CN107683849A - 一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液、制备方法及其使用方法 - Google Patents

一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液、制备方法及其使用方法 Download PDF

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刘俊江
时兆田
白志惠
王俊
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Abstract

本发明公开了一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液，由以下组分组成：1‑10％的二甲基亚砜、0.1‑2％的葡萄糖、0.1‑2％的赖氨酸、0.1‑2％的精氨酸、0.1‑2％的鸟氨酸、0.1‑2％的谷胱甘肽、0.001‑0.05％的药物组合物，余量为水。本发明的直接静脉应用的间充质干细胞冻存液，冷冻保存的间充质干细胞的细胞存活率高，操作简单，快速高效，组分安全，可以直接应用于静脉。

Description

一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液、制备方法及其使 用方法
技术领域
本发明属于干细胞保藏领域，具体涉及一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液。
背景技术
干细胞具有自我更新和分化为其它类型细胞的能力，因而在临床上的应用也越来越广泛。临床上研究较早的干细胞是神经干细胞和胚胎干细胞。但神经干细胞只能分化成为神经细胞，因而临床应用受限。而胚胎干细胞虽然能分化为多种不同的组织，但与之相关的法律和道德问题限制了胚胎干细胞的临床应用。
间充质干细胞，又称多潜能基质细胞，简称MSCs，是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，包括：骨髓、脐带、脂肪、粘膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、羊膜、胎盘等。在适宜条件下可分化为脂肪、骨、软骨等多种组织细胞。
分离得到的间充质干细胞，从分离到使用一般间隔比较长的时间，一般采用超低温液氮冷冻保存。间充质干细胞冻存液对于冷冻保存后解冻的细胞存活率影响很大。在临床应用中，需要足够量的间充质干细胞才能在人体内发挥作用，因此间充质干细胞的细胞存活率非常重要。同时在间充质干细胞冻存液中含有不适宜直接静脉应用的成分时，比如外源蛋白或者致敏原，应用前需要多次反复洗涤间充质干细胞，步骤繁琐，增加操作时间，影响间充质干细胞的细胞存活率。
发明内容
针对上述问题，本发明的发明人提出了一种间充质干细胞冻存液，直接静脉应用，细胞存活率高。
本发明的第一个方面在于公开一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液，由以下组分组成：1-10％的二甲基亚砜、0.1-2％的葡萄糖、0.1-2％的赖氨酸、0.1-2％的精氨酸、0.1-2％的鸟氨酸、0.1-2％的谷胱甘肽、0.001-0.05％的药物组合物，余量为水；以上百分比除了二甲基亚砜为体积/体积百分比外，其余均为重量/体积百分比。
优选的，所述中药中药组合物包括石斛多糖、丹参酮ⅡA和川穹嗪，所述石斛多糖、丹参酮ⅡA和川穹嗪的重量比为1:1:3。
优选的，所述石斛多糖的提取方法包括以下步骤：
S1，选取生长3年的人工栽培的霍山石斛，除叶，去根，茎剪段，自然风干；
S2，研磨成粉，用20倍体积的去离子水在60℃提取1h，离心，用10倍体积的去离子水在80℃提取3.5h，重复提取一次，离心，合并上清液；
S3，加入4倍体积的95％乙醇，静置12h，过滤，得到石斛多糖。
优选的，由以下组分组成：5％的二甲基亚砜、0.5％的葡萄糖、1％的赖氨酸、1％的精氨酸、1％的鸟氨酸、0.5％的谷胱甘肽、0.01％的中药组合物，余量为水；以上百分比除了二甲基亚砜为体积/体积百分比外，其余均为重量/体积百分比。
优选的，由以下组分组成：5％的二甲基亚砜、0.5％的葡萄糖、1％的赖氨酸、1％的精氨酸、1％的鸟氨酸、0.5％的谷胱甘肽、0.002％的石斛多糖、0.002％的丹参酮ⅡA、0.006％川穹嗪，余量为水；以上百分比除了二甲基亚砜为体积/体积百分比外，其余均为重量/体积百分比。
本发明的第二个方面在于公开第一方面冻存液的制备方法，包括以下步骤：
S1，取二甲基亚砜，加入10倍体积的去离子水，搅匀，得到溶液A；
S2，取石斛多糖、加入10倍体积的去离子水，搅匀，依次加入丹参酮ⅡA和川穹嗪，搅匀，得到溶液B；
S3，取二分之一目标体积的去离子水，依次加入葡萄糖、谷胱甘肽、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸搅匀，得到溶液C；
S4，溶液A和溶液B加入到溶液C中，用去离子水定容止目标体积，搅匀，过滤除菌。
本发明的第三个方面在于公开第一方面冻存液的使用方法，包括以下步骤：
S11，取间充质干细胞，用磷酸缓冲液悬浮，控制细胞密度在106-108/mL之间；
S12，间充质干细胞悬浮液，在15℃预冷5-30min；
S13，经15℃预冷的间充质干细胞悬浮液，在4℃预冷0.5-2h；
S14，经4℃预冷的间充质干细胞悬浮液，按1:1体积比加入到预冷至4℃的冻存液中，混合均匀，得到冷冻保存样品；
S15，冷冻保存样品，快速降温至-20℃；
S16，-20℃冷冻保存样品，保存于液氮罐中。
