CN107648263A - 一种金铂双金属纳米粒子在制备细胞免疫治疗促进剂上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金铂双金属纳米粒子在制备细胞免疫治疗促进剂上的应用，其利用金铂双金属纳米粒子具有过氧化氢酶活性，可以与肿瘤缺氧微环境中的过氧化氢反应产生氧气，并具有良好生物相容性的特性，将其与细胞免疫疗法相结合，作为细胞免疫治疗的促进剂，以改善肿瘤缺氧情况，降低肿瘤缺氧环境对免疫细胞杀伤能力的抑制，从而显著增强免疫细胞对缺氧肿瘤细胞的杀伤效果，其在肿瘤免疫治疗方面具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种金铂双金属纳米粒子在制备细胞免疫治疗促进剂上的应用。
背景技术
过继免疫治疗在许多癌症免疫治疗中有很好的应用前景。其中，过继细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）治疗被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。CIK细胞是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、白介素-2和γ干扰素等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，其兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤细胞的非主要组织相容性复合体（MHC）限制性杀瘤优点。然而，单独CIK免疫治疗在应用于实体瘤时疗效一般，其中一个重要的原因就是肿瘤产生对免疫细胞抑制性的微环境。
缺氧是肿瘤免疫微环境一个代表性的特征。它不仅抑制免疫细胞的生存和增殖，而且提高肿瘤细胞对免疫细胞杀伤的耐受。目前有研究表明提高肿瘤氧含量可以促进抗肿瘤免疫。在临床前模型中，吸氧（60% O2）可以降低肿瘤缺氧情况，从而降低对过继免疫治疗的抑制。然而，吸氧会产生一些副作用，例如加重对正常组织的炎症损伤。因此，发展一种新方法来克服肿瘤缺氧，进而提高免疫治疗效果具有重大应用前景。
金铂纳米粒子由于具备过氧化氢酶催化活性以及良好的生物相容性，广泛应用于生物传感、生物催化、纳米药物等领域。本发明提供了将具有过氧化氢酶催化活性的纳米粒子作为细胞免疫治疗促进剂，与细胞免疫疗法联合，以提高肿瘤杀伤能力，而在国内外有关文献和专利中还未有相似报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金铂双金属纳米粒子在制备细胞免疫治疗促进剂上的应用，其利用该纳米粒子具有过氧化氢模拟酶活性，以改善肿瘤细胞的缺氧，从而降低肿瘤缺氧微环境对免疫细胞的抑制，提高免疫细胞的杀伤能力。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种金铂双金属纳米粒子在制备细胞免疫治疗促进剂上的应用，所述金铂双金属纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
1）将50mL-200mL质量分数为0.01%的氯金酸水溶液加热至沸腾回流，在高速搅拌下快速加入1mL 0.068M-0.5M柠檬酸钠水溶液，溶液由淡黄色逐渐变为棕红色后继续搅拌回流15min-60min，停止加热，搅拌冷却至室温，即得金纳米粒子溶胶；
2）将150μL 25 mM-100 mM氯铂酸溶液与步骤1）所得金纳米粒子溶胶混合，80℃加热搅拌5min-20min后，缓慢加入800 μL 8 mM-15 mM抗坏血酸，继续加热搅拌15min-45min，在金纳米粒子表面形成铂壳层；
3）将步骤2）所得溶液冷却至室温后，取5mL与0.05mg-5mg巯基聚乙二醇（PEG-SH）混合，震荡反应60min-180min，以共价修饰上PEG壳层；
4）将步骤3）所得溶液离心除去多余巯基聚乙二醇，用去离子水洗涤2-4次，即得球形聚乙二醇修饰的金铂双金属纳米粒子。
所述金铂双金属纳米粒子以金为核，铂为壳，其粒径为15-30nm。
所述免疫细胞为细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）。
