CN107703299A - 鉴别布鲁氏菌病A19‑△VirB12疫苗免疫与野毒感染的方法及基于该方法的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴别布鲁氏菌病A19‑△VirB12疫苗免疫与野毒感染的方法及基于该方法的试剂盒。所述方法包括：用间接竞争ELISA法检测同一份待检样本中BMEI 1330抗体及VirB12抗体，若VirB12 OD值/BMEI 1330 OD值≥2.4，判定为VirB12缺失阳性。本发明中，用BMEI 1330抗体作为内参，检测时VirB12抗体与BMEI 1330抗体都在待检样本内，自身对照，不需要阴性对照血清，大为减小了系统误差，可显著提升准确率。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品检疫技术领域，具体而言，涉及一种鉴别布鲁氏菌病A19-ΔVirB12疫苗免疫与野毒感染的方法及基于该方法的试剂盒。
背景技术
布鲁氏菌病，又名地中海弛张热、马耳他热、波浪热(undulant fever)、波状热，是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。
在多数布病流行的国家和地区，控制家畜布病的主要手段仍是使用疫苗接种进行免疫，因此，疫苗免疫是预防和控制畜间布鲁氏菌病的主要措施和最有效的手段。目前我国使用的弱毒菌疫苗有牛A19、羊M5和猪S2；国外使用的弱毒菌疫苗有牛S19和RB51、羊Rev.1；S19由美国研发，我国从前苏联引进牛布鲁氏菌19号苗，与S19相比较，该疫苗不缺失Ery基因，命名为A19。纵观布鲁氏菌免疫制剂研究历史我们发现，布鲁氏菌弱毒苗一直处于主导地位，对布鲁氏菌的防治起到很大的作用，但是同时也带来一些隐忧，首先，现用的布鲁氏菌疫苗均为弱毒活菌疫苗，容易感染人，对人类健康存在威胁。其次，疫苗缺乏鉴别诊断标记，疫苗接种动物与自然患病动物无法甄别，造成患病动物在自然群体中长期存在，严重危害人类和动物的健康，阻碍动物鲁氏菌病的根除和净化。
随着分子生物学技术的发展，基因敲除技术成为目前解决弱毒疫苗毒力强、无法用免疫学方法区分疫苗免疫和自然感染等难题的一项重要技术。为解决布鲁氏菌病弱毒疫苗中存在的上述问题，有研究通过基因敲除技术获得了1株缺失VirB12蛋白的牛布鲁氏菌病分子标记苗，缺失的VirB12蛋白能刺激机体产生有诊断意义的抗体，并且不改变A19疫苗的免疫原性和生物学特性，用免疫学方法可以区分疫苗免疫抗体和自然感染抗体，弥补现有A19苗的缺陷，对全面提升国产弱毒菌疫苗的性能，发挥国内自主产权的布鲁氏菌弱毒菌疫苗作用的意义重大，为动物布病防控提供新的疫苗。
当前，布氏菌病活疫苗(A19-ΔVirB12株)已经进入适用阶段。布鲁氏菌疫苗免疫带来的主要问题是无法区分疫苗免疫和自然感染的动物，这在很大程度上限制了布鲁氏菌疫苗的使用和推广，也给布病的有效防治和清除带来了一定的难度。现有技术中用于鉴别野毒感染诊断的主要方法为间接ELISA，然而在使用该方法过程中，由于受到不同个体、不同牛场、不同种群、不同地域的影响，用间接ELISA法检测牛血清中VirB12抗体，数值变化上下波动较大，与阴性对照OD450值比对，比值范围不稳定，VirB12缺失阳性检出率较低，约为72％左右。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别布鲁氏菌病A19-ΔVirB12疫苗免疫与野毒感染的方法及基于该方法的试剂盒，以解决上述问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种鉴别布鲁氏菌病A19-ΔVirB12疫苗免疫与野毒感染的方法，包括：
用间接竞争ELISA法检测同一份待检样本中BMEI 1330抗体及VirB12抗体，若VirB12OD值/BMEI 1330OD值≥2.4，判定为VirB12缺失阳性。
本发明中，用BMEI 1330抗体作为内参，检测时VirB12抗体与BMEI1330抗体都在待检样本内，自身对照，不需要阴性对照血清，大为减小了系统误差，可显著提升准确率。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于鉴别布鲁氏菌病A19-ΔVirB12疫苗免疫与野毒感染的试剂盒，所述试剂盒包括BMEI 1330抗体及VirB12抗体、布鲁氏菌菌体蛋白、所述BMEI 1330抗体及所述VirB12抗体对应的二抗、以及酶显色底物；
