CN107686512A - 甲基咔啉‑3‑甲酰yigs肽,其合成,抗血栓作用和应用 - Google Patents

甲基咔啉‑3‑甲酰yigs肽,其合成,抗血栓作用和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了通式I代表的1‑甲基‑β‑咔啉‑3‑甲酰YIGS肽(式中AA为Arg或Lys),公开了它们的制备方法,公开了它们对血小板活化因子,凝血酶和花生四稀酸诱导的血小板聚集的强抑制作用,公开了它们的强抗血栓活性以及它们作为抗血栓剂的应用。

Description

甲基咔啉-3-甲酰YIGS肽,其合成,抗血栓作用和应用
技术领域
本发明涉及1-甲基-β-咔啉-3-甲酰RGD肽,涉及它们的制备方法,涉及它们的纳米结构,涉及它们对血小板活化因子,凝血酶和花生四稀酸诱导的血小板聚集的强抑制作用,涉及它们的强抗血栓活性以及作为抗血栓剂的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术
在全球范围内,血栓性疾病的发病率和死亡率都居首位。通常,血管损伤处所发生的止血作用称为生理性凝血,血管壁未受损伤发生的止血过程称为血栓形成。血栓形成与凝血系统有关。根据反应起始点的凝血因子和复合物形成的途径,凝血系统可分为内源性和外源性两种凝血系统。
内源性凝血系统的凝血酶原复合物的形成完全依赖于血浆中的凝血因子。具体凝血过程是,血浆中的凝血因子XII与受损伤的血管壁内的胶原或基膜接触,被激活成XIIa,然后催化因子XI成为Xia。XIa继而催化因子IX成为IXa。因子IXa,因子VIII,Ca2+和血小板磷脂等共同催化因子X成Xa。Xa与因子V,Ca2+和血小板磷脂形成“凝血酶原激活物”。
外源性凝血系统是指组织受外伤时,释放出因子III,发动的凝血过程。因子III是一种脂蛋白,它与血浆因子VIII和Ca2+形成复合物,该复合物可催化因子X成Xa。Xa与因子V在血小板磷脂和Ca2+参与下形成“凝血酶原激活物”。
凝血酶原没有活性,在Ca2+与凝血酶原激活物的作用下转变为凝血酶。凝血酶除了能催化纤维蛋白形成外,还能够促进血小板磷脂的释放以及增强因子VIII与因子V的活性,加速血凝过程。
纤维蛋白原是一种二聚体蛋白质,在血浆中呈溶解状态。凝血酶将其水解为单体,然后各单体之间以氢键作用,聚合在一起成为多聚体。此多聚体不稳定,在Ca2+的参与下,因子XIIIa催化多聚体中的单体,使之相互反应形成共价键。这样的纤维蛋白多聚体才是稳定的,并呈不溶解状态。它们相互连接,以蛋白质细丝纵横交错织成网状,将各种血细胞,尤其是GP IIb/IIIa血小板表面糖蛋白受体活化的血小板,网罗其中形成血块。GP IIb/IIIa血小板表面糖蛋白受体活化时与纤维蛋白原α链及纤维蛋白原γ链的RGDS，RGDV和RGDF序列结合的关键位点外化,加速血凝过程。
这些知识说明,抑制凝血酶是防止血栓的最根本的手段。在长期的研究中,发明人逐渐认识到结构式II代表的1-甲基-β-咔啉-3-羧酸对血小板活化因子,凝血酶和花生四稀酸有一定的抑制作用。在长期的研究中,发明人逐渐认识到在II的3位羧基偶联YIGS肽形成通式I代表的1-甲基-β-咔啉-3-甲酰YIGS肽(式中AA为Arg或Lys)可增强II对血小板活化因子,凝血酶和花生四稀酸诱导的血小板聚集的抑制作用。这种核心创新和关键技术的进步必然使本发明的化合物的抗血栓有效剂量大幅度下降。于是,发明人提出了本发明。
发明内容
本发明的第一个内容是提供通式I代表的两种新型1-甲基-β-咔啉-3-甲酰YIGS肽,特征在于其肽链中的AA为Arg或Lys。
本发明的第二个内容是提供制备两种种新型1-甲基-β-咔啉-3-甲酰YIGS肽,特征在于其肽链中的AA为Arg或Lys,的方法,该方法由以下步骤构成:
(1)在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下采用液相法制备Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl和Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl；
(2)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中将Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl和Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl脱除Boc,生成HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl和HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl；
(3)在稀硫酸中,室温下,L-Trp与乙醛反应12h直接生成(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸,并以无色固体的形态从反应液中沉淀析出；
(4)将(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯化,生成(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯；
