CN107660148B - 用于预防或治疗器官损伤的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于通过恢复内皮功能和/或抑制活性氧物质产生来预防或治疗器官损伤的化合物，特别是用于预防或治疗糖尿病肾损伤的化合物。具体地，本发明涉及(6‑羟基‑2,5,7,8‑四甲基色满‑2‑基)(哌嗪‑1‑基)甲酮或N,6‑二羟基‑2,5,7,8‑四甲基色满‑2‑甲酰胺或其药学上可接受的盐或碱，其用于通过恢复内皮功能和/或抑制活性氧物质产生来预防或治疗器官损伤，特别是糖尿病肾器官损伤。

Description

用于预防或治疗器官损伤的化合物
技术领域
本发明涉及通过恢复内皮功能和/或抑制活性氧物质产生来预防或治疗器官损伤的化合物，特别是涉及预防或治疗糖尿病肾损伤的化合物。
背景技术
糖尿病肾病(糖尿病性肾病)也称为结节性糖尿病肾小球硬化症或毛细血管内肾小球肾炎，是由肾小球毛细血管的血管病引起的进行性肾脏疾病。其特点在于肾病综合征和弥漫性肾小球硬化。糖尿病肾病一般由长期糖尿病引起，是许多发达国家中透析的首选指标。
由肾小球硬化引起的肾衰竭导致体液过滤缺陷和其它肾功能紊乱。血压增加(高血压)和体液滞留，加上血浆渗透压降低，引起水肿。其它并发症可能是肾动脉的动脉硬化和尿蛋白。
第一实验室异常通常为微量白蛋白尿检测阳性。当糖尿病患者常规尿液分析显示尿蛋白过多(蛋白尿)时，怀疑有糖尿病肾病。尿液分析也可能显示尿液中的葡萄糖，尤其是如果血糖控制不好的话。血清肌酐和血尿素氮可能随着肾脏损害的进展而增加。如果情况明确地是蛋白尿随时间的记录进展以及眼睛视网膜检查为糖尿病视网膜病变的存在，虽然并非总是必要的，但肾活检通常证实了诊断。
肾小球超滤是导致肾小球内高血压的糖尿病肾病的基本病理生理学。通过阻止这一步骤，ACE抑制剂药物有助于预防糖尿病肾病。肾小球超滤的发展导致基底膜增厚的阶段。这是糖尿病肾病过程中最早可检测到的变化。接着是系膜扩张，最后是结节性硬化。在这个阶段，肾脏可能会比正常的尿蛋白(白蛋白尿)渗漏出更多的血清白蛋白(血浆蛋白)，这能够通过白蛋白的医学检测来检测。随着糖尿病肾病的发展，越来越多的肾小球被进行性结节性肾小球硬化症所破坏。肾活检通常清楚地显示糖尿病肾病。糖尿病肾病通常先于糖尿病视网膜病变的发作；没有视网膜病变的肾病证据使人怀疑肾脏损害不是由糖尿病本身引起的，而是合并症(例如肾小球肾炎)的结果。
糖尿病肾病的治疗目标是减缓肾损害的发展并且控制相关并发症。一旦蛋白尿建立，主要的治疗方法是使用ACE抑制剂药物，其通常降低蛋白尿水平，减缓糖尿病肾病的发展。可能有助于肾脏保护的ACEIs的一些作用已经与激肽的上升相关，其也负责与ACEIs治疗(例如干咳)相关的一些副作用。肾脏保护作用与正常和高血压患者的降压作用有关，肾血管舒张导致肾血流量增加和传出小动脉扩张。许多研究表明，相关的药物血管紧张素受体阻滞剂(ARBs)也有类似的好处。
发明内容
有几种化合物正在为糖尿病肾病而研发。这些化合物包括甲基巴多索隆、奥美沙坦酯、舒洛地昔、NOX-E36和阿伏生坦。
然而，尽管如此，本领域仍然不断需要用于预防或治疗糖尿病肾病或糖尿病肾疾病的其它化合物。
除了其它目的以外，本发明的目的是满足本领域中的上述需求。
根据本发明，通过提供如所附权利要求中概述的化合物来满足上述目的以及其它目的。
具体地，除了其它目的之外，本发明通过根据式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或碱来满足上述目的，其用于通过恢复内皮功能和/或抑制活性氧物质产生来预防或治疗器官损伤，优选地，其中所述器官损伤是糖尿病器官损伤和/或所述器官是肾，
Figure BDA0001477601780000031
-其中，R1和R2可以相同或不同，并且表示C1-C4直链或支链烷基；
-其中，R3表示可以在活组织中去除的氢或前药部分；优选地，R3与6-氧一起形成酯基。R3可以具有1-12个碳原子，优选地1-6个碳原子，并且可以包含一个或多个胺或氧原子；
-n可以为0或1，优选为1；
-R4是包含1-20个碳原子和至少一个氮原子的基团；R4可以进一步包含氮原子、一个或多个氧原子、卤素、硫或磷原子，并且R4可以包含芳族基团，其中，R4的分子量优选地小于300Da。
如将认识到的，式(I)化合物衍生自维生素E的水溶性类似物trolox。在trolox中，R1和R2是甲基，R3是氢，并且R4是羧酸。
具体地，本发明通过根据式(II)的化合物
Figure BDA0001477601780000032
(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮(II)
或其药学上可接受的盐或碱来满足上述目的以及其它目的，其用于通过恢复内皮功能和/或抑制活性氧物质产生来预防或治疗器官损伤，优选地，其中所述器官损伤是糖尿病器官损伤和/或所述器官是肾，
根据本发明，根据另一方面，除了其它目的之外，通过根据式(III)的化合物
Figure BDA0001477601780000041
N,6-二羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺(III)
或其药学上可接受的盐或碱来满足上述目的，其用于通过恢复内皮功能和/或抑制活性氧物质产生来预防或治疗器官损伤，优选地，其中所述器官损伤是糖尿病器官损伤和/或所述器官是肾，
根据本发明，根据另一方面，除了其它目的之外，通过选自由以下化合物组成的组(称为“A组”)的化合物来满足上述目的：2,2,5,7,8-五甲基色满-6-醇；(S)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸；(R)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸；6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；N-丁基-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；6-羟基-N-异丙基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；(E)-N-(3,7-二甲基辛-2,6-二烯-1-基)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(吗啉代)甲酮；N-(4-氟苄基)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