CN107636021B - 用于制备多糖的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备多糖的工艺，所述多糖包含经由β1,4糖苷键连接在一起的式(III)的D‑木糖单元，其中R1是氢或乙酰基，R2是氢、乙酰基或4‑O‑甲基葡萄糖醛酸单元，其中，当R2是4‑O‑甲基葡萄糖醛酸单元时，在相同的糖单元上的R1基团被定义为G，其中G是氢或乙酰基，并且其中在此类多糖的还原端处的糖单元是木糖、来苏糖或木酮糖，所述工艺包括以下步骤：使从山毛榉木中提取的木聚糖选择性脱乙酰；和使在该步骤中获得的选择性脱乙酰的木聚糖异构化，或所述工艺包括以下步骤：使从山毛榉木中提取的木聚糖异构化；和使在该步骤中获得的异构化的木聚糖选择性脱乙酰。该工艺对于用于药学用途的戊聚糖多硫酸酯或其药学上可接受的盐的制备是有用的。
Figure DDA0001470419970000011

Description

用于制备多糖的工艺
描述
多糖广泛存在于天然产物中并且显现出对于医药用途越来越有吸引力的兴趣的若干且有用的生物化学性质。
作为实例，一些多糖作为免疫调节剂或镇咳剂的性质是若干科学报告的主题。
特定结构要素如支化、乙酰基基团和稀有糖单元(rare sugar unit)的存在可能对这些多糖和能够从其合成的衍生物的生物化学性质以及潜在的药理学性质产生影响。
在这样的衍生物中，戊聚糖多硫酸酯(pentosanpolysulfate)具有特别的重要性。
若干药物产品包含戊聚糖多硫酸酯或其盐作为活性成分。作为实例，
Figure BDA0001470419950000012
在美国被批准用于治疗间质性膀胱炎，
Figure BDA0001470419950000011
是具有高硫酸化程度以及4000-6000道尔顿的分子量的戊聚糖多硫酸酯钠。
从结构的角度看，戊聚糖多硫酸酯被描述为硫酸化的多糖链的复合混合物(complex mixture)，所述硫酸化的多糖链具有硫酸化的β-(1→4)-D-吡喃木糖(在下文中，木糖单元)作为最多再现的重复单元。
还存在被键合至木糖单元的2位的硫酸化的4-O-甲基α-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸单元(在下文中，甲基葡萄糖醛酸单元)。
如在科技文献中报告的戊聚糖多硫酸酯或其盐的结构式在式(I)中描述：
Figure BDA0001470419950000021
其中Z代表-SO3Y，并且Y是选自由H和药学上可接受的阳离子例如钠或钙组成的组的至少一个成员。
戊聚糖多硫酸酯是半合成的产物，其可以通过用硫酸化剂例如氯磺酸或磺酰氯处理从山毛榉木或其他植物源提取的木聚糖来获得。在硫酸化之后，戊聚糖多硫酸酯通常用氢氧化钠处理以得到对应的钠盐。
戊聚糖多硫酸酯在US2689848中被公开。所述专利公开了用于生产戊聚糖多硫酸酯的工艺，该工艺包括在吡啶的存在下用氯磺酸处理木聚糖以获得木聚糖的硫酸酯盐，然后在酸性或中性含水介质中氧化性解聚以获得解聚的产物，将该产物渗析并且分馏以获得期望的产物。然而，所述工艺不提供具有期望的分子量分布的最终产物。此外，所述工艺是冗长的、昂贵的并且以低收率提供戊聚糖多硫酸酯。
WO2008107906公开了用于类似地生产戊聚糖多硫酸酯钠的工艺，该工艺包括使用纳滤膜系统用于纯化粗制的解聚的戊聚糖多硫酸酯。
制造工艺的不同可以导致戊聚糖多硫酸酯的分子差异，例如支化、硫酸化程度、硫酸根基团在多糖链上的位置以及平均分子量。