(5)将(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯氧化,生成1-甲基-β-咔啉-3-羧酸甲酯；
(6)将1-甲基-β-咔啉-3-羧酸甲酯皂化,生成1-甲基-β-咔啉-3-羧酸；
(7)在DCC和HOBt存在下将1-甲基-β-咔啉-3-羧酸的3-羧基与HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl和HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl偶联生成1-甲基-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl和1-甲基-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl；
(8)在三氟乙酸中,在三氟甲磺酸存在下将1-甲基-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl和1-甲基-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl脱保护基生成1-甲基-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg和1-甲基-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Lys。
本发明的第三个内容是描述通式I代表的两种新型1-甲基-β-咔啉-3-甲酰YIGS肽,其肽链中的AA为Arg或Lys,的抗血小板聚集活性,特征在于它们对血小板活化因子,凝血酶和花生四稀酸诱导的血小板聚集的强抑制作用。。
本发明的第四个内容是描述通式I代表的两种新型1-甲基-β-咔啉-3-甲酰YIGS肽,其肽链中的AA为Arg或Lys,的抗血栓活性,特征在于有效剂量低达0.001nmol/kg。
本发明的第五个内容是阐明通式I代表的两种新型1-甲基-β-咔啉-3-甲酰YIGS肽,其肽链中的AA为Arg或Lys,在制备抗血栓剂中的应用。
缩略语
THF 四氢呋喃；DCC 二环己基酰亚胺；DCU 二环己基脲
HOBt N-羟基苯并三唑；NMM N-甲基吗啉
附图说明
图1 4a，b的合成路线图。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备Boc-Tyr-Ile-OBzl
将7.16g(25.5mmol)Boc-Tyr溶解于200ml干燥的THF,加入3.78g(28mmol)HOBt,搅拌使溶解。冰浴和搅拌下向该溶液中滴加6.29g(30.55mmol)DCC和50ml干燥THF的溶液。冰浴和搅拌下反应30分钟,加入10.51g(26.74mmol)Tos·Ile-OBzl,并滴加12ml NMM调节反应液的pH至9,室温搅拌反应12h,TLC显示Boc-Tyr消失。滤除DCU,减压浓缩去THF,残留物加15ml乙酸乙酯溶解,再次滤除DCU。残留物再加320ml乙酸乙酯溶解,溶液依次使用饱NaHCO3洗三次,饱和NaCl洗三次,5％KHSO4洗三次,饱和NaCl洗三次,5％NaHCO3洗三次,饱和NaCl洗三次。将乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥过夜。过滤除去Na2SO4,滤液减压浓缩,得到12.0g(97％)标题化合物,为无色固体。Mp 180-181℃,ESI/MS(m/e)484[M+H]+。
实施例2制备Boc-Tyr-Ile
将12.0g(24.8mmol)Boc-Tyr-Ile-OBzl溶解于25ml甲醇,冰浴和搅拌下加50mlNaOH(2N)水溶液调pH 14,搅拌1小时,TLC显示Boc-Tyr-Ile-OBzl消失。用2N盐酸调反应液pH至2,减压浓缩,残留物用30ml蒸馏水稀释,用乙酸乙酯萃取,每次150ml,萃取三次。合并的乙酸乙酯层用饱和NaCl水溶液洗三次,乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥过夜。过滤除,滤液减压浓缩,得到9.3g(100％)标题化合物，为无色固体。Mp 210-212℃,ESI/MS(m/e)394[M-H]-。
实施例3制备Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl
将4.6g(11.67mmol)Boc-Tyr-Ile溶解于200ml干燥的THF,加入1.73g(12.84mmol)HOBt,搅拌使溶解。冰浴及搅拌下向该溶液滴加2.88g(14.0mmol)DCC与30ml干燥THF的溶液,反应30分钟。冰浴和搅拌下将4.13g(12.24mmol)Tos·Gly-OBzl加到反应液中。向反应混合物滴加6ml NMM调反应液的PH值至9，室温反应12h，TLC显示Boc-Tyr-Ile消失。过滤出DCU，滤液减压浓缩，残留物用5ml乙酸乙酯溶解，再滤除DCU。滤液加180ml乙酸乙酯稀释并依次用饱和NaHCO3水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次，5％KHSO4水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次，5％NaHCO3水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥。过滤,减压浓缩,得6.0g(95％)标题化合物,为无色固体。Mp 160-162℃,ESI/MS(m/e)541[M+H]+。
