CN107619847A

CN107619847A - 一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法

Info

Publication number: CN107619847A
Application number: CN201711099369.2A
Authority: CN
Inventors: 胡玮
Original assignee: Ningbo Rovo Biotech Co Ltd
Current assignee: Ningbo Rovo Biotech Co Ltd
Priority date: 2017-11-09
Filing date: 2017-11-09
Publication date: 2018-01-23

Abstract

本发明公开了一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法，以人参或人参皂甙提取物为原料，在生物发酵罐中采用乳酸菌发酵的方法，在适宜的发酵条件下，将人参皂甙Rb1中的糖基水解，将其从原形药的形式转变成M1。步骤包括：准备人参原料，与发酵体系一并导入生物发酵罐中，通入蒸汽灭菌消毒；将益生菌群I接种入发酵体系中，在酸性环境下发酵8～20小时；将益生菌群II接种入发酵体系中，在酸性环境下发酵8～12小时；在发酵体系中加入发酵助剂，将pH调整至碱性，继续发酵12～24小时；发酵结束后，从液体中进一步纯化得到人参皂甙代谢物M1。

Description

一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法

技术领域

本发明涉及功能食品技术领域，具体涉及一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科植物人参的根部，具有滋补强壮、提高体力和脑力劳动能力、降低疲劳、提高血液中血红素的含量、调节中枢神经系统等作用，对于治疗心血管疾病、胃和肝脏疾病、糖尿病、不同类型的神经衰弱症等均有较好的疗效。人参享有“中药之王”的美誉，居东北三宝之冠。中国是药用人参的发祥地，人参作为珍贵中药材应用历史悠久。

人参中含皂甙、多糖、挥发油、微量元素等多种成分。其中人参皂甙是其主要的活性成分。目前分离出的单体皂甙已超过30种。如Ra1，Ra2，Ra3，Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd，Rg1，Rg2，Rg3，Re，Rh，Rf等。它们具有多种生理活性，包括调节内分泌、提高记忆力、扩张血管、降血压、抗肿瘤、抗疲劳、抗抑郁等药理作用。

人参皂甙口服后经消化道吸收，吸收率很低。例如人参皂甙Rb1的吸收率仅为1％，Rb2为3.4％，Rg1为1.9％，其血药浓度很难达到其充分发挥药理活性所需要的浓度。而用放射性同位素标识的人参皂甙做研究，则在血清中测定出3倍以上的放射活性,表明大量吸收的是人参皂甙的代谢物。因此，人参口服后主要在胃肠道内被代谢为活性更强的次级苷或苷元而发挥药效。

一些学者通过酸、酶、肠内菌和动物研究了人参皂甙在体外的代谢机制。结肠菌(例如Prevotella o ris)将Rb1代谢为20—O—β—D—吡喃葡萄糖—20(S)—原人参二醇皂甙，即M1或compound K或IH901。而人参发酵产物Ml是人参皂甙Rb在人体肠道内的主要降解产物和最终吸收形式。近年来，体内体外试验研究发现，许多生物学活性都是由该化合物引起的，如抑制肿瘤细胞的增殖、浸润和转移，抗过敏，抑制化学致癌剂诱导的染色体基因突变等，还可以转化为脂肪酸酯EM1，发挥出更有效的抗肿瘤作用。目前，M1主要是通过微生物发酵法和酶法获得。

由于人体肠道细菌存在很大的个体差异，包括日常饮食、健康状况，甚至压力等均能影响人体内细菌种类和含量。影响了人参皂甙在肠道代谢过程中的个体差异最终导致不同个体口服人参后，所产生的效果可能大不相同。因此，将人参皂甙转化为M1后再摄入体内，不仅有益于规范和保证口服人参的药学效果，而且有广阔的市场前景。

发明内容

本发明提供了一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法，以人参或人参皂甙提取物为原料，在生物发酵罐中采用乳酸菌发酵的方法，优选出最适宜的乳酸菌菌种，在适宜的发酵条件下，将人参皂甙Rb1中的糖基水解，将其从原形药的形式转变成M1。

