CN107602697A

CN107602697A - 一种治疗流感嗜血杆菌引起鼻窦炎的血清及该血清的应用

Info

Publication number: CN107602697A
Application number: CN201710756593.8A
Authority: CN
Inventors: 孙爱华; 严杰; 刘小香; 黄燕颖
Original assignee: Hangzhou Medical College
Current assignee: Hangzhou Medical College
Priority date: 2017-08-29
Filing date: 2017-08-29
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2037-08-29
Also published as: CN107602697B

Abstract

一种治疗流感嗜血杆菌引起鼻窦炎的血清及该血清的应用，属于生物技术领域。该血清由重组蛋白MAP‑rHap‑C4‑GGGS‑Hap‑C150免疫得到。该血清（及血清10倍稀释液）具有有效杀菌功能。由于该血清除具有杀菌作用的抗体成份外其余成份与人体血清成份相似，如经无菌、生物安全处理，制成鼻窦炎滴鼻液用于鼻窦炎治疗，则具有易于吸收，不使用激素，不会产生依赖性，适合婴幼儿使用的优点。

Description

一种治疗流感嗜血杆菌引起鼻窦炎的血清及该血清的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种治疗流感嗜血杆菌引起鼻窦炎的血清及该血清的应用。

背景技术

流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，Hi）为寄生于人鼻咽部及上呼吸道的革兰阴性小杆菌，呼吸道为主要入侵门户，可引起全身多部位的感染。流感嗜血杆菌是引起急性细菌性鼻窦炎的主要病原菌之一。流感嗜血杆菌可分为荚膜型和无荚膜型，前者可用荚膜抗体分为6个血清型，故荚膜型Hi又称为可分型流感嗜血杆菌（typeable H. influenzae，THi）；后者无法用荚膜多糖抗体分型，故无荚膜型Hi又称为不可分型流感嗜血杆菌（nontypeable H. influenzae，NTHi）。目前临床报道70%～98%临床分离株为NTHi。

阻止Hi黏附定植，减少细菌微菌落的形成是防治流感嗜血杆菌感染的关键，已有的研究显示Hap蛋白不仅是位于流感嗜血杆菌外膜的黏附因子，NTHi和THi均有表达，同时还可诱导机体产生具有免疫保护作用的黏膜S-IgA和血清IgG，血清IgG能阻止NTHi在呼吸道的黏附定植, 减少细菌微菌落的形成，因此Hap 蛋白诱导机体产生的IgG很有希望成为治疗流感嗜血杆菌感染的抑菌或杀菌制剂的成份。然而研究发现在流感嗜血杆菌生长过程中，Hap 表达量达到一定程度后，就会启动自体解离，最终导致细菌的分散和在呼吸道内的传播，因此普通的细菌培养不足以获得足够的Hap蛋白，要获得大量Hap蛋白作为抗原制备抗体需进行生物学改造。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种治疗流感嗜血杆菌引起鼻窦炎的血清及该血清的应用的技术方案。

所述的一种治疗流感嗜血杆菌引起鼻窦炎的血清，其特征在于由重组蛋白MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150免疫得到。

所述的一种治疗流感嗜血杆菌引起鼻窦炎的血清，其特征在于所述的MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150通过以下步骤得到：

1）以流感嗜血杆菌基因组DNA为模板，采用连接引物 PCR 分别扩增带柔性肽结构的hap-C4和hap-C150片段构建流感嗜血杆菌黏附Hap蛋白优势表位融合基因hap-C4-GGGS-hap-C150；

2）以pUCm-T^{-hap-C4-GGGS-hap-C150}为模板，采用引物携带EK序列互补构建hap-C4-GGGS-hap-C150-EK串联表位融合片段；以pUCm-T^{-8[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK]}为模板，扩增获得NdeI-8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK]-XhoI片段；

3）以NdeI-8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK]–XhoI构建原核表达系统EcoliBL21DE3^{pET42a-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]}，原核表达系统Ecoli BL21DE3^pET42a ^{-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]}诱导表达重组融合蛋白8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]，重组融合蛋白8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]水解提纯得到rHap-C4-GGGS-Hap-C150融合表位肽；

4）用碳二亚胺法将rHap-C4-GGGS-Hap-C150与Poly-Asp-Lys载体大分子交联，制备出多抗原MAP交联肽MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150。

