CN107714557B - 一种从火棘属果实中提取酪氨酸酶抑制剂的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从火棘属果实中提取酪氨酸酶抑制剂的方法及应用，其中，该方法以火棘属果实为原料，通过加热、回流、提取酪氨酸酶抑制剂的有效组分，进行大孔树脂柱分离，分别用80％乙醇和乙醇溶液再次洗脱，合并80％乙醇和乙醇的洗脱液，得到混合洗脱液；最后将混合洗脱液减压浓缩、真空低温干燥，得到酪氨酸酶抑制剂。火棘属果实的主要成分是联苯类和三萜类化合物，得到的酪氨酸酶抑制剂的主要有效成分是脂溶性相对较高的联苯类和三萜类化合物，其添加于化妆品时更容易透过皮肤组织，增加美白效果；且在酪氨酸酶抑制剂提取的过程中，使用的溶剂为以醇和蒸馏水，不使用有毒的有机溶剂，生产成本比较低，且不会对环境造成污染。

Description

一种从火棘属果实中提取酪氨酸酶抑制剂的方法及应用

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，尤其涉及一种从火棘属果实中提取酪氨酸酶抑制剂的方法及应用。

背景技术

人皮肤的颜色取决于黑色素的含量及分布。黑色素经过一系列反应生成：酪氨酸在酪氨酸酶的催化下氧化生成多巴，然后形成多巴醌，进而生成多巴色素，以及二羟基吲哚和酮式吲哚，最后聚合生成黑色素；因而酪氨酸酶的含量越多，活力越高，越容易形成黑色素，黑色素又经层层移动，转移到肌肤表皮层，从而形成雀斑、黑斑、晒斑等。因此，可以通过抑制酪氨酸酶活性来抑制黑色素的生成，从而研发酪氨酸酶抑制剂是各大化妆品公司重点关注领域。

近年来，天然酪氨酸酶抑制剂的研究非常活跃，氢醌、维生素C、曲酸及熊果苷等酪氨酸酶抑制剂相继被发现、研究。但是，氢醌因具有很大细胞毒性已很少采用；维生素C不稳定易氧化；曲酸亦不稳定易氧化，且具有一定的刺激性，近年还有研究认为曲酸具有一定的致癌性，因而已较少应用；熊果苷与氢醌在结构上相似，且在弱酸性条件下很容易水解产生氢醌和D-葡萄糖，因而推测进入人体的熊果苷可能在酸性条件下水解生成氢醌，因而近年来有学者对熊果苷的安全性也提出了质疑。因此，目前化妆品等行业研究的重点之一是寻找安全有效的天然酪氨酸酶抑制剂。

目前有研究从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制剂，该方法得到的酪氨酸酶抑制剂主要的有效成分是黄酮类，其溶解性较差尤其是脂溶性较差。由于人体细胞壁是脂类成分组成，将脂溶性较差的酪氨酸酶抑制剂添加到化妆品中，不利于皮肤组织的吸收，生物利用率比较低，美白效果较差，所以其应用也受到一定的限制。

发明内容

本发明提供一种从火棘属果实中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，本发明提供的酪氨酸酶抑制剂具有较高的脂溶性，更利于皮肤组织的吸收。

