CN107646829A - 细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置及方法，它包括保温箱体，保温箱体中间设置有冷冻腔，冷冻腔上端口设置密封盖；冷冻腔一侧设置有液位调节块，液位调节块上端通过丝杠机构连接升降电机；冷冻腔另一侧设有滑座，滑座设置在丝杠上；丝杠上端连接旋转电机；滑座前端设有翻转轴；翻转轴与滑座之间设有扭簧；翻转轴连接翻转托板；翻转托板设在冷冻腔内；翻转轴上设有拉线，拉线上端连接卷扬机；翻转托板上设有可浮于液氮面的细管架；保温箱体内壁上设有液位感应器；滑座上设有温度传感器。它能实现同冷冻室内样品不同速率的冷冻，自动维持液氮面的高度，简化了细管铺放与冷冻装置，提高了细管精液冷冻条件优化操作效率。

Description

细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置及方法

技术领域

本发明属于精子冷冻设备领域，具体为一种细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置及方法。

背景技术

研究证明，将精液进行冷冻是保存畜禽品种资源最有效、最廉价的方法。精液冷冻技术在动物遗传资源多样性保护，品种培育等领域有举足轻重的作用。细管冷冻精液则是目前最好的方案。

但鸡精液冷冻技术的效果非常不稳定，品种、个体，甚至同一个体的不同阶段，都会影响精液冷冻的效果。精液冷冻保存是利用液氮(-196℃)或者干冰(-79℃)等作为冷源，将精液经过稀释、平衡、添加冷冻保护剂、再平衡等处理后，快速降温，抑制精子的新陈代谢，使精子能够长时间保存在超低温下，解冻升温后精子能够复苏，同时具有受精能力。水的冻结主要包括成核、冰晶增长、再结晶三个过程，在精液冷冻过程中，水分子的冰晶化(即结冰)是造成精子死亡的主要原因，而冰晶形成的大小取决于温度升降的速度。Mazur等(1970)研究证实，冷冻过程中在冰晶形成之前使细胞失去90％的水分，水分结冰的机会就可以忽略。Bilodeau等(2000)指出冷冻精液的原理就是在精液稀释液中加入抗冻剂，采用合适的冷冻、解冻速率，使精液迅速越过精子致死危险温区(-15～-60℃)，降低冰晶的形成，使精子能够在超低温下存活。

因此，冷冻速率是精液冷冻技术的关键步骤，主要包括程序冷冻仪(控制样品室中喷入的液氮量)与液氮熏蒸(控制样品离液氮面的高度)来实现，后者因装置简单廉价而被广泛采用。冷冻速率主要是一步与两步冷冻法(5至-35℃慢速冷冻与-35至-150℃快速冷冻)。

液氮熏蒸技术方面，Sexton等(1980)用两步冷冻法与0.5mL细管，以及4％二甲基亚砜，筛选出以1℃/min将精液从5℃降到-20℃，再以30℃/min从-20℃降到-80℃后浸入液氮，获得了47％的受精率。大部分则是一步冷冻法，包括Purdy等(2009)用聚苯乙烯泡沫箱将0.5mL甘油(浓度为11％)细管精液放入液氮面6.4cm处熏蒸10min(-10℃/min)后浸入液氮，通过输卵管手术输精后2-8d种蛋获得了69-77％受精率。Fattah等(2017)利用0.25mL甘油(浓度3％)细管以及在液氮面4cm熏蒸7min的冷冻程序得出添加1-2mM肉毒碱对鸡精子甘油冷冻有显著的保护作用。Iaffaldano等(2016)报道用0.25mL细管与10％二甲基亚砜，优化出的方案为液氮面上10cm用10min(4℃到-90℃)，50℃解冻10s。Rakha等(2016)用20％甘油浓度冷冻印度红丛林鸟精子离液氮面5cm的距离以-8.4℃/min的速度冷冻熏蒸10min后浸入液氮，以1:5分步稀释离心去甘油得到了57.2％的受精率。