众所周知，硫酸化的碳水化合物的临床功效可以受所述差异影响，所述差异为例如-SO3-基团的类型和位置。因此，意识到对完全地控制和表征分子的需求。
对于用于药学用途的戊聚糖多硫酸酯的制造工艺应当保证，在包含于药物产品中的戊聚糖多硫酸酯中识别的所有结构要素被保存以便确保戊聚糖多硫酸酯的精确的药理学概况、治疗功效及安全性。这符合美国国家食品药品监督管理局(FDA)对于批准如
Figure BDA0001470419950000022
那样的复合组合物的药物的仿制品(generic version)的要求；事实上，对于这些应用，要求该仿制候选物具有参考目录药物(Reference Listed Drug)的相同的化学特性、物理特性和免疫化学特性的记录的证据。
尽管如此，包含于诸如
Figure BDA0001470419950000031
的药物产品中的戊聚糖多硫酸酯的完整结构表征仍然没有被完全评价或公开。
借助于在专利申请WO2014114723中描述的深入结构研究，已经可以确定包含于市场上的药物产品中的戊聚糖多硫酸酯的特定结构要素。特别地，通过分析从市场上的药物产品例如
Figure BDA0001470419950000032
分离的戊聚糖多硫酸酯，已经示出了乙酰化的单糖单元的存在。
特别地，通过将若干NMR技术例如分析HSQC、HMBC、TOCSY和COSY组合，可以发现，乙酰基基团不是均匀分布在构成戊聚糖多硫酸酯的重复单元的2位和3位之间，而是主要存在于木糖的重复单元的3位。此外，在WO2014114723中发现，所述乙酰基基团主要结合至木糖单元的3位，所述木糖单元在2位也具有4-O-甲基-葡萄糖醛酸单元。
因此，在戊聚糖多硫酸酯中的O-乙酰基基团的量，即乙酰化程度，是在制造用于药学用途的戊聚糖多硫酸酯时应当被考虑的另一个重要特征，以便确保戊聚糖多硫酸酯的精确的药理学概况、治疗功效及安全性。
NMR光谱法已经证明在多糖和硫酸化的多糖的结构表征的领域中是非常有用的分析技术；一些特定的信号可以被用于评估在戊聚糖多硫酸酯中的特定结构要素的存在。例如，在1H NMR光谱中在约2.3ppm处的信号和在HSQC NMR(异核单量子相干NMR)中在5.25/75.96ppm处的信号的存在，证实了在如上文提及的式(I)中描述的、被键合至甲基葡萄糖醛酸单元的木糖单元的3位中的氧上存在乙酰基基团，而不是硫酸根基团-SO3Y。
本发明人已经验证，从包含戊聚糖多硫酸酯的药物产品例如
Figure BDA0001470419950000033
中分离的戊聚糖多硫酸酯的结构通过另外的结构要素来表征，所述另外的结构要素到目前为止还未被确定或描述，并且可能与戊聚糖多硫酸酯用于药学用途的治疗功效和安全性相关联。
特别地，通过分析从包含戊聚糖多硫酸酯的药物产品例如
Figure BDA0001470419950000041
中分离的戊聚糖多硫酸酯的毛细管电泳图谱(CE图谱)，本发明人已经验证了接近最丰富的峰的伴随信号的存在。伴峰还存在于
Figure BDA0001470419950000044
等人Journal of Chromatography A(1998)，817，297的图2中重现的电泳图中，其中所添加的箭头指示伴峰，本文中如图1所报告的。
最丰富的峰应当对应于在还原端(reducing end)处具有硫酸化的木糖单元的戊聚糖多硫酸酯链，而伴随信号应当对应于被修饰的戊聚糖多硫酸酯链，其中在还原端处的硫酸化的木糖单元被木糖的硫酸化的异构体取代。此类异构体可以是来苏糖或木酮糖。
