CN107589188A - 阀切换技术联用色谱分离同时检测饮料中的糖类、甜味剂和防腐剂的方法 - Google Patents
阀切换技术联用色谱分离同时检测饮料中的糖类、甜味剂和防腐剂的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种阀切换技术联用色谱分离同时检测饮料中的糖类、甜味剂和防腐剂的方法。样品经过前处理后进样AS11‑HC(4×250mm)阴离子分离柱，通过设置合适的阀切换时间，在AS11‑HC柱上保留较弱的糖类物质先洗出并被收集在定量环中。收集在定量环中的糖类物质经二次切换被NaOH淋洗液冲洗冲入PA10(4×250mm)柱中分离电化学检测。保留在AS11‑HC(4×250mm)柱中的防腐剂和甜味剂随着淋洗液洗出，紫外检测器检测。本发明的方法可广泛应用于食品生产和饮料行业中的生产工艺质量控制或最终成品的成分检测。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种阀切换技术联用色谱分离同时检测饮料中的糖类、甜味剂和防腐剂的方法。
背景技术
饮料的主要原料是饮用水或矿泉水，果汁、蔬菜汁或植物的根、茎、叶、花和果实的抽提液。主要含甜味剂、酸味剂、香精、香料、食用色素、乳化剂、起泡剂、稳定剂和防腐剂等食品添加剂。防腐剂因能抑制微生物的生长繁殖，防止饮料腐败变质而延长保质期，而被广泛添加使用。但目前食品添加剂超量、超范围使用的现象很多，苯甲酸、山梨酸和对羟基苯甲酸酯类是使用最广泛的防腐剂。许多研究表明，人体食用防腐剂过量的食品会对人体造成潜在的危害。糖类既是生命体的基本原料和主要结构成分，也是生命体维持生命活动主要的能量来源，更是饮料的呈味物质。除此之外，糖类能与蛋白质结合形成糖蛋白，在生命活动中发挥重要作用。苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠，如图1所示，4种添加剂是饮料中关注较多的。苯甲酸和山梨酸作为防腐剂，应用比较广泛；安赛蜜和糖精钠是各类饮料中常用的甜味剂。对于甜味剂和防腐剂的使用限量，我国都有严格的规定。目前，糖类检测方法有高效液相法，离子色谱-脉冲安培法，液相色谱-示差折光检测法，核磁共振氢谱法毛细管电泳法等需要对他们进行单独测定，而甜味剂和防腐剂一般是通过紫外检测器进行检测。但在实际检测过程中发现中，有些糖类、甜味剂及防腐剂有紫外吸收而无电化学响应，而有些有电化学信号却无紫外吸收，因此在分析测试中，饮料中的防腐剂、甜味剂和糖需要分别对其进行测定。现有的技术手段无法做到一次性完成，检测过程繁琐，单独测定不仅会造成人力财力的浪费，而且无法满足某些对检测时效性较强应用的需求。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中糖类、甜味剂及防腐剂无法同时检测的问题，并提供一种阀切换技术联用色谱分离同时检测饮料中的糖类、甜味剂和防腐剂的方法。
本发明所采用的具体技术方案如下：
阀切换技术联用色谱分离同时检测饮料中的糖类、甜味剂和防腐剂的方法，步骤为：将经过前处理的样品装载到六通阀1的定量环中，样品随着淋洗液进入连接高效液相色谱仪的Dionex IonPac AG11-HC(4mm×50mm，括号中数字代表型号，下同)保护柱和DionexIonPac AS11-HC(4mm×250mm)分析柱中，葡萄糖、果糖和蔗糖在AS11-HC柱中保留较弱，通过设置六通阀2的阀切换时间，使三种糖被全部切换收集于六通阀2的定量环中；一定时间后再次切换六通阀2，将定量环中的三种糖经淋洗液冲入到Dionex CarboPac PA10(4×50mm)保护柱和Dionex CarboPac PA10(4×250mm)分析柱中，经分离后由电化学检测器检测；保留在IonPac AS11-HC分析柱中的亚硝酸盐、苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠五种物质随着淋洗液的淋洗被冲出色谱柱，进入紫外检测器检测。
作为优选，六通阀2的第一次阀切换时间为第2.3min，第二次阀切换时间为第3.3min。
