CN107574162A - 一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于土壤修复的，受控造孔联合表面碱化改性的生物炭基缓释营养基固定化菌剂制备方法，利用生物炭材料，通过对生物质材料干燥粉碎、热解和冷却、酸化和碱化步骤，再经生物炭内部孔道受控刻蚀步骤处理，确保制备的生物炭内孔道结构有利于微生物的生长、代谢，再将生物炭表面经氢氧化钾改性后，用缓释膜原溶液浸泡20‑30min，晾干，形成缓释膜层，用于炭基固定化微生物菌剂的制备。本发明中生物炭具有良好的物理性状，微孔数量多，且多为微小介孔，孔道结构清晰，比表面积增大，通过缓慢释放，持续为微生物的降解过程提供营养元素，降低营养物质随着降水过程的流失，同时促进微生物有效挂膜，提高了污染物的微生物降解效率。
Description
技术领域
本发明属于环境修复技术领域和微生物固定领域，尤其涉及一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，利用生物炭受控造孔联合表面改性制备缓释固定化菌剂，应用于修复石油类污染土壤。
背景技术
石油是数百种化合物组成的复合体，对动植物及人类生存均会产生不同程度的不良影响，尤其是石油中含有的多环芳烃等污染物具有“三致”效应，具有较高的生态风险，对人类健康具有潜在的威胁，在石油的勘探、开发过程中，部分石油会泄漏到环境中，污染土壤。目前，油气污染土壤的修复方法主要有：萃取、淋洗、堆肥、植物修复、微生物修复等。微生物修复是指利用天然存在的或所培养的功能微生物群，在适宜环境条件下，促进或强化微生物代谢功能，从而达到降低有毒污染物活性或降解成无毒物质的生物修复技术。与物理化学修复相比，微生物修复具有高效率、低成本、非破坏、绿色化、适用广等特点，已成为污染土壤生物修复技术的研究热点。
固定化技术作为一项起步较晚的新技术，由于其微生物密度高、反应迅速、微生物流失少、产物易分离和反应过程易控制等优点，发展迅速。目前，大部分用于固定化技术的载体是海藻酸钠、壳聚糖和凹凸棒土等，主要利用了固定化载体孔隙率高，比表面积大的特点，但是并没有考虑载体的孔隙结构、载体的表面理化特性是否有利于微生物的固定化，同时，传统的固定化载体并没有考虑营养物质是否有利于微生物的持续代谢。
传统的土壤生物修复中，需要人为投加营养物质，投加的营养物质在下雨过程中，会随着雨水溶出，并通过地表径流进入地表水环境，一方面造成土壤中营养物的流失，浪费了营养物，另一方面会导致地表水中的富营养化。也存在着修复过程中微生物固定化效果较差，固定化微生物在代谢过程中营养物不足等缺陷的技术问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种生物炭受控造孔联合表面改性的缓释营养基固定化菌剂的制备方法，以生物质，如秸秆、玉米芯为原料，内部孔道受控刻蚀、表面碱化改性及缓释营养层膜为一体，通过生物炭受控造孔联合表面改性，形成有利于微生物固定化的条件，降低土壤中污染物对于微生物的抑制，同时通过缓释营养基层的构建，为固定化的微生物代谢提供了充分的营养物质，进一步提升了微生物菌剂的代谢活性，提高了固定化菌剂在土壤修复中的作用；为农业废弃物资源化利用提供一条有效途径，用于石油类污染土壤生物修复，通过固定化的微生物菌剂，可以有效的降低石油类污染物的含量，实现石油类污染土壤的生物修复。
解决以上技术问题的本发明的一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，包括生物质材料，其特征在于：通过对生物质材料干燥粉碎、热解和冷却、酸化和碱化步骤，再经生物炭内部孔道受控刻蚀步骤处理，确保制备的生物炭内孔道结构有利于微生物的生长、代谢，再将生物炭表面经碱性溶液改性后，用缓释膜原溶液浸泡20-30min，晾干，形成缓释膜层，用于炭基固定化微生物菌剂的制备。