因此，从诸如
Figure BDA0001470419950000042
的药物产品分离的、在电泳图中显示伴峰的戊聚糖多硫酸酯应当在还原端处包括来苏糖单元、木酮糖单元或它们两者。
用于药学用途的戊聚糖多硫酸酯可以通过适当的多糖的硫酸化反应来获得，所述适当的多糖除了对适合于范围的纯度、分子量分布和乙酰化程度的要求外，还已经在其结构中具有所有上文提及的结构要素，这些上文提及的结构要素在从包含戊聚糖多硫酸酯的药物产品例如
Figure BDA0001470419950000043
中分离的戊聚糖多硫酸酯中被识别，待被明确地反映在最终合成的和分离的戊聚糖多硫酸酯中。
在多糖链单元的游离的-OH基团上发生磺化反应，而不影响多糖的上文提及的结构要素。
因此，存在开发用于适当的多糖的改进的制造工艺的需求，所述适当的多糖具有在市场上可得的戊聚糖多硫酸酯中识别的所有结构要素，所述适当的多糖可以被用作起始材料，该起始材料用于通过硫酸化获得戊聚糖多硫酸酯，所述戊聚糖多硫酸酯具有在包含于药物产品中的戊聚糖多硫酸酯中识别的所有结构要素。
本发明的目的是用于制备多糖的工艺，所述多糖包含经由β1，4糖苷键连接在一起的式(III)的D-木糖单元，
Figure BDA0001470419950000051
其中
R1是氢或乙酰基，
R2是氢、乙酰基或4-O-甲基葡萄糖醛酸单元，
其中，当R2是4-O-甲基葡萄糖醛酸单元时，在相同的糖单元上的R1基团被定义为G，其中G是氢或乙酰基，
并且其中在此类多糖的还原端处的所述糖单元是木糖、来苏糖或木酮糖，
所述工艺包括以下步骤：
a)使从山毛榉木中提取的木聚糖选择性脱乙酰；和
b)使在步骤a)中获得的选择性地脱乙酰的木聚糖异构化，
或以下步骤：
c)使从山毛榉木中提取的木聚糖异构化；和
d)使在步骤c)中获得的异构化的木聚糖选择性脱乙酰。
R1和R2的上文描述的含义可以在多糖单元中独立地选自在其他多糖单元中的R1和R2的含义。
本发明的另一个目的是用于制备式(II)的多糖的工艺
Figure BDA0001470419950000061
其中
R是氢或乙酰基
G是氢或乙酰基
A是木糖单元、来苏糖单元或木酮糖单元，
所述工艺包括上文已经引用的以下步骤：
a)使从山毛榉木中提取的木聚糖选择性脱乙酰；和
b)使在步骤a)中获得的选择性地脱乙酰的木聚糖异构化，
或以下步骤：
c)使从山毛榉木中提取的木聚糖异构化；和
d)使在步骤c)中获得的异构化的木聚糖选择性脱乙酰。
本发明的多糖目的由在以下方面中彼此不同的组分的混合物构成：其链长度、其取代(在式(II)中由R基团和G基团代表)、在还原端处的糖单元(在式(II)中由A基团代表)以及在式(II)中示例性地代表的4-O-甲基葡萄糖醛酸单元的位置。
木聚糖可以通过本领域中已知的不同的程序从山毛榉木中提取。必须考虑的一个限制是必须避免强碱性的提取条件。这是为了避免否则将会发生的、木聚糖的所有乙酰基基团的完全除去。为此，不建议按照文献中常报告的、基于用氢氧化钠浓溶液的提取的程序或其中使用浓的氢氧化钾的类似程序。
可以便利地使用的合适的提取方法是热水提取(hot water extraction)(参见例如X.Chen等人Bioresurce Technology(2010)，101,7812)、采用DMSO从先前经受去木质作用(delignification)的山毛榉木中的木聚糖提取(E.