；6-羟基-N-((S)-2-羟基-1-苯基乙基)-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；6-羟基-2,5,7,8-四甲基-N-(2-(甲基氨基)乙基)色满-2-甲酰胺；6-羟基-N,2,5,7,8-五甲基-N-(2-(甲基氨基)乙基)色满-2-甲酰胺；6-羟基-2,5,7,8-四甲基-N-(3-(哌啶-1-基)丙基)色满-2-甲酰胺；6-羟基-2,5,7,8-四甲基-N-(3-硝基苯基)色满-2-甲酰胺；N-(4-氟苯基)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；4-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰氨基)苯甲酸甲酯；(4-丁基哌嗪-1-基)(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)甲酮；(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)甲酮；((2S，5R)-4-烯丙基-2,5-二甲基哌嗪-1-基)(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)甲酮；N-((R)-2-氨基-2-氧代-1-苯基乙基)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)((S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)甲酮；N-(2-溴乙基)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；N'-(2-氰基乙基)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-碳酰肼；2-(((4-氟苄基)氨基)甲基)-2,5,7,8-四甲基-6-醇；2-((丁基氨基)甲基)-2,5,7,8-四甲基色满-6-醇；6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-羧酸；2-(羟基甲基)-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-6-醇；6-羟基-N-((R)-1-羟基丙-2-基)-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(4-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲酮；N-(2-氰基乙基)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；6-羟基-N-(2-((2-羟基乙基)(甲基)氨基)乙基)-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；(R)-N,6-二羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；(S)-N,6-二羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺；2-(((S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)甲基)-2,5,7,8-四甲基色满-6-醇；2-((((S)-2-羟基-1-苯基乙基)氨基)甲基)-2,5,7,8-四甲基色满-6-醇；2,5,7,8-四甲基-2-(哌啶-1-基甲基)色满-6-醇；N,6-二羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-甲酰胺；(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)甲酮；(6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-基)(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)甲酮；2-(((S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)甲基)-2,5,7,8-四甲基色满-6-醇；2-(((S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)甲基)-2,5,7,8-四甲基色满-6-醇；2-(4-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)哌嗪-1-基)乙酸；(6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮；(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)甲酮；2-(4-(6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-羰基)哌嗪-1-基)乙酸；2-(4-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)哌嗪-1-基)乙酸乙酯；(S)-2-(4-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)哌嗪-1-基)乙酸；(R)-2-(4-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)哌嗪-1-基)乙酸；(2S)-1-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)吡咯烷-2-羧酸；(2S)-1-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)吡咯烷-2-羧酸；(2S)-1-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)吡咯烷-2-羧酸及其药学上可接受的盐或碱，其用于通过恢复内皮功能和/或抑制活性氧物质产生来预防或治疗器官损伤，优选地，其中所述器官损伤是糖尿病器官损伤和/或所述器官是肾。