所述生物质材料木质素含量15~20%，总纤维素含量65%~70%，碱性溶液为2~4%的的氢氧化钾溶液。
所述生物炭内部孔道受控刻蚀步骤处理后生物炭孔径为15~20um。
本发明中的基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)干燥粉碎：将生物质材料55-65℃烘干10-14h，粉碎；
(2)热解冷却：取粉碎后的原料以10-15℃/min升温到400-500℃，热解3-4h，加热过程中氧气体积浓度为10~12%（v/v）（体积百分比浓度，以下相同），冷却、研磨；
(3)酸化：冷却后的生物炭原料于硝酸、氢氟酸和磷酸混合酸中浸泡3~4h，过滤；
(4)碱化：过滤物放入过氧化氢溶液中浸泡30~60min，pH=3~4，静置、沉淀，生物炭原料含水率8~10%；
(5) 生物炭内部孔道受控刻蚀：将(4)制得的生物炭原料置于加热炉中进行生物炭内部孔道受控刻蚀；
(6)表面改性处理：将(5)中的生物炭原料于氢氧化钾浸泡、澄清后去除上清液，生物炭原料含水率8~15%；以20-25℃/min速率升温到500~550℃，控制加热炉中气压1.1~1.2个大气压，氧气含量1%~2%（v/v），再以20~30℃/min速率冷却到室温，冷却过程中氧气含量0.1%~0.5%（v/v）；
(7)干燥后制膜：烘干后以20-25℃/min速率升温到400-500℃，加热时间3-4h，冷却、干燥；再按1:1~3的质量比例将生物炭原料放入缓释膜制备溶液中，浸泡20~30min，沉淀后、晾干；
(8) 固化：按1:100的质量比例，将制膜后的生物炭加入到微生物液体培养基中，以5-10%接种量接入接种菌，置于摇床中固定18-20h；将下层固体转入离心管中，6000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85%生理盐水洗涤下层固体后离心5min，重复洗涤三次，离心所得固体物质即为固定化菌剂。
所述硝酸、氢氟酸、磷酸、过氧化氢溶液和氢氧化钾为体积百分比浓度为1%~2%（v/v）的硝酸、0.5%~1%（v/v）的氢氟酸和10%~15%（v/v）的磷酸混合酸，8~10%（v/v）的过氧化氢溶液，2~4%（v/v）的氢氧化钾；所述步骤（8）中接入活化16-18h后的接种菌。
所述生物炭载体内孔道受控刻蚀步骤在有氧过程中反应，具体如下：
（1）预加热：以10-15℃/min速率升温到100~120℃，控制加热炉中气压1.1~1.2个大气压，温度达到100~120℃后，加热5~10min；
（2）预加热完成后，以速率30-35℃/min升温到700~750℃，控制加热炉中气压1.2~1.5个大气压，氧气含量1%~2% ，加热3~4h；
（3）以20~30℃/min速率冷却到室温。
所述步骤（1）和步骤（2）中氧气体积百分含量1%~2%（v/v），所述步骤（3）冷却过程中氧气体积百分含量0.1%~0.5%（v/v）。
所述步骤（7）中缓释膜制备溶液，即向水中加入碳酸氢铵，使碳酸氢铵浓度为25%~30%，再加入琼脂糖浓度为0.08%-0.1%，调节水中无机盐浓度，K2HPO4∙3H2O 2.266 g/L，KH2PO4 0.68 g/L，MgSO4∙7H2O 0.1 g/L，FeSO4∙7H2O 0.03 g/L，MnSO4∙H2O 0.03 g/L，CaCl20.0151 g/L，NH4Cl 1.325 g/L，即可。
