CN107586882B - 一个与黄瓜圆形果顶性状紧密连锁的分子标记InDel-RT - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与黄瓜圆形果顶性状主效QTL RT6.1连锁的分子标记方法，属于生物技术领域。首先公开了与QTL RT6.1紧密连锁的分子标记Indel‑RT，同时公开了该标记的引物Indel‑RT‑F/Indel‑RT‑R。在含有RT6.1的分离群体和含有RT6.1的自交系材料中，标记引物Indel‑RT‑F/Indel‑RT‑R在圆形果顶株系中均能扩增出165bp产物，在不含有RT6.1的尖角形果顶株系中扩增出156bp产物。本发明公开的与RT6.1紧密连锁分子标记，可用于黄瓜圆形果顶性状的分子标记辅助育种。

Description

一个与黄瓜圆形果顶性状紧密连锁的分子标记InDel-RT
一、技术领域
本发明公开了黄瓜圆形果顶主效QTL的连锁分子标记，属于蔬菜分子遗传育种技术领域，可用于黄瓜圆形果顶性状的分子标记辅助育种。
二、背景技术
黄瓜是我国大面积栽培的主要蔬菜，与人们生活密切相关且具有极高的经济价值。优良外观品质能够提升黄瓜的商品价值，消费者往往偏向购买瓜形美观的黄瓜。目前市场上黄瓜的果顶形状一般分为两种类型：尖角型和圆钝型。具有尖角形果顶的黄瓜在生产上易形成瓜条弯曲甚至“尖嘴”状的畸形果，严重降低了商品率。而圆形果顶的黄瓜其瓜条相对匀称美观，瓜条均一便于包装。同时，尖角形果顶部位的果肉风味较差，不管是鲜食还是在腌制加工中通常被当作不食用部分直接丢弃，相比之下圆钝型黄瓜的可食用比例高，在增殖加工过程中不但节省了原料，也减少了加工步骤。此外，在大规模的机械化采收和净菜清洗加工过程中，尖角型果顶与圆钝形果顶相比，更容易损伤，也会降低果实的商品性。因此圆形果顶性状是一种极具商业价值的育种目标性状，然而由于传统育种方法效率较低，而且目前尚未有黄瓜圆形果顶性状的分子育种标记，黄瓜果顶性状的育种改良受到了阻碍。
基于上述背景，本发明开展了黄瓜果顶性状的遗传机制和圆形果顶QTL定位研究。以圆钝型果顶黄瓜材料‘EC’为母本，尖角型果顶黄瓜材料‘ST’为父本，构建了F2和F2∶3群体，利用F2∶3群体对黄瓜果顶形状QTL位点进行定位，利用F4∶5剩余杂合体群体(RHL)对主效QTL进行验证，同时结合双亲重测序结果的分析，结合双亲重测序结果的分析，开发并筛选与主效QTL位点紧密连锁的InDel标记。利用IL(圆形果顶)×CCMC(尖角形果顶)的F2群体和10份黄瓜种质材料验证峰值标记对圆形果顶的选择效果。该标记可为黄瓜圆形果顶的分子标记辅助选择育种提供新型、高效、实用的分子标记。
三、发明内容
本发明的目的是提供与黄瓜圆形果顶主效QTL RT6.1紧密连锁的分子标记InDel-RT。
本发明通过以下技术方案得以实现：
与黄瓜自交系‘EC’的圆形果顶主效QTL RT6.1紧密连锁的分子标记InDel-RT，其上游引物InDel-RT-F序列为TGAAAACAATTTATGAAAATTTTGGAC，下游引物InDel-RT-R序列为TGCCCTTTAACTCACCTTTTTCTA。
具体方法为：
1.以黄瓜材料的DNA作为模板，用InDel-RT分子标记引物进行PCR扩增；
2.PCR扩增反应体系组成为：10×buffer(含Mg2+)2.0μL，dNTP 2.0μL，正、反向引物各1μL，Taq酶(5U·μL-1)0.25μL、DNA(10ng)1.0μL，ddH2O，12.75μL，反应总体积为20μL。反应程序为94℃预变性5min，每个循环95℃预变性30s，60℃退火30S，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min，16℃保存。
3.PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。电泳结果可显示，具有圆形果顶性状的黄瓜材料可扩增出165bp特异条带，具有尖角果顶性状的材料可扩增出156bp的条带。
有益效果：
1.InDel-RT是圆形果顶主效QTL RT6.1的峰值标记，该标记引物(InDel-RT-F/InDel-RT-R)能用于分子标记辅助选择RT6.1。
2.本发明公开的‘EC’中与圆形果顶主效QTL RT6.1紧密连锁的分子标记引物(InDel-RT-F/InDel-RT-R)是根据双亲基因组重测序的结果设计而成，使用简单、方便、扩增稳定。
四、附图说明
图1：不同果顶类型黄瓜材料照片。圆钝型果顶黄瓜材料‘EC’和‘IL’，尖角型果顶黄瓜材料‘ST和‘CCMC’为标记开发群体的亲本材料。
图2：利用F2∶3群体进行RT6.1定位，白色框和斜纹框分别表示2016年春季和秋季的检测结果
图3：利用F4∶5RHL群体缩短的RT6.1区段及标记Indel-RT在染色体上的位置
注：黑点表示峰值位置
图4用IL和CCMC及其F2群体中圆形和三角形果顶极端性状的单株的DNA为模版，.用本发明中的标记引物Indel-RT-F/Indel-RT-R进行PCR扩增，结果显示在IL(泳道1)和圆形果顶极端表型单株(泳道4-8)中扩增出165bp的单条带，而在CCMC(泳道2)和尖角形果顶极端表型单株(泳道3，9-13)中均扩增出的156bp条带，M泳道为DNA marker。