本发明人惊奇地发现，本发明根据式(I)的化合物，最优选为(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮或N,6-二羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酰胺，在糖尿病小鼠模型中对恢复内皮功能和/或抑制活性氧物质具有显著作用，通过在器官中恢复内皮功能和/或抑制活性氧物质产生，从而使其适用于预防或治疗器官损伤，尤其是在糖尿病肾病或糖尿病肾疾病中。
根据本发明的优选实施方式，本发明的预防或治疗包括施用治疗有效剂量的本发明化合物例如根据式(I)、(II)和(III)或根据A组的化合物。
根据式(I)的化合物，
Figure BDA0001477601780000061
优选地具有以下特征：
R1和R2可以相同或不同，并且表示C1-C4直链或支链烷基。优选地，R1和R2是甲基、乙基或异丙基，最优选地，R1和R3相同，并且是甲基或异丙基。其它合适的基团是正丁基和叔丁基。
R3表示能够在活组织中去除的氢或前药部分。优选地，R3与6-氧一起形成酯基。R3可以具有1-12个碳原子，优选地1-6个碳原子，并且可以包含一个或多个胺或氧原子。合适的基团(与6-氧一起)包括乙基酯、丁基酯、苯甲酰基酯、或氨基酸的酯、或氨基酸，其中氨基用具有1-4个碳原子的烷基羧酸酰胺化。在优选的实施方式中，R3是氢。
n可以为0或1，优选为1；
R4是包含1-20个碳原子和至少一个氮原子的基团。R4可以进一步包含氮原子、一个或多个氧原子、卤素、硫或磷原子，并且R4可以包含芳族基团。
R4的分子量优选地小于300Da。
优选地，根据式(I)的化合物具有低于500Da的分子量。
优选地，根据式(I)的化合物不含芳族杂环。
优选地，R4包含羰基，并且最优选地，与trolox部分连接的羰基。
在一个优选的实施方式中，R4是-CO-N-R5，其中C＝O与trolox部分结合，并且其中R5是任选地由氮或氧取代的烷基，其中烷基包含1-12个碳原子，并且其中氮可以是胺、季胺、胍或亚胺，并且氧可以是羟基、羰基或羧酸。氧和氮一起可以形成酰胺、脲或氨基甲酸酯基团。
R5中的烷基可以是直链、支链或环状的，并且优选地包含至少一个环状结构。
由式(I)表示的化合物可以根据已知的化学合成来制备。
例如，在EP202580中描述了具有胍基或通过烷基连接到trolox部分的哌嗪基的化合物。可以使用类似的合成，其中6-氧被保护，并在合成后释放，或用前药部分保护。
例如，在US461890中描述了具有烟酸酯基作为取代基的化合物。与trolox部分的6-氧连接的烟酸酯能够作为前药部分，其在体内水解成游离羟基。
例如，在WO88/08424的实施例18-23和78-164中描述了合适的化合物。
例如，在WO97/41121的制备例1、6、7、12-15、21、24和27中描述了合适的化合物，其中苯甲酰基可以去除，或者可以作为前药部分。
在例如WO03/024943中描述了其它化合物，例如化合物9-11、25-28、109-112、119-122等。
例如，在WO2014/011047中描述了具有季铵基的化合物，包括实施例中对合成的描述。
附图说明
本发明将在下面的实施例中进一步详述。在这些实施例中，参考了附图，其中：
图1示出了SUL121治疗的糖尿病和非糖尿病小鼠的代谢数据。A)体重，B)水摄入量，C)尿量，D)非空腹血糖水平，E)血压。*p<0.05糖尿病SUL121与糖尿病对照；
图2示出了终端的器官重量。*p<0.05糖尿病SUL121与糖尿病对照。#p<0.05糖尿病与野生型对照；
图3示出了糖尿病动物的尿白蛋白排泄和ACR比率。*、#p<0.05糖尿病SUL121与糖尿病对照；
图4示出了糖尿病动物的FGS评分通过SUL121治疗显著降低；
图5示出了SUL121治疗恢复内皮介导的舒张；
图6示出了SUL121治疗使糖尿病中的血浆H2O2水平标准化；
图7示出了SUL121治疗使高葡萄糖诱导的细胞ROS产生标准化；以及
图8示出了不同参数之间的相关性。
具体实施方式
实施例
实施例1：几种化合物的合成
根据本发明的化合物能够根据本领域技术人员公知的标准合成方法来合成。SUL-0083、SUL-0084和SUL-0085是可商购的。下面的表1提供了本发明化合物的总结，作为本文中使用的本发明化合物的可互换的任意指示(代码)。
表1：根据本发明的几种化合物
Figure BDA0001477601780000081
Figure BDA0001477601780000091
Figure BDA0001477601780000101
SUL089-112、114-117、120-126、128-130、132、134-135、138和140的合成
通过在用于酰胺形成的标准偶合试剂(例如HATU和CDI)的存在下与合适的胺反应来实现trolox的酰胺化。通过用BH3还原形成的酰胺来制备相应的胺。通过与羟胺/CDI反应来制备异羟肟酸衍生物。通过与(取代的)肼反应来实现trolox的碳酰肼类似物的合成。从光学纯的(R)-或(S)-Trolox开始或通过手性色谱来制备对映体/非对映体化合物。
Figure BDA0001477601780000111
SUL-118、SUL-119和SUL-146的合成
用salen配体与钴的配合物salcomine氧化可商购的丙泊酚，接着用NaBH4还原，以得到2,6-二异丙基苯-1,4-二酚。随后用HCO/SnCl2/HCl甲基化并与甲基丙烯酸甲酯反应，以得到SUL-146(6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-羧酸甲酯)。用LiOH水解，以得到羧酸SUL-118(6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-羧酸)。通过用LiAlH4还原SUL-146，以获得醇SUL-119(2-(羟基甲基)-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-6-醇)。
Figure BDA0001477601780000121
SUL-131、SUL-133、SUL-137和SUL-146的合成