作为优选，在样品检测的过程中，Dionex CarboPac PA10(4×50mm)保护柱和Dionex CarboPac PA10(4×250mm)分析柱中的淋洗条件为：流速1.0mL/min，柱温35℃，以45mmol/L的氢氧化钠淋洗液等度洗脱；Dionex IonPac AG11-HC(4mm×50mm)保护柱和Dionex IonPac AS11-HC(4mm×250mm)分析柱中的淋洗条件为：流速1.0mL/min，柱温35℃，以水和200mmol/L的氢氧化钠溶液混合成流动相进行梯度洗脱。
作为优选，电化学检测器的检测波形为Carbohydrates Standard Quad。
作为优选，紫外检测器检测波长为230nm。
本发明相对于现有技术而言，在0.5-2.5的线性范围内，方法的回归系数r2≥0.9990，重现性RSD≤6.72％，回收率为80.0％-120.0％。本方法可广泛应用于食品生产和饮料行业中的生产工艺质量控制或最终成品的成分检测。
附图说明
图1为4种添加剂的化学结构，图中a苯甲酸；b山梨酸；c安赛蜜；d糖精钠；
图2为色谱系统的工作过程；图中六通阀不同孔之间实线代表连通，虚线代表不连通，下同；
图3为1mg/L葡萄糖，果糖和蔗糖混合标准样品色谱图，图中1-葡萄糖，2-果糖，3-蔗糖；
图4为亚硝酸，山梨酸，苯甲酸，安赛蜜和糖精钠混合标准样品色谱图，C＝1.0mg/L，图中1-亚硝酸，2-山梨酸，3-苯甲酸，4-安赛蜜，5-糖精钠；
图5为葡萄糖，果糖和蔗糖混合溶液的色谱图，C＝2.0mg/L；
图6为3种糖的第二个切换时间与峰面积的关系，C＝1.0mg/L；
图7为3种糖的第一个切换时间与峰面积的关系，C＝1.0mg/L；
图8为蛇草水电化学检测信号图，图中1-蔗糖；
图9为蛇草水紫外检测信号图；
图10为二锅头电化学检测信号图，图中1-蔗糖；
图11为二锅头紫外检测信号图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
阀切换技术联用色谱分离同时检测饮料中的糖类、甜味剂和防腐剂的方法，其具体步骤为：将经过前处理的样品装载到六通阀1的定量环中，样品随着淋洗液进入连接高效液相色谱仪的Dionex IonPac AG11-HC(4mm×50mm)保护柱和Dionex IonPac AS11-HC(4mm×250mm)分析柱中，葡萄糖、果糖和蔗糖在AS11-HC柱中保留较弱，通过设置六通阀2的阀切换时间(本实施例中选择2.3min)，使三种糖被全部切换收集于六通阀2的定量环中；一定时间后(本实施例中选择3.3min)再次切换六通阀2，将定量环中的三种糖经淋洗液冲入到Dionex CarboPac PA10(4×50mm)保护柱和Dionex CarboPac PA10(4×250mm)分析柱中，经分离后由电化学检测器检测；保留在IonPac AS11-HC分析柱中的亚硝酸盐、苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠五种物质随着淋洗液的淋洗被冲出色谱柱，进入紫外检测器检测。
下面详细阐述上述技术方案的理论依据和效果。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
仪器：ICS-5000型离子色谱仪(金电极，电化学检测器，美国赛默飞有限公司)；安捷伦1200高液液相色谱仪带紫外检测器；数显恒温水浴锅HH-1型(金坛市江南仪器厂)；电子分析天平BS-224S型(赛多利斯科学仪器有限公司)；戴安梯度泵GP50(戴安中国有限公司)。
试剂：苯甲酸、亚硝酸钠(分析纯，购自上海振兴试剂厂)、安赛蜜、山梨酸、糖精钠(98％)(购自源叶生物)；葡萄糖(分析纯，购自天津市永大化学试剂有限公司)、D-果糖(高纯，99％)(购自源叶生物)、蔗糖(分析纯，购自广州市金华大化学试剂有限公司)。实验用水为超纯水(Millipore,Molsheim,France，电阻率18.2MΩ·cm)。
实验样品：红星二锅头(酒精度：56％vol)、东方树叶乌龙茶原味茶饮料、哇哈哈苏打水饮品、崂山白花蛇草水，购自当地超市。下文简称它们为二锅头、乌龙茶、苏打水和蛇草水。
1.2 溶液制备
标准储备溶液：苯甲酸、亚硝酸钠、安赛蜜、山梨酸、糖精钠由分析纯试剂配置成浓度为1000mg/L的贮备液，葡萄糖、果糖、蔗糖由分析纯试剂配置成浓度为1000mg/L的贮备液，储存于4℃冰箱备用。