精液冷冻技术的步骤非常多，原精采集、精液质量检测、稀释、添加冷冻保护剂、细管灌封、冷冻、解冻等。其中，冷冻速率的筛选无疑是核心。同时对于冷冻速率，与冷冻保护剂浓度或者其它因素的优化，一般采用单因素分析，先固定一个，优化另一个。但冷冻速率可能与其它因素，以及各因素的不同水平存在着相互影响的互作关系，这需要一批样品同时用不同冷冻速率冷冻，而目前细管精液的冷冻商业化的设备，还不能实现同一冷冻室同批样品用不同冷冻速率冷冻，且存在设备昂贵、复杂、笨重，液氮消耗多等诸多缺陷。

发明内容

本发明的目的是针对以上问题，提供一种细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置及方法，它能实现同冷冻室内样品不同速率的冷冻，自动维持液氮面的高度，简化了细管铺放与冷冻装置，提高了细管冷冻速率优化操作效率，为精液细管冷冻技术提供了简单廉价的标准化装置。

为实现以上目的，本发明采用的技术方案是：一种细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置，它包括保温箱体1及上端的密封盖19，所述保温箱体1中间设置有盛放液氮的冷冻腔6，两侧分别设置有第一控制腔2和第二控制腔3；所述第二控制腔3内设置有液位调节块7，所述液位调节块7上端通过丝杠机构连接升降电机10；所述第一控制腔2内设置有滑座16，所述滑座16设置在丝杠11上；所述丝杠11上端连接旋转电机13；所述滑座16前端设置有可旋转的翻转轴171；所述翻转轴171前端竖直设置有可上下调节高度的竖直板173，所述竖直板173下端水平设置翻转托板17；所述翻转托板17设置在冷冻腔6内；所述翻转轴171上固定缠绕有拉线15，拉线15上端连接卷扬机14；所述翻转托板17上设置有可浮于液氮面的细管架18；所述保温箱体1内壁上设置有液位感应器8；所述滑座16上设置有温度传感器20；所述冷冻腔6与第二控制腔3之间设置有网孔板21；所述冷冻腔6与第一控制腔2之间设置有隔板22。

进一步的，所述细管架18包括呈口字形状的漂浮框181，所述漂浮框181一面均匀设置有穿孔，相对的另一面设置有对应的盲孔；所述穿孔和盲孔中间连接有用于放入精液细管的网状套管182。

进一步的，所述翻转托板17包括底框172；所述底框172上端四角竖直设置有限位杆174；所述漂浮框181侧边设置有与限位杆174配合的卡位槽183。

进一步的，所述第二控制腔3上端设置有第三控制腔4；所述第一控制腔2上端设置有第四控制腔5；所述卷扬机14、旋转电机13均设置有第四控制腔5内；所述升降电机10设置在第三控制腔4内。

进一步的，所述卷扬机14端头的旋转轴141通过棘轮143连接线盘142；所述拉线15设置在线盘142上；所述棘轮143上设置有扭簧。

进一步的，所述滑座16尾端滑动设置在限位导轨12内。

进一步的，所述液位调节块7侧边设置有卡位导轨9。

进一步的，所述升降电机10、卷扬机14、旋转电机13、液位感应器8、温度传感器20均连接控制器；所述控制器设置在保温箱体1上表面或者侧面。

进一步的，所述翻转轴171与滑座16之间设置有扭簧。

进一步的，所述漂浮框181为泡沫框。

进一步的，所述竖直板173上设置有竖直的调节槽175；所述竖直板173通过调节槽175内的螺栓与翻转轴171连接。

本发明的有益效果：

1、细管精液最简单、廉价、可操作性强的冷冻技术，能在种畜禽场，野外操作。

2、多层导轨式细管架浮体

1)特殊设计的细管架能实现同冷冻室样品不同冷冻速率冷冻的技术，从低到高置于各层的细管可以得到不同的冷冻速率，随着细管架上下移动又可以获得整体的不同冷冻速率，此外处在同一层的多支细管可以分成不同处理组(譬如多个冷冻剂配方)，从而实现同批样品众多冷冻速率的筛选以及某些因素与冷冻速率的交互作用分析，提高最佳冷冻条件筛选效率，应对因个体品种差异导致冻精效果不稳定困境。

