CN107636466B - 先兆子痫的诊断性测定和治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种在怀孕对象中先兆子痫的诊断或预后的方法，其包括提供来自怀孕对象的样品并测量所述样品中以下量之间的比例，(a)所述样品中sFlt‑1和PlGF之一或二者，和(b)血红素分解产物和精氨酸分解产物之一或二者。还描述了测定试剂盒和适于在所述方法中使用的计算机。还描述了治疗先兆子痫的方法，其包括施用药学有效量的L‑精氨酸和/或瓜氨酸和精氨酸酶抑制剂或其药学上可接受的盐。还描述了治疗癌症的方法，其包括用治疗有效量的抗VEGF化合物、L‑精氨酸和精氨酸酶抑制剂治疗对象。

Description

先兆子痫的诊断性测定和治疗
本发明提供通过描述关键的潜在病理生理学途径治疗先兆子痫的方法，以及提供通过测量来自怀孕对象的样品中的血管内皮生长因子受体1(VEGFR1，也称为可溶的fms样酪氨酸激酶1(sFlt-1))/胎盘生长因子(PlGF)以及血红素和精氨酸的分解产物之间的比例的先兆子痫(PE)的诊断和预后的方法。这是为先兆子痫提供定制的治疗方法的首个发明。还提供了在治疗与增加的血管发生相关的病症(例如癌症)中减少抗VEGF化合物的副作用的方法。
先兆子痫是一种高血压综合征，其影响所有妊娠的4-7％并且是全世界孕妇和胎儿发病率和死亡率的主要因素(Hogberg U.The World Health Report 2005:Scand JPublic Health.2005；33(6):409-411)。二十个孕妇中的一个受到先兆子痫的影响，并且其影响1000名孕妇中的3名的严重形式(<34周妊娠)(Lisonkova,S.,Sabr,Y.,Mayer,C.,Young,C.,Skoll,和Joseph,KS Obstet Gynecol 2014；124:771-781)在美国呈上升趋势(Ananth,CV,Keyes,KM和Wapner,RJ BMJ 2013；347:f6564)。先兆子痫导致所有早产的三分之一(Ghulmiyyah,L.和Sibai,B.Semin Perinatol.2012；36:56-59)。孕妇高血压和肾功能不全是先兆子痫的标志(Moran P,Lindheimer MD,Davison JM.Semin Nephrol.2004；24(6):588-595)。除了导致胎儿的死亡或严重残疾的婴儿早产之外，其没有治疗(Ghulmiyyah,L.,Sibai,B.Semin Perinatol.,2012；36(1):56-59)。它被分类为蛋白尿和非蛋白尿先兆子痫(Homer CS,Brown MA,Mangos G,Davis GK.J Hypertens.2008；26(2):295-302)。虽然患有蛋白尿先兆子痫的女性在妊娠20周后出现高血压和蛋白尿等经典症状，但患有非蛋白尿先兆子痫的女性更可能遭受高血压和肝脏疾病。与妊娠期高血压相比，这群女性更有可能患有宫内生长受限(intrauterine growth restriction,IUGR)(HomerCS,Brown MA,Mangos G,Davis GK.J Hypertens.2008；26(2):295-302)。
先兆子痫的确切病因是未知的。由细胞保护途径失调(Rodgers GM,Taylor RN,Roberts JM.Am J Obstet Gynecol.1988；159(4):908-914)和血管生成因子不平衡(AhmadS,Ahmed A.Placenta.2001；22(8-9):A.7；Maynard SE,Min JY,Merchan J,Lim KH,Li J,Mondal S,Libermann TA,Morgan JP,Sellke FW,Stillman IE,Epstein FH,Sukhatme VP,Karumanchi SA.J Clin Invest.2003；111(5):649-658:Ahmad S,Ahmed A.CircRes.2004；95(9):884-891)导致的内皮稳态的破坏[Ahmed,2000#4520]越来越多地被认为是先兆子痫的关键特征(Goulopoulou S,Davidge ST.Trends Mol Med.2015；21(2):88-97)。孕妇高血压、肾损伤和不良妊娠结果可能是由于高sFlt-1(VEGF的天然拮抗剂)导致的VEGF活性的丧失。
VEGF受体1也被称为fms样酪氨酸激酶(Flt-1)，并且sFlt-1是Flt-1受体的可溶性剪接变体(soluble splice variant)，其缺少跨膜结构域和细胞质结构域。sFlt-1高亲和性地连接至VEGF，但不刺激内皮细胞中的有丝分裂发生。
重要的是，sFlt-1(VEGF的内源性抑制剂)以及可溶的内皮因子(sEng)(转化生长因子β1(TGF-β1)共受体内皮因子的切割产物)的循环水平在先兆子痫的临床表现发病的前几周升高，(Levine RJ,Maynard SE,Qian C,Lim KH,England LJ,YU KF,Schisterman EF,Thadhani R,Sachs BP,Epstein FH,Sibai BM,Sukhatme VP,Karumanchi SA.N Engl JMed.2004；350(7):672-683)(Levine RJ,Lam C,Qian C,Yu KF,Maynard SE,Sachs BP,Sibai BM,Epstein FH,Romero R,Thadhani R,Karumanchi SA.N Engl J Med.2006；355(10):992-1005)。高母体sFlt-1导致严重先兆子痫以及不良后果。
尽管提出将sFlt-1降低到关键临界阈值以下作为治疗(Bergmann A,Ahmad S,Cudmore M,Gruber AD,Wittschen P,Lindenmaier W,Christofori G,Gross V,GonzalvesA,Grone HJ,Ahmed A,Weich HA.J Cell Mol Med.2010；14(6B):1857-1867；Thadhani R,Kisner T,Hagmann H,Bossung V,Noack S,Schaarschmidt W,Jank A,Kribs A,CornelyOA,Kreyssig C,Hemphill L,Rigby AC,Khedkar S,Lindner TH,Mallmann P,Stepan H,Karumanchi SA,Benzing T.Circulation.2011；124(8):940-950)，先兆子痫并非在所有具有高sFlt-1的女性中发展(Levine RJ,Maynard SE,Qian C,Lim KH,England LJ,Yu KF,Schisterman EF,Thadhani R,Sachs BP,Epstein FH,Sibai BM,Sukhatme VP,KarumanchiSA,N Engl J Med.2004；350(7):672-683:Solomon CG,Seely EW.N Engl J Med.2004；350(7):641-642)。