标准混合溶液：分别移取一定量的上述标准储备溶液至10mL的容量瓶中，用超纯水定容，配得浓度均为0.50mg/L、1.00mg/L、1.50mg/L、2.00mg/L、2.50mg/L的混合标准溶液系列备用。
样品溶液的配制：样品溶液的处理：把饮料或二锅头置于试管中，放置于80℃水浴中加热20分钟，并搅拌，以除去CO2气体或乙醇，以减少两者对实验分析的影响。样品冷却至室温，过0.45μm微孔滤膜后进样分析。
1.3 色谱条件
色谱系统的工作过程如图2，在连接时尽量缩短仪器单元与单元之间的连接线，以减少死体积。图中a是将样品装载到六通阀1中的25μL定量环中；样品随着淋洗液进入分析柱AS11-HC中，五种物质(亚硝酸盐、苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠)在AS11-HC上面有保留，三种糖(葡萄糖、果糖、蔗糖)在AS11-HC柱中保留较弱，在2.3min被洗出通过阀2切换收集于定量环中，如图中b所示。；3.3min后，再次切换阀2，收集在定量环中的物质经淋洗液冲入到PA10(4×250mm)分析柱中，经分离后电化学检测。而保留在AS11-HC中待测物经冲洗后进入紫外检测器检测，如图中c所示。分析完成后，系统切换到原始状态，如图中d所示。
电化学检测条件：保护柱Dionex CarboPacTMPA10(4×50mm)，分析柱DionexPA10(4×250mm)，流速1.0mL/min，柱温35℃。以45mmol/L的氢氧化钠淋洗液等度洗脱，电化学检测。电化学检测器的波形为：Carbohydrates(Standard Quad)。
紫外检测物质分离条件：保护柱AG11-HC(4×50mm)，分析柱AS11-HC(4×250mm)；流动相：水(A)和200mmol/L的氢氧化钠溶液(B)，梯度淋洗条件见表1，进样量25μL，柱温35℃。紫外检测器检测波长为230nm。
表1 防腐剂及甜味剂的梯度淋洗程序
2 结果与分析
2.1 淋洗条件的优化
在样品检测的过程中，通过对不同的流动相条件进行试验，最终确定用DionexCarboPacTMPA10(4×50mm)保护柱，DionexPA10(4×250mm)分析柱用45mmol/L的NaOH淋洗液，流速1.0mL/min等度淋洗用来分离三种糖：葡萄糖、果糖和蔗糖，色谱图见图3。Dionex IonPac AG11-HC(4mm×50mm)保护柱和Dionex IonPac AS11-HC(4mm×250mm)分析柱，根据表1的梯度淋洗条件，以1.0mL/min的流速梯度淋洗五种防腐剂、甜味剂：亚硝酸盐、苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠，色谱图见图4。
2.2 切换时间的选择
为确定合适的阀切换时间，首先要知道糖类物质的大致出峰时间。保护柱AG11-HC(4×50mm)和分析柱AS11-HC(4×250mm)后面直接连接电化学检测器和紫外检测器，采用表1的梯度淋洗，观察2mg/L糖类、防腐剂和甜味剂标准混合溶液的出峰情况，由于如图5所示，从图中可以看出，3种糖类物质保留非常弱，在2.4min左右开始冲出，在3.3min左右已全部被冲出，几种防腐剂和甜味剂约在6min后出峰，见图4。
其次，以防系统压力过高，本发明选用定量环代替富集柱收集阀切换出的液体，定量环的长度是保证收集是否完全的一个因素，太短可能导致前期收集的液体流出，太长导致峰展宽。我们的计算方法是：首先确定需要收集的液体的量，根据切换的时间及流速可推算出切换的量，然后根据使用的绿色peek管的直径及长度得到收集环的容积，收集环的容积要略大于切换的量，以保证收集完全，最终确定定量环的长度为418cm。为了获得更准确的切换时间，对1.0mg/L标准混合溶液进行一系列的测试。首先在第一个切换时间为2.4min的条件下，分别测试第二个切换时间为3.1min、3.2min、3.3min、3.4min、3.6min时标准混合溶液的出峰情况，得到各个糖和防腐剂、甜味剂的时间与峰面积关系如图6所示。