本发明的优点在于：本发明利用聚乙二醇修饰的金铂双金属纳米粒子具过氧化氢酶活性，可与缺氧肿瘤细胞产生的过氧化氢反应生成氧气的特性，将其作为细胞免疫治疗的促进剂，以降低缺氧肿瘤微环境对免疫细胞的抑制，提高免疫细胞的杀伤能力，且其特异性高、生物相容性好，对正常组织副作用小。
附图说明
图1为本发明金铂双金属纳米粒子的TEM图。
图2为本发明金铂双金属纳米粒子催化缺氧肿瘤细胞微环境中的过氧化氢产生氧气的效果。
图3为利用本发明金铂双金属纳米粒子联合CIK细胞对缺氧肿瘤细胞的杀伤效果。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1 金铂双金属纳米粒子的制备：
将50mL质量分数为0.01%的氯金酸水溶液加热至沸腾回流，在高速搅拌下快速加入1mL0.068M柠檬酸钠水溶液，溶液由淡黄色逐渐变为棕红色后继续搅拌回流15 min，停止加热，搅拌冷却至室温，即得直径约为13nm的金纳米粒子溶胶；接着加入150μL 50 mM 氯铂酸溶液，80℃加热搅拌10min后，缓慢加入800 μL 10 mM 抗坏血酸，继续加热搅拌30min后搅拌冷却至室温，即得直径约为18 nm的金铂纳米粒子；取5mL金铂纳米粒子溶液，加入0.05mg巯基聚乙二醇，震荡反应1h后用去离子水洗涤2次，即得聚乙二醇修饰的金铂双金属纳米粒子。
图1为所得聚乙二醇修饰的金铂双金属纳米粒子的TEM图。图中可以看出其为单分散、粒径约为16-20nm的球形纳米粒子。
实施例2 利用金铂双金属纳米粒子催化缺氧肿瘤细胞微环境中的过氧化氢产生氧气：
将人卵巢癌细胞系SKOV3细胞用胰酶消化后，悬浮在细胞培养基中。通过通混合气（94%N2+1% O2+5% CO2）30min使细胞缺氧，随后加入1.2 nM金铂双金属纳米粒子，立即用溶氧仪检测溶液中的氧含量随时间的变化，实验结果见图2。
由图2可见，加入纳米粒子5min内可以检测到氧含量显著增加。
实施例3 考察利用金铂双金属纳米粒子联合CIK细胞对缺氧肿瘤细胞的杀伤效果
用CCK-8法检测CIK细胞介导的杀伤能力。
以人卵巢癌细胞系SKOV3细胞为靶细胞，接种于96孔板中（5×103个/孔）。细胞贴壁后，第一组常氧（21% O2）培养，第二组缺氧(1% O2)环境培养，第三组缺氧(1% O2)环境培养并加入金铂双金属纳米粒子，每组平行5孔。三组在37℃下培养16h。以CIK细胞为效应细胞，按效靶比（E：T）为10:1、5:1、3:1、1:1接种，培养4h后，每孔加入10% CCK-8溶液，反应4h，在酶标仪上450nm波长下检测各孔的吸光度（A）值，按如下公式计算杀伤率，实验结果见图3：
杀伤率（%）=[1-（A(E+T)-A（E)）/A（T）]×l00％。
由图3结果显示，与在常氧情况下培养的肿瘤细胞相比，缺氧情况下培养的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果减弱，而加入金铂双金属纳米粒子后，可提高CIK细胞对缺氧肿瘤细胞的杀伤效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (2)
1.一种金铂双金属纳米粒子在制备细胞免疫治疗促进剂上的应用，其特征在于，所述金铂双金属纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
1）将50mL-200mL质量分数为0.01%的氯金酸水溶液加热至沸腾回流，在高速搅拌下快速加入1mL 0.068M-0.5M柠檬酸钠水溶液，溶液由淡黄色逐渐变为棕红色后继续搅拌回流15min-60min，停止加热，搅拌冷却至室温，即得金纳米粒子溶胶；
2）将150μL 25 mM-100 mM氯铂酸溶液与步骤1）所得金纳米粒子溶胶混合，80℃加热搅拌5min-20min后，缓慢加入800 μL 8 mM-15 mM抗坏血酸，继续加热搅拌15min-45min；
3）待步骤2）所得溶液冷却至室温后，取5mL与0.05mg-5mg巯基聚乙二醇混合，震荡反应60min-180min；
4）将步骤3）所得溶液离心除去多余巯基聚乙二醇，用去离子水洗涤2-4次，即得聚乙二醇修饰的金铂双金属纳米粒子。
2.根据权利要求1所述金铂双金属纳米粒子在制备细胞免疫治疗促进剂上的应用，其特征在于，所述金铂双金属纳米粒子的粒径为15-30nm。
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