相比之下，在随后发展出综合征的怀孕女性的前三个月中胎盘生长因子(PlGF)减少。(Torry DS,Wang HS,Wang TH,Caudle MR,Torry RJ,Am J Obstet Gynecol.1998；179(6Pt1):1539-1544)(Taylor RN,Grimwood J,Taylor RS,McMaster MT,Fisher SJ,NorthRA.Am J Obstet Gynecol.2003；188(1):177-182)(Levine RJ,Thadhani R,Qian C,LamC,Lim KH,Yu KF,Blink AL,Sachs BP,Epstein FH,Sibai BM,Sukhatme VP,KarumanchiSA.Jama.2005；293(1):77-85)(Buhimschi CS,Norwitz ER,Funai E,Richman S,GullerS,Lockwood CJ,Buhimschi IA.Am J Obstet Gynecol.2005；192(3):734-741)(SavvidouMD,Noori M,Anderson JM,Hingorani AD,Nicolaides KH.Ultrasound ObstetGynecol.2008；32(7):871-876)(Foidart JM,Munaut C,Chantraine F,Akolekar R,Nicolaides KH.Ultrasound Obstet Gynecol.2010；35(6):680-687)(Noori M,DonaldAE,Angelakopoulou A,Hingorani AD,Williams DJ.Circulation.2010；122(5):478-487)。胎盘生长因子被认为是早期诊断性生物标志物，并与sFlt-1一起用于辅助先兆子痫的诊断。市售的测定试剂盒由Roche Diagnostics以商品名Electrosys sFlt-1和Electrosys PlGF免疫测定生产。Verlohren等人(Am.J.Oststet,Gyne(2010)161e1)的文章中讨论了这一点，其表明该试剂盒可能是诊断的辅助。对于晚发PE(late onset PE)的灵敏度仅为58.2％。该测定也在US 7,407,659中进行了讨论。近来，使用这些试剂盒，sFlt-1:PlGF比例已被测量以预测在临床上疑似出现综合征的女性中先兆子痫的短期消失(Zeisler等N Engl J Med 374；1nejm.org January 7,2016)。
血红素加氧酶-1(Hmox1)是一种酶，负责降解血红素以生成等摩尔量的胆绿素(转化成胆红素)、游离铁(以生成铁蛋白、铁-III-铁蛋白复合物)和一氧化碳(CO)，一种具有抗细胞凋亡特性的有效血管扩张剂(Gozzelino,Jeney等2010)。导致氧化性应激的刺激，例如过氧亚硝酸盐，上调Hmox1的表达)(Gozzelino等2010，Motterlini等2010)。实际上，人Hmox1缺乏导致严重的并且持续的内皮损伤(Yachie等1999)，这也是与先兆子痫相关的核心现象(Roberts等1989)。Hmox1的保护性功能在人胎盘组织中描述(Ahmed等2000)，并且Hmox1负调控sFlt-1的生产(Cudmore等2007)，这是在很多研究中均被证实的一般现象。例如，许多通过上调Hmox1抑制sFlt-1的药物(Onda等，2015；McCarthy等，2011)；西地那非(sildenafil)通过Hmox1抑制来自滋养层的sFlt-1(Jeong等，2014)。另外，Hmox1诱导在怀孕小鼠中减弱缺血诱导的高血压(George等，2011)并且减弱蛋白酶激活受体-2介导的sFlt-1释放(Al-Ani等，2010)。此外，心脏舒张血压和细胞质可溶性sFlt-1的水平在Hmox-1+/-的怀孕小鼠中显著提升(Zhao等，2009)。确实，Hmox1转录在注定发展先兆子痫的女性中降低(Farina等，2008)，并且Hmox1启动子的多态性与先兆子痫相关(Kaartokallio等，2014)并且具有先兆子痫的女性与具有健康孕期的那些相比在她们呼出的气息中具有显著降低的CO水平，其显示Hmox1活性的降低(Baum等，2000)。
L-精氨酸作为eNOS和精氨酸酶的底物以分别生产NO和尿素。L-精氨酸的可利用性是NO生物活性的主要决定因素；它的降低通过超氧化物阴离子清除NO增加过氧化亚硝酸盐形成(Goulopoulou等2015)。在发展出严重PE的女性中观察到在11-13周的妊娠中L-精氨酸和高精氨酸水平的降低(Khalil等2010)。最近的研究显示L-精氨酸代谢的参数无法区别早期发病PE和晚期发病PE，但是为L-精氨酸-NOS的改向至L-精氨酸-精氨酸酶途径提供间接证据(Tamas等，2013)。然而为什么以及精氨酸活性如何在先兆子痫中升高是未知的。
精氨酸酶抑制剂或L-精氨酸补充剂已在I/II期临床实验中使用，例如在患有冠心病(NCT02009527，Kovamees等，2014)和胃癌(Zhao等，2013)的病人中预防缺血再灌注的损伤。L-精氨酸补充剂在怀孕并发症小规模临床实验中被单独使用，无结论性成果。Vadillo-Ortega和同事们的研究表明当与抗氧化维生素施用时，L-精氨酸补充剂在高风险女性中降低先兆子痫的风险(Gadillo-Ortega等，2011)，但其他对于治疗疾病显示出很小或没有有益效果(Staff等2004)。L-精氨酸补充剂本身还提高不对称二甲基精氨酸和精氨酸酶的水平(Staff等，2004)，不对称二甲基精氨酸和精氨酸酶均是内皮NOS的直接和间接竞争性抑制剂并且在先兆子痫中增加(Sankaralingam等，2010)。L-瓜氨酸补充剂的使用已经显示出增加的L-精氨酸细胞质水平，并且L-瓜氨酸生产NO与L-精氨酸同样高效(Schwedhelm等，2008)，且在动物模型中已经显示L-瓜氨酸提升内皮细胞中内皮NOS的生产同时限制可诱导的NOS的活性(Wijnands等，2012)。
目前，对于先兆子痫没有可利用的有效的预防或治疗的方法。基于疾病的基本机理的更好理解而发展诊断和新治疗是重要的。现在，涉及的复杂的及相互作用的路径的鉴定和表征允许新的诊断和预后方法的发展和有效治疗的鉴定。
本发明人发现在样品中测量胎儿标志物并且与母体标志物进行比较改良先兆子痫的诊断和预后。这帮助有先兆子痫风险的对象的鉴别，并且还鉴别对于使用以下组化合物治疗很可能产生应答的对象。
本发明是基于将低Hmox1活性和高sFlt-1水平与在先兆子痫中增加的精氨酸酶-1表达和尿素循环的失调相关联的发现。现在，本发明人已经找到了一组改良的诊断标志物。本发明人已经发现血管生成因子sFlt-1和/或PlGF可与血红素和/或精氨酸的分解产物(例如，分别为胆红素和尿素)一同被测量。sFlt-1和/或PlGF与分解产物的比例现已被证实是先兆子痫的预测标志物。这个意外的组合提供了胎儿相关的标志物(sFlt-1和/或PlGF)和母体标志物(血红素分解产物和尿素)的关联。因此这个比例提供了基于母亲和胎儿的福祉(welfare)的指示物，而非仅基于胎盘或胎儿的标志物。基于该比例能提供施用L-精氨酸、精氨酸酶抑制剂和/或瓜氨酸的组合的定制治疗。
本发明人在研究血红素加氧酶1(Hmox1)时意外地识别出这个比例。
本发明基于先兆子痫是由于VEGF和Hmox1活性的部分缺失而造成的假设。