实施例4制备Boc-Tyr-Ile-Gly
将6.0g(11.1mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl溶于15ml 25ml甲醇,冰浴和搅拌下加35ml NaOH(2N)水溶液调pH 14,搅拌1小时,TLC显示Boc-Tyr-Ile-Gly-OBzl消失。用2N盐酸调反应液pH至2,减压浓缩,残留物用30ml蒸馏水稀释,用乙酸乙酯萃取,每次150ml,萃取三次。合并的乙酸乙酯层用饱和NaCl水溶液洗三次,乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥过夜。过滤除,滤液减压浓缩,得到5.0g(100％)标题化合物，为无色固体。Mp 220-222℃,ESI/MS(m/e)ESI-MS(m/z)452[M-H]-。
实施例5制备Boc-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl
将2.80g(9.47mmol)Boc-Ser(Bzl)溶解于80ml干燥的THF中,加入1.40g(10.41mmol)HOBt,搅拌使溶解。冰浴及搅拌下向该溶液滴加2.34g(11.4mmol)DCC与30ml干燥THF的溶液,反应30分钟。冰浴和搅拌下将4.76g(9.94mmol)Tos·Arg(NO2)-OBzl加到反应液中。向反应混合物滴加4ml NMM调反应液的PH值至9，室温反应12h，TLC显示Boc-Ser(Bzl)消失。过滤出DCU，滤液减压浓缩，残留物用5ml乙酸乙酯溶解，再滤除DCU。滤液加180ml乙酸乙酯稀释并依次用饱和NaHCO3水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次，5％KHSO4水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次，5％NaHCO3水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥。过滤,减压浓缩,得5.5g(98％)标题化合物,为无色固体。ESI/MS 587[M+H]+。
实施例6制备HCl·Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl
将4.8g(8.19mmol)Boc-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl溶于30ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4N),冰浴下搅拌1小时,TLC显示Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl消失。反应液减压浓缩,残留物加5ml乙酸乙酯溶解,减压浓缩,得到的无色固体再用5ml乙酸乙酯溶解,减压浓缩。得到的无色固体用5ml乙醚溶解,减压浓缩,得到的无色固体再用5ml乙醚溶解,减压浓缩,得4.3g(100％)标题化合物。为无色粉末。ESI/MS 487[M+H]+。
实施例7制备Boc-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl
将1.78g(6.01mmol)Boc-Ser(Bzl)溶解于170ml干燥的THF中,加入0.9g(6.61mmol)HOBt,搅拌使溶解。冰浴及搅拌下向该溶液滴加1.48g(7.21mmol)DCC与20ml干燥THF的溶液,反应30分钟。冰浴和搅拌下将2.4g(6.61mmol)Tos·Lys(Bzl)-OBzl加到反应液中。向反应混合物滴加4ml NMM调反应液的PH值至9，室温反应12h，TLC显示Boc-Ser(Bzl)消失。过滤出DCU，滤液减压浓缩，残留物用5ml乙酸乙酯溶解，再滤除DCU。滤液加180ml乙酸乙酯稀释并依次用饱和NaHCO3水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次，5％KHSO4水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次，5％NaHCO3水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥。过滤,减压浓缩,得3.6g(92％)标题化合物,为无色固体。ESI/MS 648[M+H]+。
实施例8制备HCl·Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl
将5.1g(7.87mmol)Boc-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl溶于30ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4N),冰浴下搅拌1小时,TLC显示Boc-Ser(Bzl)-Lys(Bzl)-OBzl消失。反应液减压浓缩,残留物加5ml乙酸乙酯溶解,减压浓缩,得到的无色固体再用5ml乙酸乙酯溶解,减压浓缩。得到的无色固体用5ml乙醚溶解,减压浓缩,得到的无色固体再用5ml乙醚溶解,减压浓缩,得4.0g(93％)标题化合物。为无色粉末。ESI/MS 548[M+H]+。
实施例9制备Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl
将1.76g(3.89mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly溶解于100ml干燥的THF中,加入0.53g(3.89mmol)HOBt,搅拌使溶解。冰浴及搅拌下向该溶液滴加0.87g(4.24mmol)DCC与20ml干燥THF的溶液,反应30分钟。冰浴和搅拌下将1.85g(3.54mmol)HCl·Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl加到反应液中。向反应混合物滴加4ml NMM调反应液的PH值至9，室温反应12h，TLC显示Boc-Ser(Bzl)消失。过滤出DCU，滤液减压浓缩，残留物用5ml乙酸乙酯溶解，再滤除DCU。滤液加180ml乙酸乙酯稀释并依次用饱和NaHCO3水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次，5％KHSO4水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次，5％NaHCO3水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥。过滤,减压浓缩,得2.7g(75％)标题化合物,为无色固体。ESI/MS 921[M+H]+。
实施例10制备HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl
将3.1g(3.37mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl溶于25ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4N),冰浴下搅拌1小时,TLC显示Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl消失。反应液减压浓缩,残留物加5ml乙酸乙酯溶解,减压浓缩,得到的无色固体再用5ml乙酸乙酯溶解,减压浓缩。得到的无色固体用5ml乙醚溶解,减压浓缩,得到的无色固体再用5ml乙醚溶解,减压浓缩,得2.9g(100％)标题化合物。为无色粉末。ESI/MS 821[M+H]+。
实施例11制备Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl
将4.51g(10.0mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly溶解于100ml干燥的THF中,加入1.48g(11.0mmol)HOBt,搅拌使溶解。冰浴及搅拌下向该溶液滴加2.47g(12.0mmol)DCC与40ml干燥THF的溶液,反应30分钟。冰浴和搅拌下将1.85g(3.54mmol)HCl·Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl加到反应液中。向反应混合物滴加9ml NMM调反应液的PH值至9，室温反应12h，TLC显示Boc-Tyr-Ile-Gly消失。过滤出DCU，滤液减压浓缩，残留物用5ml乙酸乙酯溶解，再滤除DCU。滤液加180ml乙酸乙酯稀释并依次用饱和NaHCO3水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次，5％KHSO4水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次，5％NaHCO3水溶液洗三次，饱和NaCl水溶液洗三次。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥。过滤,减压浓缩,得7.2g(73％)标题化合物,为无色固体。ESI/MS 981[M+H]+。
实施例12制备HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Bzl)-OBzl
将5.2g(5.3mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl溶于25ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4N),冰浴下搅拌1小时,TLC显示Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl消失。反应液减压浓缩,残留物加5ml乙酸乙酯溶解,减压浓缩,得到的无色固体再用5ml乙酸乙酯溶解,减压浓缩。得到的无色固体用5ml乙醚溶解,减压浓缩,得到的无色固体再用5ml乙醚溶解,减压浓缩,得4.4g(94％)标题化合物。为无色粉末。ESI/MS 881[M+H]+。
