CN107586830B - 一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，属于生物应用技术领域。本发明采用生物化学及细胞学方法，利用BMP6处理细胞，模拟了干燥综合症发生时的细胞微环境从而研究卷烟烟气对AQP‑5表达量的影响，相较于动物实验而言更为简单、高效；在卷烟烟气的捕集上采用了口腔仿生模拟装置，更贴合实际的人抽吸状态；同时采用了荧光定量PCR方法，可实时比较不同样品对AQP‑5 mRNA表达量的影响，从而为卷烟烟气的功效性评价提供了一个新的快速手段。
Description
技术领域
本发明属于生物应用技术领域，具体涉及一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法。
背景技术
唾液是维持口腔微生态环境平衡的主要因素，具有湿润口腔和食物、便于说话吞咽、移走味蕾上的食物微粒，从而不断尝到食物上的味道以及清洁和保护口腔等多种作用。卷烟感官评价表明部分卷烟烟气会引起口腔干涩、燥刺、不适等负面感受，因此研发具有降燥生津功能的卷烟产品，对于改善口腔舒适感提升卷烟抽吸品质具有重要意义。
水通道蛋白家族(Aquaporins,AQP)是特异性跨膜转运水的一组蛋白，能显著增加细胞膜水通透性，参与水的分泌、吸收及细胞内外水的平衡。AQP5是一种主要表达于唾液腺及皮肤小汗腺的水通道蛋白，主要介导水分子跨细胞膜通透转运，在唾液分泌中起着重要作用。研究表明干燥综合症患者及干燥综合症模型小鼠涎腺细胞中存在AQP5的下调或亚细胞分布异常，因此恢复腺体内A QP5的正常亚细胞分布、上调AQP5成为治疗干燥综合症的可能手段。目前，医学上化学物质对水通道蛋白的影响大多是通过干燥综合症动物模型进行整体动物水平的AQP5研究，不适用于大批量样品的检测。因此如何通过细胞分子生物学方法来进行卷烟烟气对水通道蛋白影响检测对生津物质的开发起着重要作用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供及一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，该方法利用BMP6处理细胞，模拟了干燥综合症发生时的细胞微环境，从而研究卷烟烟气对AQP-5表达量的影响，相较于动物实验而言更为简单、高效。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，包括如下步骤：
步骤(1)，采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10-20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；
步骤(2)，将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25％胰酶消化后，以2-4×104个/m L细胞浓度接种于DMEM/F12细胞培养基上，在37℃、5％CO2的条件下培养22-26h后，加入骨形成蛋白6至终浓度为6ng/ml，处理2-3d；
步骤(3)，移去步骤(2)中的培养上清，以步骤(1)得到的仿生抽吸液体稀释4-8倍后的液体作为培养基继续在37℃、5％CO2的条件下对细胞进行培养22-26h；仿生抽吸液体的用量与细胞之间的比例没有限制，按照培养基的常用量使用即可；
步骤(4)，培养结束后弃上清，用0.25％胰酶消化细胞后，提取细胞总RN A；
步骤(5)，采用步骤(4)得到的RNA作为模板进行逆转录PCR合成cD NA；
步骤(6)，采用步骤(5)中的cDNA作为模板进行荧光定量PCR分析，采用SYBR Green法操作进行荧光定量PCR实验；
PCR反应体系共20μL，其中，2×Mix 10μL、ddH2O 6.8μL、上游引物200nmol/L 0.4μL、下游引物200nmol/L 0.4μL、ROX染料0.4μL，模板2μL；β-actin为内参；
PCR反应条件为，预变性95℃5min，变性96℃10s，退火/延伸60℃30s，共40个循环；
AQP5引物：上游引物为5’-actgggttttctgggtaggg-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物为5’-gtggtcagctccatggtctt-3’(SEQ ID NO.2)；
内参引物：上游引物为5’-ggagattactgccctggctccta-3’(SEQ ID NO.3)，下游引物为5’-gactcatcgtactcctgcttgctg-3’(SEQ ID NO.4)；
步骤(7)，数据分析：所得荧光定量PCR结果采用2-ΔΔCt方法进行数据分析，得到该待检测样品烟气对水通道蛋白5细胞mRNA相对表达量。
进一步，优选的是，步骤(1)所述的平衡条件为：温度22±1℃，湿度60±2％，时间48h。
进一步，优选的是，步骤(1)所述的抽吸采用全自动转盘式吸烟机。
进一步，优选的是，步骤(1)所述的抽吸的抽吸频率为1口/min，抽吸持续时间为2s，抽吸容量为35mL±0.15mL/口。
进一步，优选的是，步骤(1)中，浸润模拟人工口腔黏膜内壁所用的DM EM/F12细胞培养基的量为5mL。
进一步，优选的是，培养均在培养板中进行。
进一步，优选的是，步骤(2)和步骤(4)消化细胞的时间均为1-2min。
进一步，优选的是，在进行逆转录前需要对RNA的纯度进行判定，判定方法是：将待测样品的RNA分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.8～2.1时，表明纯度合格，能进行逆转录，反之，则表明纯度不合格，不能进行逆转录。
进一步，优选的是，每个样品检测均重复三次，水通道蛋白5细胞mRNA相对表达量取其平均值。