为了直接测试在低Hmox1活性下高sFlt-1的诱导导致严重先兆子痫的想法，本发明人通过静脉内注射表达sFlt-1的腺病毒(Ad-sFlt-1)将sFlt-1全身性地递送到单倍性不足(haploinsufficiency)的Hmox1(Hmox1+/-)怀孕小鼠中，这增加了母体循环中sFlt-1的水平(图3)。与野生型(Hmox1+/+)怀孕动物相比，高sFlt-1水平不仅在Hmox1+/-怀孕小鼠中诱导较高血压，而且在Hmox1+/-怀孕小鼠中诱导更高程度的肾脏和肝脏损伤(图3)。因为先兆子痫的诊断标准之一是高血压，本发明人测量了这些小鼠妊娠第18.5天的平均动脉血压(MAP)，并发现它们与野生型同窝出生者相比在较高sFlt-1水平具有严重的高血压(图3a)。另一个先兆子痫的关键特征——肾小球内皮增生——是普遍的母体内皮损伤的良好指示物(Stillman IE，Karumanchi SA.J Am Soc Nephrol.2007：18(8)：2281-2284)，其导致20周妊娠后尿液中的过滤不良和蛋白质增加(Moran P，Lindheimer MD，Davison JM.SiminNephrol.2004：24(6)：588-595)。因此，本发明人进行了肾组织学的盲法分析(blindanalysis)，其显示出典型的严重肾小球内皮增生的分叶(lobulation)和疤痕肾小球(图3b)。与肾损伤一致，这些动物的尿白蛋白排泄与野生型对照相比显著增加(图3c)。严重肾损伤的进一步直接证据由肾损伤分子-1(KIM-1，与严重先兆子痫相关的近端肾小管损伤的特异性标志物)升高的尿水平(Burwick RM，Easter SR，Dawood HY，Yamamoto HS，Fichorova RN，Feinberg BB.Hypertension.2014；64(4):833-838)(图3d)和尿sFlt-1水平(Buhimschi CS，Norwitz ER，Funai E，Richman S，Guller S，Lockwood CJ，BuhimschiIA.Am J Obstet Gynecol.2005；192(3):734-741)(图3e)证实。据报道，异常肝功能检查与对于不利母体结果的增高风险相关(Kozic JR，Benton SJ，Hutcheon JA，Payne BA，MageeLA，von Dadelszen P.J Obstet Gynaecol Can.2011；33(10):995-1004)。丙氨酸氨基转移酶(ALT)(图3f)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)(图3g)(两个肝功能缺陷标志物)在高sFlt-1的Hmox1缺乏的小鼠中均显著增加。有趣的是，据报道与sFlt-1一起诱导严重先兆子痫的可溶性内皮因子(sEng)(Venkatesha S，Toporsian M，Lam C，Hanai J，Mammoto T，Kim YM，Bdolah Y，Lim KH，Yuan HT，Libermann TA，Stillman IE，Roberts D，D′Amore PA，EpsteinFH，Sellke FW，Romero R，Sukhatme，Letarte M，Karumanchi SA.Nat Med.2006；12(6):642-649)也增加(补充图3h)。与严重先兆子痫表型一致，在给予Ad-sFlt-1的Hmox1+/-小鼠中减少的胎儿生长(图3i)和增加的胎儿重吸收(图3j)是显著的。
已知增加的Hmox1活性提高胆红素的血浆浓度(Hayashi S，Takamiya R，Yamaguchi T，Matsumoto K，Tojo SJ，Tamatani T，Kitajima M，Makino N，Ishimura Y，Suematsu M.Circ Res.1999；85(8):663-671)，因此本发明人测量血浆胆红素作为Hmox1活性的标志物。一个意外的发现是，sFlt-1诱导野生型怀孕小鼠血浆胆红素急剧增加(图3l)，但是Hmox1+/-小鼠血浆胆红素的增加变钝(图3l)，其增加了在野生型动物中高sFlt-1诱导Hmox1激活作为应激应答机制的可能性。本发明人在这些研究过程中的这些发现提供了创造性的步骤来考虑高sFlt-1和低Hmox1活性产生严重形式的先兆子痫，这现在可被用作开发定制治疗的诊断性测试。
在高sFlt-1水平环境下Hmox1的丧失由于精氨酸酶活性升高，精氨基琥珀酸裂合酶(Asl)和精氨基琥珀酸合酶(Ass)表达降低，引起精氨酸代谢失调(尿素循环)导致组织中硝化应激增加，而导致严重形式的先兆子痫(图4)。另外，观察到在具有高水平sFlt-1的Hmox1-/-小鼠中增加的肾脏铁超负荷(图9)。观察到的尿素途径失调反映在患有严重先兆子痫的女性中，她们显示出异常高的sFlt-1和低胆红素(图7)。在这个验证组的患者中，胎盘精氨酸酶在mRNA和蛋白质水平上均显著升高(图7g)。相反，转录和蛋白质水平的Asl(图7e、7g、7j)和Ass1(图7f、7g、7k)显著降低。在早期发病的患者中，sFlt-1和胆红素之间的比例显示出在接受者操作特性(receiver operating characteristic,ROC)曲线下的面积与0.97具有统计学差异(图7m)。而且，在妊娠20+0周表现出疑似为先兆子痫的迹象的单胎妊娠孕妇中，尿素水平、通过精氨酸酶水解精氨酸的产物显著增加而胆红素水平降低(图8)。sFlt-1/PlGF和胆红素/尿素之间的比例被证实具有重要的预测价值，其对于早期发病的疾病具有91.67％的灵敏度和96％的特异性，以及对于晚期发病的疾病具有85.7％的灵敏度和96％的特异性(图8f)。导致在先兆子痫中增加的精氨酸的这种机制是由于Hmox1表达或活性的丧失和高sFlt-1造成的。
为了校正先兆子痫的症状，向存在高sFlt-1的Hmox1缺乏的小鼠中施用精氨酸酶抑制剂(N-ω-羟基-L-去甲精氨酸)以及L-精氨酸。治疗导致由高sFlt-1引起的损伤后减少的肾小球硬化和肾小球膜溶解(图5a-b)、蛋白尿(图5c)和KIM-1的尿液水平(图5d)。硝化应激(nitrosative stress)被减弱，在治疗后肾脏3-硝基酪氨酸免疫染色也出现减弱(图5e)。当单独施用L-精氨酸或精氨酸酶抑制剂时(图5a-c)没有这些改善。在暴露于sFlt-1后，胎盘精氨酸转录物在Hmox1+/-怀孕小鼠中上调(图5e)，并且精氨酸酶联合L-精氨酸补充剂在Hmox1+/-怀孕动物中挽救先兆子痫样症状(包括高血压(图5f)、蛋白尿(图5g)、尿液Kim-1水平(图5h)和胎儿重吸收速率(图5i))。胎儿体重增加(图5j)并且治疗后的胎儿看起来正常(图5k)。精氨酸酶抑制剂或L-精氨酸补充剂的单独施用不能在所有动物中去除所有的先兆子痫迹象(图5f-5j)。另外，在先兆子痫的降低的子宫灌注压(RUPP)模型中精氨酸酶抑制剂和L-精氨酸的联合施用被证明是有效的(图6)。本发明的先兆子痫的新治疗可改善先兆子痫症状，例如血压的正常化、蛋白尿和肾损伤的减少以及胎儿生长的改善和胎儿重吸收的抑制。数据提供了先兆子痫是由Hmox1和精氨酸代谢的失调引起的直接证据，并表明Hmox1的上调和精氨酸酶的下调保护免发先兆子痫的临床症状。
本发明的第一方面提供了一种在怀孕对象中诊断或预后先兆子痫的方法，其包括提供来自怀孕对象的样品，并测量sFlt-1和PlGF之一或二者的量和血红素的分解产物和精氨酸的分解产物之一或二者的量之间的比例。
当单独测量时，sFlt-1特别作为晚期发病的先兆子痫诊断的合适标志物，特别是当与血红素分解产物(例如胆红素)一起测量并比较时。
当与血红素分解产物(例如胆红素)一起测量并比较时，sFlt-1和PlGF还可一同测量以提供比例，其对于指示晚期发病的先兆子痫特别有用。
sFlt-1和PlGF还可一同测量以提供比例，结合血红素分解产物(例如胆红素)和精氨酸分解产物(例如尿素)也可一同测量以提供比例，并且这两个比例可相互比较。这对于指示晚期发病的先兆子痫特别有用。
sFlt-1、PlGF、血红素分解产物(例如胆红素)和精氨酸分解产物(例如尿素)还可一同测量以提供比例，其对于指示晚期发病的先兆子痫特别有用。
精氨酸分解产物可能包括尿素、鸟氨酸、瓜氨酸、精氨基琥珀酸和氨。尿素是通过精氨酸酶的精氨酸的水解产物(见图2)，并且尿素的血液水平与精氨酸的活性高度相关(Liener等，1950)，所以预期在具有患先兆子痫风险的对象中发现比正常浓度更高的尿素浓度。
本发明另外可测量来自对象的样品中精氨酸的量和精氨酸酶的表达和活性。
本发明的另一方面提供了一种在怀孕对象中诊断或预后先兆子痫的方法，其包括提供来自怀孕对象的样品并测量所述样品中sFlt-1和肾脏或肾功能标志物的量之间的比例。肾脏或肾损伤的所述标志物可能是KIM-1(尿肾损伤分子1)。