所述的血清在制备治疗流感嗜血杆菌引起鼻窦炎药物中的应用。

本发明获得的血清（及血清10倍稀释液）具有有效杀菌功能。由于该血清除具有杀菌作用的抗体成份外其余成份与人体血清成份相似，如经无菌、生物安全处理，制成鼻窦炎滴鼻液用于鼻窦炎治疗，则具有易于吸收，不使用激素，不会产生依赖性，适合婴幼儿使用的优点。

附图说明

图1为小鼠免疫血清对NTHi杀菌试验结果；

注：A组为血清原液滴鼻；B组为10倍稀释血清滴鼻；C组为100倍稀释血清滴鼻；D组为对照PBS滴鼻。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例

材料与方法

菌株、血清和主要试剂来源

不可分型流感嗜血杆菌标准菌株ATCC49247（NTHi）、荚膜型流感嗜血杆菌标准菌株ATCC9327（Hia）、ATCC 9334（Hib）、ATCC 9007（Hic）、ATCC 9332（Hid）、ATCC 8142（Hie）和ATCC 9833（Hif）由浙江大学医学院病原生物学系提供。清洁级青紫兰品系家兔，3～4 周龄，清洁级BALB／c小鼠小鼠，雌性，6～8 周龄，体重（18±1）g均由杭州医学院动物实验中心提供。本研究符合杭州医学院实验动物伦理委员会所制定的伦理学标准。各Hi菌株用哥伦比亚血琼脂平板（bioMérieux）37ºC传代培养。

抗原表位融合片段的构建和克隆

采用细菌基因组DNA提取试剂盒（Axygen）提取ATCC49247株基因组DNA，紫外分光光度法测定其浓度和纯度。以流感嗜血杆菌基因组DNA为模板，采用连接引物 PCR 分别扩增带柔性肽结构的hap-C4和hap-C150片段，上下游引物见表1 中hap-C4-1和hap-C150-1，接引物hap-C4-1包括hap-C4-1F和hap-C4-R，所述的hap-C4-1F的核苷酸序列如SEQ No.1所示，所述的hap-C4-1R的核苷酸序列如SEQ No.2所示，连接引物hap-C150-1包括hap-C150-1F和hap-C150-1R，所述的hap-C150-1F核苷酸序列如SEQ No.3所示，所述的hap-C150-1R核苷酸序列如SEQ No.4所示。PCR总体积100 µL，内含2.5 mol/L各dNTP、250 nmol/L各引物、2.5 UEX-Taq酶、100 ng 各DNA模板和1×PCR缓冲液pH8.3。PCR参数：94ºC 5 min；94ºC 30 S、52ºC 30 S、72ºC 30 S，30个循环；72ºC 5 min。小量 DNA3S 柱快速离心纯化试剂盒（BioColor）回收目的扩增产物, 分光光度法测定其 DNA 浓度。将回收的带柔性肽结构的hap-C4和hap-C150扩增片段等摩尔混合（DNA 总量<500 ng）, 除不加引物外，其余反应成分及含量与上述 PCR 相同，反应参数：94ºC 5 min；94ºC 30 S、52ºC 30 S、72ºC 60 S，10个循环；72ºC 7min。利用hap-C4下游和hap-C150上游引物中互补的柔性肽序列形成复合模板，然后加入 hap-C4-1F和hap-C150-1R各250 nmol/L，PCR 参数：94ºC 5 min；94ºC 30 S、52ºC 30 S、72ºC 60 S，30个循环；72ºC 7min；采用溴乙锭预染的2.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，目的扩增片段预期大小为156bp（hap-C4 72bp+GGGS 12bp+ hap-C150 72bp）。采用T-A克隆试剂盒(BioColor)将上述目的基因扩增片段克隆至pUCm-T载体中, 转化入E. coli DH5α并用LB 培养基扩增, 小量碱变性法提取重组质粒, 委托 Invitrogen 公司测定重组质粒 pUCm-T^{-hap-C4-GGGS- hap-C150}中插入片段的序列。