优选的，快速降温至-20℃的降温速度为5-10摄氏度/min。
优选的，还包括以下步骤：S17，从液氮罐中取出冷冻保存样品，在恒温20±1℃水浴加热30-60min，解冻。
本发明的有益效果：
本发明的直接静脉应用的间充质干细胞冻存液，冷冻保存的间充质干细胞的细胞存活率高，操作简单，快速高效，组分安全，可以直接应用于静脉。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但足本领域技术人员将会理解，下列实施例仅于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液，由以下组分组成：1％的二甲基亚砜、0.1％的葡萄糖、0.1％的赖氨酸、0.1％的精氨酸、0.1％的鸟氨酸、0.1％的谷胱甘肽、0.0002％的石斛多糖、0.0002％的丹参酮ⅡA、0.0006％川穹嗪，余量为水；以上百分比除了二甲基亚砜为体积/体积百分比外，其余均为重量/体积百分比。
实施例2
实施例1的冻存液的制备方法，包括以下步骤：
S1，取二甲基亚砜，加入10倍体积的去离子水，搅匀，得到溶液A；
S2，取石斛多糖、加入10倍体积的去离子水，搅匀，依次加入丹参酮ⅡA和川穹嗪，搅匀，得到溶液B；
S3，取二分之一目标体积的去离子水，依次加入葡萄糖、谷胱甘肽、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸搅匀，得到溶液C；
S4，溶液A和溶液B加入到溶液C中，用去离子水定容止目标体积，搅匀，过滤除菌。
实施例3
实施例1的冻存液的使用方法，包括以下步骤：
S11，取间充质干细胞，用磷酸缓冲液悬浮，控制细胞密度在106-108/mL之间；
S12，间充质干细胞悬浮液，在15℃预冷5-30min；
S13，经15℃预冷的间充质干细胞悬浮液，在4℃预冷0.5-2h；
S14，经4℃预冷的间充质干细胞悬浮液，按1:1体积比加入到预冷至4℃的冻存液中，混合均匀，得到冷冻保存样品；
S15，冷冻保存样品，快速降温至-20℃；快速降温至-20℃的降温速度为5-10摄氏度/min；
S16，-20℃冷冻保存样品，保存于液氮罐中。
S17，从液氮罐中取出冷冻保存样品，在恒温20±1℃水浴加热30-60min，解冻。
实施例4
一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液，由以下组分组成：10％的二甲基亚砜、2％的葡萄糖、2％的赖氨酸、2％的精氨酸、2％的鸟氨酸、2％的谷胱甘肽、0.02％的石斛多糖、0.02％的丹参酮ⅡA、0.01％川穹嗪，余量为水；以上百分比除了二甲基亚砜为体积/体积百分比外，其余均为重量/体积百分比。
实施例5
一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液，由以下组分组成：5％的二甲基亚砜、0.5％的葡萄糖、1％的赖氨酸、1％的精氨酸、1％的鸟氨酸、0.5％的谷胱甘肽、0.002％的石斛多糖、0.002％的丹参酮ⅡA、0.006％川穹嗪，余量为水；以上百分比除了二甲基亚砜为体积/体积百分比外，其余均为重量/体积百分比。
实施例6
实施例1的所述石斛多糖的提取方法包括以下步骤：
S1，选取生长3年的人工栽培的霍山石斛，除叶，去根，茎剪段，自然风干；
S2，研磨成粉，用20倍体积的去离子水在60℃提取1h，离心，用10倍体积的去离子水在80℃提取3.5h，重复提取一次，离心，合并上清液；
S3，加入4倍体积的95％乙醇，静置12h，过滤，得到石斛多糖。
对照例1
一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液，由以下组分组成：1％的二甲基亚砜、0.1％的鸟氨酸、0.1％的谷胱甘肽、0.0002％的石斛多糖、0.0003％的丹参酮ⅡA、0.0005％川穹嗪，余量为水；以上百分比除了二甲基亚砜为体积/体积百分比外，其余均为重量/体积百分比。
对照例2
一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液，由以下组分组成：1％的二甲基亚砜、0.1％的葡萄糖、0.1％的赖氨酸、0.1％的精氨酸、0.1％的鸟氨酸、0.1％的谷胱甘肽、0.0002％的石斛多糖，余量为水；以上百分比除了二甲基亚砜为体积/体积百分比外，其余均为重量/体积百分比。
对照例3
一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液，由以下组分组成：1％的二甲基亚砜、0.1％的葡萄糖、0.1％的赖氨酸、0.1％的精氨酸、0.1％的鸟氨酸、0.1％的谷胱甘肽、0.0003％的石斛多糖、0.0003％的丹参酮ⅡA、0.0004％川穹嗪，余量为水；以上百分比除了二甲基亚砜为体积/体积百分比外，其余均为重量/体积百分比。
实验例一本发明实施例和对照例的间充质干细胞冻存液的效果评价
以实施例1、4、5，按照实施例2的方法，对照例1-3的组分，按照实施例2的方法，即没有相应的组分则不添加，制成间充质干细胞冻存液，按照实施例3的使用方法对来自人脂肪间充质干细胞进行超低温保藏，保藏48h后解冻。解冻后的间充质干细胞，离心，用生理盐水悬浮，用台盼蓝染色法测定细胞存活率。结果见表1。
表1发明实施例和对照例的冻存液对细胞存活率的影响
细胞存活率(％)
对照例1 35*
对照例2 47*
对照例3 42*
对照例4 78**
实施例1 85***
实施例4 81***
实施例5 95****
*符号数目相同表示没有显著性差异，数目不同表示有显著性差异(P<0.05)
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (9)