抽吸时，全自动转盘式吸烟机连接在装置的烟气进气管上。
若有多个样品间比较，需将RNA浓度调成一致，优选采用超纯水调节浓度。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明采用生物化学及细胞学方法，建立了一种卷烟烟气对细胞水通道蛋白mRNA表达量影响的检测方法，该方法利用BMP6处理细胞，模拟了干燥综合症发生时的细胞微环境从而研究卷烟烟气对AQP-5表达量的影响，相较于动物实验而言更为简单、高效，将实验周期从几个月缩短至几天；在卷烟烟气的捕集上采用了口腔仿生模拟装置，更贴合实际的人抽吸状态；同时采用了荧光定量PCR方法，可实时比较不同样品对AQP-5mRNA表达量的影响，从而为卷烟烟气的功效性评价提供了一个新的快速手段。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
1.实验材料：涎腺腺样囊性癌细胞(SACC-83细胞)从ATCC购买。
2.主要实验器材：
ABI QuantStudio 7Flex Real-Time PCR System(美国Thermo Fisher Scientific公司)；
CO2培养箱(Thermo公司)；
二级生物安全柜(Heal Force公司)；
倒置显微镜(TS100-F-HMC型，Nikon公司)；
96孔板、细胞培养瓶(美国Corning公司)。
本发明提取细胞总RNA用TIANGEN公司的培养细胞总RNA提取试剂盒进行提取；
逆转录PCR合成cDNA时采用TaKaRa Clontech公司的逆转录试剂盒进行PCR。
实施例1
一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，包括如下步骤：
步骤(1)，采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后采用全自动转盘式吸烟机进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；所述的平衡条件为：温度21℃，湿度58％，时间48h；所述的抽吸的抽吸频率为1口/min，抽吸持续时间为2s，抽吸容量为34.85mL/口；
步骤(2)，将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25％胰酶消化后，以2×104个/mL细胞浓度接种于DMEM/F12细胞培养基上，在37℃、5％CO2的条件下培养22h后，加入骨形成蛋白6至终浓度为6ng/ml，处理2d；
步骤(3)，移去步骤(2)中的培养上清，以步骤(1)得到的仿生抽吸液体稀释4倍后的液体作为培养基继续在37℃、5％CO2的条件下对细胞进行培养22h；仿生抽吸液体的用量与细胞之间的比例没有限制，按照培养基的常用量使用即可；
步骤(4)，培养结束后弃上清，用0.25％胰酶消化细胞后，提取细胞总RN A；
步骤(5)，采用步骤(4)得到的RNA作为模板进行逆转录PCR合成cD NA；
步骤(6)，采用步骤(5)中的cDNA作为模板进行荧光定量PCR分析，采用SYBR Green法操作进行荧光定量PCR实验；
PCR反应体系共20μL，其中，2×Mix 10μL、ddH2O 6.8μL、上游引物200nmol/L 0.4μL、下游引物200nmol/L 0.4μL、ROX染料0.4μL，模板2μL；β-actin为内参；
PCR反应条件为，预变性95℃5min，变性96℃10s，退火/延伸60℃30s，共40个循环；
AQP5引物：上游引物为5’-actgggttttctgggtaggg-3’，下游引物为5’-gtggtcagctccatggtctt-3’；
内参引物：上游引物为5’-ggagattactgccctggctccta-3’，下游引物为5’-gactcatcgtactcctgcttgctg-3’；
步骤(7)，数据分析：所得荧光定量PCR结果采用2-ΔΔCt方法进行数据分析，得到该待检测样品烟气对水通道蛋白5细胞mRNA相对表达量。
实施例2
一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，包括如下步骤：
步骤(1)，采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后采用全自动转盘式吸烟机进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；所述的平衡条件为：温度23℃，湿度62％，时间48h；所述的抽吸的抽吸频率为1口/min，抽吸持续时间为2s，抽吸容量为35mL±0.15mL/口；
步骤(2)，将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25％胰酶消化后，以4×104个/mL细胞浓度接种于DMEM/F12细胞培养基上，在37℃、5％CO2的条件下培养26h后，加入骨形成蛋白6至终浓度为6ng/ml，处理3d；
步骤(3)，移去步骤(2)中的培养上清，以步骤(1)得到的仿生抽吸液体稀释8倍后的液体作为培养基继续在37℃、5％CO2的条件下对细胞进行培养26h；仿生抽吸液体的用量与细胞之间的比例没有限制，按照培养基的常用量使用即可；
步骤(4)，培养结束后弃上清，用0.25％胰酶消化细胞后，提取细胞总RN A；之后对RNA的纯度进行判定，判定方法是：将待测样品的RNA分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.8～2.1时，表明纯度合格，能进行逆转录，反之，则表明纯度不合格，不能进行逆转录；
步骤(5)，采用步骤(4)得到的RNA作为模板进行逆转录PCR合成cD NA；
步骤(6)，采用步骤(5)中的cDNA作为模板进行荧光定量PCR分析，采用SYBR Green法操作进行荧光定量PCR实验；