所述步骤（8）中微生物液体培养基为所述微生物液体培养基为将蔗糖10 g、牛肉膏6 g、酵母粉1.5 g和1000 m L蒸馏水混合均匀，调节培养基中无机盐浓度为K2HPO4∙3H2O2.266 g/L，KH2PO4 0.68 g/L，MgSO4∙7H2O 0.1 g/L，FeSO4∙7H2O 0.03 g/L，MnSO4∙H2O 0.03g/L，CaCl2 0.0151 g/L，NH4Cl 1.325 g/L，再用NaOH或盐酸调节pH，温度121 ℃灭菌20 min即可。
所述pH 7.0~7.4。
本发明固定化微生物技术将游离的微生物细胞限制在载体孔隙内生长、代谢，能够保持较高的菌群密度及微生物活性的技术，使其在土壤中的停留时间较长、能较好地适应pH值过高或过低以及毒性过大的环境等。因此确保良好的微生物活性，是对污染土壤进行生物修复的关键。
一般认为较大的孔隙率的微生物载体能实现高固定化效率，但本发明中对于生物炭微生物固定化技术而言，炭基载体内的孔道结构和表面特性是影响微生物固定化的关键，合适的载体内的孔径和较长的孔道有利于微生物附着在生物炭基载体上，固定化生物炭载体需要确保合适的孔径。孔径过大，增大污染物对微生物的胁迫；孔径过小，微生物不能进入载体孔道，固定效率差，导致制备的固定化微生物菌剂中活性微生物量较少。本发明通过对基材的选择和工艺条件优化实现了生物炭基载体内部孔道的受控刻蚀，确保制备的生物炭基载体的高生物活性。
本发明通过构建缓释膜，将营养物质封闭在生物炭载体内，使营养物缓慢释放并为生物代谢所利用，提高了营养物的利用效率和微生物的代谢活性，并且避免了营养物的随着雨水流失，造成当地水环境的污染。
本发明中，步骤1确定了生物炭基材原理的组分，木质素含量15~20%，总纤维素含量65%~70%。木质素质量分数是生物炭比表面积的主要影响因素，较高的木质素质量分数越高，孔隙率越小，所制得的生物炭比表面积越小，本发明中，针对秸秆、玉米芯等农业废弃物的组分分析表明，其木质素含量较低，有利于后期制备较高孔隙率的生物炭，同时原料的来源较为广泛，可以实现农业废物的资源化。
步骤2主要实现生物炭载体，在400-500℃下对生物质原料进行高温缺氧热解3-4h，升温速率设置为10-12℃/min，生物炭基载体内部空隙初步制备，但在工艺条件优化方面，在较低的温度和较低的氧气含量条件下，可以实现生物炭表面微孔的大量生成，当又避免了热解速率的过快，形成过大、过浅的孔道，导致后期固定化效率较差。
步骤3主要针对本发明中采用的秸秆、玉米芯等农业废物中无机物含量较高的材料，采用硝酸、氢氟酸和磷酸混合酸进行酸化，可有效地将原料中的部分不溶物溶出，进一步提高生物炭内部的空隙率，同时加入的磷酸可以作为后续微生物代谢过程中重要的营养元素，提高了后续固定化微生物的降解效率。
本发明通过控制热化学刻蚀过程中，氧的含量和分布，以及热化学过程中温度控制，创新载体内的合适的孔径和较长的孔道受控刻蚀技术。本发明将经过初步热解的炭基材料载体浸没于过氧化氢溶液中，让过氧化氢溶液渗透到载体的微孔内，通过pH调节，使过氧化氢保持稳定。经过氧化氢处理后的载体通过预热，使载体孔道中的过氧化氢分解，生成氧气，通过优化加热炉中气压和氧气量，确保生成的氧气保留在孔道内。预热完成后，然后快速升温，实现生物炭载体内部孔道的受控刻蚀，其关键控制条件包括：首先，控制加热炉中的氧气浓度，通过工艺条件优化，加热炉中氧气浓度为1%~2%（v/v），防止由于加热炉中的氧气含量过高导致载体孔径过大，通过控制步骤4中过氧化氢溶液浓度、浸泡时间，以及沉淀后生物炭原料含水率，确保载体孔道内过氧化氢生成的氧气浓度，并通过优化加热炉中的气压和氧气浓度，延缓载体空隙内生成的氧气逸出到加热炉中，实现炭基载体内空隙的生成主要由孔道内生成的氧气反应，确保载体内孔道向内部扩展，增加孔道长度；其次，对于刻蚀温度的调节，可以实现生物炭载体孔径和孔道长度的控制，低温时生物炭的孔隙数量少，所吸附的微生物数量和石油量少；随着温度升高，生物炭表面的粗糙程度增加，孔隙数量增多，吸附的微生物数量和石油量增加，但是，热解温度过高会使生物炭的孔隙堵塞，阻碍氧气和营养元素等的传质作用，遏制固定化菌剂的降解性能，通过工艺条件优化，升温速率到30-35℃/min，升温到700~750℃，实现孔径为15~20um，为微生物进入孔道内部，并固定化奠定基础，同时也为后续营养物缓释膜的覆膜过程留下了空间。