1.一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液，其特征在于，由以下组分组成：
1-10％的二甲基亚砜、0.1-2％的葡萄糖、0.1-2％的赖氨酸、0.1-2％的精氨酸、0.1-2％的鸟氨酸、0.1-2％的谷胱甘肽、0.001-0.05％的药物组合物，余量为水；以上百分比除了二甲基亚砜为体积/体积百分比外，其余均为重量/体积百分比。
2.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述药物组合物包括石斛多糖、丹参酮ⅡA和川穹嗪；所述石斛多糖、丹参酮ⅡA和川穹嗪的重量比为1:1:3。
3.如权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述石斛多糖的提取方法包括以下步骤：
S 1，选取生长3年的人工栽培的霍山石斛，除叶，去根，茎剪段，自然风干；
S2，研磨成粉，用20倍体积的去离子水在60℃提取1h，离心，用10倍体积的去离子水在80℃提取3.5h，重复提取一次，离心，合并上清液；
S3，加入4倍体积的95％乙醇，静置12h，过滤，得到石斛多糖。
4.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，由以下组分组成：
5％的二甲基亚砜、0.5％的葡萄糖、1％的赖氨酸、1％的精氨酸、1％的鸟氨酸、0.5％的谷胱甘肽、0.01％的中药组合物，余量为水；以上百分比除了二甲基亚砜为体积/体积百分比外，其余均为重量/体积百分比。
5.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，由以下组分组成：
5％的二甲基亚砜、0.5％的葡萄糖、1％的赖氨酸、1％的精氨酸、1％的鸟氨酸、0.5％的谷胱甘肽、0.002％的石斛多糖、0.002％的丹参酮ⅡA、0.006％川穹嗪，余量为水；以上百分比除了二甲基亚砜为体积/体积百分比外，其余均为重量/体积百分比。
6.如权利要求1-5任一所述的冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，取二甲基亚砜，加入10倍体积的去离子水，搅匀，得到溶液A；
S2，取石斛多糖、加入10倍体积的去离子水，搅匀，依次加入丹参酮ⅡA和川穹嗪，搅匀，得到溶液B；
S3，取二分之一目标体积的去离子水，依次加入葡萄糖、谷胱甘肽、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸搅匀，得到溶液C；
S4，溶液A和溶液B加入到溶液C中，用去离子水定容止目标体积，搅匀，过滤除菌。
7.如权利要求1-5任一所述的冻存液的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11，取间充质干细胞，用磷酸缓冲液悬浮，控制细胞密度在106-108/mL之间；
S12，间充质干细胞悬浮液，在15℃预冷5-30min；
S13，经15℃预冷的间充质干细胞悬浮液，在4℃预冷0.5-2h；
S14，经4℃预冷的间充质干细胞悬浮液，按1:1体积比加入到预冷至4℃的冻存液中，混合均匀，得到冷冻保存样品；
S15，冷冻保存样品，快速降温至-20℃；
S16，-20℃冷冻保存样品，保存于液氮罐中。
8.如权利要求7所述的冻存液的使用方法，其特征在于，快速降温至-20℃的降温速度为5-10摄氏度/min。
9.如权利要求7所述的冻存液的使用方法，其特征在于，还包括以下步骤：
S17，从液氮罐中取出冷冻保存样品，在恒温20±1℃水浴加热30-60min，解冻。
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