由该图6可知，3.3min时，富集效果最好，因此选择3.3min为第二个切换时间。然后固定第二个切换时间为3.3min，分别测试2.0min、2.2min、2.3min、2.4min、2.6min时标准混合溶液的出峰情况，得到切换时间与峰面积关系如图9所示。由该曲线图可知，2.3min时，富集效果最好，因此选择2.3min为第一个切换时间。
2.3 标准曲线、重现性和检出限
分别配制各检测物质0.5mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L，2.0mg/L，2.5mg/L的系列浓度，按上述的色谱条件进样，得到峰面积和浓度的线性方程。对浓度为1.0mg/L的标准溶液重复进样8次求得方法的重现性及3倍信噪比，得方法的检出限(S/N)，结果见表2。可见，该方法在0.5-2.5mg/L线性范围内有较好的相关系数、检出限及重现性。
表2 线性关系及检出限
2.4 样品分析及回收率实验
取适量的样品置于试管中，放置80℃水浴中加热20min以除去气泡或乙醇，冷却至室温后过0.45μm微孔滤膜，滤液进上述的阀切换色谱系统。蛇草水和二锅头的色谱图见图8-图11。以同样的方法进行加标测定，平行进样三次，测定加标回收率，实验结果见表3-表5。
表3 二锅头白酒加标回收率
表4 蛇草水加标回收率
表5 苏打水加标回收率
由此可见，本方法采用阀切换联用AS11-HC(4×250mm)分离，紫外检测和PA10(4×250mm)分离电化学检测同时检测饮料中的3种糖和5种防腐剂、甜味剂。该方法简单方便，整体性完整，重现性理想，回收率高，测定数据准确可靠，可以广泛应用于食品生产和饮料行业中的生产工艺质量控制或最终成品的成分检测。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种阀切换技术联用色谱分离同时检测饮料中的糖类、甜味剂和防腐剂的方法，其特征在于，将经过前处理的样品装载到六通阀1的定量环中，样品随着淋洗液进入连接高效液相色谱仪的Dionex IonPac AG11-HC(4mm×50mm)保护柱和Dionex IonPac AS11-HC(4mm×250mm)分析柱中，葡萄糖、果糖和蔗糖在AS11-HC柱中不保留，通过设置六通阀2的阀切换时间，使三种糖被全部切换收集于六通阀2的定量环中；一定时间后再次切换六通阀2，将定量环中的三种糖经淋洗液冲入到Dionex CarboPac PA10(4×50mm)保护柱和DionexCarboPac PA10(4×250mm)分析柱中，经分离后由电化学检测器检测；保留在IonPac AS11-HC分析柱中的亚硝酸盐、苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠五种物质随着淋洗液的淋洗被冲出色谱柱，进入紫外检测器检测。
2.如权利要求1所述的阀切换技术联用色谱分离同时检测饮料中的糖类、甜味剂和防腐剂的方法，其特征在于，六通阀2的第一次阀切换时间为第2.3min，第二次阀切换时间为第3.3min。
3.如权利要求1所述的阀切换技术联用色谱分离同时检测饮料中的糖类、甜味剂和防腐剂的方法，其特征在于，在样品检测的过程中，Dionex CarboPac PA10(4×50mm)保护柱和Dionex CarboPac PA10(4×250mm)分析柱中的淋洗条件为：流速1.0mL/min，柱温35℃，以45mmol/L的氢氧化钠淋洗液等度洗脱；Dionex IonPac AG11-HC(4mm×50mm)保护柱和Dionex IonPac AS11-HC(4mm×250mm)分析柱中的淋洗条件为：流速1.0mL/min，柱温35℃，以水和200mmol/L的氢氧化钠溶液混合成流动相进行梯度洗脱。
4.如权利要求1所述的阀切换技术联用色谱分离同时检测饮料中的糖类、甜味剂和防腐剂的方法，其特征在于，电化学检测器的检测波形为Carbohydrates Standard Quad。
5.如权利要求1所述的阀切换技术联用色谱分离同时检测饮料中的糖类、甜味剂和防腐剂的方法，其特征在于，紫外检测器检测波长为230nm。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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