本发明提供一种从火棘属果实中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，该方法包括：

将沥干后的火棘属果实加入到乙醇溶液中，用匀浆机匀浆得到糊状物，加热提取糊状物，得到火棘属果实浆液；

过滤所述棘属果实浆液，用旋转蒸发仪减压旋干回收乙醇，直至无醇味为止，得到火棘属果实提取物；

向所述火棘属果实提取物中加入蒸馏水，然后分别用20％，40％和60％乙醇溶液进行大孔树脂柱分离，直至柱液洗脱至无色；

所述柱液洗脱至无色后，分别用80％乙醇和乙醇溶液再次洗脱，合并80％乙醇和乙醇的洗脱液，得到混合洗脱液，收集、备用；

将所述混合洗脱液减压浓缩、真空低温干燥，得到酪氨酸酶抑制剂。

优选地，所述火棘属果实为全缘火棘或窄叶火棘的果实。

优选地，所述沥干后的火棘属果实的重量与所述95％乙醇溶液的体积比为1g:1-3ml。

优选地，所述匀浆机匀浆后加热提取的温度为60-80℃，时间为2-4h。

优选地，所述火棘属提取物与所述蒸馏水的体积比为1:0.3～1:1。

一种氨酸酶抑制剂的应用，所述酪氨酸酶抑制剂按照从火棘属果实中提取酪氨酸酶抑制剂的方法制备，所述酪氨酸酶抑制剂用于制备抑制酪氨酸酶活性的化妆品。

本发明提供了一种从火棘属果实中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，该方法包括：将沥干后的火棘属果实加入到乙醇溶液中，用匀浆机匀浆，加热提取匀浆后得到的糊状物，进而得到火棘属果实浆液；过滤所述棘属果实浆液，用旋转蒸发仪减压旋干回收乙醇，直至无醇味为止，得到火棘属果实提取物；向所述火棘属果实提取物中加入蒸馏水，然后分别用20％，40％和60％乙醇溶液进行大孔树脂柱分离，直至下柱液洗脱至无色；所述柱液洗脱至无色后，分别用80％乙醇和乙醇溶液再次洗脱，合并80％乙醇和乙醇的洗脱液，得到混合洗脱液，收集、备用；所述混合洗脱液减压浓缩、真空低温干燥，得到酪氨酸酶抑制剂。火棘属果实的主要成分是联苯类和三萜类化合物，得到的酪氨酸酶抑制剂的主要有效成分是联苯类和三萜类化合物,其脂溶性相对较高，添加于化妆品时更容易透过皮肤组织，增加美白效果；且在酪氨酸酶抑制剂提取的过程中，使用的溶剂为以醇和蒸馏水，不使用有毒的有机溶剂，生产成本比较低，且不会对环境造成污染。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的从火棘属果实中提取酪氨酸酶抑制剂的方法流程示意图。

图2为本发明实施例提供的含从火棘属果实中提取的酪氨酸酶抑制剂的美白面霜功效评价示意图。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的的例子。

酪氨酸在酪氨酸酶的一系列催化氧化反应下合成黑色素，因此，美白系列的化妆品中需要通过添加酪氨酸酶抑制剂来抑制黑色素的生成。由于人体细胞壁是脂类成分组成，将脂溶性较差的酪氨酸酶抑制剂添加到化妆品中，不利于皮肤组织的吸收，生物利用率比较低，美白效果较差，因此需要添加脂溶性能比较好的酪氨酸酶抑制剂添加到化妆品中。

火棘属果实的主要成分是联苯类和三萜类化合物，从火棘属果实中提取得到的酪氨酸酶抑制剂的主要有效成分是联苯类和三萜类化合物,其脂溶性相对较高，添加于化妆品时更容易透过皮肤组织，增加美白效果。

请参考附图1，附图1示出了从火棘属果实中提取酪氨酸酶抑制剂的方法流程示意图，以下具体实施例的描述均以附图1为基础。

实施例1：

S101：将沥干后的火棘属果实加入到95％乙醇溶液中，用匀浆机匀浆，加热提取，得到火棘属果实浆液；其中，火棘属果实的重量与所述95％乙醇溶液的体积比为1g:1ml。加热提取的温度为60℃，时间为2h；

S102：过滤所述棘属果实浆液，用旋转蒸发仪减压旋干回收乙醇，直至无醇味为止，得到火棘属果实提取物；

S103：向所述火棘属果实提取物中加入蒸馏水，然后分别用20％，40％和60％乙醇溶液进行大孔树脂柱分离，直至下柱液洗脱至无色；其中，所述火棘属提取物与所述蒸馏水的体积比为1:0.3。

S104：所述柱液洗脱至无色后，分别用80％乙醇和乙醇溶液再次洗脱，合并80％乙醇和乙醇的洗脱液，得到混合洗脱液，收集、备用；

S105：所述混合洗脱液减压浓缩、真空低温干燥，得到酪氨酸酶抑制剂。

实施例2：

S201：将沥干后的全缘火棘属果实加入到95％乙醇溶液中，用匀浆机匀浆，加热提取，得到火棘属果实浆液；其中，火棘属果实的重量与所述95％乙醇溶液的体积比为1g:3ml。加热提取的温度为80℃，时间为4h。

S202：过滤所述棘属果实浆液，用旋转蒸发仪减压旋干回收乙醇，直至无醇味为止，得到火棘属提取物；

S203：向所述火棘属果实提取物中加入蒸馏水，然后分别用20％，40％和60％乙醇溶液进行大孔树脂柱分离，直至下柱液洗脱至无色；其中，所述火棘属果实提取物与所述蒸馏水的体积比为1:1:1。

S204：所述柱液洗脱至无色后，分别用80％乙醇和乙醇溶液再次洗脱，合并80％乙醇和乙醇的洗脱液，得到混合洗脱液，收集、备用；

S205：所述混合洗脱液减压浓缩、真空低温干燥，得到酪氨酸酶抑制剂。

实施例3：摘取成熟的窄叶火棘属果实，洗净、沥干；

S301：将沥干后的窄叶火棘属果实加入到95％乙醇溶液中，用匀浆机匀浆，加热提取，得到火棘属果实浆液；其中，火棘属果实的重量与所述95％乙醇溶液的体积比为1g:2ml。加热提取的温度为70℃，时间为3h。

S302：过滤所述棘属果实浆液，用旋转蒸发仪减压旋干回收乙醇，直至无醇味为止，得到火棘属提取物；

S303：向所述火棘属果实提取物中加入蒸馏水，然后分别用20％，40％和60％乙醇溶液进行大孔树脂柱分离，直至下柱液洗脱至无色；其中，所述火棘属果实提取物与所述蒸馏水的体积比为1:0.7；