Figure BDA0001470419950000071
等人Acta ChemicaScandinavica(1956)，10，1160和D.V.Evtuguin等人Carb.Res.(2008)，343，256)以及基于采用离子液体的木聚糖提取的程序(参见例如R.C.Sun等人Bioresources(2013)，8，1946和C.Froschauser等人(2013)，14，1741)。
对从山毛榉木中提取的木聚糖进行选择性脱乙酰以裂解过多的乙酰基基团。
在用这些程序提取的山毛榉木聚糖的乙酰化程度高于在从市场上可得的药物产品中分离的戊聚糖多硫酸酯中发现的乙酰化程度的情况下，选择性脱乙酰是该工艺的必要步骤。
已经令人惊奇地发现，可以以选择性的方式除去R1(当在相同的糖单元中的R2不是4-O-甲基葡萄糖醛酸单元时)、R2和R基团中的大部分的乙酰基而同时将在式(III)或式(II)中的很多G基团作为乙酰基保留。
在步骤a)中或在步骤d)中获得的选择性地脱乙酰的木聚糖的特征在于，在式(III)或式(II)中的G基团的至少20％是乙酰基；优选地，在式(III)或式(II)中的G基团的从35％至70％是乙酰基。
在步骤a)中或在步骤d)中获得的选择性地脱乙酰的木聚糖的特征还在于，总乙酰基基团的至少50％并且优选地至少70％存在于在式(III)或式(II)中的G基团上。步骤a)或步骤d)可以在含水环境中在碱性试剂的存在下在碱性或温和碱性的反应条件下进行。
优选地，在pH＝8和pH＝12之间、更优选地在pH＝9和pH＝11之间的pH范围内进行选择性脱乙酰。
合适的碱性试剂是碱性氢氧化物或碱性黑色氢氧化物(alkaline terroushydroxide)的水溶液；优选地，碱性试剂是氢氧化钠水溶液。
步骤a)的选择性脱乙酰或步骤d)的选择性脱乙酰可以在将碱性试剂添加至从山毛榉木中提取的木聚糖在水中的混合物的情况下进行。
碱性试剂的添加优选地在恒定pH条件(即pH固定设置(pHstat setting))下进行，优选地通过测量反应混合物的pH而自动地控制碱性试剂的添加速率，所述自动地控制是以使得决不允许pH值在用于从木聚糖基质中释放乙酸的较低pH值的方向上或朝向由于过量的碱性试剂添加造成的较高值的方向上过度地偏离设定值(即pH固定控制)的方式进行。
反应在0℃和100℃之间、优选地在0℃和25℃之间的温度进行。
反应持续时间可以从0.5小时至12小时变化，优选地在4小时至10小时之间变化，这强烈依赖于所采取的反应条件。
当转化在恒定的pH条件下进行时，对于随时间保持所选择的反应pH所需的碱性试剂的量的控制是监测反应进程的便利的方法。
此外，反应的进程和反应选择性可以借助于1H NMR光谱法来便利地监测，所述1HNMR光谱法特别地观察在2.0ppm和2.5ppm之间的范围内的信号，其中发现对应于不同的乙酰基基团的单独的信号。
在步骤a)结束时或在步骤d)结束时，选择性地脱乙酰的木聚糖的分离可以按照科技文献中报告的方法来实现。例如，通过添加有机溶剂如甲醇和/或乙醇来沉淀。在可选方案中，还可以有利地进行基于超滤随后冻干的程序。
在步骤b)中或在步骤c)中，在多糖链的还原端处的木糖单元中的一些被异构化为来苏糖单元或木酮糖单元。
异构化应当在避免木聚糖的完全脱乙酰的反应条件下进行。因此，应当避免太剧烈的碱性条件。
步骤b)或步骤c)可以通过将在步骤a)中获得的选择性地脱乙酰的木聚糖或在吡啶中从山毛榉木中提取的木聚糖加热持续足够的时间来进行。吡啶可以以无水形式或在多至80％的含水量的水的存在下被使用。如果在异构化的过程中，溶剂从反应器中被蒸馏出，则含水量还可以在反应时间期间变化。
吡啶和水相对于木聚糖的总体积可以是在2倍体积至40倍体积之间，优选地在4倍体积至20倍体积之间。
反应时间可以从4小时和12小时之间变化。
反应温度可以在70℃和150℃之间变化。如果反应在回流温度进行，则反应温度将根据含水量在94℃和115℃之间变化。