串联表位融合片段的构建及鉴定以100ng pUCm-T^{-hap-C4-GGGS-hap-C150}为模板、hap-C4-2F和Hap-C150-2R为引物，引物hap-C4-2F的核苷酸序列如SEQ No.5所示，引物Hap-C150-2R的核苷酸序列如SEQ No.6所示，扩增5’-端携带肠激酶（enterokinase，EK）酶切位点（DDDDK）编码序列及3’-端携带EK互补序列的hap-C4-GGGS- hap-C150-EK片段，反应体系94℃5 min后94℃30 S、45℃30 S、72℃120 S循环10次，利用hap-C4-2F和Hap-C150-2R引物中EK互补序列形成hap-C4-GGGS-hap-C150-EK串联表位融合片段，1.5%琼脂糖凝胶电泳后用PCR产物回收试剂盒(TaKaRa)回收大小为1488 bp的8×[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK])目的扩增片段，紫外线分光光度法测定其浓度。采用T-A克隆试剂盒（BioColor）将上述目的基因扩增片段克隆至pUCm-T载体中, 转化入E. coli DH5α并用LB 培养基扩增, 小量碱变性法提取重组质粒, 委托 Invitrogen 公司测定重组质粒 pUCm-T^{-8[hap-C4-GGGS- hap-C150-EK]}中插入片段的序列。采用含核酸内切酶Nde I位点的hap-C4-3F以及含核酸内切酶XhoI位点的hap-C150-3R引物．以pUCm-T^{-8[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK]}为模板，扩增获得NdeI-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK] -XhoI片段，按上法获得T-A克隆并测序。

串联式目的表位基因原核表达及鉴定采用质粒提取试剂盒（Sigma）)分别提取在E.coli DH5α中扩增的pUCm-T^{-NaeI-8[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK]-XhoI}和表达载体pET42a（Novagen），分光光度法测定其浓度。各质粒用Nde I和Xho I（TaKaRa）双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离后用DNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep）回收NdeI-8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK] -XhoI片段片段和线性化pET42a，在T4DNA连接酶（TaKaRa）作用下形成重组表达载体，转化入E coliBL21 DE3（Novagen）形成原核表达系统Ecoli BL21DE3^{pET42a-8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK]}。该菌接种于含100 µg卡那霉素的BL培养液中，1.0 mmoL／L IPTG（Sigma）及30℃、37℃条件下诱导目的重组融合蛋白8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]表达。采用SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统检测其表达量，Ni-NTA亲和层析柱提纯目的重组融合蛋白，紫外分光光度法测定提纯蛋白的浓度。

表 1 PCR引物序列及手增产物

目的重组融合蛋白水解和提纯

目的重组融合蛋白8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]肠激酶酶切反应体系如下：0.5 U／ml重组牛肠激酶（Sigma）、1mg／ml目的重组融合蛋白、1×酶切反应缓冲液（50mmoL／L NaCI、20 mmol／L Tris-HCI、2 mmoL／LCaCl₂，pH7．4），25℃反应12 h后Tricine-SDS-PAGE观察酶切效果。首先用二碳酸二叔丁酯（Sigma）保护rHap-C4-GGGS- Hap-C150氨基，采用SephadexG-25柱分离rHap-C4-GGGS- Hap-C150融合表位肽，洗脱液为0.01mol／L PBS（pH7.4）。回收融合表位肽用PEGl0000（Sigma）浓缩，紫外分光光度法测定蛋白浓度。

rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK与Poly-Asp-Lys交联

将Poly-Asp-Lys和rHap-C4-GGGS-Hap-C150按1：20的比例分别溶于0.01mol／L PBS（pH7.4），每毫克蛋白加入3 mg水溶性二环己基碳二亚胺（DCC，Sigma）室温250 r／min搅拌16 h进行交联。反应产物中加入终浓度为11 %的NaCl，4℃中边搅拌边缓慢加入-20℃预冷的无水乙醇，直至出现蛋白沉淀。10 000 r／min 4℃离心15 min，取沉淀溶于PBS中，按上法再次用NaCl-乙醇沉淀，4℃离心后收集交联后MAP产物并将其命名为MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150，紫外分光光度法测定蛋白浓度。