从羧酸SUL-118(6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-羧酸)开始，使用CDI作为偶联剂，通过与羟胺反应以得到羟胺。通过使SUL-118与适当的哌嗪衍生物反应来制备化合物SUL133((6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-基)(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)甲酮)和SUL137((6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮)。偶联试剂HATU和CDI都产生令人满意的产率。通过用乙醛酸还原胺化SUL137((6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮)来制备SUL139(2-(4-(6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-羰基)哌嗪-1-基)乙酸)。
Figure BDA0001477601780000131
SUL-136、SUL-141和SUL-142的合成
在N2气氛下水解SUL-140(2-(4-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)哌嗪-1-基)乙酸乙酯)，以高收率得到SUL-136(2-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)哌嗪-1-基)乙酸)。根据上述条件制备对映异构体SUL-141和SUL-142。
Figure BDA0001477601780000132
SUL143、144和145的合成
用(S)-甲基吡咯烷-2-羧酸酯(L-脯氨酸甲酯)酰胺化trolox，在柱色谱后得到两种非对映异构体。随后水解各个非对映异构体，以得到SUL-144((2S)-1-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)吡咯烷-2-羧酸(非对映异构体1))和SUL-145((2S)-1-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)吡咯烷-2-羧酸(非对映异构体2))。通过混合各个非对映异构体的酯，接着通过使用LiOH水解酯部分，以获得外消旋类似物SUL-143((2S)-1-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)吡咯烷-2-羧酸)。
Figure BDA0001477601780000141
Trolox的酰胺化(通常示例)
将Trolox(11g，0.044mol，1当量)悬浮于乙腈(100-150ml)中。分批加入CDI(8.6g，0.053mol，1.2当量)。将反应混合物在室温下搅拌0.5-1小时。加入1-丁基哌嗪(6.9g，0.048mol，1.1当量)后，将反应混合物在25-30℃下搅拌过周末。将反应混合物浓缩，加入H2O(200ml)，并用EtOAc(4X)萃取水层。将合并的有机层干燥、过滤并浓缩。通过柱色谱(DCM/10％MeOH)纯化获得的粗产物，以得到目标化合物(9g产物，82％纯度)。从EtOAc/庚烷中结晶，以得到白色固体SUL-108(6g，0.016mol，36％产率，90％纯度)。将获得的物质溶于DCM(50-100ml)中。加入HCl(4M的二噁烷，8.8ml，0.0035mol，2.2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌过周末。过滤混合物，用DCM冲洗，并干燥，以得到白色固体SUL-108的HCl盐(6.3g，97-98％纯度)。
1H-NMR(CDCl3,ppm):0.93(t,3H),1.38(m,2H),1.58(s,3H),1.67(m,2H),2.09(s,3H),2.12(s,3H),2.15(s,3H),2.50-3.20(m,14H).M+＝375.3
Trolox酰胺的还原(通常示例)
SUL-128.(2-(((S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)甲基)-2,5,7,8-四甲基色满-6-醇).HCl
将BH3.THF的THF溶液(16ml，0.0156mol，2当量)冷却至T＝0℃。逐滴加入SUL-122((6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)((S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)甲酮的溶液；2.6g，0.0078mol，1当量)的THF溶液(50ml)，将反应混合物回流1小时，并冷却至室温过夜。将反应混合物在冰浴上冷却，并逐滴加入HCl(6M，25ml)。加入DCM(100ml)并分层。用DCM(3X)萃取水层。用K2CO3干燥合并的有机层，直到不再有气体形成。将有机相过滤并浓缩。粗产物在冰浴上冷却，并逐滴加入NaOH(6M，50ml)。加入后，将反应混合物搅拌1小时，并用DCM(4X)萃取。将合并的DCM层干燥、过滤并浓缩，以得到1.6g粗产物(20-40％纯度)。通过柱色谱纯化该物质，得到SUL-128(300mg，0.94mmol，产率12％，纯度90％)。将其溶于DCM(10ml)中并冷却至T＝0℃(冰浴)。加入HCl(4M的二噁烷溶液，0.3ml，0.94mmol，1.2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。过滤形成的固体，用Et2O洗涤并干燥，以得到作为白色固体(非对映异构体的混合物)的SUL-128的HCl盐(300mg，90％纯度)。
1H-NMR(CDCl3,ppm):1.20-1.90(m,7H),2.12(s,6H),2.17(s,3H),2.20-2.90(m,9H),3.4-3.65(m,2H).M+＝320.1
2,6-二异丙基环己-2,5-二烯-1,4-二酮的合成
将丙泊酚(100g，561mmol)溶于DMF(250mL)中。将溶液冷却至0℃，同时搅拌。加入Salcomine(16.6g，51mmol；9mol％)，将所得反应混合物搅拌112h过夜，同时温热至室温。将反应混合物倒入水(7L)中。所得浆液用庚烷(5×1L)萃取。将合并的有机萃取物用Na2SO4干燥。在真空下浓缩溶液，以得到油状物的粗品2,6-二异丙基环己-2,5-二烯-1,4-二酮(62.5g；325mmol；产率58％)。该产物不经进一步纯化即用于下一步。
2,6-二异丙基苯-1,4-二基的合成
