％淀粉的HAc-NaAc缓冲液(50mM，pH 5.0)中，60度下反应15分钟，利用葡萄糖检测试剂盒测定生成的葡萄糖的含量，活力单位 U定义为每分钟催化产生1μmol葡萄糖所需的酶量。GOx酶活测定的条件是在磷酸钾缓冲液中(100mM，pH 7.4)加入终浓度为10mM的葡萄糖、0.17mM的联大茴香胺和2U/mL的过氧化氢酶，室温下反应，测定 500nm处的吸光值，活力单位U定义为每分钟催化1μmol葡萄糖转化所需的酶量；
步骤四，GA和GOx细胞表面共展示系统的构建：将GA-DocC和 GOx-DocT融合蛋白与展示有支架蛋白的细胞进行4小时的孵育，洗涤细胞，悬浮在反应缓冲液中，测定总体反应速率，条件是在含有0.1％淀粉的HAc-NaAc缓冲液(50mM，pH 5.0含有0.17mM的联大茴香胺和2U/mL 的过氧化氢酶)中，50度条件下反应10分钟，测定500nm处的吸光值，获得酵母表面按比例共展示GA和GOx(yeast–GA&GOx,n:1,n＝1,2,3)。
所述酵母为毕赤酵母，毕赤酵母分别分泌表达融合蛋白GA-DocC和 GOx-DocT。所述利用a凝集素锚定蛋白将具有不同特异性的支架蛋白 cohesin结构域CohC和CohT按照可控的比例共展示在酿酒酵母细胞的表面。
酵母表面单展示GOx的制备参见(Hongwei Wang,Qiaolin Lang, Liang Li,BoLiang,Xiangjiang Tang,Lingrang Kong,Marco Mascin, and Aihua Liu,Yeast surfacedisplaying glucose oxidase as whole-cell biocatalyst:Construction,characterization and its electrochemical glucose sensing application,Analytical Chemistry 2013,85,6107–6112.)。
然后按照上述获得的共展示酶进一步操作即得到顺序酶传感器，所述方法包括如下步骤：
将玻碳电极依次用粒径为1.0μm,0.2μm,0.05μm的氧化铝粉末打磨至镜面，然后将电极分别在超纯水，乙醇中超声清洗1min，放在氮气下吹干备用。称取2mg还原氧化石墨烯(RGO)加入1mL的聚丙烯酸水溶液(1mg/mL)中，超声分散30min，使分散均匀。将配好的悬浮液离心分离收集沉淀并清洗，洗去过多的聚丙烯酸，然后重新超声分散均匀备用。移取5μLRGO分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，制备的电极表示为RGO/GCE。然后取10μL yeast–GA&GOx(n:1)滴涂到RGO/GCE 表面，修饰好的电极表示为yeast–GA&GOx(n:1)/RGO/GCE(顺序酶传感器)。取10μL yeast–GOx滴涂到RGO/GCE表面，修饰好的电极表示为 yeast–GOx/RGO/GCE(葡萄糖传感器)。
电极使用之前，滴涂5μL 0.05％wt的全氟磺酸树脂膜(Nafion) 到电极表面。制备好的电极置于4度冰箱过夜晾干。
按照上述最佳实验条件制备系列顺序酶传感器：分别制备游离酶共混顺序酶传感器(表示为free-GA/free-GOx/RGO/GCE)、酵母表面单展示 GOx的葡萄糖传感器(yeast–GOx/RGO/GCE)、酵母表面单展示GA和酵母表面单展示GOx全细胞催化剂共混顺序酶传感器(表示为yeast–GA/ yeast–GOx/RGO/GCE)、酵母表面1:1共展示GA&GOx顺序酶传感器(表示为yeast–GA&GOx(1:1)/RGO/GCE)、酵母表面2:1共展示GA&GOx顺序酶传感器(表示为yeast–GA&GOx(2:1)/RGO/GCE)、酵母表面3:1共展示 GA&GOx顺序酶传感器(表示为yeast–GA&GOx(3:1)/RGO/GCE)。
实施例2
在5mL的0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)中，–0.4V的工作电位下，利用i-t法测定上述最佳实验条件制备系列共展示的顺序酶传感器对可溶性淀粉标准溶液的电流响应(参见图3A)和工作曲线(参见图 3B)。
由图3可见，按比例共展示全细胞修饰电极检测淀粉的响应时间、灵敏度均优于非共展示的体系。在加入同等浓度的淀粉后，酵母表面2:1 共展示GA&GOx修饰电极具有最大电流阶跃值，然后依次为酵母表面3:1 共展示GA&GOx修饰电极、酵母表面1:1共展示yeast–GA&GOx修饰电极，说明表面共展示GA&GOx的最佳比例为2:1，共展示体系与非共展示体系相比，信号响应优势十分明显。而单展示共混方法制备的修饰电极较游离酶修饰电极的检测信号仍然较高，说明表面展示体系具有高效表达酶的特点，有利于提高传感器的检测信号灵敏度。对于酵母表面2:1共展示GA&GOx修饰电极构筑的yeast–GA&GOx(2:1)/RGO/GCE传感器，其电流与淀粉浓度在0.02-0.30％(w/v)之间呈良好的线性关系。
实施例3
在5mL的0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)中，施加电位–0.4V vs SCE，利用i–t法测定上述最佳实验条件制备获得yeast–GA&GOx (2:1)/RGO/GCE对葡萄糖标准浓度的电流响应(参见图4A)和工作曲线 (参见图4B)。