S304：所述柱液洗脱至无色后，分别用80％乙醇和乙醇溶液再次洗脱，合并80％乙醇和乙醇的洗脱液，得到混合洗脱液，收集、备用；

S305：所述混合洗脱液减压浓缩、真空低温干燥，得到酪氨酸酶抑制剂。

为探究通过本发明实施例提供的从火棘属果实中提取酪氨酸酶抑制物的方法所提取的酪氨酸酶抑制物能够抑制酪氨酸酶的活性，熊果苷为目前公认的美白系列化妆品的主要酪氨酸酶抑制剂，本发明实施例提供了酪氨酸酶抑制物与熊果苷对酪氨酸酶活性抑制的评价方法，具体的评价方法为：

将酪氨酸酶抑制物溶解在DMSO(Dimethyl sulfoxide，即二甲基亚砜)中，然后加入摩尔浓度为1/15M、pH值为6.8的磷酸缓冲盐溶液配制成浓度为0.5mg/mL的溶液。取40μL浓度为0.5mg/mL的上述溶液加入到96孔板中，并加入20μL摩尔浓度为1/15M、pH值为6.8的磷酸缓冲盐溶液、40μL浓度为200U/mL的酪氨酸酶和100μL浓度为5mM的底物L-多巴，形成体外酪氨酸酶活性检测液。由熊果苷配制成的酪氨酸酶活性检测液的配制方法、浓度、各组分添加量均与体外酪氨酸酶活性检测液的相同。

将体外酪氨酸酶活性检测液和由熊果苷配制成的酪氨酸酶活性检测液在37℃的条件下孵育20min，孵育结束后在波长为490nm光下分别测定体外酪氨酸酶活性检测液和由熊果苷配制成的酪氨酸酶活性检测液的吸光度，并计算酪氨酸酶活性的抑制率，计算公式为：

抑制率(I)％＝[1-(C-D)/(A-B)]×100％

其中A是没有抑制剂存在时的吸光度值；B是仅有底物时的吸高度值；C是酶与底物在抑制剂存在下的吸光值；D是没有酶存在时的吸光值。

通过上述公式计算得知，0.5mg/mL的活性组分和熊果苷对酪氨酸酶的抑制率分别为70.5±2.4％和36.1±2.1％，该浓度下火棘果活性组分对酪氨酸酶的抑制活性大于熊果苷。

本发明实施例提供了含火棘属果实活性组分的美白面霜的功效实验，具体实验内容为：配制含火棘属果实活性组分的美白面霜，各组分的质量分数如下：

表1 火棘果活性组分美白面霜(质量分数％)

同样的方法配制不含火棘属果实活性组分的美白面霜，作为空白对照。

按照《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》选择符合纳入条件的受试者(年龄20-22岁的女性自愿者)。以左、右手臂前臂内侧作为试验区域(左边涂抹火棘果美白面霜，右边为空白对照)，每晚分别涂抹1次，涂抹量约为(3.0±0.2)mg·cm－2，每隔7天操作人员测定受试者试验部位涂抹火棘果美白面霜和空白对照面霜前后的皮肤白度，测试周期为4周。且测试期间不在测试部位涂抹测试样品以外的其他保湿或美白产品。

采用国际上通用的基于CIE L*a*b*颜色体系的分光测色仪对皮肤美白效果进行评价。分光测色仪测得的L*值表征的是皮肤的亮度，其变化表示产品使用前后皮肤亮度的变化。L*值越大，表示皮肤越白；反之，表示皮肤颜色越深。

测定结果数据用“平均值±标准差”表示。用SPSS分析软件进行统计学分析，采用t检验，P＜0.05具有显著意义。

实验结果请参考附图2，从附图2中能够看出，含火棘果活性组分的美白面霜可提高人体皮肤亮度，其效果随着使用时间的增长而提高，因而具有良好的美白效果。由此说明，本发明实施例提供的方法所提取的酪氨酸酶抑制物能够显著抑制酪氨酸酶的活性。

Claims (5)

1.一种从火棘属果实中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述方法包括：

将沥干后的火棘属果实加入到95%乙醇溶液中，用匀浆机匀浆得到糊状物，加热提取糊状物，得到火棘属果实浆液，其中加热提取的温度为60-80℃，时间为2-4h；

过滤所述火棘属果实浆液，用旋转蒸发仪减压旋干回收乙醇，直至无醇味为止，得到火棘属果实提取物；

向所述火棘属果实提取物中加入蒸馏水，然后分别用20%、40%和60%乙醇溶液进行大孔树脂柱分离，直至柱液洗脱至无色；

所述柱液洗脱至无色后，分别用80%乙醇溶液和乙醇再次洗脱，合并80%乙醇溶液和乙醇的洗脱液，得到混合洗脱液，收集、备用；

将所述混合洗脱液减压浓缩、真空低温干燥，得到酪氨酸酶抑制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述火棘属果实为全缘火棘或窄叶火棘的果实。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沥干后的火棘属果实的重量与所述95%乙醇溶液的重量体积比为1g:1-3ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述火棘属果实提取物与所述蒸馏水的体积比为1:0.3~1:1。

5.一种用于制备抑制酪氨酸酶活性的化妆品的酪氨酸酶抑制剂的应用，其特征在于，所述酪氨酸酶抑制剂按照权利要求1-4中任意一项所述的从火棘属果实中提取酪氨酸酶抑制剂的方法制备。

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