再采用氢氧化钾试剂对其进行碱化改性，通过优化改性过程中氢氧化钾溶液浓度及反应条件，并在500~550℃条件下实现热化学反应，因氢氧化钾的熔点是380℃，此时的氢氧化钠处于熔融状态，能够有效与生物炭基材料反应，增加载体表面的羟基、羧基等疏水基团增加，材料表面疏水性能增加，保证微生物固定过程中，有效挂膜，且能有效吸附石油污染物，从而增大了石油降解菌与石油烃类污染底物的接触几率，同时氢氧化钾的在热化学过程中会生成碳酸钾，并吸附在生物炭的空隙内部，被营养物缓释膜的覆盖后，能够缓慢释放，为微生物提供生长代谢所必须的钾元素。
在通过受控造孔联合表面改性制备的生物炭空隙内进行表面覆膜，形成缓释膜层，可以有效地将营养物质封闭在生物炭载体内，使营养物缓慢释放并为生物代谢所利用，提高了营养物的利用效率和微生物的代谢活性，并且避免了营养物的随着雨水流失，造成当地水环境的污染。以碳酸氢铵的琼脂糖水溶液，并加入微量营养元素，K2HPO4∙3H2O 2.266g/L，KH2PO4 0.68 g/L，MgSO4∙7H2O 0.1 g/L，FeSO4∙7H2O 0.03 g/L，MnSO4∙H2O 0.03 g/L，CaCl2 0.0151 g/L，NH4Cl 1.325 g/L等无机盐作为缓释膜原溶液，琼脂糖浓度为0.08%-0.1%，碳酸氢铵浓度为25%~30%，对碱化后的生物炭基载体进行覆膜，晾干后，在生物炭基表面形成薄膜，能有效地降低生物炭表面吸附的氮、磷、钾以及各种微量元素的释放，为固定化微生物提供长期、稳定的营养来源，促进微生物生长代谢。
步骤8中，将其与无机培养基及具有石油类降解功能的微生物菌种进行固定化，制备高效固定化微生物菌剂。
经高温碱化后的生物炭基载体，无毒且为微生物生长提供了足够的营养物质，并为微生物的生长提供了有利的生长条件，同时降解菌分泌的酶能渗入到生物炭孔道中，与孔内吸附的污染物作用，加速石油污染物的降解。经高温碱化改性后的生物炭基载体具有良好的物理性状，微孔数量增多，孔道结构清晰，孔径适宜于微生物的固定化，比表面积增大，能有效保护孔道内部石油降解菌，为石油降解菌提供较长保护时间。制备的炭基载体通过氢氧化钠改性后，增加载体表面的羟基、羧基等疏水基团增加，材料表面疏水性能增加，保证微生物固定过程中，有效挂膜
通过对生物炭材料空隙内覆盖营养物缓释膜，能有效将氮、磷、钾等营养物封闭在生物炭载体内，通过缓慢释放，持续为微生物的降解过程提供营养元素。使微生物在土壤中积累足够的生物活性，避免因外界环境及土壤微生物竞争，导致石油降解菌数量减少。
本发明以生物炭为材料，如秸秆、玉米芯为原料制备所得，通过对生物炭内部孔道的受控刻蚀，确保制备的生物炭内孔道结构有利于微生物的生长、代谢，经生物炭表面改性后，再在表面覆膜，构建生物炭孔道缓释营养层，固定石油降解菌后，形成一种基于生物炭受控造孔联合表面改性的缓释营养基固定化菌剂。制备的生物炭受控造孔联合表面改性的缓释营养基固定化菌剂具有良好的促进微生物代谢的性能，可用于石油烃类污染土壤修复和农业废弃物处理。本发明具有材料来源广泛、修复效果好、有利于农业废弃物处理，且可用于石油污染土壤修复使用等优点。
本发明中制得的固定化生物菌剂与污染物土壤按1:100~1:200(w/w)混合，经过10~30d的降解，能实现土壤中石油类污染物80~90%的降解效率。
附图说明
图1为本发明中工艺流图