所述比例可以与预定比例进行比较以确定先兆子痫的预后或诊断。通常比例增加到某一水平以上表明所述对象患有先兆子痫和具有差的先兆子痫预后。
还提供了通过监测从对象获取的样品中的所述比例来监测所述对象中先兆子痫的方法。
血红素分解路径涉及Hmox1。图1改编自Ryter S.W.等的文章(Physiol.Rev.(2006)86,583-650)，并总结了血红素的分解产物。
如图1所示，Hmox1分解血红素为游离铁(以制备铁蛋白，铁-III-铁蛋白复合物)、一氧化碳、胆绿素(转化为胆红素)。因此，可以测定这些产物中的一种或多种，最通常为胆红素。
所述测定还可与胎盘生长因子(PlGF)的测定结合使用，以进一步提高所述诊断的准确性。如已经讨论的，PlGF的测定通常是本领域已知的。
通常，在没有先兆子痫的健康对象中发现正常水平的sFlt-1(妊娠早期：1107pg/ml；妊娠中期：1437pg/ml；妊娠晚期：2395pg/ml)和胆红素(妊娠早期：1.7-6.8μmol/dL；妊娠中期：1.7-13.7μmol/dL；妊娠晚期：1.7-18.8μmol/dL)。通常，血液中的正常比例小于239pg/μmol。
通常725pg/μmol以上的比例表明所述对象患有PE。
在没有先兆子痫的健康对象中观察到通常正常水平的PlGF(30-626pg/ml)。
在妊娠中期小于通常279pg/ml的PlGF水平提供PE的进一步证据。
通常，在没有先兆子痫的健康对象中观察到正常水平的尿素(2.5-7.1mmol/dL)。通常，血液中sFlt-1:PlGF和胆红素:尿素之间的正常比例为小于10。
通常，血液中sFlt-1:PlGF和胆红素之间的正常比例为小于3.3。
通常，血液中sFlt-1:PlGF和尿素之间的正常比例为小于5.2。
通常，血液中sFlt-1和尿素之间的正常比例为小于1020。
通常，血液中sFlt-1和胆红素:尿素之间的正常比例为小于698.4。
通常，血液中PlGF和胆红素:尿素之间的正常比例为大于161.4。
通常，血液中PlGF和胆红素之间的正常比例为大于33.94。
通常，血液中PlGF和尿素之间的正常比例为大于45.09。
先兆子痫可能是早期发病或晚期发病的疾病。
sFlt-1、PlGF、血红素分解产物或精氨酸分解产物可通过使用分析物特异性结合试剂(例如抗体或其片段，例如Fab、F(ab’)2或svFv)进行测量。sFlt-1或血红素分解产物可通过免疫测试(例如ELISA或其他本领域通常已知的免疫测试)确定。
通常，CO水平可使用CO呼吸分析仪或从血清或血浆样品分析来测定。
可从来自血清或血浆的样品，使用例如重氮基方法(Diazo method)、高效液相色谱、通过血红素氧化酶的转变的酶法或在473nm(胆红素的最大吸光度)的分光光度法来测量胆红素。
可从来自血清或血浆的样品，通过例如使用红外荧光、分光光度或通过胆绿素还原酶活性测定测量胆绿素。
可从血清或血浆样品通过使用测定平台(如Abbott Architect或Roche ECLIA)上的免疫测定法或免疫放射测定方法来测量铁蛋白水平。
通常地，精氨酸或尿素可使用高效液相色谱层析测量，或通过使用特异性结合试剂(例如抗体或其片段，例如Fab、F(ab′)2或svFv)测量。水平可通过免疫测试(例如ELISA或其他本领域通常已知的免疫测试)确定。
精氨酸酶可使用特异性结合试剂(例如抗体或其片段，例如Fab、F(ab′)2或svFv)测量。水平可通过免疫测试(例如ELISA或其他本领域通常已知的免疫测试)确定。
可从来自血清或血浆的样品使用分光光度测量精氨酸酶活性。生产的尿素与底物特异性反应以生产有色产物，其与存在的精氨酸酶活性成比例。
样品可以是血液、尿液、血清或血浆的样品。怀孕的人类对象可提供它。可以例如在妊娠第20周提供，当母亲通常也进行超声波扫描时获取。或者，可以在怀孕期间的其他时间提供以监测例如预先存在的PE或者观察PE的治疗是否有效。所述样品可被分开并在不同测试中使用。或者，不同的样品可被用于不同的分析物。因此血液可被用于一种分析物，且尿液可被用于另一种。
还提供了用于本发明的方法的测定试剂盒。
它们通常包含特异性结合试剂和一或多种特异性检测血红素分解产物的试剂，例如特异性结合试剂。特异性结合试剂可以是如上所定义的抗体或其片段。所述血红素分解产物可以是如上所述的。
测定试剂盒可包含用于分析所述血红素分解产物的测定试剂盒成分，例如胆红素氧化酶以检测胆红素，或胆绿素还原酶以检测胆绿素。
所述测定试剂盒可包含特别用于检测精氨酸水解产物(例如尿素)的组分。
本发明人发现Hmox1失调导致在高sFlt-1水平下精氨酸代谢(尿素循环的一部分)的失调，其导致精氨酸酶活性(例如精氨酸酶I或II活性)升高，精氨基琥珀酸裂合酶(Asl)和精氨基琥珀酸合酶(Ass)表达降低，这导致肾脏和胎盘中eNOS/尿素途径的失调。尿素循环途径总结在图2中。
这已被发明人认定为是可纠正的。
本发明的另一方面提供一种治疗先兆子痫的方法，其包括施用药学上有效量的一或多种L-精氨酸和/或瓜氨酸和精氨酸酶抑制剂或精氨基琥珀酸裂合酶(Asl)和精氨基琥珀酸合酶(Ass)的活化剂。
精氨酸酶抑制剂是本领域已知的。例如，所述抑制剂可以是去甲-NOHA(N-羟基-去甲-精氨酸)。以前已经用于在缺血性损伤中恢复内皮功能(Kovamees O.等PLOS(2014,9(7)e103260)。静脉内施用所述抑制剂。例如，所述抑制剂可以是精氨酸酶I或II抑制剂。
具有和不含抗氧化剂维生素补充剂的L-精氨酸治疗是本领域已知的。例如，L-精氨酸已被给予患有先兆子痫的孕妇(Vadillo-Ortega F.等人BMJ(2011,342:d2901))。
通常L-精氨酸与精氨酸酶抑制剂一起施用。
L-瓜氨酸治疗也已经进行了测试，并且L-瓜氨酸在1型糖尿病小鼠(Romero MJ等Frontiers of Immunology(2013,4:doi:10.3389/fimmu.2013.00480))中保护免受肾损伤。
使用以下组合治疗先兆子痫的方法：
(i)瓜氨酸，以及ASS和ASl的活化剂；或者
(ii)还提供精氨基琥珀酸以及ASS活化剂。这些是图8所示途径的成分，并且预期能够治疗先兆子痫。
精氨酸酶抑制剂和L-精氨酸的组合也在之前被用于治疗哮喘、镰状细胞病和肺动脉高压(EP 2,397,128)。
可以使用的其它精氨酸酶抑制剂包括N(ω)-羟基-去甲-L-精氨酸(NOHA)、2(S)-氨基-6-硼酸己酸(ABH)、S-(+)–氨基-5-C-碘乙酰氨基己酸、S-(+)-氨基-5-碘乙酰氨基戊酸，L-正缬氨酸和L-HO精氨酸。通常所述抑制剂是去甲-NOHA或NOHA。
还提供用于治疗先兆子痫的L-精氨酸和/或瓜氨酸和精氨酸酶的抑制剂。通常L-精氨酸与精氨酸酶抑制剂组合施用。
通常L-精氨酸或瓜氨酸可以口服施用，但也可以通过注射施用，例如与精氨酸酶的抑制剂组合施用。
所述精氨酸酶抑制剂可以口服施用，但通常通过注射施用。
注射可以是静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内。
使用根据本发明的方法可鉴别待治疗的患者。
本发明的治疗方法对于在体内(例如血液、血清、血浆或尿液)具有高sFlt-1和/或PlGF与血红素分解产物和/或精氨酸产物的比例的患者特别有效。因此，所述患者可能是具有这种高比例的患者。
本发明还提供了治疗先兆子痫的方法，其包含施用药学有效量的L-精氨酸和/或瓜氨酸和精氨酸酶抑制剂和铁螯合剂，例如去铁敏。可能在具有高水平的sFlt-1的患者中观察到提高的肾脏铁超负荷，并且铁螯合剂可能被用于抵消肾脏铁超负荷。
还提供了计算机和分析设备，其包括用于计算如上所述的诊断、预后方法和监测的装置。