含杀菌抗体的血清的制备

1.5%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，一组每只鼻腔逐滴滴入100µL含30µg MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150的 PBS 溶液，另一组每只鼻腔逐滴滴入100µL PBS溶液作为对照。第一次免疫用Al(OH)₃完全佐剂，第二次和第三次免疫用Al(OH)₃不完全佐剂。每 2 周注射一次，分别于免疫前和最后一次免疫后 2 周取小鼠静脉血，离心分离血清-20℃冰箱内保存。动物试验均在杭州医学院动物实验中心进行。

补体的制备

青紫兰品系家兔，清洁级，3～4 周龄，由杭州医学院动物实验中心提供。先采少量血并分离血清测试补体的自然杀菌抗体活性，无自然杀菌抗体活性或杀菌率低 30%者可大量采血。将5份以上的血清混合，分装成每份5-8 ml，放-20℃冰箱内保存4周，为避免补体偏转现象的发生，一般应用不稀释的原血清。

补体自然杀菌率的检测

取96孔反应板一块，标记补体和灭活补体各2孔。加生理盐水50µL／孔，将补体和灭活补体分别加入孔内，25µL／孔，然后加入菌液25µL／孔。充分混合后于37℃，5% CO 2条件下孵育30 min。反应结束，取各孔中合物25µL滴加于巧克力平板，倾斜平板使液体自然流下，置37℃，5% CO₂条件下孵育过夜。分别计数补体和灭活补体菌落数，按下式求出补体自然杀菌率：

补体自然杀菌率（%）＝（1－补体对照菌数／灭活补体对照菌数）×100％

菌液制备

菌种划线接种于巧克力平板上，于 37℃，5% CO 2 条件下培养过夜，菌苔用稀释缓冲液稀释，并调整浓度至约1×10⁵CFU／ml和1×10¹⁰CFU／ml，置 4℃保存备用。

血清杀菌活性测定

96孔反应板每孔内加25µL 稀释缓冲液，第l孔加25µL待测血清，吹吸5次后取25µL加至第2孔，再吹吸5次后取出25µL至第3孔，如此连续倍比稀释至最后一孔。每孔内加25µL乳兔补体，于37℃，5% CO 2条件下孵育15 min；加25µL菌液（菌液浓度为10⁵CFU／ml）和25µL稀释缓冲液，37℃，5% CO₂ 条件下孵育60 min；取25µL滴加于巧克力平板，倾斜平板使液体自然流下，37℃，5% CO₂条件下孵育过夜；次日计数活菌。实验中设不加血清对照（包括加灭活补体和未灭活补体的对照）。以未灭活补体对照为参考，计算杀菌率。

杀菌率（％）＝（1－血清组菌落数／补体对照菌落数）×100％

杀菌率为 50％时血清的稀释度的倒数即为体外杀菌抗体的滴度。

血清杀菌活性测定结果

MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150免疫小鼠获得血清体外杀菌抗体的滴度均高于32，将获得的全部小鼠血清温合，置 4℃保存备用。

浸润棉条制备

购买人工合成海绵（Merocel，Medtronic Xomed，Jacksonville，FL USA)。海绵被修剪成0.50 mm×0.50 mm×9.00 mm的棉条，以游标卡尺（精确度0.02 mm）测量保证修剪尺寸精确。所有金属手术器械以戊二醛消毒。手术刀、显微手术镊和显微手术剪用于修剪海绵，以显微手术镊将棉条插入鼻孔。

急性鼻窦炎模型

将60只小鼠采用数字表法将小鼠随机分为4组（A、B、C和D组），每组15只，分笼饲养，每笼3～5只。小鼠称重用浓度为15 mg／mL戊巴比妥钠溶液按每克体重6µL体积腹腔内注射进行麻醉，用75％乙醇棉签清理小鼠头部，待乙醇完全挥发后进行实验。以显微手术镊轴位夹持棉条，并将棉条插入小鼠右侧鼻孔，镊子插入深度不超过1.50 mm，缓慢将棉条插入鼻腔内4 mm。1×10¹⁰CFU／ml的流感嗜血杆菌细菌悬液10µL滴于棉条上，再将棉条剩余露在外面的部分塞人鼻孔内。