2)导轨式多层细管一体化浮体，通过导热性良好的网状细管导轨，解决了单层细管架叠加形成多层细管架结构存在的细管铺放、细管架转移、细管难固定容易飘落，以及整个操作繁琐的困境

3)在一步冷冻时，该导轨式多层细管一体化浮体，可以独立的在一个只含有液氮的泡沫箱中完成细管精液冷冻，不需要任何电机等结构，大幅度简化操作与降低装置研发成本，同时增加冷冻技术的稳定性。

3、液位传感器和液位调节块的设计可解决液氮蒸汽熏蒸，多步冷冻时，冷冻架离液氮面距离，随时间延长液氮的蒸发消耗，液氮面下降，而导致的冷冻速率变化问题。

4、通过调节竖直板173在翻转轴171的竖直高度可调节翻转托板17的固定高度，可依据托板最低位置高度确定倒入液氮的多少，便于稳定实验条件与节约液氮，同时也可以使空腔2不进入液氮，提高机械传动装置的性能与使用寿命。

5、经测试，用这套技术优化出的冷冻速率，在甘油浓度优化以及DMA细管精液冷冻技术研究中，达到了国内领先、国际先进水平的受精率(70％左右)(表1、表2)。

表1不同甘油浓度冻精受精率与孵化率

表2 DMA细管冻精的受精及孵化率

6、通过本发明中的装置，发现甘油浓度-冷冻速率对鸡细管精液冷冻效果有非常强的交互作用。从单个因素看，以甘油浓度为主效应，浓度最低的2％组，第1至9层均显著低于其它各浓度组，而11％浓度组，则在1至9层均显著高于2％至6％浓度组，8％-11％各组间差异不显著，11％组效果最优；以冷冻速率作为主效应，浓度最低的2％组活力高低不同，第1至5层与第9层没有显著差异(P>0.05)，但显著低于6至8层的(P<0.05)，6至8层之间差异不显著，其中第6层效果最佳；甘油浓度-冷冻速率交互作用下“浓度”、“速率”、“浓度-速率”对活力有极显著的影响(P<0.01)(表3)。

表3不同甘油浓度冻精解冻后不同层的活力(n＝3)

附图说明

图1为本发明内部结构示意图。

图2为本发明内部结构俯视示意图。

图3为细管架俯视结构示意图。

图4为图3中局部A放大结构示意图。

图5为翻转托板结构示意图。

图6为图5俯视示意图。

图7为图5右视图。

图8为卷扬机连接拉线的结构示意图。

图9为卷扬机端面结构示意图。

图中：1、保温箱体；2、第一控制腔；3、第二控制腔；4、第三控制腔；5、第四控制腔；6、冷冻腔；7、液位调节块；8、液位感应器；9、卡位导轨；10、升降电机；11、丝杠；12、限位导轨；13、旋转电机；14、卷扬机；15、拉线；16、滑座；17、翻转托板；18、细管架；19、密封盖；20、温度传感器；21、网孔板；22、隔板；141、旋转轴；142、线盘；143、棘轮；171、翻转轴；172、底框；173、竖直板；174、限位杆；175、调节槽；181、漂浮框；182、网状套管；183、卡位槽。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

如图1-图9所示，本发明的具体结构为：为实现以上目的，本发明采用的技术方案是：一种细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置，它包括保温箱体1及上端的密封盖19，所述保温箱体1中间设置有盛放液氮的冷冻腔6，两侧分别设置有第一控制腔2和第二控制腔3；所述第二控制腔3内设置有液位调节块7，所述液位调节块7上端通过丝杠机构连接升降电机10；所述第一控制腔2内设置有滑座16，所述滑座16设置在丝杠11上；所述丝杠11上端连接旋转电机13；所述滑座16前端设置有可旋转的翻转轴171；所述翻转轴171前端竖直设置有可上下调节高度的竖直板173，所述竖直板173下端水平设置翻转托板17；所述翻转托板17设置在冷冻腔6内；所述翻转轴171上固定缠绕有拉线15，拉线15上端连接卷扬机14；所述翻转托板17上设置有可浮于液氮面的细管架18；所述保温箱体1内壁上设置有液位感应器8；所述滑座16上设置有温度传感器20；所述冷冻腔6与第二控制腔3之间设置有网孔板21；所述冷冻腔6与第一控制腔2之间设置有隔板22。