实施例13制备(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)
搅拌下向400ml蒸馏水中滴加入1ml 98％的浓硫酸,搅拌均匀后分三次加入10.0g(50mmol)L-Trp,搅拌五分钟L-Trp溶解,滴加入10ml乙醛溶液(40％),室温反应12h后,有无色固体沉淀析出,滴加3ml浓氨水调反应溶液pH至7,静置1h,抽滤,得10.03g(87％)标题化合物,为无色固体。Mp 287-289℃.ESI/MS 231[M+H]+.[α]D 25＝-273.97(c＝0.275,H2O/CH3OH).IR(KBr)3101-2405,2962,2905,1703,1624,1595,1506,1453,1376,1072,904cm- 1.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝11.92(s,1H),10.97(s,1H),9.17(s,1H),7.45(d,J＝7.5Hz,1H),7.36(t,J＝8.0Hz,1H),7.10(t,J＝8.0Hz,1H),7.01(t,J＝7.5Hz,1H),4.22(q,J＝4.8Hz,1H),3.66(dd,J＝10.5Hz,J＝5.0Hz,1H),3.14(dd,J＝10.5Hz,J＝2.4Hz,1H),2.85(ddd,J＝10.5Hz,J＝5.0Hz,J＝2.4Hz,1H),1.38(d,J＝5.0Hz,3H)。
实施例14制备(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯
冰浴和搅拌下向50ml甲醇中缓慢滴加2.5ml(34.40mmol)SOCl2,搅拌30min,加6.6g(28.7mmol)(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸,室温反应24h。原料消失。反应混合物用20％碳酸钠水溶液中和,得到6.5g(94％)标题化合物,为浅黄色固体。ESI/MS245[M+H]+。
实施例15制备1-甲基-β-咔啉-3-羧酸甲酯
冰盐浴搅拌下将5.61g(20mmol)(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯悬浮于100ml DMF中。约3h内往该悬浮液中分次加入4.60g(28mmol)KMnO4,补加50m lDMF,继续反应1h。撤去冰盐浴,室温反应48h,监测到原料消失。加100ml无水乙醇稀释反应混合物,布氏漏斗抽滤,滤液室温下减压浓缩得浅黄色固体。黑色滤渣用150ml无水乙醇分三次浸泡,过滤,滤液减压浓缩得黄色固体。将得到的黄色固体合并,用乙醇重结晶得3.6g浅黄色固体。再经柱层析纯化得3g(83％)标题化合物,为无色固体。ESI/MS 241[M+H]+。
实施例16制备1-甲基-β-咔啉-3-羧酸(2)
将5g(20.83mmol)1-甲基-β-咔啉-3-羧酸甲酯悬浮于150ml NaOH水溶液(2N),60℃反应9h,监测原料消失,终止反应。反应液放冷至室温,用盐酸(4N)酸化至pH2,置于冰箱中静置过夜,抽滤,得3.76g(80％)标题化合物。为无色固体。Mp 292-293℃.[α]D 25＝-1.83(c＝0.4,H2O).ESI/MS 225[M-H]-.IR(KBr)3381,3277,2974,1465,1442,1409,904,867,686,640,567cm-1.1H-NMR(DMSO,500MHz)δ/ppm＝12.86(s,1H),8.98(s,1H),8.47(d,J＝7.90Hz,1H),7.75(d,J＝8.20Hz,1H),7.69(t,J＝7.3Hz,1H),7.38(t,J＝7.40Hz,1H),2.99(s,3H).13C-NMR(DMSO,125MHz)δ/ppm＝165.19,162.80,142.53,142.26,136.37,133.61,130.21,129.03,123.26,121.46,116.89,113.19,19.01。
实施例17制备1-甲基-β-咔啉-3-甲酰基-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl(3a)
使用实施例1的操作,从0.35g(1.54mmol)1-甲基-β-咔啉-3-羧酸与1.46g(1.54mmol)HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl得到0.46g(29％)标题化合物,为无色固体。Mp 126-127℃.[α]D 25＝29.01(c＝0.7,CH3OH).ESI/MS 1127[M+H]+.IR(KBr)3392,3260,3031,2979,2938,1735,1670,1623,1520,1459,1390,1369,1312,1268,1165,1108,1026,915,854,746,694,594,450cm-1。