在一个实施方案中，在步骤a)中获得的1g选择性地脱乙酰的木聚糖或从山毛榉木中提取的1g木聚糖可以被溶解于5mL的水和5mL的吡啶中并且被加热至回流持续8小时。
反应时间可以在至少一种另外的物质的存在下被减少，所述至少一种另外的物质选自氧化铝或包含多价金属的物质，例如铝化合物或钙化合物。优选的铝化合物是乙酸铝。优选的钙化合物是氯化钙和乙酸钙。
被称为木聚糖量的这些另外的化合物的量可以便利地被包括在按重量计10％至100％之间，优选地在按重量计20％至50％之间。
在另外的实施方案中，在步骤a)中获得的1g选择性地脱乙酰的木聚糖或从山毛榉木中提取的1g木聚糖可以被溶解于5mL的水和5mL的吡啶中；0.2g氧化铝被添加并且混合物被加热至回流持续5小时。
此分离可以通过反应混合物的共沸除水进行无水化(anhydrifying)，如果需要的话随后添加乙醇。沉淀的木聚糖通过过滤分离并且干燥。
在步骤a)中获得的选择性地脱乙酰的木聚糖的多糖链的还原端处或在从山毛榉木中提取的木聚糖的多糖链的还原端处的木糖单元的异构化是在不改变所述木聚糖的聚合物结构的情况下进行；也就是说，通过将在多糖链中的木糖单元和甲基葡萄糖醛酸单元的数目保持大体上不改变。这通过将在步骤a)中获得的脱乙酰的木聚糖的分子量分布与在异构化步骤b)之后获得的式(III)或式(II)的多糖的分子量分布进行比较来证实。
在另外的实施方案中，本发明的工艺的步骤a)和步骤b)以“一锅法”进行，其借助于乙酰基保留法(acetyl preserving method)使从山毛榉木中提取的木聚糖发生反应；其可以在含水环境中在包含多价金属的至少一种物质的存在下使用碱性试剂来实现。
合适的碱性试剂是含水氢氧化钠、含水氢氧化钙；优选地，碱性试剂是含水氢氧化钠。
合适的包含多价金属的物质是氯化钙、乙酸钙和铝化合物例如乙酸铝。
反应条件与适合用于选择性脱乙酰的反应条件类似，其中不同之处在于，包含多价金属的物质自从反应开始就被添加至反应混合物。其量可以是相对于基质多至按重量计30％，优选地不超过按重量计20％。
碱性试剂的添加优选地在恒定的pH条件(即pH固定设置)下进行，逐渐地添加碱性试剂同时控制pH(即pH固定控制)。
在一个实施方案中，步骤a)和步骤b)的一锅法选择性脱乙酰和异构化可以在含水氢氧化钙或含水铝酸钠的存在下进行，以此方式同时提供碱性试剂和包含多价金属的物质。
如此获得的木聚糖的分离可以按照在科技文献中报告的方法便利地实现。例如，通过添加有机溶剂如甲醇和/或乙醇来沉淀。在可选方案中，还可以有利地进行基于超滤随后冻干的程序。
本发明的另外的方面由通过前述工艺可获得的式(III)或式(II)的多糖所代表。
前述工艺还可以包括式(III)或式(II)的多糖通过硫酸化反应转化为戊聚糖多硫酸酯。
硫酸化反应可以通过本领域中已知的程序来进行，例如在Daus等人(2011)，Macromolecular Materials and Engineering，296，第551-561页中公开的程序，其中从山毛榉木中提取的木聚糖被用作起始材料。
因此，本发明的另一方面是通过前述工艺可获得的戊聚糖多硫酸酯。
前述工艺还可以包括通过用适当的金属氢氧化物(优选地用碱氢氧化物或碱土氢氧化物，例如氢氧化钠或氢氧化钙)处理根据本发明获得的戊聚糖多硫酸酯来将戊聚糖多硫酸酯转化为药学上可接受的盐(优选地碱金属盐或碱土盐)的步骤。
优选地，戊聚糖多硫酸酯用氢氧化钠处理以得到对应的钠盐。
本发明的目的是多糖，所述多糖包含经由β1，4糖苷键连接在一起的式(III)的D-木糖单元，
Figure BDA0001470419950000111
其中
R1是氢或乙酰基，
R2是氢、乙酰基或4-O-甲基葡萄糖醛酸单元，
其中，当R2是4-O-甲基葡萄糖醛酸单元时，在相同的糖单元上的R1基团被定义为G，其中G是氢或乙酰基，
并且其中在此类多糖的还原端处的所述糖单元是木糖、来苏糖或木酮糖。
本发明的另外的目的是式(II)的多糖
Figure BDA0001470419950000112
其中R是氢或乙酰基，
G是氢或乙酰基，
A是木糖单元、来苏糖单元或木酮糖单元。