所述计算机可适于提供接受指示(i)来自怀孕对象的样本中的sFlt-1和/或PlGF的量的信号和(ii)指示血红素分解产物和/或精氨酸分解产物的量的信号，(iii)来自怀孕对象的样本中的指示肾脏功能或肝功能标志物的量的信号，以及用于比较所述信号以生成比例的装置和用于显示所述比例的显示器。所述标志物和检测所述标志物的方法可如上所述。
计算机可以包括只读存储器。
所述信号可以是例如指示来自所述组分之一的测定中的颜色的信号。这可以与计算机中的预定浓度曲线进行比较以校准分析物的量，并且然后当与第二分析物比较时产生比例。
给予癌症患者的所有抗VEGF药物能诱导“先兆子痫样综合征”(Vigneau，C.等2014)。
本发明人提供了一种新的疗法以减少所述“接受抗VEGF治疗的癌症患者中先兆子痫样迹象，因为他们已经描绘了‘先兆子痫表型’的病理生理学途径”。他们将在治疗癌症中增加双重治疗(L-精氨酸+精氨酸酶抑制剂)的使用，其中癌症患者正在或将要用VEGF中和抗体(例如阿瓦斯丁)、VEGF受体拮抗剂(例如索拉非尼、舒尼替尼和布立尼布)和VEGF陷阱(例如阿柏西普)进行治疗。
在导致血管生成活性和抗氧化酶活性不平衡的所有疾病或治疗中，推荐本发明人的双重治疗(L-精氨酸+精氨酸酶抑制剂)以减少正在进行的治疗的症状或副作用。
本发明的另一方面使用L-精氨酸和精氨酸酶抑制剂(例如以上定义的)来降低在癌症治疗中抗VEGF化合物的副作用。
本发明还提供一种治疗癌症的方法，其包括用治疗有效量的抗VEGF化合物和L-精氨酸和精氨酸酶抑制剂治疗患者，用于癌症治疗。
VEGF(血管内皮生长因子)是由细胞产生的刺激血管发生和血管生成的信号传导蛋白。表达VEGF的癌症能够生长和转移。因此，抑制VEGF或其作用是治疗癌症的一种方式。
抗VEGF化合物可以是抗VEGF抗体或其功能片段。这些包括贝伐珠单抗(抗VEGF-A的人源化单克隆抗体)和VEGF-Trap(诱饵VEGF受体，例如阿柏西普)阻断循环VEGF的活性，而索拉非尼、舒尼替尼和布立尼布是VEGF信号传导途径(特别是VEGF受体)的多靶点酪氨酸激酶抑制剂(MTKI)。
现在将参照附图仅通过举例的方式描述本发明。
图1.显示了血红素分解途径(改编自Ryter等Physiol.Rev.(2006)86,583-650)。
图2.显示精氨酸途径，其是尿素循环的一部分。
图3.部分Hmox1缺乏导致怀孕Hmox1+/-小鼠在高sFlt-1环境下的严重先兆子痫。(A)用在妊娠第18天记录平均动脉血压(MAP)的定时怀孕的Hmox1+/-和Hmox1+/+小鼠，用两种不同剂量(低剂量的0.5×109pfu或高剂量的1×109pfu)的Ad-sFlt-1处理。Ad-CMV作为对照组。(B)来自定时怀孕的Hmox1+/-小鼠的代表性肾小球用低剂量和高剂量的Ad-sFlt-1或对照病毒处理。将连续切片用苏木精和曙红(HE)、过碘酸-希夫(PAS)或Masson三色(MT)染色。(C)24小时尿白蛋白排泄标准化至尿肌酐，并且表示为用低剂量和高剂量Ad-sFlt-1或对照病毒处理的定时怀孕的Hmox1+/-和Hmox1+/+小鼠妊娠第18天尿白蛋白:肌酐比例。(D)用低剂量和高剂量的Ad-sFlt-1或对照病毒处理的定时怀孕的Hmox1+/-和Hmox1+/+小鼠妊娠第18天的尿肾损伤分子-1(pg/ml)(KIM-1)。(E)用低剂量和高剂量的Ad-sFlt-1或对照病毒处理的定时怀孕的Hmox1+/-和Hmox1+/+小鼠妊娠第18天尿sFlt-1(ng/ml)。(F)用低剂量和高剂量的Ad-sFlt-1或对照病毒处理的定时怀孕的Hmox1+/-和Hmox1+/+小鼠妊娠第18天的血浆丙氨酸转氨酶(ALT)。(G)用低剂量和高剂量的Ad-sFlt-1或对照病毒处理的定时怀孕的Hmox1+/-和Hmox1+/+小鼠妊娠第18天的血浆天冬氨酸氨基转移酶(AST)。(H)用低剂量和高剂量的Ad-sFlt-1或对照病毒处理的定时怀孕的Hmox1+/-和Hmox1+/+小鼠妊娠第18天的血浆可溶性内皮因子。(I)用低剂量和高剂量的Ad-sFlt-1或对照病毒处理的定时怀孕的Hmox1+/-和Hmox1+/+小鼠妊娠第18天的平均胎儿体重，表示为g/幼鼠。(J)用低剂量和高剂量的Ad-sFlt-1或对照病毒处理的定时怀孕的Hmox1+/-和Hmox1+/+小鼠妊娠第18天的总胎儿吸收率，表示为百分比。(K)用高剂量的Ad-sFlt-1或Ad-CMV处理的定时怀孕的Hmox1+/-小鼠以及用高剂量的Ad-sFlt-1处理的Hmox1+/-小鼠第18天的代表性幼鼠和胎盘。(L)用低剂量和高剂量的Ad-sFlt-1或对照病毒处理的定时怀孕的Hmox1+/-和Hmox1+/+小鼠妊娠第18天的血浆胆红素。结果代表或表示为平均值(±SEM)，并通过单因素重复测量方差分析(ANOVA)进行分析，然后进行Student-Newman-Keuls事后检验。
图4.可溶性Flt-1加重严重肾损伤、使精氨酸代谢失调并促进Hmox1-/-小鼠中的氧化应激。(A)用Ad-sFlt-1处理的来自Hmox1-/-小鼠的代表性肾小球，显示严重的肾小球硬化和肾小球膜破裂。将连续切片用苏木精和曙红(HE)和高碘酸-希夫(PAS)染色。(B)针对异常的肾小球编号的切片盲评打分，并且表示为每来自用Ad-sFlt-1或对照病毒(Ad-CMV)处理的Hmox1-/-小鼠的连续切片在总肾小球中的百分比。(C)24小时尿白蛋白排泄标准化至尿肌酐，并且表示为用Ad-sFlt-1或对照病毒处理的Hmox1+/+和Hmox1-/-小鼠尿白蛋白:肌酐的比例(ACR)。(D)用Ad-sFlt-1或对照病毒处理的Hmox1+/+和Hmox1-/-小鼠中的血浆胆红素。插图：蛋白免疫印迹显示用Ad-CMV或Ad-sFlt-1处理的Hmox1+/+小鼠中肾Hmox1的表达。(E)用Ad-sFlt-1或对照病毒处理的Hmox1+/+和Hmox1-/-小鼠的肾裂解物中精氨酸酶-1的相对mRNA表达。(F)用Ad-sFlt-1或对照病毒处理的Hmox1+/+和Hmox1-/-小鼠的肾裂解物中总精氨酸酶-1活性，以mM/mg蛋白质表示。(G)用Ad-sFlt-1或对照病毒(Ad-CMV)处理的Hmox1+/+和Hmox1-/-小鼠的肾裂解物中精氨基琥珀酸裂解酶(Asl)的相对mRNA表达。(H)用Ad-sFlt-1或对照病毒(Ad-CMV)处理的Hmox1+/+和Hmox1-/-小鼠的肾裂解物中精氨基琥珀酸合酶-1(Ass1)的相对mRNA表达。(I)蛋白免疫印迹显示用Ad-sFlt-1或对照病毒处理的Hmox1+/+和Hmox1-/-小鼠的肾裂解物中的3-硝基酪氨酸表达。β-肌动蛋白用作加样对照。结果代表或表示为平均值(±SEM)，并通过单因素重复测量方差分析进行分析，然后进行Student-Newman-Keuls事后检验。
图5.精氨酸途径的转移在高sFlt-1环境下拯救Hmox1+/-怀孕小鼠中的先兆子痫表型。(A)来自Ad-sFlt-1注射的Hmox1-/-小鼠的代表性肾小球，所述小鼠用精氨酸酶抑制剂(去甲-NOHA)、L-精氨酸或精氨酸酶抑制剂和L-精氨酸处理。将连续切片用苏木精和曙红(HE)和高碘酸-希夫(PAS)染色。(B)24小时尿白蛋白排泄标准化至尿肌酐，并且表示为来自Ad-sFlt-1注射的Hmox1-/-小鼠的尿白蛋白:肌酐比例，所述小鼠用精氨酸酶抑制剂(去甲-NOHA)、L-精氨酸或精氨酸酶抑制剂和L-精氨酸处理。(C)来自Ad-sFlt-1注射的Hmox1-/-小鼠的尿肾损伤分子-1(pg/ml)(KIM-1)，所述小鼠用精氨酸酶抑制剂(去甲-NOHA)、L-精氨酸或精氨酸酶抑制剂和L-精氨酸处理。(D)来自Ad-sFlt-1注射的Hmox1-/-小鼠的肾切片中3-硝基酪氨酸的免疫组织化学定位，所述小鼠用精氨酸酶抑制剂(去甲-NOHA)和L-精氨酸或未处理对照处理。(E)来自Ad-sFlt-1注射的Hmox1+/-小鼠的Hmox1+/+和Hmox1-/-胎盘中精氨酸酶-1的相对mRNA表达。