实施例18制备1-甲基-β-咔啉-3-甲酰基-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl(3b)
使用实施例1的操作,从0.223g(0.98mmol)1-甲基-β-咔啉-3-羧酸与0.95g(1.04mmol)HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl得到0.331g(31％)标题化合物,为无色固体。Mp 122-123℃.[α]D 25＝34.10(c＝0.45,CH3OH).ESI/MS 1189[M+H]+.IR(KBr)3390,3260,2978,2936,1734,1668,1620,1525,1457,1391,1365,1314,1254,1106,1030,919,869,744,696,597,452cm-1。
实施例19制备1-甲基-β-咔啉-3-甲酰基-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(4a)
冰浴和搅拌下将0.845g(0.75mmol)1-甲基-β-咔啉-3-甲酰基-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl溶于3ml三氟醋酸,充分搅拌5分钟,往里滴加1ml三氟甲磺酸,冰浴反应2h,原料消失,加大量无水乙醚并搅拌10分钟,静置,将上层清液弃去,再加无水乙醚搅拌,静置,倾倒出上层清液,如此反复多次。减压浓缩,得到棕黄色粉末,用少量水溶解,滴加稀氨水调溶液pH至7,用SephdexG15除盐,水为洗脱剂,收集洗脱液,冻干,得到0.521g(65％)标题化合物,为淡黄色固体。Mp 139-141℃.[α]D 25＝29.14(c＝0.25,H2O/CH3OH).ESI/MS 803[M+H]+.1H-NMR(DMSO,500MHz)δ/ppm＝10.98(s,1H),8.98(s,1H),8.57(m,4H),8.47(d,J＝7.90Hz,1H),7.75(d,J＝8.20Hz,1H),7.69(t,J＝7.3Hz,1H),7.38(t,J＝7.40Hz,1H),7.03(d,J＝8.3Hz,2H),6.70(d,J＝10.2Hz,2H),5.02(s,1H),4.63(dd,J＝11.0Hz,5.2Hz,1H),4.50(m,2H),4.07(s,2H),3.96(m,1H),3.18(dd,J＝15.8Hz,5.5Hz,1H),2.99(s,3H),2.93(dd,J＝16.9Hz,11.2Hz,1H),2.51(m,1H),2.17(m,2H),1.98(m,3H),1.80(m,6H),1.31(m,2H),0.89(m,6H)。
实施例20制备1-甲基-β-咔啉-3-甲酰基-Tyr-Ile-Gly-Ser-Lys(4b)
冰浴和搅拌下将0.891g(0.75mmol)1-甲基-β-咔啉-3-甲酰基-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl溶于3ml三氟醋酸,充分搅拌5分钟,往里滴加1ml三氟甲磺酸,冰浴反应2h,原料消失,加大量无水乙醚并搅拌10分钟,静置,将上层清液弃去,再加无水乙醚搅拌,静置,倾倒出上层清液,如此反复多次。减压浓缩,得到棕黄色粉末,用少量水溶解,滴加稀氨水调溶液pH至7,用SephdexG15除盐,水为洗脱剂,收集洗脱液,冻干,得到0.303g(65％)标题化合物,为淡黄色固体。Mp 135-136℃.[α]D 25＝27.69(c＝0.25,H2O/CH3OH).ESI/MS775[M+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝10.98(s,1H),8.98(s,1H),8.57(m,4H),8.47(d,J＝7.90Hz,1H),7.75(d,J＝8.20Hz,1H),7.69(t,J＝7.3Hz,1H),7.38(t,J＝7.40Hz,1H),7.03(d,J＝8.3Hz,2H),6.70(d,J＝10Hz,2H),5.02(s,1H),4.63(dd,J＝11.0Hz,5.2Hz,1H),4.53(m,1H),4.07(s,2H),3.96(m,1H),3.18(dd,J＝15.8Hz,5.5Hz,1H),2.99(s,3H),2.93(dd,J＝16.9Hz,11.2Hz,1H),2.68(m,2H),2.51(m,1H),2.17(m,2H),1.98(m,3H),1.55(m,6H),1.31(m,2H),0.89(m,6H)。
试验例1评价4a,b的抗血小板聚集活性
取新鲜的猪血用3.8％枸橼酸钠抗凝(V枸橼酸钠:V猪血＝9:1),然后1000r/min离心10分钟得富血小板血浆,再以3000r/min离心10分钟,得贫血小板血浆。以ADP(二磷酸腺苷,终浓度1×10-5M),PAF(血小板活化因子,终浓度1×10-7M),TH(凝血酶,终浓度1U/ml)和AA(花生四烯酸,终浓度0.15mg/ml)为诱导剂诱导血小板聚集。分别测试化合物2及4a,b在10mM,0.1mM,0.01mM,1μM,0.1μM,0.01μM,0.001μM浓度下的血小板聚集率，计算IC50。结果列入表1。结果表明,4a,b可有效地抑制PAF,TH和AA诱导的血小板聚集。