将粗品2,6-二异丙基环己-2,5-二烯-1,4-二酮(62.5g，325mmol)溶于二氯甲烷(300mL)和甲醇(100mL)中。用冰浴将溶液冷却至0℃。分批加入硼氢化钠(4.5g，182mmol)。加入完成后，将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入丙酮(150mL)以猝灭过量的硼氢化钠。搅拌30分钟后，加入2N HCl水溶液(200mL)。搅拌45分钟后，混合物用乙酸乙酯(4×400mL)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥。在真空下浓缩溶液，以定量产率得到红色油状物的粗品2,6-二异丙基苯-1,4-二醇(64g，330mmol)。该产物不经进一步纯化即用于下一步。
3,5-二异丙基-2-甲基苯-1,4-二酚的合成
将2,6-二异丙基苯-1,4-二酚(64g，0.33mol)、多聚甲醛(9.8g，0.327mol)、SnCl2(217.9g，1.15mol)、37％浓HCl水溶液(0.6L)和二异丙醚(2.5L)的混合物加热回流4小时。冷却至室温过夜后，分离两相混合物。水层用TBME(2000mL)萃取。将合并的有机级分用1NHCl水溶液(1000mL)、水(1000mL)和盐水(1000mL)洗涤。将有机级分用Na2SO4干燥并在真空下浓缩，根据GCMS分析，以得到3,5-二异丙基-2-甲基苯-1,4-二酚和2,6-二异丙基-3,5-二甲基苯-1,4-二酚(61g油)的50:35混合物。在用乙酸乙酯/庚烷＝97.5:2.5(4000mL)、95:5(4000mL)洗脱的硅胶(1200mL)上进行色谱纯化，以得到油状物3,5-二异丙基-2-甲基苯-1,4-二酚6(16.6g，79.8mmol；24％：83％纯度)。
6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-羧酸甲酯的合成
将3,5-二异丙基-2-甲基苯-1,4-二醇(10.6g，50.9mmol；83％纯度)溶于甲基丙烯酸甲酯(20mL，186mmol)中。将溶液转移到Berghof反应器中的Teflon管中。加入甲醛水溶液(10mL；37重量％溶液，用10-15％MeOH稳定)，并在封闭的反应器中将反应混合物加热至180℃(内部温度)5小时，同时搅拌。在冷却到约40℃后，将反应混合物倒入MeOH(200mL)中并将混合物在真空下浓缩。在用乙酸乙酯/庚烷＝95:5(5000mL；TLC：Rf～0.2；斑点用碘蒸汽染色)洗脱的硅胶(600mL)上进行色谱纯化，以得到期望的纯产物6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-羧酸甲酯(10.0g，31.3mmol，61％)。
6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-羧酸(SUL-118)的合成
将纯品6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-羧酸甲酯(8.3g，25.9mmol)和氢氧化锂一水合物(4.3g，102.5mmol；4当量)的MeOH(100mL)、THF(100mL)和水(25mL)溶液的混合物在环境压力下加热30分钟，同时用旋转蒸发器在60℃的温水浴中旋转。有机溶剂在真空下蒸发。向残余物中加入水(150mL)，然后加入乙酸(10mL)。获得浅橙色混合物。用乙酸乙酯(3×100mL)萃取，用Na2SO4干燥合并的有机级分并在真空下浓缩，以得到橙色固体的粗产物。用tBME(150mL)搅拌固体。将米色固体沉淀并获得橙色溶液。加入庚烷(250mL)并将混合物搅拌15分钟。用玻璃过滤器过滤混合物。在抽吸下在过滤器上用庚烷(2×50mL)洗涤残余固体。将固体在60℃真空下干燥，以得到灰白色固体的纯品6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-羧酸(SUL-118)(3.1g，10.13mmol；39％，100％纯度)。
1H-NMR(CDCl3,ppm):1.38(t,12H),1.52(s,3H),1.87(m,1H),2.20(s,3H),2.30(m,1H),3.20(m,1H),3.38(m,1H).M+＝307.10
SUL119(2-(羟基甲基)-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-6-醇)的合成
用注射器通过橡胶隔片在5分钟内将6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-羧酸甲酯(500mg，1.56mmol)的THF(12mL)溶液加入到LiAlH4(238mg，6.26mmol；4当量)，在惰性氮气氛下在干燥三颈100mL圆底烧瓶中预称重，同时在室温下搅拌。酯的放热加入伴随有气体逸出。加入完成后，将所得的灰色悬浮液加热至回流。3小时后停止加热，通过逐滴加入EtOAc(6mL；放热)淬灭反应。分小份加入水(5mL)，然后加入2N HCl(2mL)，然后加入EtOAc(25mL)。将混合物倾倒在Na2SO4(约50g)上，将浅黄色有机层从两相混合物中分离出来。将水相用EtOAc(50mL)洗涤并将合并的有机级分在真空下浓缩，以得到澄清油状物的粗品醇(530mg)。加入庚烷(100mL)，在真空下浓缩后，以得到2-(羟基甲基)-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-6-醇(248mg，0.85mmol，54％，LCMS：95.5％纯度)。
M+＝293.2
SUL139(2-(4-(6-羟基-5,7-二异丙基-2,8-二甲基色满-2-羰基)哌嗪-1-基)乙酸的合成
将SUL-137(440mg，1.17mmol，1当量)溶于MeOH(50ml)中并加入乙醛酸(216mg，2.35mmol，2当量)。将所得混合物在室温下搅拌1小时，随后加入NaBH3CN(183mg，2.94mmol，2.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入乙酸(数毫升)，在室温下搅拌0.5-1小时后，浓缩反应混合物。将所得残余物溶于EtOAc中，用H2O(2X)洗涤，干燥、过滤并浓缩，以得到浅黄色固体SUL-139(500mg，1.16mmol，98％，91-92％纯度)。
1H-NMR(CD3OD,ppm):1.33(dd,12H),1.59(s,3H),1.62(m,1H),2.09(s,3H),2-5-3.0(m,7H),3.1-3.6(m,4H),3.81(bs,2H),4.28(bs,2H).M+＝433.2.