优选的，所述细管架18包括呈口字形状的漂浮框181，所述漂浮框181一面均匀设置有穿孔，相对的另一面设置有对应的盲孔；所述穿孔和盲孔中间连接有用于放入精液细管的网状套管182。

优选的，所述翻转托板17包括底框172；所述底框172上端四角竖直设置有限位杆174；所述漂浮框181侧边设置有与限位杆174配合的卡位槽183。

优选的，所述第二控制腔3上端设置有第三控制腔4；所述第一控制腔2上端设置有第四控制腔5；所述卷扬机14、旋转电机13均设置有第四控制腔5内；所述升降电机10设置在第三控制腔4内。

优选的，所述卷扬机14端头的旋转轴141通过棘轮143连接线盘142；所述拉线15设置在线盘142上；所述棘轮143上设置有扭簧。

优选的，所述滑座16尾端滑动设置在限位导轨12内。

优选的，所述液位调节块7侧边设置有卡位导轨9。

优选的，所述升降电机10、卷扬机14、旋转电机13、液位感应器8、温度传感器20均连接控制器；所述控制器设置在保温箱体1上表面或者侧面。

优选的，所述翻转轴171与滑座16之间设置有扭簧。

优选的，所述漂浮框181为泡沫框。

进一步的，所述竖直板173上设置有竖直的调节槽175；所述竖直板173通过调节槽175内的螺栓与翻转轴171连接。

本发明具体使用方法：

单步冷冻：离液氮面不同高度的细管就有不同冷冻速率，本发明设计的细管架采用能浮在液氮面的材料做成一个能放多层精液细管的架子，同一个架子放在冷冻室，上面不同高度的细管就能获得不同冷冻速率。

多步程序冷冻：通过升降电机10带动丝杠11旋转，促使滑座16升降，从而实现反转托板17的升降，反转托板17带动细管架18升降，使得细管架18内的精液细管整体可以获得不同冷冻速率，且能实现多步程序冷冻，譬如在开始冷冻程序后，第一步离液氮面多高，持续多久，第二步多高，持续多久，依次类推，就实现了目前最先进的程序冷冻仪的功能，同时也实现了同一冷冻室样品，多个冷冻速率筛选。

细管铺放效率提高：细管架18包括呈口字形状的漂浮框181，漂浮框181一面均匀设置有穿孔，相对的另一面设置有对应的盲孔；穿孔和盲孔中间连接有网状套管182；网状套管182用导热良好耐冻的丝网做成细管，工作人员可将细管架盲端开口面朝下水平放置，快速将精液细管顺着导管靠重力轻松插入到漂浮框181的穿孔内，成倍提高细管插入效率。

冷冻条件筛选效率的提高：从低到高置于各层的细管可以得到不同的冷冻速率，随着细管架上下移动又可以获得整体的不同冷冻速率，此外处在同一层的多支细管可以分成不同处理组(譬如多个冷冻剂配方)，从而实现同批样品众多冷冻速率的筛选以及某些因素与冷冻速率的交互作用分析，提高最佳冷冻条件筛选效率。

液氮容器内液氮面恒定技术：利用液位感应器8感应液氮面位置，当液氮面低于设定值时，液位感应器8发送信号给升降电机10，升降电机10带动液位调节块7，往下压，促使液氮面上升。

快速将细管浸入液氮中的技术：细管架18放置在翻转托板17上，完成了一系列冷冻步骤后，到冷冻的最后一步，需要将细管架18内的精液细管全部快速放置到冷冻腔6内，此时卷扬机14旋转，带动线盘142旋转，拉动拉线15，拉线15带动翻转轴171旋转，促使翻转托板17翻转90度，从而使得细管架18上的穿孔面朝下，网状套管182内的精液细管全部滑落出来进入到液氮内。