(F)在定时怀孕的Ad-sFlt-1注射的Hmox1+/-小鼠中妊娠第18天记录的平均动脉血压(MAP)，所述小鼠用精氨酸酶抑制剂、L-精氨酸或和L-精氨酸和精氨酸酶抑制剂或未处理对照处理。(G)定时怀孕的Ad-sFlt-1注射的Hmox1+/-小鼠中妊娠第18天24小时尿白蛋白:肌酐比例，所述小鼠用精氨酸酶抑制剂、L-精氨酸或和L-精氨酸和精氨酸酶抑制剂或未处理对照处理。(H)定时怀孕的Ad-sFlt-1注射的Hmox1+/-小鼠中妊娠第18天的尿肾损伤分子-1(pg/ml)(KIM-1)，所述小鼠用精氨酸酶抑制剂、L-精氨酸或和L-精氨酸和精氨酸酶抑制剂或未处理对照处理。(I)定时怀孕的Ad-sFlt-1注射的Hmox1+/-小鼠中妊娠第18天以百分比表示的总胎儿吸收率，所述小鼠用精氨酸酶抑制剂、L-精氨酸或和L-精氨酸和精氨酸酶抑制剂或未处理对照处理。(J)定时怀孕的Ad-sFlt-1注射的Hmox1+/-小鼠中妊娠第18天以每只幼鼠的克数表示的平均胎儿体重，所述小鼠用精氨酸酶抑制剂、L-精氨酸或和L-精氨酸和精氨酸酶抑制剂或未处理对照处理。(K)定时怀孕的Ad-sFlt-1注射的Hmox1+/-小鼠中妊娠第18天的代表性幼鼠和胎盘，所述小鼠用精氨酸酶抑制剂和L-精氨酸或未处理对照处理。结果代表或表示为平均值(±SEM)，并通过单因素重复测量方差分析进行分析，然后进行Student-Newman-Keuls事后检验。
图6.在先兆子痫的RUPP模型中L-精氨酸和精氨酸酶抑制剂组合治疗的效果。(A)心脏收缩动脉血压(SBP)。(B)在第18天以g/幼鼠计的平均胎儿体重。(C)来自定时怀孕的C57/bl6小鼠在妊娠第18天以百分比表示的总胎儿重吸收率，所述小鼠经历RUPP或空白手术并且用或不用L-精氨酸和精氨酸酶抑制剂处理。(D)在定时怀孕的小鼠中妊娠第18天尿白蛋白:肌酐比例，所述小鼠经历RUPP或空白手术并且用或不用L-精氨酸和精氨酸酶抑制剂处理。(E)来自定时怀孕的C57/bl6小鼠妊娠第18天尿肾损伤分子-1(KIM-1)，所述小鼠经历RUPP或空白手术并且用或不用L-精氨酸和精氨酸酶抑制剂处理。(F)来自定时怀孕的C57/bl6小鼠妊娠第18天循环sFlt-1水平，所述小鼠经历RUPP或空白手术并且用或不用L-精氨酸和精氨酸酶抑制剂处理。
图7.具有升高的sFlt-1水平的先兆子痫患者具有改变的精氨酸生物合成途径。(A)早期发病的先兆子痫妊娠和孕龄匹配的对照组中的血浆sFlt-1水平。(B)早期发病的先兆子痫妊娠和孕龄匹配的对照组中的血浆胆红素水平。(C)早期发病的先兆子痫妊娠和孕龄匹配的对照组中的以比例表达的sFlt-1:胆红素水平。(D-F)在早期发病的先兆子痫的胎盘的子集中精氨酸酶1、精氨基琥珀酸裂解酶(Asl)和精氨基琥珀酸合酶-1(Ass1)的相对mRNA表达，当与孕龄匹配的对照组相比所述子集具有显著升高的sFlt1水平。(G-K)来自正常妊娠和并发有先兆子痫的妊娠的胎盘中精氨酸酶1、Asl和Ass1的蛋白免疫印迹和密度计分析(densitometric analysis)。β-肌动蛋白作为加样对照，并且所有的密度计分析均标准化至β-肌动蛋白。(L)蛋白免疫印迹分析显示在正常和先兆子痫女性的胎盘溶解产物中3-硝基酪氨酸表达。(M)使用sFlt-1:胆红素比例用于预测不良结局的ROC曲线。
图8.对于注定发展先兆子痫的女性的sFlt-1与胆红素或sFlt-1:PlGF与胆红素:尿素之间的比例。(A)并发有早期发病、晚期发病的先兆子痫的妊娠中的血浆胆红素(μmol/dL)水平，并与年龄匹配的正常妊娠相比较。(B)并发有早期发病、晚期发病的先兆子痫的妊娠中的血浆尿素(mmol/dL)水平，并与年龄匹配的正常妊娠相比较。(C)并发有早期发病、晚期发病的先兆子痫的妊娠中的可溶性Flt-1:胆红素的比例，并与年龄匹配的正常妊娠相比较。(D)使用sFlt-1:胆红素比例用于预测不良结果的ROC曲线。(E)并发有早期发病、晚期发病的先兆子痫的妊娠中的sFlt-1:PlGF:胆红素:尿素的比例，并与年龄匹配的正常妊娠相比较。(F)使用sFlt-11:PlGF:胆红素:尿素比例用于预测不良结果的ROC曲线。
图9.Perl’s普鲁士蓝染色显示sFlt-1处理的Hmox1-/-小鼠中的铁沉积。
图10.提出示意路径以解释定制的先兆子痫治疗方法。
材料和方法
患者样品
预测性研究：这是一个前瞻性研究，其在2012年9月和2014年12月间在伦敦圣乔治医院大学(St George’s Hospital University of London)进行。从所有女性获得书面知情同意书同意参加这次研究。本研究经过伦敦-斯坦摩尔研究伦理委员会(London-Stanmore Research Ethics Committee)批准。本研究参与标准是具有单胎妊娠的女性，其在20+0周妊娠后显示出疑似先兆子痫的症状或迹象。测定操作者不知晓参与者的临床信息。母体血液通过无抗凝剂静脉穿刺获取。样品在2000×g离心，并且吸取血清存储于-80℃直至测试。sFlt-1和PlGF浓度平行确定，并且然后通过Roche Diagnostics,Penzberg,Germany的Elecsys平台上的市售测定测量。
验证研究：机构伦理委员会(Institutional Ethics Committee)批准血液和组织的采集，并且获得了书面知情同意书。来自单胎妊娠女性的血液样品募集自低危和高危临床以及生产和分娩的个体。所有女性从加入直至分娩均前瞻性跟进。母体血液通过无抗凝剂静脉穿刺收集。样品在2000×g离心，并且吸取血清存储于-80℃直至测试。sFlt-1和PlGF浓度平行确定，并且然后通过市售ELISA测定试剂盒测量(R&D系统)。母体血清胆红素水平使用比色法测定试剂盒测量。
实验动物
对十二周龄的Hmox1-/-小鼠和Hmox1+/+小鼠进行非怀孕研究。通过注射入尾静脉将动物注射1×109PFU的Ad-sFlt-1-1或Ad-CMV(对照)腺病毒。腺病毒施用后9天，将小鼠分别置于代谢笼中24小时。测量体重、食物和水摄入量以及尿量。进行尿液测量后，在第10天进行血液取样，将动物安乐死，并收集其肾脏和肝脏以进行进一步分析。在非怀孕的Hmox1-/-小鼠和Hmox1+/+动物中还进行了使用精氨酸酶抑制剂和/或L-精氨酸补充剂的联合疗法挽救研究(rescue study)。小鼠每天腹膜内注射去甲-NOHA(Bachem，Bubendorf，Switzerland)。在Ad-sFlt-1-1腺病毒注射一周前通过向饮用水补充25g/L的L-精氨酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)给予动物L-精氨酸，直到研究结束。
怀孕小鼠研究在10至12周龄的Hmox1+/-小鼠和Hmox1+/+小鼠或野生型C57/Bl6小鼠中进行。怀孕的第一天(E0.5)是通过第二天早上存在阴道塞而定义的。在E10.5(妊娠中期)，通过注射入尾静脉向怀孕小鼠注射1×109PFU的Ad-sFlt-1-1或Ad-CMV(对照)腺病毒。对于RUPP研究，在妊娠第13天，麻醉定时怀孕的C57/Bl6小鼠。顺着身体的中线制造切口，并且分离腹主动脉。然后将血管用放置在主动脉上围绕钝针(大约1mm2直径)的7.0缝合线限制。然后将针移除。右卵巢动脉用7.0缝合线限制。闭合切口，并且允许小鼠康复5天。对于低剂量sFlt-1实验，使用1×108PFU的表达sFlt-1的腺病毒。将E17.5小鼠分别置于代谢笼中24小时，并且如前所述在E18.5测量动脉血压(Wang等，2013)。简言之，通过使用氯胺酮/赛拉嗪混合物(cocktail)将小鼠麻醉，并用连接到压力换能器(ADInstruments Ltd，Oxford，UK)的Millar 1-French Mikro-Tip压力导管分离颈动脉和颈动脉插管。在30分钟的血压稳定后，记录动脉压并在额外的10分钟内平均。测量后，进行血液取样，将动物安乐死，并且收集他们的肾脏、肝脏和胎盘。计数和称重活胎儿和胎盘。所有实验均使用大学伦理审查委员会(University Ethical Review Committee)批准的程序按1986年“英国动物(科学程序)法”进行。