本发明的多糖目的由在以下方面中彼此不同的组分的混合物构成：其链长度、其取代(在式(II)中由R基团和G基团代表)、在还原端处的糖单元(在式(II)中由A基团代表)以及在式(II)中示例性地代表的4-O-甲基葡萄糖醛酸单元的位置。
根据本发明获得的式(III)、式(II)的多糖和戊聚糖多硫酸酯可以借助于毛细管电泳、HSQC NMR和1H NMR来分析，以验证在从包含戊聚糖多硫酸酯的药物产品中分离的戊聚糖多硫酸酯中识别的特征结构单元的存在。
因此在另外的方面中，本发明还涉及用于确定在从包含戊聚糖多硫酸酯的药物产品中分离的戊聚糖多硫酸酯中识别的结构要素在戊聚糖多硫酸酯的样品中以及在根据本发明获得的式(III)和式(II)的多糖中的存在的方法；以及涉及它们用于制备用于药学用途的戊聚糖多硫酸酯或其药学上可接受的盐的应用。
所述方法包括将根据本发明获得的式(III)和式(II)的多糖和/或戊聚糖多硫酸酯的CE电泳图、HSQC NMR和1H NMR光谱与从包含戊聚糖多硫酸酯的药物产品中分离的戊聚糖多硫酸酯的CE电泳图、HSQC NMR和1H NMR光谱进行比较。
定义
术语“药学上可接受的盐”在本文中指的是具有成盐化合物的生物有效性和性质并且当被施用于哺乳动物优选地人类时不产生不良反应的那些盐或衍生物。药学上可接受的盐可以是无机盐或有机盐；药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱金属盐或碱土盐。关于药学上可接受的盐的另外的信息可以在Handbook of pharmaceutical salts，P.Stahl，C.Wermuth，WILEY-VCH，127-133，2008中找到，其通过引用并入本文。
术语“重复单元”指的是衍生自单体的单个分子的聚合物链的一部分。
术语“一锅法”指的是在不分离相应的一种或更多种中间体产物的情况下进行的两个或更多个连续的反应。
术语“还原端”指的是具有不被包括在糖苷键中的异头碳(C1)的多糖链的末端单糖。
术语“结构要素”指的是可以在多糖链中作为单个单元或作为重复单元存在的多糖链的任何特征部分，其规则地或不规则地分布在链中。例如，合适的结构要素可以是单糖单元，其特征在于，其是支化的、或其包括特定的取代基或可以是再现的单糖重复单元的异构体。
术语“用于药学用途的戊聚糖多硫酸酯”指的是具有在从市场上的药物产品例如
Figure BDA0001470419950000131
中分离的戊聚糖多硫酸酯中识别的所有结构要素的戊聚糖多硫酸酯。所有识别的结构要素的存在可以通过将用于药学用途的戊聚糖多硫酸酯的CE电泳图和HSQC NMR以及1H NMR光谱与从包含戊聚糖多硫酸酯的药物产品例如
Figure BDA0001470419950000132
中分离的戊聚糖多硫酸酯的CE电泳图和HSQC NMR以及1H NMR光谱进行比较来验证。
本文中引用的所有出版物、专利和专利申请据此通过引用以其整体被并入。
以下实施例例证本发明的可能的实现方式并且在任何情况下都不能被用于限制其价值或有效性的领域。
实施例
实施例1
用于乙酰基基团的分析方法
将木聚糖样品(约25mg)溶解于0.7mL D2O中。为了获得1H-NMR光谱，使用AgilentMercury-200MHz设备。
对于相关的乙酰基基团的氢原子的信号归属是以下的信号归属：
2.20ppm：被键合至在2位与4-O-甲基葡萄糖醛酸单元连接的木糖单元的3位的乙酰基基团
2.14ppm：被键合至未连接至4-O-甲基葡萄糖醛酸单元的木糖单元的3位的乙酰基基团
2.09ppm：被键合至木糖单元的2位的乙酰基基团
实施例2
用于单糖的分析方法
在4mL硫酸1M中在100℃使木聚糖样品(约25mg)水解持续1.5小时。在水解之后，混合物用氢氧化钠中和。为了衍生，使0.1mL的中和的溶液与0.4mL的0.23M磷酸盐缓冲液(pH＝8)和0.2mL的3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(PMP)在甲醇中的87mg/mL的溶液混合。