PCR反应体系共20μL，其中，2×Mix 10μL、ddH2O 6.8μL、上游引物200nmol/L 0.4μL、下游引物200nmol/L 0.4μL、ROX染料0.4μL，模板2μL；β-actin为内参；
PCR反应条件为，预变性95℃5min，变性96℃10s，退火/延伸60℃30s，共40个循环；
AQP5引物：上游引物为5’-actgggttttctgggtaggg-3’，下游引物为5’-gtggtcagctccatggtctt-3’；
内参引物：上游引物为5’-ggagattactgccctggctccta-3’，下游引物为5’-gactcatcgtactcctgcttgctg-3’；
步骤(7)，数据分析：所得荧光定量PCR结果采用2-ΔΔCt方法进行数据分析，得到该待检测样品烟气对水通道蛋白5细胞mRNA相对表达量。
其中，步骤(2)和步骤(4)消化细胞的时间均为1min。
每个样品检测均重复三次，水通道蛋白5细胞mRNA相对表达量取其平均值。
实施例3
一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，包括如下步骤：
步骤(1)，采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用5mL DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取15支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后采用全自动转盘式吸烟机进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；所述的平衡条件为：温度22℃，湿度60％，时间48h；所述的抽吸的抽吸频率为1口/min，抽吸持续时间为2s，抽吸容量为35/口；
步骤(2)，将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25％胰酶消化后，以3×104个/mL细胞浓度接种于DMEM/F12细胞培养基上，在37℃、5％CO2的条件下培养24h后，加入骨形成蛋白6(BMP6)至终浓度为6ng/ml，处理2.5d；
步骤(3)，用移液枪移去步骤(2)中的培养上清，以步骤(1)得到的仿生抽吸液体稀释6倍后的液体作为培养基继续在37℃、5％CO2的条件下对细胞进行培养24h；
步骤(4)，培养结束后弃上清，用0.25％胰酶消化细胞后，提取细胞总RN A；之后对RNA的纯度进行判定，判定方法是：将待测样品的RNA分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.8～2.1时，表明纯度合格，能进行逆转录，反之，则表明纯度不合格，不能进行逆转录；
步骤(5)，采用步骤(4)得到的RNA作为模板进行逆转录PCR合成cD NA；
步骤(6)，采用步骤(5)中的cDNA作为模板进行荧光定量PCR分析，采用SYBR Green法操作进行荧光定量PCR实验；
PCR反应体系共20μL，其中，2×Mix 10μL、ddH2O 6.8μL、上游引物200nmol/L 0.4μL、下游引物200nmol/L 0.4μL、ROX染料0.4μL，模板2μL；β-actin为内参；
PCR反应条件为，预变性95℃5min，变性96℃10s，退火/延伸60℃30s，共40个循环；
AQP5引物：上游引物为5’-actgggttttctgggtaggg-3’，下游引物为5’-gtggtcagctccatggtctt-3’；
内参引物：上游引物为5’-ggagattactgccctggctccta-3’，下游引物为5’-gactcatcgtactcctgcttgctg-3’；
步骤(7)，数据分析：所得荧光定量PCR结果采用2-ΔΔCt方法进行数据分析，得到该待检测样品烟气对水通道蛋白5细胞mRNA相对表达量。
其中，培养均在96孔培养板中进行，步骤(2)和步骤(4)消化细胞的时间均为2min。
每个样品检测均重复三次，水通道蛋白5细胞mRNA相对表达量取其平均值。
实施例4
实施例4与实施例3的区别在于：步骤(2)和步骤(4)消化细胞的时间均为1.2min，其余皆相同。
应用实例
随机挑选市售的5种卷烟进行检测，采用实施例3所述的方法，对这4种卷烟检测时，提取到的RNA需要用超微量核酸蛋白测定仪测定RNA浓度，之后用超纯水所有的RNA浓度调成一致。AQP-5mRNA相对表达量结果如表1所示。
表1：5种不同牌号卷烟的荧光定量PCR分析结果
由表1可以看出，5种卷烟对SACC-83细胞的mRNA表达量有所差异。
之后采用人工感官评吸方法对5种卷烟的生津感进行打分，结果如表2所示。
表2：5种不同牌号卷烟的生津感打分
表2是5种卷烟的人工感官评吸打分，将表2的结果和表1的结果采用SP SS16.0软件进行相关性分析，两者存在显著相关(p<0.05)，表明采用本方法测出的样品对水通道蛋白5mRNA表达量影响与人工评吸的生津感存在显著的相关性，本方法可作为感官评吸的有力补充。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID NO.1
actgggtttt ctgggtaggg 20
SEQ ID NO.2；
gtggtcagct ccatggtctt 20
SEQ ID NO.3
ggagattact gccctggctc cta 23
SEQ ID NO.4
gactcatcgt actcctgctt gctg 24
序列表
<110> 云南中烟工业有限责任公司
<120> 一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