卷扬机14的旋转轴141通过棘轮143连接线盘142，可有效保证当滑座16上升时，带扭簧的棘轮143会自动旋转，促使拉线15自动缩回，保持直线状态，从而使得一旦卷扬机14旋转，则能使得翻转轴171快速反应翻转，保证精液细管能在预定时间内快速落入到液氮内。

如图1所示，丝杠11的最低端位置是高于液氮面的，将电机等机械装置尽量避开液氮熏蒸，从而言延长机械部分寿命。并且，通过调节竖直板173在翻转轴171的竖直高度可调节翻转托板17的固定高度，可依据托板最低位置高度调节倒入液氮的多少，便于稳定实验条件与节约液氮，同时也可以使空腔2不进入液氮，提高机械传动装置的性能与使用寿命。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置，它包括保温箱体(1)及上端的密封盖(19)，其特征在于，所述保温箱体(1)中间设置有盛放液氮的冷冻腔(6)，两侧分别设置有第一控制腔(2)和第二控制腔(3)；所述第二控制腔(3)内设置有液位调节块(7)，所述液位调节块(7)上端通过丝杠机构连接升降电机(10)；所述第一控制腔(2)内设置有滑座(16)，所述滑座(16)设置在丝杠(11)上；所述丝杠(11)上端连接旋转电机(13)；所述滑座(16)前端设置有可旋转的翻转轴(171)；所述翻转轴(171)前端竖直设置有可上下调节高度的竖直板(173)，所述竖直板(173)下端水平设置翻转托板(17)；所述翻转托板(17)设置在冷冻腔(6)内；所述翻转轴(171)上固定缠绕有拉线(15)，拉线(15)上端连接卷扬机(14)；所述翻转托板(17)上设置有可浮于液氮面的细管架(18)；所述保温箱体(1)内壁上设置有液位感应器(8)；所述滑座(16)上设置有温度传感器(20)；所述冷冻腔(6)与第二控制腔(3)之间设置有网孔板(21)；所述冷冻腔(6)与第一控制腔(2)之间设置有隔板(22)。

2.根据权利要求1所述的细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置，其特征在于，所述细管架(18)包括呈口字形状的漂浮框(181)，所述漂浮框(181)一面均匀设置有穿孔，相对的另一面设置有对应的盲孔；所述穿孔和盲孔中间连接有用于放入精液细管的网状套管(182)。

3.根据权利要求2所述的细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置，其特征在于，所述翻转托板(17)包括底框(172)；所述底框(172)上端四角竖直设置有限位杆(174)；所述漂浮框(181)侧边设置有与限位杆(174)配合的卡位槽(183)。

4.根据权利要求1所述的细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置，其特征在于，所述第二控制腔(3)上端设置有第三控制腔(4)；所述第一控制腔(2)上端设置有第四控制腔(5)；所述卷扬机(14)、旋转电机(13)均设置有第四控制腔(5)内；所述升降电机(10)设置在第三控制腔(4)内。

5.根据权利要求1所述的细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置，其特征在于，所述卷扬机(14)端头的旋转轴(141)通过棘轮(143)连接线盘(142)；所述拉线(15)设置在线盘(142)上；所述棘轮(143)上设置有扭簧。

6.根据权利要求1所述的细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置，其特征在于，所述竖直板(173)上设置有竖直的调节槽(175)；所述竖直板(173)通过调节槽(175)内的螺栓与翻转轴(171)连接。

7.根据权利要求1所述的细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置，其特征在于，所述液位调节块(7)侧边设置有卡位导轨(9)。

8.根据权利要求1所述的细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置，其特征在于，所述升降电机(10)、卷扬机(14)、旋转电机(13)、液位感应器(8)、温度传感器(20)均连接控制器；所述控制器设置在保温箱体(1)上表面或者侧面。

9.根据权利要求1所述的细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置，其特征在于，所述翻转轴(171)与滑座(16)之间设置有扭簧。

10.根据权利要求1所述的细管精液冷冻参数及其互作效应研究的装置，其特征在于，所述漂浮框(181)为泡沫框。