混合物在70℃加热持续1小时并且在室温用0.7mL氯仿萃取三次。用1mL的B相(参见洗脱液)稀释0.1mL的水相来制备衍生的溶液。对于HPLC分析，使用AerisPeptide XB-C184.6x250mm(Phenomenex)。色谱条件是：
流量：0.8mL/分钟
柱T：35℃
梯度：t＝0分钟 A相 30％ B相 70％
t＝1分钟 A相 30％ B相 70％
t＝41分钟 A相 0％ B相 100％
t＝42分钟 A相 30％ B相 70％
t＝55分钟 A相 30％ B相 70％
洗脱液：A相＝100％Na2HPO4缓冲液0.1M pH 7
B相＝80％Na2HPO4缓冲液0.1M pH 7
20％乙腈
检测器：UV 250nm
注射：5μL衍生的溶液
保留时间：来苏糖约25分钟
木糖约37分钟
实施例3
山毛榉木聚糖的提取
向270mL的过乙酸的10％溶液添加氢氧化钠15％溶液，直至pH＝4。在搅拌下添加山毛榉锯末(14g)并且将混合物加热至85℃。搅拌在85℃保持持续30分钟。观察到脱色。在室温冷却之后，将混合物过滤并且回收的固体用淡水洗涤。在40℃在真空下干燥之后，获得7.5g。向干燥的产物添加450mL的DMSO。悬浮液在60℃在氮气下加热并且搅拌持续24小时，在室温冷却并且过滤。对固体重复DMSO提取。每个DMSO溶液添加有2L乙醇，在4℃冷却并且保持持续3天。将固体过滤、混合在一起并且干燥，得到总共0.33g的山毛榉木聚糖。
实施例4
山毛榉木聚糖的提取
使用加速溶剂提取器设备(accelerated solvent extractor equipment)(来自Thermo Scientific的Dianox ASE 150型)进行木聚糖提取。该仪器的100mL不锈钢池装载有30g的山毛榉锯末。去离子水用作提取溶剂。应用以下仪器参数以进行提取：
温度150℃
静态时间90分钟
冲洗量(rinse volume)220秒
静态循环1
还原释放(reduce relief)关
预热时间0分钟
预热吹扫(preheat purge)关
旁路加热(bypass heatup)关
此提取程序重复10次并且将收集的棕色溶液混合在一起。添加DMSO(60mL)。在真空下浓缩溶液，其中外部浴温度设定在65℃，在大部分的水被蒸发后，在搅拌下添加乙醇(1500mL)，沉淀出木聚糖。继续搅拌持续1小时，并且将产物过滤并且用乙醇洗涤(两次，每一次用200mL)。在干燥之后，获得29g的山毛榉木聚糖。
实施例5
木聚糖的选择性脱乙酰
在搅拌下混合水(160mL)和山毛榉木聚糖(10g)。用恒温槽使温度达到10℃。添加氢氧化钠30％水溶液直至pH＝11.0。继续搅拌并且保持温度，同时自动添加氢氧化钠5％水溶液以将pH保持在pH＝11.0和pH＝11.1之间的范围内。氢氧化钠溶液的添加借助于pH固定系统来控制。
在8小时之后，添加总共10.6g的氢氧化钠5％溶液。添加乙酸用于中和。向反应混合物添加DMSO(20mL)并且该混合物在真空下浓缩直至残余的重量是约35g。将浓缩的溶液添加至乙醇(600mL)。形成沉淀物，浆料在室温搅拌持续2小时并且过滤。在干燥之后，获得7.8g的略微有色的粉末。
通过1H-NMR分析起始材料(山毛榉木聚糖)和所获得的选择性地脱乙酰的木聚糖产物两者的乙酰基分布。连接至还带有4-O-甲基-葡萄糖醛酸单元的木糖单元的乙酰基基团结果是在起始材料中的总乙酰基基团的10％以及在选择性地脱乙酰的产物中的总乙酰基基团的83％。
实施例6
山毛榉木聚糖的异构化
将实施例5的山毛榉木聚糖(5g)与50mL水和50mL吡啶混合。将该混合物加热至回流并且温度在搅拌下保持持续8小时。在真空下除去溶剂直至残余的重量是10g。添加乙醇，并且再次地在真空下除去溶剂直至残余的重量是约10g。添加乙醇(150mL)并且混合物在室温搅拌持续2小时。将固体过滤并且在45℃在真空下干燥，获得4.3g。分析起始材料(山毛榉木聚糖)和产物(异构化的山毛榉木聚糖)的单糖组成：在起始材料中的来苏糖的结果是0(来苏糖不可检测)并且在所获得的产物中是0.9％。