SUL136(2-(4-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)哌嗪-1-基)乙酸)的合成
向配备有两个隔膜(左和右)和活栓的250ml三颈烧瓶中加入SUL-136(15.5g，38.4mmol)和THF/水(240ml THF+80ml水)。使用配备有长注射器针头的进口管穿过左隔膜，通过氩气鼓泡将澄清溶液搅拌并脱气至少30分钟；右隔膜配备有短针并作为出口。将脱气的溶液(其保持在氩气下)在冰浴中冷却至0℃，一次性加入固体无水LiOH(2.3g，96mmol，2.5当量)。在0℃下搅拌所得反应混合物2小时，然后通过加入Dowex-50WX8-200离子交换树脂的MeOH/水(3/1，v/v)浆液而中和；最终的pH值是约6。用抽吸过滤掉Dowex树脂并用3份MeOH/水(3/1，v/v)冲洗。将滤液在真空下浓缩并向湿产物中加入约100ml水。将得到的白色水悬浮液冷冻干燥过夜，以得到白色固体SUL-136(13.48g，93％，LCMS：99.6％)。
1H-NMR(CD3OD,ppm)):1.60(s,3H),1.65(m,1H),2.05(s,3H),2.10(s,6H),2.55(m,2H),2.62(m,1H),3.0,(bs,4H),3.40(bs,2H),3.65(bs,2H),4.25(bs,2H).M+＝377.1
SUL144((2S)-1-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)吡咯烷-2-羧酸)的合成
将(2S)-1-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羰基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(非对映异构体1，3.5g，9.7mmol)溶解于THF/H2O(60/20mL)中。将N2鼓泡通过溶液1小时。将混合物在冰浴中冷却并加入LiOH.H2O(1.01g，24.2mmol，2.5当量)。将反应混合物在N2下在RT下搅拌过夜。将Dowex-50WX8-200(用MeOH/H2O 3:1洗涤4次)作为浆液加入MeOH/H2O(3:1)中直至pH＝6。过滤混合物，用MeOH/H2O(3：1)洗涤并在真空中浓缩。将氘代H2O(50mL)加入到浓缩物中并将该溶液冷冻干燥，以得到灰白色泡沫SUL-144(3.4g，9.7mmol，定量，99.7％纯度)。
1H-NMR(CDCl3):1.60(s,3H),1.65-2.30(m,14H),2.60(m,2H),2.81(m,1H),3.49(m,1H),4.01(t,1H),4.50(d,1H).M+＝348.1
实施例2
介绍
(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮或SUL121已经示出在减少大鼠肾中的缺血和再灌注损伤方面非常有效。在该模型中，在血流恢复之后，长时间停止血流流向肾。已知该模型强烈诱导肾ROS产生。SUL121被认为是H2S诱导剂，具有包括抑制呼吸链的多种作用的化合物从而减少ROS的形成。其中一个潜在的机制可能是产生H2S的酶CBS的诱导和GDF15的表达增加。
鉴于其在肾缺血和再灌注模型中的有效性，假设化合物SUL121也将在肥胖诱导的2型糖尿病(T2DM)的实验模型中保护肾。因此，研究了SUL121对小鼠2型糖尿病模型中白蛋白尿和肾损伤发展的作用。为了研究，使用db/db小鼠模型。db/db小鼠不具有功能性瘦素受体，因此产生肥胖诱导的糖尿病。糖尿病从6-8周龄开始，在18周龄时能够观察到足够的肾损伤和白蛋白尿的水平。
为了研究SUL121对糖尿病发展的影响，从10周龄开始用SUL121治疗直到18周龄。另外，为了研究SUL121对健康动物的作用，对照小鼠进行类似的治疗。未经治疗的对照组包括在该研究中，用作健康未经治疗的对照。通过在10周和14周龄时植入渗透微型泵来施用药物和载体。
材料和方法
化学品和制剂
细胞培养级DMSO获自Sigma-Aldrich(Zwijndrecht，荷兰)。0.9％无菌盐水溶液来自Baxter(Utrecht，荷兰)。(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮(SUL121)由Sulfateq BV，Groningen，荷兰供应，以对应于177g/l的500mg的100％DMSO制剂供应。渗透微型泵(Alzet，USA)对DMSO浓度≤50％有抗性。因此，在50％DMSO的盐水溶液中测试SUL121的溶解度。SUL121完全溶解于50％DMSO中直到浓度为12.6g/l。Alzet model2004泵装有200μl的12.6g/l SUL121溶液或200μl 50％DMSO溶液(载体)。根据泵规格，每天施用6μl的SUL121，使得35克小鼠的日剂量为2.2mg/kg/天。
测试动物
雄性db/db小鼠(n＝16)和瘦杂合子对照动物(n＝16)购自Harlan UK(株JAX000642)。所有的小鼠单独安置。水和食物是随意给予的。研究四组小鼠：
1)db/db+载体(糖尿病对照)
2)db/db+Sul121(治疗的糖尿病组)
3)wt+载体(非糖尿病对照)
4)wt+Sul121(仅研究药物作用)
在10周(t＝0)和14周(t＝4)龄时，通过植入渗透微型泵来施用药物和载体。代谢笼和血压测量每两周进行一次。血液样本不能通过脸颊穿刺获得，因此在10周(t＝0)和12周(t＝2)龄时从眼窝丛收集血液。在18周龄(t＝8)时，所有动物被终结并通过心脏穿刺收集血液。
尿测量