图5：圆形和尖角形果顶黄瓜自交系材料的DNA作为模板，用本发明中的标记引物Indel-RT-F/Indel-RT-R进行PCR扩增，结果显示在EC(泳道1)和圆形果顶自交系(泳道2-6)中扩增出165bp的单条带，而在ST(泳道7)和尖角形果顶自交系(泳道8-10)中均扩增出156bp的条带；M泳道为DNA marker。
五、具体实施方式
在2016年春、秋两季对“EC×ST”构建的F2∶3群体进行了果尖表型鉴定。选用1335对SSR引物和224对InDel引物在‘EC’和‘ST’之间进行多态引物筛选，然后将232对多态引物在16个F2单株上继续筛选，最终133个SSR引物和14个InDel引物在145个F2单株中进行PCR扩增，用JoinMap4.0构建连锁图谱，并用Windows QTL Cartographer v2.5软件定位黄瓜果尖形状相关QTL。结果显示，位于6号染色体上的主效QTL RT6.1在两个环境中均可被检测到，可解释的表型变异率分别为14.1％和18.2％。从F3∶4群体中筛选含有RT6.1的剩余杂合单株并构建F4∶5群体。利用该群体对主效区间进行标记加密，并结合该群体内单株果尖表型鉴定，将RT6.1区段进一步缩短，Indel-RT是该区段的峰值标记，与RT6.1紧密连锁。
1.与RT6.1紧密连锁分子标记引物设计
在分子标记连锁图谱构建和黄瓜圆形果顶主效QTL RT6.1遗传定位研究中，分子标记Indel-RT-是RT6.1的峰值标记(图3)。该标记引物是通过双亲全基因组重测序，利用SAMTOOLS软件检测长度小于50bp的小片段插入与缺失位点，并根据该位点上下游200bp的序列，用Premier 5.0软件设计而成。
标记Indel-RT引物序列为：
InDel-RT-F：5’-TGAAAACAATTTATGAAAATTTTGGAC-3
InDel-RT-R：5’-TGCCCTTTAACTCACCTTTTTCTA-3’
2.标记引物InDel-RT-F/InDel-RT-R在IL×CCMC F2群体的分子检测
为了验证该分子标记的准确性，利用InDel-RT-F/InDel-RT-R引物在IL×CCMC杂交构建的F2群体中的圆形果顶单株和尖角形果顶单株进行PCR扩增检测，结果显示圆形果顶亲本IL和圆形果顶单株中的扩增产物为165bp的特异条带，而尖角形果顶亲本CCMC和尖角形果顶单株中扩增出156bp的条带(图4)。
PCR扩增反应体系组成为：10×buffer(含Mg2+)2.0μL，dNTP 2.0μL，正、反向引物各1μL，Taq酶(5U·μL-1)0.25μL、DNA(10ng)1.0μL，ddH2O，12.75μL，反应总体积为20μL。反应程序为94℃预变性5min，每个循环95℃预变性20s，58℃退火20S，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸5min，16℃保存。PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。
3.标记引物InDel-RT-F/InDel-RT-R在黄瓜种质材料中的分子检测
利用标记引物InDel-RT-F/InDel-RT-R在6份圆形果顶和4份尖角形果顶种质材料(表1)中进行PCR扩增检测(条件和方法同上)。结果表明：圆形果顶种质材料的扩增产物为165bp的特异条带，而尖角形果顶种质材料中扩增出156bp的条带(图5)。
表1 10份不同果顶类型的黄瓜材料
Figure BSA0000153198730000031

Claims (3)

1.黄瓜圆形果顶性状主效QTL RT6.1的分子标记InDel-RT，其特征在于：该分子标记的引物序列为：
InDel-RT-F：5’-TGAAAACAATTTATGAAAATTTTGGAC-3’
InDel-RT-R：5’-TGCCCTTTAACTCACCTTTTTCTA-3’
且Indel-RT是RT6.1的峰值标记。
2.黄瓜圆形果顶性状主效QTL RT6.1的分子标记方法，其特征包括：
(1)以待鉴定材料的DNA为模板，用权利要求1所述的分子标记InDel-RT的引物对进行PCR扩增；PCR扩增反应的总体系为20μl，包括：10×buffer(含Mg2+)2.0μL，dNTP 2.0μL，正、反向引物各1μL，Taq酶(5U·μL-1)0.25μL、DNA(10ng)1.0μL，ddH2O，12.75μL； 反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30S，72℃延伸1min 20s，35个循环；72℃延伸5min，10℃保存，
PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色，
(2)标记引物鉴定RT6.1：能扩增出156bp特异条带的植株为含有RT6.1的植株。
3.权利要求1所述的分子标记在黄瓜圆形果顶性状分子标记辅助育种中的应用。
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