血清体内杀菌试验

建模当天为0天，治疗组从第 5天开始每天早、中、晚三次分别向3组小鼠每只双侧鼻腔滴10µL不同稀释度小鼠免疫血清（A组为血清原液、B组为10倍稀释血清、C组为100倍稀释血清），待其完全吸入后归笼饲养。D组为对照组则每天早、中、晚三次向双侧鼻腔滴10µL PBS，观察小鼠发病情况。建模后2、5、8、11和14天每组随机取3只小鼠，以腹腔注射120 mg／kg戊巴比妥钠致呼吸衰竭处死小鼠，用含5％胎牛血清的PBS溶液做鼻腔灌洗，得到灌洗液约100µL／只，将灌洗液以l0倍进行倍比稀释后，分别取10µL原液和各稀释度铺板，37℃，5％C02培养过夜，第二天观察不同稀释度灌洗液巧克力平板上菌落数量，并对细菌进行NTHi鉴定。

小鼠接种NTHi后临床表现

鼻腔接种NTHi组第4天时，大部分小鼠出现饮食减少、活动减退、出现频繁的喷嚏、大量清涕流出等症状。A组、B组第6天开始症状有缓解，C组和D组一直到第10天开始症状才开始缓解，没有小鼠死亡。

小鼠免疫血清清除NTHi能力

建模后第2、5天（免疫血清或PBS处理前）和8、11和14天（免疫血清或PBS处理后）每组随机取3只小鼠鼻腔灌洗细菌培养，培养结果图1。4组血清（或血清稀释液）及PBS滴鼻处理前，各组灌洗液第2天10²～10⁴稀释培养结果阳性、第5天10⁴或10⁵培养结果阳性，第2天和第5天4组间比较无差异。第8天A组只有一只灌洗液原液培养阳性，B组有一只灌洗液原液和10²稀释各一只阳性，而C组和D组则继续高稀释度（10⁴或10⁵）灌洗液呈阳性；第11天和第14天 A组和B组均阴性；C组和D组细菌载量有所下降，第11天C组3只10或10²稀释呈阳性、而D组则3只10²或10³稀释呈阳性；第14天C组和D组细菌仍未完全清除，C组有1只原液培养阳性，D组则有原液和10倍稀释液培养阳性各1只。各时间点细菌载量A组和B组、C组和D组间无显著性差异，提示本发明制备小鼠免疫血清即使10倍稀释对NTHi仍有效杀菌功能。

经小鼠急性鼻窦炎模型证明本发明获得的血清（及血清10倍稀释液）具有有效杀菌功能。由于该血清除具有杀菌作用的抗体成份外其余成份与人体血清成份相似，如经无菌、生物安全处理，制成鼻窦炎滴鼻液用于鼻窦炎治疗，则具有易于吸收，不使用激素，不会产生依赖性，适合婴幼儿使用的优点。

序列表

<110> 杭州医学院

<120> 一种治疗流感嗜血杆菌引起鼻窦炎的血清及该血清的应用

<130> 1

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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cgttactcaa atagtgcg 18

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cgcctcgagt ttatcgtcat catcacgttc aataaaatat cg 42

Claims

1.一种治疗流感嗜血杆菌引起鼻窦炎的血清，其特征在于由重组蛋白MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150免疫得到。

2.如权利要求1所述的一种治疗流感嗜血杆菌引起鼻窦炎的血清，其特征在于所述的MAP-rHap-C4-GGGS-Hap-C150通过以下步骤得到：

2）以pUCm-T^{-hap-C4-GGGS-hap-C150}为模板，采用引物携带EK序列互补构建hap-C4-GGGS-hap-C150-EK串联表位融合片段；以pUCm-T^{-8[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK]}为模板，扩增获得NdeI-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]-XhoI片段；

3）以NdeI-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]–XhoI构建原核表达系统EcoliBL21DE3^{pET42a-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]}，原核表达系统Ecoli BL21DE3^pET42a ^{-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]}诱导表达重组融合蛋白8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]，重组融合蛋白8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]水解提纯得到rHap-C4-GGGS-Hap-C150融合表位肽；

4）用碳二亚胺法将rHap-C4-GGGS-Hap-C150与Poly-Asp-Lys载体大分子交联，制备出多抗原MAP交联肽MAP- rHap-C4-GGGS-Hap-C150。

3.如权利要求1所述的血清在制备治疗流感嗜血杆菌引起鼻窦炎药物中的应用。