actgggtttt ctgggtaggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gtggtcagct ccatggtctt 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ggagattact gccctggctc cta 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gactcatcgt actcctgctt gctg 24
Claims (9)
1.一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），采用用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10-20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；
步骤（2），将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25%胰酶消化后，以2×104个/mL -4×104个/mL细胞浓度接种于DMEM/F12细胞培养基上，在37℃、5%CO2的条件下培养22-26h后，加入骨形成蛋白6至终浓度为6ng/ml，处理2-3d；
步骤（3），移去步骤（2）中的培养上清，以步骤（1）得到的仿生抽吸液体稀释4-8倍后的液体作为培养基继续在37℃、5%CO2的条件下对细胞进行培养22-26h；
步骤（4），培养结束后弃上清，用0.25%胰酶消化细胞后，提取细胞总RNA；
步骤（5），采用步骤（4）得到的RNA作为模板进行逆转录PCR合成cDNA；
步骤（6），采用步骤（5）中的cDNA作为模板进行荧光定量PCR分析，采用SYBR Green法操作进行荧光定量PCR实验；
PCR反应体系共20μL，其中，2×Mix 10μL、ddH2O 6.8μL、上游引物200nmol/L 0.4μL、下游引物200 nmol/L 0.4μL、ROX染料0.4μL，模板2μL；β-actin为内参；
PCR反应条件为，预变性95℃ 5min，变性96℃ 10s，退火／延伸60℃ 30s，共40个循环；
AQP5引物：上游引物为5’-actgggttttctgggtaggg-3’，下游引物为5’-gtggtcagctccatggtctt-3’；
内参引物：上游引物为5’-ggagattactgccctggctccta -3’，下游引物为5’-gactcatcgtactcctgcttgctg-3’；
步骤（7），数据分析：所得荧光定量PCR结果采用2-ΔΔCt方法进行数据分析，得到该待检测样品烟气对水通道蛋白5细胞mRNA相对表达量；
所述的用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置包括用于烟气暴露吸收的瓶体、烟气捕集器和真空泵；所述瓶体的内壁设置模拟人工口腔黏膜内壁并浸润有人工唾液，其下部设置有连通瓶体的烟气进气管，上部设置有连通瓶体的大气连接管及烟气排出管；所述烟气进气管用于卷烟的夹持，且其上设置有第一阀门；所述大气连接管上设置有第二阀门；所述烟气排出管上设置有第三阀门，并通过管道依次连接烟气捕集器和真空泵。
2.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述的平衡条件为：温度22±1℃，湿度60±2%，时间48h。
3.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述的抽吸采用全自动转盘式吸烟机。
4.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述的抽吸的抽吸频率为1口/min，抽吸持续时间为2s，抽吸容量为35mL±0.15mL/口。
5.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，浸润模拟人工口腔黏膜内壁所用的DMEM/F12细胞培养基的量为5mL。
6.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，培养均在培养板中进行。
7.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（4）消化细胞的时间均为1-2min。
8.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，在进行逆转录前需要对RNA的纯度进行判定，判定方法是：将待测样品的RNA分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.8~2.1时，表明纯度合格，能进行逆转录，反之，则表明纯度不合格，不能进行逆转录。
9.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，每个样品检测均重复三次，水通道蛋白5细胞mRNA相对表达量取其平均值。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Aquaporin 5 regulates cigarette smoke induced emphysema by modulating barrier and immune properties of the epithelium;Neil R. Aggarwal， et al.;《Tissue Barriers》;20130603;第1卷(第4期);第e25248篇，第1页摘要 * |
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