Claims (14)

1.用于制备多糖的工艺，所述多糖包含经由β1,4糖苷键连接在一起的式(III)的D-木糖单元，
Figure FDA0002782261620000011
其中
R1是氢或乙酰基，
R2是氢、乙酰基或4-O-甲基葡萄糖醛酸单元，
其中，当R2是4-O-甲基葡萄糖醛酸单元时，在相同的糖单元上的R1基团被定义为G，其中G是氢或乙酰基，
并且其中在这样的多糖的还原端处的所述糖单元是木糖、来苏糖或木酮糖，
所述工艺包括以下步骤：
a)使从山毛榉木中提取的木聚糖选择性脱乙酰；和
b)使在步骤a)中获得的选择性地脱乙酰的木聚糖异构化，
或以下步骤：
c)使从山毛榉木中提取的木聚糖异构化；和
d)使在步骤c)中获得的异构化的木聚糖选择性脱乙酰；
其特征在于
步骤a)或步骤d)在碱性试剂的存在下进行；
步骤b)通过在吡啶的存在下加热在步骤a)中获得的脱乙酰的木聚糖来进行；或步骤c)通过在吡啶的存在下加热从山毛榉木中提取的木聚糖来进行；并且
在步骤b)中或在步骤c)中，在多糖链的还原端处的木糖单元中的一些被异构化成来苏糖单元或木酮糖单元。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述碱性试剂是含水氢氧化钠。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，步骤a)或步骤d)在含水环境中在被包括在pH＝8和pH＝12之间的范围内的pH进行。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，步骤b)或步骤c)在选自氧化铝、铝化合物或钙盐的至少一种另外的物质的存在下进行。
5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，步骤a)和步骤b)以“一锅法”进行。
6.根据权利要求5所述的工艺，其特征在于，所述“一锅法”反应在含水环境中在碱性试剂和包含多价金属的至少一种物质的存在下进行。
7.根据权利要求6所述的工艺，其特征在于，所述包含多价金属的至少一种物质选自包括氯化钙、乙酸钙和乙酸铝的组。
8.根据权利要求1所述的工艺，还包括通过硫酸化反应将所述多糖转化为戊聚糖多硫酸酯的步骤。
9.根据权利要求8所述的工艺，还包括将戊聚糖多硫酸酯转化为药学上可接受的盐的步骤。
10.根据权利要求1所述的工艺，其中所述多糖具有式(II)
Figure FDA0002782261620000021
其中
R是氢或乙酰基，
G是氢或乙酰基，
A是木糖单元、来苏糖单元或木酮糖单元。
11.根据权利要求1或10所述的工艺，其中在步骤a)中或在步骤d)中获得的选择性地脱乙酰的木聚糖的特征在于，在式(III)或式(II)中的G基团的至少20％是乙酰基。
12.根据权利要求1或10所述的工艺，其中在步骤a)中或在步骤d)中获得的选择性地脱乙酰的木聚糖的特征在于，在式(III)或式(II)中的G基团的从35％至70％是乙酰基。
13.一种多糖的混合物，所述多糖包含经由β1,4糖苷键连接在一起的式(III)的D-木糖单元，
Figure FDA0002782261620000031
其中
R1是氢或乙酰基，
R2是氢、乙酰基或4-O-甲基葡萄糖醛酸单元，
其中，当R2是4-O-甲基葡萄糖醛酸单元时，在相同的糖单元上的R1基团被定义为G，其中G是氢或乙酰基，
并且其中在这样的多糖的还原端处的所述糖单元是木糖、来苏糖或木酮糖，并且其中在多糖链的还原端处的所述糖单元中的一些是来苏糖单元或木酮糖单元。
14.一种式(II)的多糖的混合物
Figure FDA0002782261620000041
R是氢或乙酰基，
G是氢或乙酰基，
A是木糖单元、来苏糖单元或木酮糖单元，其中在多糖链的还原端处的糖单元中的一些是来苏糖单元或木酮糖单元。
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