将样品储存在-20℃后，通过用特定电极由24小时尿收集采用葡萄糖氧化酶方法来测定尿葡萄糖浓度。通过标准实验室方法(Jaffe方法，不用脱蛋白，DiaSys诊断系统，Holzheim，德国)测量尿肌酐浓度。计算24小时尿收集和白蛋白与肌酸酐比率的中值。另外，使用小鼠白蛋白Elisa试剂盒(Abcam，Cambridge，UK)手动测定尿中的小鼠白蛋白水平。使用Amplex Red H2O2测定试剂盒(生命科技，Leusden，荷兰)测定尿过氧化氢水平。
血压测量
在麻醉的小鼠(2％异氟烷)中通过尾套法(PS-200A；Riken-Kaihatsu；东京，日本)来测量动脉血压。对于每只动物，血压值表示在单次时段中获得的三到十次记录的平均值。
组织学
将多聚甲醛中固定的肾脏用于α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色。切割四微米切片，脱石蜡，水合，并用1mmol/EDTA(pH9.0)处理以用于抗原修复。所有步骤均根据Vector MOM试剂盒方案。为了评估糖尿病损伤后的纤维化，将切片用1：100稀释度的α-SMA(小鼠单克隆抗α-平滑肌肌动蛋白；Sigma Chemical，St.Louis，MO)进行染色，MOM稀释剂证明为阴性染色。
过氧化物酶活性通过与AEC(Dako)温育而产生。使用计算机辅助的形态测量法测量α-SMA的表达。在×200的放大倍数下评估总染色。从测量中排除肾小球和动脉。将α-SMA染色除以测量的面积并以百分比表示。测量至少10个皮质领域以获得每只动物的平均得分。
为了评价糖尿病损伤后的肾脏损伤，将切片染色为肾小管损伤标记物KIM-1(兔多克隆，H.van Go博士，格罗宁根大学医学中心)。将石蜡切片脱蜡，并在80℃下温育过夜，在pH 9的0.1M Tris·HCl缓冲液中进行抗原修复。使用两步免疫过氧化物酶技术。用PBS代替一抗的对照载玻片为持续阴性。以不知情的方式进行染色和形态分析的评估。
与分离主动脉的器官浴实验
在个体肌电图浴(Danish Myo Technology,Aarhus,Denmark)中，将新鲜分离的胸主动脉环(长1.5-2毫米)安装在200μm的不锈钢丝上。简言之，将含有6ml Krebs溶液的浴温热至37℃并预平衡，并用95％O2-5％CO2连续充气以保持pH为7.4。通过显微镜评估主动脉条的长度。使主动脉环平衡40分钟直到它们在稳定的基线。然后引发环并通过用KCl(60mM)连续两次刺激以检查活力，随后洗涤并重新稳定以获得可再现的收缩反应。
血管方案
收缩反应测量为对苯肾上腺素(PE；10nM-100μM)然后单一浓度的KCl(90mM)的累积浓度-反应曲线。通过获得用PE(1μM)预收缩的环中ACh(10nM-300μM)的浓度-反应曲线，然后用高浓度的NO供体硝普钠(SNP；0.1mM)刺激来评估内皮依赖性舒张，以评估最大内皮依赖性舒张。
为了研究内皮在血管收缩作用中的作用，通过用潮湿的钢丝摩擦血管的腔侧来去除内皮细胞层，以使环剥落。为了检验不同EDRF在调节血管收缩反应和介导内皮依赖性舒张中的作用，使用PG和NO合成的抑制剂。为此，通过用非特异性环氧合酶抑制剂吲哚美辛(10μM)预温育环(20分钟)以评估PG组分。通过随后与NO合成抑制剂NG-单甲基-L-精氨酸(L-NMMA；1μM)和吲哚美辛一起温育来检查NO组分。其余的乙酰胆碱介导的舒张归因于未知的EDHF。
形态分析
将4微米厚的福尔马林固定切片脱石蜡并用高碘酸-希夫(PAS)染色，以定量局灶性肾小球硬化症(FGS)和肾小管损伤。通过确定肾小球中每个象限中的系膜扩张和粘着斑的水平，从而以双盲方式将FGS半定量评分并以0至4的等级表示。如果25％的肾小球受到影响，则评分为1，50％为2，75％为3，以及100％为4。每个肾脏总共分析50个肾小球，并通过将该评分乘以具有相同FGS评分的肾小球百分比来计算总FGS评分。因此总的FGS评分在0到200的范围内。
通过评估四种损伤标记物来评估肾小管形态的组织学变化：肾小管坏死、刷状缘缺失、基底膜剥落和管腔内肿瘤。根据受伤程度(0：<5％；1：5-25％；2：25-75％；3：>75％)，将每个参数按照0至3的等级进行分级。每个肾脏总共分析30个肾小管，并计算组织学评分。因此总的组织学评分在0到90的范围内。
数据处理
对KCl和PE的收缩以毫牛顿为单位给出。对ACh和SNP的舒张反应表示为用PE预收缩的百分比。除此之外，针对ACh诱导的舒张(SigmaPlot version10.0，Systat Software，San Jose，CA)确定每条单独曲线下的面积(AUC；以任意单位)。使用AUC呈现总内皮依赖性舒张，并且随后分析存在和不存在抑制剂时ACh介导的舒张中的差异，以评估不同EDRF的贡献，即PG用于吲哚美辛对环氧化酶抑制敏感的部分，NO用于L-NMMA对NOS抑制敏感的部分，并且EDHF通过排除PG和NO(34)。
统计评估
数据以平均值±SE表示，n表示每组动物的数量。用SPSS 16.0.2Windows(SPSS，Chicago，IL)进行统计分析。用重复ANOVA测试全浓度-反应曲线之间的差异；用单因素ANOVA测试点之间的差异。P值<0.05(双尾)认为是统计学显著的。
结果
代谢数据
代谢数据在图1中示出。如预期的那样，糖尿病小鼠与其瘦的对照相比具有显著更高的体重(图1，面板A)。从第4周及以后，糖尿病小鼠体重逐渐减轻。SUL121治疗在任何时间点均不影响体重。
在糖尿病小鼠中水摄入量和尿量(图1，面板B和C)紧密相关并且显著更高。在第8周，SUL121治疗的糖尿病小鼠的尿量和水摄入量显著低于糖尿病对照(糖尿病对照和糖尿病SUL121的尿量分别为23.1±2.5和11.2±3.8g，水摄入量分别为22.5±2.5和10.9±3.9g)。在所有其它时间点，SUL121并没有显著影响尿量和水摄入量。