所述BMEI 1330抗体及所述VirB12抗体对应的二抗标记有用于指示反应强度的酶。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
应用本发明所提供的方法和试剂盒，可对布鲁氏菌病A19-ΔVirB12分子标记疫苗后提供间接酶联免疫吸附试验(iELISA)区分该疫苗接种的动物与野毒感染动物。本发明提供的iELISA方法解决了免疫动物与临床患病动物难以鉴别区分的问题，对牛布鲁氏菌病的防控、根除和净化具有实际应用价值。
具体实施方式
本发明涉及一种鉴别布鲁氏菌病A19-ΔVirB12疫苗免疫与野毒感染的方法，包括：
用间接竞争ELISA法检测同一份待检样本中BMEI 1330抗体及VirB12抗体，若VirB12OD值/BMEI 1330OD值≥2.4，判定为VirB12缺失阳性。
优选的，所述待检样本为血液或血清。
优选的，用间接竞争ELISA法检测是，所用的反应强度的酶为辣根过氧化酶，若VirB12OD450/BMEI 1330OD450≥2.4，判定为VirB12缺失阳性。
VirB12蛋白是由VirB12基因编码的一个布鲁氏菌宿主定植蛋白，分子量约为17kDa，在细菌与宿主的相互作用中起作用。研究证明，VirB12在布鲁氏菌感染中是一种免疫原性蛋白，可刺激宿主产生VirB12抗体，因此VirB12蛋白可作为一种布鲁氏菌血清学检测标记抗原。
BMEI 1330即为羊布鲁氏菌的一种外膜蛋白(outer membrane protein x,OMP)，BMEI 1330为该外膜蛋白的NCBI ORF no.，其功能为protease DO。
现有技术中，多采用间接ELISA对待检样本进行检查。即包被VirB12蛋白，用HRP-VirB12抗体与待检样本一起加入。待检样本中的VirB12蛋白与Solid-VirB12蛋白竞争HRP-VirB12抗体。用待测血清OD值/阴性对照血清OD值≥2时即判定为VirB12缺失阳性。然而这种方法中，由于阴性对照血清与待测血清显然来自于不同的动物体，所以会随着不同个体、不同牛场、不同种群、不同地域的影响产生各种难以规避的误差，使得检测的准确率下降。
而本发明中，用OMPx抗体作为内参，检测时VirB12抗体与OMPx抗体都在待检样本内，自身对照，不需要阴性对照血清，大为减小了系统误差，因而准确率可显著提升。
优选的，如上所述的鉴别布鲁氏菌病A19-ΔVirB12疫苗免疫与野毒感染的方法，所述用间接竞争ELISA法检测同一份待测样本中OMPx抗体及VirB12抗体的具体步骤包括：
1).将BMEI 1330抗体及VirB12抗体分别加入预先包被有布鲁氏菌菌体蛋白的固相支持物的不同孔内，加入待检样本进行孵育；同时预留至少一个不加入BMEI 1330抗体或VirB12抗体的孔作为阴性对照；
2).洗涤去除未结合的待检样本和抗体后，分别加入所述BMEI 1330抗体及所述VirB12抗体对应的酶标二抗进行孵育；
3).洗涤去除未结合的酶标二抗，加入所述酶标二抗所偶联酶的底物进行显色反应并检测OD值。
本发明提供的方法可简述为：布氏菌病活疫苗(A19-ΔVirB12株)免疫牛，6个月后，血清凝集试验(SAT)法检测牛血清中布氏菌抗体，检测结果为阳性的，进行VirB12阳性筛查。采用竞争ELISA方法检测抗体差异。抗原采用菌体蛋白提取方法进行制备(该方法属传统方法，不再赘述)。用制备的菌体蛋白包被、孵育微量板，洗涤微量板去除未包被的抗原；选择4个孔，分别加BMEI 1330单克隆抗体孔(单克隆抗体采用传统方法制备，不再赘述；效价均为1：4000)、无血清对照孔、VirB12单克隆抗体孔、无血清对照孔，立即加上待测血清，温室孵育；洗涤去除未结合的血清和单抗，每孔加入羊抗鼠辣根过氧化物酶结合物并孵育，洗涤未结合的结合物；加显色剂，平板振摇，酶标检测仪检测OD值；比对VirB12及BMEI1330孔的OD值，其比值时≥2.4时，判断VirB12缺失阳性。
优选的，如上所述的鉴别布鲁氏菌病A19-ΔVirB12疫苗免疫与野毒感染的方法，在步骤1)中，所述孵育的条件为：
振摇2min～4min，室温孵育40min～80min；
更优选的，所述孵育的条件为振摇3min，室温孵育60min。
优选的，如上所述的鉴别布鲁氏菌病A19-ΔVirB12疫苗免疫与野毒感染的方法，在步骤2)中，所述酶标二抗的浓度为1:3000～5000；
更优选的，在步骤2)中，所述酶标二抗的浓度为1:4000；
优选的，在步骤2)中，所述孵育的条件为：振摇20s～40s，室温静置1.5min～2.5min；
