CN107686825A - 一株防治水稻纹枯病的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌 - Google Patents

一株防治水稻纹枯病的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株抑制水稻纹枯病的细菌纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，该菌株提供了一种对人畜无毒，对生态环境友好，对水稻纹枯病有良好防效的微生物菌种及其农药产品。本发明增加了防治水稻纹枯病微生物杀菌剂的种类。

Description

一株防治水稻纹枯病的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌
技术领域
本发明涉及水稻纹枯病的微生物防治技术领域，尤其涉及一株防治水稻纹 枯病的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌。
背景技术
水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)是国内外最严重而且也是最难治理的 真菌病害之一，其分布广泛、为害严重，每年都给农业生产造成巨大的经济损 失。由于纹枯病菌腐生能力强、寄主范围广，国内外至今尚未发现对该病的高 抗品种。目前我国生产上防治水稻纹枯病以井冈霉素和一些化学农药为主，抗 生素和化学药剂的长期反复使用已经使病原菌产生了明显的抗药性，导致防效 下降甚至丧失，用药量不断增加，而长期大量使用农药造成自然生态环境污染 及稻米农药残留量增加的问题也越来越突出。由于水稻纹枯病是一种土传病害， 病原菌对寄主的寄生专化性不强，作物品种间特异抗性差异很小或没有(刘薇 等，2009)。利用有益微生物进行生物防治不但经济有效，而且无副作用。因此， 利用有拮抗作用的微生物进行生物防治是一条有探索价值的新途径。近年来， 世界主要稻区普遍开展了采用拮抗微生物来控制水稻纹枯病危害的生物防治研 究。
对水稻纹枯病的生物防治研究目前已取得比较大的进展，已报道筛选到对 水稻纹枯病菌有较强作用的枯草芽孢杆菌Bs-916、B5423-R、芽孢杆菌属Drt211、 NBl2、致黄假单胞菌B34以及青霉属的Z88、木霉属、镰孢菌、产农抗120放线 菌、伯克霍尔德菌SD7及海洋细菌等菌株对水稻纹枯病菌具有一定的拮抗作用。 应用最多当属枯草芽孢杆菌，江苏农科院(陈志谊等，2003)成功筛选枯草芽孢 杆菌Bs-916，对多种水稻病害具有良好的防效，其商品“纹曲宁”自1991年推 广以来，对纹枯病的防效稳定在70％以上。南京农业大学研制的生物农药“麦丰 宁”，由枯草芽孢杆菌B3制成，对立枯丝核菌具有显著的抑制作用。云南农业 大学与中国农业大学共同研制的“百抗”的主要有效成分是枯草芽孢杆菌B908， 已经获得农业部登记注册，对水稻纹枯病的防治效果达70％以上。
近年来，世界主要稻区普遍开展了采用拮抗微生物来控制水稻纹枯病危害 的生物防治研究，开发成产品的主要是枯草芽孢杆菌生防菌剂，大部分水稻纹 枯病的生防菌株均处于实验室研究阶段，生产上尚缺少用于防治水稻纹枯病的 新型微生物农药。
本发明为了筛选水稻纹枯病菌的高效生防菌，采用三点对峙培养法、菌丝 生长速率法、菌核萌发抑制法和离体防效试验，对辽宁省、吉林省和黑龙江省 等地区采集的水稻田土样进行分离和筛选，并对生防菌株进行种类鉴定。旨在 获得防治效果较高的生防菌株，为水稻纹枯病生物防治提供依据。
发明内容
为了解决上述问题，本发明在防治水稻纹枯病上找到了一株新的生防菌株。
本发明的技术方案如下：
一株对水稻纹枯病具有抑制作用纺锤形赖氨酸芽孢杆菌JLN3-2，其已经于 2017年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类 命名：纺锤形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis，保藏号为：CGMCC N0.14660。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研 究所。
本发明公开的细菌纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，所具有的形态特征：菌株JLN3-2 的单菌落呈圆形，粘稠不透明，表面微湿润并凸起、边缘整齐，灰白色，易挑 起。革兰氏染色呈阳性，细胞杆状，两端钝圆。
试验证明，本发明的细菌纺锤形赖氨酸芽孢杆菌对水稻纹枯病菌具有很强 的抑制作用。
本发明的抑制水稻纹枯病菌的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，具有如下优点：
1.提供对人畜无毒，对生态环境友好，对水稻纹枯病有良好防效地微生物 菌种及其农药产品。
2.提供一株防治水稻纹枯病的细菌纺锤形赖氨酸芽孢杆菌。
3.增加防治水稻纹枯病微生物杀菌剂的种类。
附图说明
图1：纺锤形赖氨酸芽孢杆菌对水稻纹枯病菌的拮抗效果(三点对峙法)；
图2：纺锤形赖氨酸芽孢杆菌对水稻纹枯病菌的拮抗效果(菌丝生长速率 法)；
图3：纺锤形赖氨酸芽孢杆菌对水稻纹枯病菌的拮抗效果(菌核萌发抑制 法)；
图4：纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液对水稻纹枯病的离体防治效果。
具体实施方式
下面以具体的实施例对本发明作详细的描述。
菌株的筛选、分离与鉴定
菌株的分离：采用土壤稀释分离法进行分离纯化。
菌株的筛选：采用三点平板对峙培养法、菌丝生长速率法和菌核萌发抑制 法，综合筛选对水稻纹枯病菌有生防作用的生防菌。
1平板对峙培养法
采用三点平板对峙培养法，选取已活化、培养48h的水稻纹枯病菌菌落， 用5mm的打孔器制成菌饼置PDA平板中央，在距水稻纹枯病菌饼30mm处呈三角 形对称的3个点移置供试生防菌。27℃恒温培养72h。观察抑菌圈的形成并测量 其大小。