由图可见，随着葡萄糖的加入，氧化电流信号迅速增加且5s内达到稳定值的95％(图4A)。检测葡萄糖的线性范围为0.0002-0.01％。
实施例4
在5mL的0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)中，施加电位–0.4V vs SCE，利用i-t法测定上述最佳实验条件制备系列共展示的不同酶组合的系列顺序酶传感器检测相同质量浓度的淀粉和葡萄糖的产生的电流的比值(参见图5)。
由图可见，GA、GOx可控比例共展示全细胞催化剂修饰电极能显著提高对淀粉的检测信号灵敏度，说明限速步GA水解淀粉反应速率高于非共展示体系。从而提高了检测淀粉的响应速度和检测灵敏度。且以最优修饰电极yeast–GA&GOx(2:1)/RGO/GCE检测淀粉最灵敏。
实施例5
采用上述实施例制备的最优yeast–GA&GOx(2:1)/RGO/GCE和 yeast–GOx/RGO/GCE传感器，实现对实际样品中葡糖糖和淀粉含量的检测：
称取一定质量的当地产饼干、药物头孢、感冒灵冲剂和香蕉烘干片，分别经研磨后，溶于水，再经0.22μm的滤纸过滤，收集滤液，再用0.1M 柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)配成5％(w/v)的溶液备用。
利用酵母表面单展示GOx获得的yeast–GOx/RGO/GCE修饰电极，即葡萄糖电化学传感器，检测样液中的葡萄糖浓度，以防止顺序酶传感器检测淀粉时葡萄糖对检测结果产生影响。
然后用最优修饰电极yeast–GA&GOx(2:1)/RGO/GCE检测样品中葡萄糖和淀粉的总量。
表1根据一优选实施例中所制得最优化的葡萄糖电化学传感器对实际样品中葡萄糖含量的检测。
表2根据一优选实施例中所制得最优化的 yeast–GA&GOx(2:1)/RGO/GCE电化学传感器对实际样品中葡萄糖和淀粉含量的检测。
表1实际样液中葡萄糖浓度的检测
表2实际样品中葡萄糖和淀粉含量
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由权利要求指出。
应当理解的是，本发明并不局限于已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。
Claims (7)
1.一种利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：将扣囊复膜酵母的糖化酶（GA）和黑曲霉的葡萄糖氧化酶（GOx）编码基因与具有不同特异性的dockerin结构域DocC和DocT编码基因进行融合，利用毕赤酵母分别分泌表达融合蛋白GA-DocC和GOx-DocT；利用a凝集素锚定蛋白将具有不同特异性的支架蛋白cohesin结构域CohC和CohT按比例可控共展示在酿酒酵母细胞的表面；将GA-DocC和GOx-DocT 融合蛋白与展示有支架蛋白的细胞进行孵育，通过cohesin-dockerin的特异性作用将GA和GOx按比例共展示在酵母细胞表面，再将共展示的酵母菌株分别修饰到经处理的电极获得电化学淀粉传感器，实现对样液中葡萄糖或淀粉的定量检测。
2.按权利要求1所述的利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：采用所述酵母细胞共展示顺序酶修饰的电极为工作电极,以饱和甘汞电极（SCE）为参比电极、铂丝为对电极，以0.1 M的 pH 5.0的柠檬酸盐缓冲溶液作为电解液，三电极连接至电化学工作站，在施加电位–0.4 V vs SCE下，利用i–t法测定传感器对淀粉标准溶液的电流。
3.按权利要求1所述的利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：利用a凝集素锚定蛋白将所述展示酶可控展示于酿酒酵母细胞的表面，GA和GOx摩尔比为1:1、2:1或3:1。
4.按权利要求3所述的利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：所述GA和GOx摩尔比为2:1。
5.按权利要求3或4所述的利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：将酵母表面按比例共展示GA和GOx的菌株分别修饰在经还原氧化石墨烯(RGO)滴涂的玻碳电极(GCE)上,所得传感器表示为yeast–GA&GOx(n:1)/RGO/GCE，其中n为1、2或3。
6.按权利要求5所述的利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：所述经处理的电极为
1）将玻碳电极用氧化铝粉末打磨，然后将电极分别在超纯水，乙醇中超声清洗，放在氮气下吹干，备用；
2）将2 mg还原氧化石墨烯(RGO)加入1 mL的1 mg/mL的聚丙烯酸水溶液中，超声分散均匀，将配好的悬浮液离心分离收集沉淀并清洗, 然后重新超声分散均匀备用；
3）将上述获得分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，获得表示为RGO/GCE的电极；然后滴涂yeast–GA&GOx菌株，获得yeast–GA&GOx(n:1)/RGO/GCE传感器。
7.按权利要求6所述的利用细胞表面可控展示顺序酶构建的传感器检测糖的方法，其特征在于：所述传感器使用之前，滴涂0.05% wt的全氟磺酸树脂膜（Nafion）到电极表面。
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