更优选的，在步骤2)中，所述孵育的条件为：振摇30s，室温静置2min。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于鉴别布鲁氏菌病A19-ΔVirB12疫苗免疫与野毒感染的试剂盒，所述试剂盒包括BMEI 1330抗体及VirB12抗体、布鲁氏菌菌体蛋白、所述BMEI 1330抗体及所述VirB12抗体对应的二抗、以及酶显色底物；
所述BMEI 1330抗体及所述VirB12抗体对应的二抗标记有用于指示反应强度的酶。
优选的，如上所述的试剂盒，所述指示反应强度的酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。
优选的，如上所述的试剂盒，所述指示反应强度的酶为辣根过氧化酶，所述酶显色底物包括TMB、OPD或ABTS中做任一种。
优选的，如上所述的试剂盒，所述布鲁氏菌菌体蛋白预先包被于固相支持物上；
更优选的，所述固相支持物为酶标板；
更优选的，所述酶标板上每孔包被有30ng～70ng布鲁氏菌菌体蛋白；更优选为40ng～60ng，或50ng。
优选的，如上所述的试剂盒，所述BMEI 1330抗体及所述VirB12抗体的效价均≥1：4000；
优选的，每30ng～70ng布鲁氏菌菌体蛋白加入所述BMEI 1330抗体或所述VirB12抗体的量均为40μl～60μl；
更优选的，每30ng～70ng布鲁氏菌菌体蛋白加入所述BMEI 1330抗体或所述VirB12抗体的量均为50μl。
优选的，如上所述的试剂盒，所述试剂盒还包括酶结合物工作液、酶显色终止液、样品稀释液、含有标准品、封闭液中的一种或多种。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1
微孔板预处理；用包被缓冲液稀释纯化菌体蛋白抗原(0.3μg/mL)，每孔加入100μl，37℃孵育1.5h；PBST洗涤3次；设置BMEI 1330孔、无血清对照孔、VirB12孔、无血清对照孔，分别加40μl BMEI 1330单抗、PBST、VirB12单抗、PBST，立即加入50μl待检牛血清样本，振摇2min，室温孵育80min；弃去板内样品稀释液，PBST洗涤3次；HRP酶标二抗稀释1:5000倍，每孔加100μl，振摇20s，室温静置2.5min；弃去板内酶标二抗，PBST洗涤3次；加底物显色液100μl，室温反应；各反应孔中加2mol/L硫酸50μl终止反应。当VirB12OD450/BMEI1330OD450≥2.4，判定为VirB12缺失阳性。
实施例2
微孔板预处理；用包被缓冲液稀释纯化菌体蛋白抗原(0.7μg/mL)，每孔加入100μl，37℃孵育2.5h；PBST洗涤3次；设置BMEI 1330孔、无血清对照孔、VirB12孔、无血清对照孔，分别加60μl BMEI 1330单抗、PBST、VirB12单抗、PBST，立即加入50μl待检牛血清样本，振摇4min，室温孵育40min；弃去板内样品稀释液，PBST洗涤3次；HRP酶标二抗稀释1:3000倍，每孔加100μl，振摇40s，室温静置1.5min；弃去板内酶标二抗，PBST洗涤5次；加底物显色液100μl，室温反应；各反应孔中加2mol/L硫酸50μl终止反应。当VirB12OD450/BMEI1330OD450≥2.4，判定为VirB12缺失阳性。
实施例3
微孔板预处理；用包被缓冲液稀释纯化菌体蛋白抗原(0.5μg/mL)，每孔加入100μl，37℃孵育2h；PBST洗涤3次；设置BMEI 1330孔、无血清对照孔、VirB12孔、无血清对照孔，分别加50μl BMEI 1330单抗、PBST、VirB12单抗、PBST，立即加入50μl待检牛血清样本，振摇3min，室温孵育1h；弃去板内样品稀释液，PBST洗涤3次；HRP酶标二抗稀释1：4000倍，每孔加100μl，振摇30s，室温静置2min；弃去板内酶标二抗，PBST洗涤4次；加底物显色液100μl，室温反应；各反应孔中加2mol/L硫酸50μl终止反应。当VirB12OD450/BMEI 1330OD450≥2.4，判定为VirB12缺失阳性。
实验例1