一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法，步骤包括：

(1)准备人参原料，与发酵体系一并导入生物发酵罐中，通入蒸汽灭菌消毒。

(2)对益生菌群I和益生菌群II进行种子培养。

(3)将益生菌群I接种入发酵体系中，在酸性环境下发酵8～20小时。

(4)将益生菌群II接种入发酵体系中，在酸性环境下发酵8～12小时。

(5)在发酵体系中加入发酵助剂，将pH调整至碱性，继续发酵12～24小时。

(6)将发酵体系进行固液分离。

(7)从液体中进一步纯化得到人参皂甙代谢物M1溶液。

(8)将人参皂甙代谢物M1溶液制成M1固体粉末。

为了达到更好的发明效果，进行以下优选：

步骤(1)中，人参原料包括人参干燥根部或粉状人参皂甙提取物，人参干燥根部需预先打成粉末，再与发酵体系混合。人参原料用量占发酵体系的10％～35％。

步骤(1)中，发酵体系中含有蛋白胨、牛肉膏粉、酵母膏粉、磷酸氢二钾、柠檬酸三铵、硫酸镁、硫酸锰、吐温-80、乙酸钠、山梨醇、L-山梨糖。

步骤(2)中的益生菌I为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、魏斯氏菌中的2～3种；益生菌II为双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、类干酪乳杆菌中的2～3种。

步骤(2)中所述的益生菌种子液可采用本领域常用的种子液制备方法制备，例如，采用MRS培养基，调节pH至6.0，在30～35℃培养12小时～24小时，制备种子液。

步骤(3)(4)中的发酵体系中，所述的益生菌种子液的接种量优选为5％-15％。

步骤(3)(4)中的发酵体系中，pH值为5.5～6.5，温度为28～35℃。

步骤(5)的发酵体系中，pH值为7.0～7.5，温度为28～35℃。

步骤(5)的发酵体系中，发酵助剂为糖类、糖苷类和磷酯类的混合物，具体为海藻糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、低聚麦芽糖、熊果苷、水杨苷、菊粉、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇的4～8种混合物。

步骤(6)的固液分离方法包括离心分离、板框过滤、膜过滤等。

步骤(7)中的分离方法包括大孔树脂吸附法、Saphdex-LH20层析分离法和聚酰胺柱层析法。

步骤(8)中的干燥方法为喷雾干燥法。

现有技术获取人参代谢物M1的方法主要为：化学合成、酶法降解、肠道细菌降解。与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明提供了一种通过乳酸菌发酵制备人参皂甙代谢物M1的方法，可以人参干燥根的粉末或人参皂甙提取物为原料，通过乳酸菌发酵的一系列生物转换，将人参皂甙Rb1转换为M1。该制备方法具有发酵成本低、生物转化效率高、发酵液杂质少、质量高，易于进一步分离、纯化出目的产物M1的特点。用人参皂甙M1替代人参皂甙提取物开发功能食品，不仅可以克服因人体肠道菌群差异导致的口服人参后效果的不一致，而且还能够发挥出人参制品更大的功效，规范和保证口服人参的药学效果。

具体实施方式

实施例1

发酵罐中的发酵体系中含有人参皂甙提取物10％，蛋白胨8％、牛肉膏粉4％、酵母膏粉4％、磷酸氢二钾0.5％、柠檬酸三铵0.5％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.05％、吐温-800.5％、乙酸钠0.1％、山梨醇0.01％、L-山梨糖0.01％，用水补足体积。通入蒸汽于121℃灭菌消毒20分钟。

对益生菌群I进行种子培养。I中含有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、魏斯氏菌。采用MRS培养基，调节pH至6.0，在35℃培养18小时，制得种子液。

将益生菌群I接种入发酵体系中，接种量为8％，pH值为6.0～6.5，温度为32～35℃，发酵培养18小时。

对益生菌群II进行种子培养。II中含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、类干酪乳杆菌。采用MRS培养基，调节pH至6.0，在35℃培养18小时，制得种子液。

将益生菌群II接种入发酵体系中，接种量为8％，pH值为6.0～6.5，温度为32～35℃，发酵培养18小时。

在发酵体系中加入发酵助剂，发酵助剂由海藻糖、L-岩藻糖、菊粉、卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇组成，用氢氧化钠溶液将pH调节至7.2～7.5，温度为32～35℃，发酵培养16小时。