2菌丝生长速率法
采用菌丝生长速率法，将纯化的供试菌株菌饼移至液体培养基中， 28℃130r·min-1振荡培养24h，作为种子培养液。用移液枪取种子培养液5mL 转入装有100mL液体培养基的三角瓶(250mL)中，28℃130r·min-1振荡培养 120h，8000r·min-1离心10min，取上清液经过滤器(φ＝0.22μm)过滤，获得无 菌发酵滤液。取1mL无菌发酵滤液与9mL PDA培养基混匀，倒入灭菌培养皿 中制成带菌液平板。在带菌液PDA平板中心移置水稻纹枯病菌菌饼1个，27℃ 恒温培养。每处理重复3次。48h后计测抑菌圈直径和抑菌率。
菌落生长直径(mm)＝测量直径(mm)-菌饼直径(mm)
3菌核萌发抑制法
将供试水稻纹枯病菌在PDA平板上培养10d，待菌核形成后，选择大小基本 一致的菌核放入无菌发酵滤液中浸泡30min，处理后的菌核移入PDA平板，每 皿4个，以无菌水浸泡的菌核为对照。每个处理重复3次。27℃恒温培养。48h 后显微镜下观察菌核萌发情况，统计菌核萌发率及菌丝萌发级数，计算萌发菌 丝指数和抑制率。
萌发菌丝分级标准：0级：萌发菌丝数为零根；1级：萌发菌丝数为1～20 根；2级：萌发菌丝数为21～50根；3级：萌发菌丝数为51～80根；4级：萌发 菌丝数为81～140根；5级：萌发菌丝数为141根以上。
菌株的鉴定：
1生防细菌鉴定
采用形态特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列测定结合方法进行。形 态特征和生理生化特性试验参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定 手册》进行。采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂 盒提取菌株DNA，应用细菌16SrRNA基因通用引物对提取的基因组DNA进行PCR 扩增。
PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix12.5μL，F引物1μL，R引物1μL， 模板DNA1μL，加ddH2O至总体积25μL。PCR反应程序：94℃预变性5min； 94℃变性1min，58℃退火1min，72℃复性2min，重复31个循环，最后72℃ 下延伸10min。所得PCR产物由上海生物工程股份有限公司进行序列测定，测 得的序列经NCBI进行BLAST比对后，用MEGA7软件进行序列分析，构建系统发 育树。
表1生理生化特性测定
Table 1Analysis to physiological and biochemical characteristics
注：+:阳性；-:阴性。Note:+:Positive；-:Negativ.
对峙培养测定纺锤形赖氨酸芽孢杆菌对水稻纹枯病原菌的抑制作用
表2生防菌株对水稻纹枯病菌的生防效果
Table2Bio-control strains antagonistic effect of R.solani
注：数据为3次重复的平均值±标准差；显著性分析采用最小极差法(LSD,P＜0.05)。
Note:The experimental data in the table were Mean±SD(repeated3times).Different owercase letters indicated significant differences usingLSD test at 0.05level.
表3菌株发酵液对水稻纹枯病的离体防治效果
Table3Control effect offermentation broth on R.solani
注：显著性分析采用最小极差法(LSD,P＜0.05)。
Note:Different lowercase letters indicated significant differencesusing LSD test at 0.05level.
本发明的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌JLN3-2对水稻纹枯病菌有较好的防治效 果，通过三点对峙培养法、菌丝生长速率法、菌核萌发抑制法和离体防效试验， 结果表明纺锤形赖氨酸芽孢杆菌对水稻纹枯病菌的抑菌圈分别为18.30mm；菌 丝生长抑制率分别为63.29％；菌核萌发抑制率分别为83.33％。在保护处理中， 纺锤形赖氨酸芽孢杆菌在24h的防效为94.92％；在治疗处理中，纺锤形赖氨酸 芽孢杆菌在8h的防效为74.58％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本 发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护 范围之内。

Claims (4)

1.一株抑制水稻纹枯病的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌JLN3-2，其已经于2017年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：14660。
2.如权利要求1所述的抑制水稻纹枯病的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌JLN3-2，其特征在于，其对水稻纹枯病菌有良好的拮抗效果。
3.如权利要求1所述的抑制水稻纹枯病的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌JLN3-2，其特征在于，其在防治水稻纹枯病微生物杀菌剂中的应用。
4.如权利要求1所述的抑制水稻纹枯病的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌JLN3-2，其特征在于，其在水稻纹枯病防治农药中的应用。
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