原间接ELISA方法：采集194份牛血清(包括布病阳性血清85份、A19-ΔVirB12免疫牛血清66份、布病阴性牛血清43份)间接ELISA法进行检测。微孔板预处理；用包被缓冲液稀释纯化VirB12蛋白抗原(0.5μg/mL)，每孔加入100μl，37℃孵育2h；PBST洗涤3次；设置阳性和阴性对照血清孔，分别加入阳性和阴性血清5μl，然后加入样品稀释液95μl，其余检测孔加入待检牛血清样本5μl，振摇30s，37℃孵育1h；弃去板内样品稀释液，PBST洗涤3次；酶标二抗稀释1：5000倍，每孔加100μl，振摇30s，室温静置2min；弃去板内酶标二抗，PBST洗涤4次；加底物显色液100μl，室温反应；各反应孔中加2mol/L硫酸50μl终止反应。待测血清OD450/阴性对照血清OD450≥2，判定为VirB12缺失阳性，本方法VirB12缺失阳性检出率为72.72％。
示范：采集194份牛血清(包括布病阳性血清85份、A19-ΔVirB12免疫牛血清66份、布病阴性牛血清43份)，用实施例3的方法进行竞争ELISA法进行抗体差异检测。本方法VirB12缺失阳性检出率为78.79％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种鉴别布鲁氏菌病A19-△VirB12疫苗免疫与野毒感染的方法，其特征在于，包括：
用间接竞争ELISA法检测同一份待检样本中BMEI 1330抗体及VirB12抗体，若VirB12OD值/BMEI 1330OD值≥2.4，判定为VirB12缺失阳性。
2.根据权利要求1所述的鉴别布鲁氏菌病A19-△VirB12疫苗免疫与野毒感染的方法，其特征在于，所述用间接竞争ELISA法检测同一份待测样本中BMEI 1330抗体及VirB12抗体的具体步骤包括：
1).将BMEI 1330抗体及VirB12抗体分别加入预先包被有布鲁氏菌菌体蛋白的固相支持物的不同孔内，加入待检样本进行孵育；同时预留至少一个不加入BMEI 1330抗体或VirB12抗体的孔作为阴性对照；
2).洗涤去除未结合的待检样本和抗体后，分别加入所述BMEI 1330抗体及所述VirB12抗体对应的酶标二抗进行孵育；
3).洗涤去除未结合的酶标二抗，加入所述酶标二抗所偶联酶的底物进行显色反应并检测OD值。
3.根据权利要求2所述的鉴别布鲁氏菌病A19-△VirB12疫苗免疫与野毒感染的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述孵育的条件为：
振摇2min～4min，室温孵育40min～80min。
4.根据权利要求2所述的鉴别布鲁氏菌病A19-△VirB12疫苗免疫与野毒感染的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述酶标二抗的浓度为1:3000～5000；
优选的，在步骤2)中，所述孵育的条件为：振摇20s～40s，室温静置1.5min～2.5min。
5.一种用于鉴别布鲁氏菌病A19-△VirB12疫苗免疫与野毒感染的试剂盒，所述试剂盒包括BMEI 1330抗体及VirB12抗体、布鲁氏菌菌体蛋白、所述BMEI 1330抗体及所述VirB12抗体对应的二抗、以及酶显色底物；
所述BMEI 1330抗体及所述VirB12抗体对应的二抗标记有用于指示反应强度的酶。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述指示反应强度的酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述指示反应强度的酶为辣根过氧化酶，所述酶显色底物包括TMB、OPD或ABTS中做任一种。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述布鲁氏菌菌体蛋白预先包被于固相支持物上；
优选的，所述固相支持物为酶标板；
更优选的，所述酶标板上每孔包被有30ng～70ng布鲁氏菌菌体蛋白。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述BMEI 1330抗体及所述VirB12抗体的效价均≥1：4000；
优选的，每30ng～70ng布鲁氏菌菌体蛋白加入所述BMEI 1330抗体或所述VirB12抗体的量均为40μl～60μl。
10.根据权利要求5～9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶结合物工作液、酶显色终止液、样品稀释液、含有标准品、封闭液中的一种或多种。
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| CN107703299B (zh) | 2019-12-10 |
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