发酵结束后，用离心机离心发酵液，弃渣，液体用Saphdex-LH20层析分离法分离得到人参皂甙M1。加入糊精等助剂后采用喷雾干燥的方法制备成M1成品粉末。

用HPLC分析方法，使用Rb1和M1的标准品，检测发酵原料中Rb1的含量和发酵液中M1的含量，并计算转化率(原料中的Rb1含量/发酵液中M1的含量*100％)。色谱柱：WatersSymmetry C18柱(4.6mm×150mm)，流动相：乙腈-水(体积比为40：60)溶液，流速：1.0mL/min，检测波长：203nm，柱温：35℃，进样量：l0μL。

本次实验中转化率为97.5％。

实施例2

发酵罐中的发酵体系中含有人参干燥根粉末20％，蛋白胨8％、牛肉膏粉4％、酵母膏粉4％、磷酸氢二钾0.5％、柠檬酸三铵0.5％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.05％、吐温-800.5％、乙酸钠0.1％、山梨醇0.01％、L-山梨糖0.01％，用水补足体积。通入蒸汽于121℃灭菌消毒20分钟。

用HPLC分析方法，使用Rb1和M1的标准品，检测发酵原料中Rb1的含量和发酵液中M1的含量，并计算转化率(原料中的Rb1含量/发酵液中M1的含量*100％)。

本次实验中转化率为92.2％。

实施例3

发酵罐中的发酵体系中含有人参皂甙提取物12％，蛋白胨8％、牛肉膏粉5％、酵母膏粉5％、磷酸氢二钾0.5％、柠檬酸三铵0.5％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.05％、吐温-800.5％、乙酸钠0.1％、山梨醇0.01％、L-山梨糖0.01％，用水补足体积。通入蒸汽于121℃灭菌消毒20分钟。

对益生菌群I进行种子培养。I中含有保加利亚乳杆菌、魏斯氏菌。采用MRS培养基，调节pH至6.0，在35℃培养18小时，制得种子液。

对益生菌群II进行种子培养。II中含有双歧杆菌、类干酪乳杆菌。采用MRS培养基，调节pH至6.0，在35℃培养18小时，制得种子液。

在发酵体系中加入发酵助剂，发酵助剂由D-岩藻糖、低聚麦芽糖、熊果苷、水杨苷、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇组成，用氢氧化钠溶液将pH调节至7.2～7.5，温度为32～35℃，发酵培养16小时。

发酵结束后，用板框过滤发酵液，弃渣，液体用Saphdex-LH20层析分离法分离得到人参皂甙M1。加入糊精等助剂后采用喷雾干燥的方法制备成M1成品粉末。

本次实验中转化率为93.3％。

实施例4

发酵罐中的发酵体系中含有人参皂甙提取物10％，蛋白胨10％、牛肉膏粉3％、酵母膏粉4％、磷酸氢二钾0.5％、柠檬酸三铵0.5％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.05％、吐温-800.5％、乙酸钠0.1％、山梨醇0.01％、L-山梨糖0.01％，用水补足体积。通入蒸汽于121℃灭菌消毒20分钟。

对益生菌群I进行种子培养。I中含有嗜热链球菌、魏斯氏菌。采用MRS培养基，调节pH至6.0，在35℃培养18小时，制得种子液。

将益生菌群I接种入发酵体系中，接种量为10％，pH值为6.0～6.5，温度为32～35℃，发酵培养18小时。

对益生菌群II进行种子培养。II中含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌。采用MRS培养基，调节pH至6.0，在35℃培养18小时，制得种子液。

将益生菌群II接种入发酵体系中，接种量为10％，pH值为6.0～6.5，温度为32～35℃，发酵培养18小时。

在发酵体系中加入发酵助剂，发酵助剂由D-岩藻糖、低聚麦芽糖、水杨苷、菊粉、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇组成，用氢氧化钠溶液将pH调节至7.2～7.5，温度为32～35℃，发酵培养16小时。