与野生型对照小鼠相比，糖尿病db/db小鼠的非空腹血糖水平显著更高(图1，面板D)。在实验过程期间，糖尿病动物的非空腹血糖水平分别从27.5±2.5和27.2±1.3(糖尿病对照和糖尿病SUL121治疗)分别升高到35.8±2.4和35.3±1.1mM，表明严重和进行性糖尿病状态。用SUL121治疗不影响血糖水平。
在第0、2和6周，测量血压(图1，面板E)。在第0周，糖尿病动物的平均血压高于非糖尿病野生型小鼠。SUL121治疗在第2周时降低了非糖尿病野生型小鼠在第2周的血压。SUL121治疗在第6周时不影响血压。在糖尿病小鼠中，SUL121治疗不影响血压。
SUL121治疗对器官重量的影响
治疗8周后，终结小鼠并测量器官重量(图2)。在糖尿病对照小鼠中，左右肾重量均显著增加，表明肾肥大。SUL121治疗将肾重量标准化为非糖尿病对照值。
SUL121对肾功能的影响
为了测试SUL121治疗是否能减少肾脏损伤，对糖尿病动物在所有时间点测量尿中的白蛋白渗漏。每日总白蛋白排泄量(AER)通过将尿白蛋白浓度与每日排尿量相乘来计算(图3A)。用SUL121治疗在第6周和第8周阻止了糖尿病动物中AER的发展。仅在第8周测量非糖尿病对照中的AER，并且显著低于糖尿病动物(非糖尿病对照：33.8±5.1mg/天，非糖尿病SUL121治疗：31.3±4.6mg/天)。SUL121治疗不影响非糖尿病动物中的AER。
另外，在第6和8周时确定白蛋白/肌酸酐比(ACR)(图3B)。在第6周，SUL121治疗的糖尿病小鼠中的ACR显著低于糖尿病对照小鼠(对于糖尿病对照和糖尿病SUL121治疗，分别为1107±130和534±79μg/mg)。在第8周，SUL121治疗的动物中的ACR也低于糖尿病对照小鼠，但是这没有达到统计学显著性。(对于糖尿病对照和糖尿病SUL121治疗，分别为1084±156和866±91μg/mg)。
在第8周时野生型动物中的ACR显著低于糖尿病动物，并且不受SUL121治疗的影响(对于野生型对照和野生型SUL121治疗，分别为71±9和55±6μg/mg)。
SUL121对肾脏组织学的影响
由于SUL121对蛋白尿具有深远的影响，因此进行PAS染色以研究SUL121对所有动物中局灶性肾小球硬化(FGS)的影响(图4)。如预期的那样，糖尿病db/db小鼠中FGS评分增加。用SUL121治疗显著降低糖尿病小鼠中的FGS评分。
糖尿病中的血管功能
内皮细胞舒张因子释放受损(内皮功能障碍)是糖尿病db/db模型中确立的现象。为了建立SUL121治疗对内皮功能的作用，用苯肾上腺素(PE)预收缩小鼠主动脉环，随后用增加浓度的乙酰胆碱(ACh)使其舒张。构建剂量效应曲线(图5A)，证明与对照相比，db/db小鼠中ACh的舒张受损(对于db/db和对照，最大舒张分别为PE 39.2±6.5和9.2±1.6％)。在SUL121治疗的糖尿病组中，舒张恢复至对照水平(11.3±2.3％)。在非糖尿病对照中，SUL121治疗不影响血管舒张(9.2±1.6％)。总之，这些数据表明，SUL121治疗能够预防糖尿病的db/db模型中内皮功能障碍的发展。
为了进一步研究血管舒张中涉及的内皮成分，使用针对eNOS(L-NMMA)和环氧合酶(吲哚美辛)的特异性抑制剂来构建剂量反应曲线，并计算每种成分的相对贡献(图5B)。在糖尿病动物中，SUL121通过显著增加EDHF而改善了总舒张。此外，SUL121引起NO和前列腺素成分的不显著(p＝0.06)增加。
SUL121对糖尿病患者中ROS产生的影响
增强的活性氧物质(ROS)产生在糖尿病中是公认的现象。为了研究SUL121治疗对ROS产生的影响，在血浆中测量过氧化氢(稳定的ROS的代谢物)(图6)。SUL121治疗使血浆中的H2O2水平标准化。
体外评估SUL121在糖尿病中介导的保护
为了进一步探索SUL121在糖尿病中介导肾保护的机制，采用糖尿病的体外模型。为此，使小鼠肾系膜细胞暴露于模拟2型糖尿病(高葡萄糖和胰岛素)的条件。暴露于高葡萄糖/胰岛素使细胞内ROS水平增加约70％(图7)。有趣的是，如果细胞用SUL121预治疗，则这种增加能显著地被抑制(p<0.05)。单独SUL121不影响细胞内ROS产生。
相关性
为了确定肾肥大是否与肾功能改变有关，在所有组合的糖尿病动物的肾重量和白蛋白排泄之间进行相关性分析(图8，面板A)。两种标记物之间均发现显著正相关性(p<0.05)。由于SUL121在糖尿病动物中使内皮功能标准化，所以最大舒张水平与肾重量(图8，面板B)和白蛋白排泄(图8，面板C)的乙酰胆碱相关。两个相关性均显著(p<0.05)。
由于SUL121抑制血浆中的H2O2水平，所以H2O2与白蛋白排泄(图8，面板D)和肾重量(图8，面板E)相关。两个相关性均显著(p<0.05)。血浆中的H2O2水平与乙酰胆碱的最大舒张水平不相关(数据未显示)。

Claims (2)

1.根据式(II)的化合物
Figure FDA0002717178960000011
(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮
或其药学上可接受的盐在制备用于通过恢复内皮功能和/或抑制活性氧物质产生来预防或治疗器官损伤的药物中的用途，其中所述器官损伤为糖尿病肾病。
2.根据权利要求1所述的(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮的用途，其中，所述器官是肾。
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