血液和尿液中的生物化学测量
使用Albuwell-M试剂盒(Exocell Inc，Philadelphia，PA)确定尿白蛋白。用于人和鼠sFlt-1、KIM-1和PlGF的酶联免疫吸附测定试剂盒从R&D Systems获得并根据制造商的说明进行。
实时聚合酶链反应
如前所述进行样品准备和实时定量聚合酶链反应(Wang等，2013)。
单克隆抗3-硝基酪氨酸(1:1000稀释，Abcam)、抗精氨基琥珀酸合酶(1:500，Abcam)、抗精氨基琥珀酸裂合酶(1:500，Abcam)、抗精氨酸酶-1抗体(1:500，Genetex)和抗β肌动蛋白(1:10000，Sigma)。
免疫组织化学
如前所述，准备人和鼠胎盘组织用于免疫组织化学。通过使用对精氨酸酶-1、Ass1、Asl和3-硝基酪氨酸的抗体进行免疫组织化学。使用以下抗体：(1)抗精氨酸酶-1抗体(1:50，Genetex)；(2)抗精氨基琥珀酸合酶(1:100，Abcam)；(3)抗精氨基琥珀酸裂解酶(1:100，Abcam)和(4)抗3-硝基酪氨酸(1:100稀释，Abcam)。将来自小鼠肾脏或人胎盘活检的切片再水化，用正常血清封闭，并在室温下与第一抗体温育2小时。使用Vectastain ABC试剂盒与DAB进行可视化。切片用苏木精复染色。使用Nikon倒置显微镜和Image Pro-Plus图像分析软件分析染色。
基因阵列
如上所述从小鼠肾组织制备RNA样品，并提交给爱丁堡大学ARK-Genomics，在那里它们进行了质量分析。
蛋白免疫印迹分析
仔细分析(dissect)肾裂解物，并将样品快速冷冻在液氮中。用单克隆抗3-硝基酪氨酸(1:1000稀释，Abcam)、抗精氨基琥珀酸合酶(1:500，Abcam)、抗精氨基琥珀酸裂合酶(1:500，Abcam)、抗精氨酸酶-1抗体(1:500，Genetex)和抗β肌动蛋白(1:10000，Sigma)进行蛋白免疫印记。使用与辣根过氧化物酶(1:1000稀释，Transduction Laboratories)缀合的抗兔或抗小鼠IgG第二抗体。
统计学分析
结果以平均值±SEM表示，并使用方差分析(ANOVA)在多个组之间进行比较。当P<0.05时报告显著性差异。
结果
为了测试严重先兆子痫可能由于VEGF和Hmox1活性的部分缺失出现的观点并且准确反映人PE样症状，我们向单倍性不足(带有单个Hmox1等位基因)的Hmox1(Hmox1+/-)怀孕小鼠通过静脉注射两剂量的编码sFlt-1(Ad-sFlt-1)的腺病毒全身性递送sFlt-1。使用这个方法，我们复制了怀孕小鼠血浆中显著增加的sFlt-1。由于先兆子痫的诊断标准之一是高血压，平均动脉血压(MAP)在妊娠第18.5天测量(图3a)，或者使用植入的无线电遥测持续测量心脏收缩血压(SBP)。两个测量方式均显示，与它们的野生型的同窝出生者相比，在较高sFlt-1循环水平在E18.5用Ad-sFlt-1处理的Hmox1+/-组中严重升高的血压。另外，无线电遥测研究显示持续迅速增加的SBP，其在sFlt-1处理的Hmox1+/-小鼠中在E18.5达到最高值。肾小球内皮增生是严重先兆子痫的主要特征和普遍的母体内皮损伤的良好指示剂。来自这些小鼠的肾组织学分析显示出严重的肾小球内皮增生的分叶和疤痕肾小球(图3b)。与肾损伤相一致，尿白蛋白分泌与野生型小鼠相比在这些动物中也显著增加(图3c)。严重肾损伤由肾损伤分子-1(与严重先兆子痫相关的近端肾小管损伤的特异性标志物)的尿液水平增加(图3d)和提升的尿sFlt-1水平(与严重先兆子痫相关)(图3e)而进一步证实。
异常肝功能测试被报道与不良母体结果增加的风险相关，并且丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)(二者为急性肝损伤的标志物)在Hmox1缺陷的小鼠中在高sFlt-1攻击下显著增加(图3f和g)。另外，可溶性内皮因子(sEng)(内皮激活的标志物，并且据报道与sFlt-1协同诱导严重先兆子痫)也增加(图3h)。与先兆子痫的表型一致，在Hmox1+/-小鼠中发现胎儿体重下降(图3i)和胎儿重吸收增加(图3j)。从sFlt-1处理的Hmox1+/-小鼠中获取的幼鼠代表性图片显示更小和更低血管化的胚胎。从Ad-sFlt-1处理的Hmox1+/-小鼠获取的Hmox1+/+和Hmox1+/-胎盘中的Arg1水平，在Hmox1+/-胎盘中显示显著提升的Arg1mRNA(图4k)。我们测量血浆胆红素，因为其是Hmox1活性的公认标志物，并且我们注意到sFlt-1诱导血浆胆红素在野生型妊娠中的急剧增加，但是在Hmox1缺陷的动物中增加是钝性的(图3l)。在sFlt-1处理的Hmox1+/+和Hmox1+/-小鼠中的胎盘Hmox活性研究反映血浆胆红素结果，以进一步证实使用胆红素作为Hmox活性的替代标志物的有效性。这提高了作为在正常妊娠中的应激反应机制高sFlt-1诱导Hmox1活性的可能性，但是当Hmox1活性受限时该机制受损。这些研究表明高sFlt-1和低Hmox1活性产生一种先兆子痫表型的严重形式，其现在可被用作替代标志物以支持定制治疗开发。
为了直接测试升高的sFlt-1和Hmox1受损环境可诱导严重先兆子痫的概念，我们向Hmox1-/-小鼠全身性递送了sFlt-1。编码sFlt-1的腺病毒(Ad-sFlt-1)的静脉内注射在循环和尿中产生高水平的sFlt-1，其提示肾损伤。如Hmox1缺乏还致使小鼠不育，这些实验在非妊娠状态进行并且专注于之后的肾损伤。Hmox1完全丧失和高循环的sFlt-1导致严重的局灶性肾小球病变，其特征在于肾小球内皮不同程度的膨胀，伴随肾小球毛细血管回路闭塞或变窄、肾小球硬化、肾小球膜溶解、分叶和疤痕以及在一些细胞中的核破裂(图4a)。这通过肾切片的随机单盲评分被证实，其显示在sFlt-1处理的Hmox1-/-小鼠中显著更高水平的肾小球异常(图4b)。与严重肾损伤一致，蛋白尿增加(图4c)。高sFlt-1导致在野生型小鼠中血浆胆红素(Hmox1活性的替代标志物)的上调，但是sFlt-1不在敲除动物中增加Hmox1活性(低血浆胆红素水平)(图4d)。为了调查导致sFlt-1诱导的肾损伤的机制，我们研究了在小鼠暴露于高水平的sFlt-1 10天后肾基因表达中的变化。Affymetrix基因芯片微阵列分析显示用sFlt-1处理的Hmox1-/-小鼠的肾中的几个上调的基因(>20倍)。最显著上调的基因之一是精氨酸酶-1(Arg1)，其通过real-time PCT(图4e)和精氨酸活性测试(图4f)被验证。Arg1的替代物是L-精氨酸。作为内皮一氧化氮合酶(NOS)的底物，L-精氨酸的利用度还是一氧化氮(NO)生物利用度的主要决定物。在L-精氨酸合成中的速率限制步骤是通过精氨基琥珀酸合酶(Ass)和精氨基琥珀酸裂合酶(Asl)将L-瓜氨酸(NO生产的副产品)转化为精氨基琥珀酸以回收精氨基琥珀酸为L-精氨酸。sFlt-1的过表达显著抑制在Hmox1-/-小鼠中的Asl(图4g)和Asl(图4h)的mRNA表达，其提示在先兆子痫中Hmox1活性的降低可导致精氨酸途径酶的重要失调。已经知道氧化应激标志物——硝基酪氨酸的表达在正常妊娠中比在先兆子痫胎盘中更多。精氨酸代谢的失调和缺少应答sFlt-1的胆红素升高促使我们在这些小鼠肾脏中调查反应性硝基酪氨酸种类(reactive nitrotyrosine species)。使用蛋白免疫印记分析，用Ad-sFlt-1处理的Hmox1-/-小鼠的肾裂解物中显示更高的3-硝基酪氨酸富集，3-硝基酪氨酸是反应性硝基酪氨酸种类的标志物(图4i)。