发酵结束后，用滤布过滤发酵液，弃渣，再用微孔滤膜进一步过滤，液体用HPD400大孔树脂层析分离法分离得到人参皂甙M1。加入糊精等助剂后采用喷雾干燥的方法制备成M1成品粉末。

本次实验中转化率为94.8％。

实施例5

发酵罐中的发酵体系中含有人参干燥根粉末25％，蛋白胨10％、牛肉膏粉5％、酵母膏粉4％、磷酸氢二钾0.5％、柠檬酸三铵0.5％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.05％、吐温-800.5％、乙酸钠0.1％、山梨醇0.01％、L-山梨糖0.01％，用水补足体积。通入蒸汽于121℃灭菌消毒20分钟。

对益生菌群I进行种子培养。I中含有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌。采用MRS培养基，调节pH至6.0，在35℃培养18小时，制得种子液。

将益生菌群I接种入发酵体系中，接种量为12％，pH值为6.0～6.5，温度为32～35℃，发酵培养18小时。

对益生菌群II进行种子培养。II中含有嗜酸乳杆菌、类干酪乳杆菌。采用MRS培养基，调节pH至6.0，在35℃培养18小时，制得种子液。

将益生菌群II接种入发酵体系中，接种量为12％，pH值为6.0～6.5，温度为32～35℃，发酵培养18小时。

在发酵体系中加入发酵助剂，发酵助剂由海藻糖、D-岩藻糖、熊果苷、水杨苷、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇组成，用氢氧化钠溶液将pH调节至7.2～7.5，温度为32～35℃，发酵培养16小时。

发酵结束后，用离心机离心发酵液，弃渣，液体用聚酰胺柱层析分离法分离得到人参皂甙M1。加入糊精等助剂后采用喷雾干燥的方法制备成M1成品粉末。

本次实验中转化率为89.5％。

Claims

1.一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)准备人参原料，与发酵体系一并导入生物发酵罐中，通入蒸汽灭菌消毒；

(2)对益生菌群I和益生菌群II进行种子培养，益生菌I为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、魏斯氏菌中的2～3种，益生菌II为双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、类干酪乳杆菌中的2～3种；

(3)将益生菌群I接种入发酵体系中，在酸性环境下发酵8～20小时；

(4)将益生菌群II接种入发酵体系中，在酸性环境下发酵8～12小时；

(5)在发酵体系中加入发酵助剂，发酵助剂为糖类、糖苷类和磷酯类的混合物，具体为海藻糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、低聚麦芽糖、熊果苷、水杨苷、菊粉、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇的4～8种混合物；

(6)将pH调整至碱性，继续发酵12～24小时；

(7)将发酵体系进行固液分离，从液体中进一步纯化得到人参皂甙代谢物M1溶液，将人参皂甙代谢物M1溶液制成M1固体粉末。

2.根据权利要求1所述的一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法，其特征在于，步骤(1)中，人参原料包括人参干燥根部或粉状人参皂甙提取物。

3.根据权利要求1所述的一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法，其特征在于，步骤(3)中，发酵体系中含有蛋白胨、牛肉膏粉、酵母膏粉、磷酸氢二钾、柠檬酸三铵、硫酸镁、硫酸锰、吐温-80、乙酸钠、山梨醇、L-山梨糖。

4.根据权利要求1所述的一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法，其特征在于，步骤(3)(4)中的发酵体系中，所述的益生菌种子液的接种量优选为5％-15％。

5.根据权利要求1所述的一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法，其特征在于，步骤(3)(4)中的发酵体系中，pH值为5.5～6.5，温度为28～35℃。

6.根据权利要求1所述的一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法，其特征在于，步骤(6)中的发酵体系中，pH值为7.0～7.5，温度为28～35℃。

7.根据权利要求1所述的一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法，其特征在于，步骤(7)的固液分离方法包括离心分离、板框过滤、膜过滤等。

8.根据权利要求1所述的一种生物发酵制备人参皂甙代谢物的方法，其特征在于，步骤(7)中的分离方法包括大孔树脂吸附法、Saphdex-LH20层析分离法和聚酰胺柱层析法。