表1 4a,b的抗血小板聚集作用(n＝6)
试验例2评价4a,b的口服抗血栓活性
实验前将4a,b配成0.33nM的生理盐水溶液(加入少量的吐温80润湿助溶),用于口服的剂量为0.001nmol/kg。1配成0.33nM的生理盐水溶液(加入少量的吐温80润湿助溶),用于口服的剂量为10nmol/kg。YIGS肽配成0.33nM的生理盐水溶液,用于口服的剂量为100nmol/kg。阳性药Asprin配成10g/L的生理盐水溶液,即55.5mM的浓度,用于体内的剂量为167mmol/kg。空白对照为生理盐水,抗凝剂为肝素钠2.4mg/ml生理盐水溶液。将雄性SD大鼠随机分组,n＝12,以(3ml/kg)给大鼠灌胃,30分钟后,用乌拉坦(20g/100ml,7ml/kg),麻醉后,分离右颈动脉和左颈静脉。把一根6cm长的事先精密称重的丝线放在聚乙烯管中,将插管充满肝素钠的生理盐水溶液(50IU/ml)后,一端插入左侧静脉,从一端加入定量肝素钠抗凝,然后插入右侧动脉。血流从右侧动脉流经聚乙烯管流入左侧静脉。15min后取出附有血栓的丝线,在滤纸上轻轻蘸掉血滴,放入事先称重好的离心管中,精确称重并记录。减重法计算出血栓的湿重。并记录湿重。每个化合物重复12次给药。统计各组的血栓湿重并做t检验。结果表明4a,b有非常好的剂量依赖的抗血栓活性(表2)有效剂量低至0.001nmol/kg。
表2 4a,b的口服抗血栓活性
n＝12；a)与生理盐水比p<0.01。

Claims (3)

1.通式I代表的1-甲基-β-咔啉-3-甲酰YIGS肽,其肽链中的AA为Arg或Lys，
2.制备权利要求1的1-甲基-β-咔啉-3-甲酰YIGS肽的方法,该方法由以下步骤构成:
(1)在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下采用液相法制备Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl和Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl；
(2)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中将Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl和Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl脱除Boc,生成HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl和HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl；
(3)在稀硫酸中,室温下,L-Trp与乙醛反应12h直接生成(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸,并以无色固体的形态从反应液中沉淀析出；
(4)将(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯化,生成(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯；
(5)将(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯氧化,生成1-甲基-β-咔啉-3-羧酸甲酯；
(6)将1-甲基-β-咔啉-3-羧酸甲酯皂化,生成1-甲基-β-咔啉-3-羧酸；
(7)在DCC和HOBt存在下将1-甲基-β-咔啉-3-羧酸的3-羧基与HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl和HCl·Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl偶联生成1-甲基-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl和1-甲基-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl；
(8)在三氟乙酸中,在三氟甲磺酸存在下将1-甲基-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(NO2)-OBzl和1-甲基-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OBzl脱保护基生成1-甲基-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg和1-甲基-β-咔啉-3-甲酰-Tyr-Ile-Gly-Ser-Lys。
3.权利要求1的1-甲基-β-咔啉-3-甲酰YIGS肽在制备抗血栓剂中的应用。
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