sFlt-1在Hmox1-/-小鼠中的过表达导致Arg1活性的增加，我们直接检测了精氨酸酶活性的抑制以及L-精氨酸补充剂是否可以挽救这些小鼠中观察到的严重肾损伤。当精氨酸酶活性通过每天腹膜内注射N-ω-羟基-L-去甲精氨酸(去甲-NOHA)以及在饮用水中随意添加L-精氨酸被抑制时，这挽救了肾小球硬化和肾小球膜溶解(图5a)。其还显著抑制通过蛋白尿检测到的肾损伤(图5b)，并且在暴露于高sFlt-1的Hmox1-/-小鼠中尿KIM-1水平明显降低(图5c)。Hmox1-/-小鼠中联合疗法后，肾3-硝基酪氨酸免疫染色也看上去被减弱(图5d)。收集自Ad-sFlt-1处理的Hmox1+/-小鼠的Hmox1+/+和Hmox1+/-胎盘中的胎盘Arg1水平显示出在Hmox1+/-胎盘中显著升高的Arg1mRNA(图5e)。向饮用水中随意加入的L-精氨酸补充剂在Ad-sFlt-1处理的Hmox1+/-小鼠中显著降低平均动脉血压(MAP)(图5f)，但在胎儿重吸收速率或平均胎儿体重上没有显著进步(图5j)。反之，每天的去甲-NOHA治疗降低重吸收速率(图5i)而对于MAP(图5f)或者胎儿体重没有明显效果。两种疗法还显示蛋白尿无显著改善(图5g)。但是，当精氨酸酶活性通过每天的L-精氨酸补充剂抑制时，这降低血压(图5f)、改善胎儿体重分布至正常Ad-CMV范围内(图5j)。联合疗法产生外观健康的胎儿(图5k)并且导致胎儿重吸收速率的明显和显著降低(图5i)。联合疗法还显著抑制通过蛋白尿检测到的肾损伤(图5g)，并且尿KIM-1水平在暴露于高sFlt-1的Hmox+/-小鼠中显著降低(图5h)。
降低的子宫胎盘灌注和其导致的胎盘缺血是先兆子痫的另一个主要标志。更近来，Gilbert等显示大鼠中降低的子宫胎盘灌注(RUPP)模型产生的胎盘缺血提升sFlt-1和sEng，并且显著降低Hmox1表达。我们小型化并改造了大鼠RUPP模型为小鼠以检测我们新的去甲-NOHA和L-精氨酸联合疗法。如之前在大鼠RUPP中报道的，与空白对照相比在野生型C57/Bl6小鼠中的RUPP手术显著增加了心脏收缩血压(SBP)(图6a)和sFt-1水平(图6f)。同样地，蛋白尿(图6d)和重吸收速率(图6c)也在RUPP介入之后增加。但是，用去甲-NOHA和L-精氨酸的联合疗法可在RUPP小鼠中降低心脏收缩血压(SBP)(图6a)、sFlt-1(图6f)、蛋白尿(图6d)和重吸收速率(图6c)并且正常化胎儿体重(图6b)。
为了验证严重先兆子痫在那些Hmox1活性和VEGF信号传导缺陷的选定组的孕妇中发生的观点，我们在患有先兆子痫的女性和对照女性中测量了血浆sFlt-1。如预期的，血浆sFlt-1显著升高(图7a)，并且在这些具有高sFlt-1的个体中血浆胆红素被发现是低的(图7b)。另外，sFlt-1与胆红素的比例在PE样品中显著更高(图7c)。我们下一步比较了参与在胎盘中精氨酸代谢的酶的表达，所述胎盘获得自正常妊娠和先兆子痫并发的妊娠，以观察这些与在我们的先兆子痫模型小鼠中观察到的高sFlt-1和低Hmox1环境中的那些是否以类似的方式变化。胎盘Arg1在mRNA(图7d)和蛋白质水平上均急剧增加(图7g和i)，其与胎盘精氨酸酶水平在先兆子痫中增加相一致。相反的，Asl(图7e、7g、7j)和Ass1(图7f、7g、7k)的转录和蛋白质水平显著降低。蛋白免疫印迹分析显示在来自先兆子痫女性的胎盘裂解物中增加的3-硝基酪氨酸表达(图7l)。接受者操作特性(ROC)分析显示sFlt-1/胆红素比例对于发展早期严重先兆子痫的女性和没有发展病症的那些女性具有良好辨别力，具有0.98的ROC曲线以下区域(图7m)。
为了检测血管发生失衡的失调结合Hmox1活性降低和精氨酸酶活性升高是否可被用作潜在的诊断工具，sFlt-1、PlGF、胆红素和尿素的血浆水平在妊娠中期具有疑似先兆子痫的迹象的女性中测量。分析显示，在妊娠中期在发展出早期发病的先兆子痫和晚期发病的先兆子痫的患者中，血浆胆红素将会显著降低并且尿素会显著升高(图8a和b)。sFlt-1与胆红素比例在早期发病和晚期发病的先兆子痫中也均显示出显著增加(图8c)，其分别具有在0.865和0.989的ROC曲线以下的区域(图8d)。但是，当评估4个参数的结合并表达为[sFlt-1:PlGF]/[胆红素:尿素]时，我们新的诊断算法显示当与正常妊娠比较时，在早期发病和晚期发病的先兆子痫组中显著增加的[sFlt-1:PlGF]/[胆红素:尿素]比例(图8e)。另外，接受者操作特性(ROC)分析显示当与没有发展出病症的女性相比，这个比例对于发展出早期严重早期先兆子痫和晚期发病的先兆子痫的女性具有良好辨别力，分别具有0.985和0.983的ROC曲线以下的区域(图8f)。

Claims (19)

1.sFlt-1和/或PlGF的特异性结合试剂和血红素分解产物和/或精氨酸分解产物的特异性结合试剂在制备用于通过测量来自怀孕对象的样品中sFlt-1和PlGF之一或二者的量与血红素分解产物和精氨酸分解产物之一或二者的量之间的比例从而在怀孕对象中诊断或预后先兆子痫的试剂盒中的用途，其中所述血红素分解产物选自胆红素、胆绿素、一氧化碳和铁蛋白，所述精氨酸分解产物选自尿素、鸟氨酸、瓜氨酸、精氨基琥珀酸或氨。
2.权利要求1的用途，其中将所述比例与预定比例进行比较，以确定先兆子痫的诊断或预后。
3.权利要求1的用途，其中在所述样品中测量胆红素的量。
4.权利要求3的用途，其中在所述样品中测量尿素的量。
5.前述权利要求中任一项的用途，其中所述样品是血液、血清、血浆或尿液。
6.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述试剂盒用于检测所述对象中早期发病或晚期发病的先兆子痫的存在。
7.权利要求1-4中任一项的用途，其中通过免疫测定确定所述样品中sFlt-1的量、血红素分解产物的量和任选的PlGF的量和任选的精氨酸分解产物的量。
8.用于通过测量怀孕对象的样品中sFlt-1和PlGF之一或二者的量与血红素分解产物和精氨酸分解产物之一或二者的量之间的比例在怀孕对象中诊断或预后先兆子痫的测定试剂盒，其包含(i)sFlt-1和/或PlGF的特异性结合试剂和(i)血红素分解产物和/或精氨酸分解产物的特异性结合试剂和/或(ii)血红素分解特异性测定试剂盒组分，其中所述血红素分解产物是胆红素、胆绿素、碳氧血红蛋白或铁蛋白，所述精氨酸分解产物选自尿素、鸟氨酸、瓜氨酸、精氨基琥珀酸或氨。
9.权利要求8的测定试剂盒，其中所述特异性结合试剂包含对sFlt-1或所述血红素分解产物特异性的抗体或其片段。
10.L-精氨酸和/或瓜氨酸和精氨酸酶抑制剂或其药学上可接受的盐在制备用于在对象中治疗先兆子痫的药物中的用途。
11.权利要求10的用途，其中所述精氨酸酶抑制剂是去甲-NOHA。
12.权利要求10或11的用途，其中所述L-精氨酸和/或瓜氨酸口服施用，或呈口服施用的形式。
13.权利要求10或11的用途，其中所述精氨酸酶抑制剂肌内或腹膜内施用，或呈肌内或腹膜内施用的形式。
14.权利要求10或11的用途，其中使用权利要求1至7中任一项中所定义的试剂盒来鉴定所述对象中先兆子痫的存在。
15.权利要求10或11的用途，其中所述对象具有高的sFlt与血红素分解产物的比例。
16.权利要求10或11的用途，其包含施用药学有效量的铁螯合剂。
17.权利要求16的用途，其中所述铁螯合剂为去铁胺。
18.一种计算机，其适于提供接收指示(i)来自怀孕对象样品中的sFlt-1和/或PlGF的量的信号和(ii)来自怀孕对象样品中指示血红素分解产物和/或精氨酸分解产物的量的信号和提供用于比较所述信号以产生比例的装置，以及用于显示所述比例的显示器。
19.一种分析设备，其包括根据权利要求18所述的计算机。
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