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明做更进一步详细说明：
实施例1
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明进行进一步说明：
本实施例是针对四川长宁页岩气井场石油烃类污染土壤开展的生物炭基缓释固定化生物修复菌剂的制备。
（1）利用玉米芯为原料，木质素含量15%，总纤维素含量70%。将玉米芯依次用自来水和纯净水洗净，60℃烘干12h，将干燥后的原料粉碎，过20目筛。
（2）取粉碎后的原料，置于加热炉中，以10℃/min升温速率升温到 400℃，热解3h，加热过程中氧气浓度控制在10%（v/v），冷却取出后，研磨，过200目筛。
（3）冷却后的生物炭原料，置于1%（v/v）的硝酸、0.5%（v/v）的氢氟酸和10%（v/v）磷酸混合酸中，浸泡3h，沉淀后，去除上层残酸液。
（4）将去除酸液后的生物炭原料放入8%过氧化氢溶液中，浸泡30min，pH控制在3，静置、沉淀，去除过氧化氢上清液，确保生物炭原料含水率8%。
（5）过氧化氢浸泡后的玉米芯生物炭基材料置于加热炉中进行生物炭内部孔道受控刻蚀造孔，以10℃/min升温速率升温到100℃，控制加热炉中气压1.1个大气压，氧气含量1%（v/v），温度达到100℃后，加热5min。预加热完成后，提高升温速率到30℃/min，升温到700℃，控制加热炉中气压1.2个大气压，氧气含量1%（v/v），加热3h。再以20℃/min的降温速率冷却到室温，冷却过程中，氧气含量0.1%（v/v）。
（6）将定向受控刻蚀后制得的生物炭中间产物与2%（v/v）的氢氧化钾浸泡，澄清后，以20℃/min升温速率升温到500℃，控制加热炉中气压1.1个大气压，氧气含量1%（v/v），以20℃/min的降温速率冷却到室温，冷却过程中，氧气含量0.1%（v/v）。再将生物炭原料至于120℃烘箱中烘干，置于加热炉中，以20℃/min升温速率升温到400℃，加热3h，冷却，干燥保存待用。
（7）将碳酸氢铵加入到含0.08%琼脂的水溶液中，使溶液中碳酸氢铵浓度为25%，调节水中无机盐浓度，K2HPO4∙3H2O 2.266 g/L，KH2PO4 0.68 g/L，MgSO4∙7H2O 0.1 g/L，FeSO4∙7H2O 0.03 g/L，MnSO4∙H2O 0.03 g/L，CaCl2 0.0151 g/L，NH4Cl 1.325 g/L，制备缓释膜原溶液。将制备的生物炭载体按1：1放入缓释膜制备溶液中，浸泡20min，沉淀后，自然晾干。
（8）取已覆膜的生物炭原料，按质量比1:100的比例，加入到微生物液体培养基中，121℃灭菌20min，以5%接种量接入活化16h后的接种菌Pseudomonas putida (中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号10368)，置于温度为35℃、转速为130 r/min的摇床中固定18h。倒掉上层培养基，将下层固体转入离心管中，在6000 r/min离心10min，弃去上清液。用0.85%生理盐水洗涤下层固体后，离心5min，重复洗涤三次，离心所得固体物质即为固定化菌剂。
微生物液体培养基的配方为：蔗糖10 g、牛肉膏6 g、酵母粉1.5 g和1000 m L蒸馏水混合均匀，调节培养基中无机盐浓度，K2HPO4∙3H2O 2.266 g/L，KH2PO4 0.68 g/L，MgSO4∙7H2O 0.1 g/L，FeSO4∙7H2O 0.03 g/L，MnSO4∙H2O 0.03 g/L，CaCl2 0.0151 g/L，NH4Cl1.325 g/L，以pH试纸为指示，用NaOH或盐酸调节pH 7.3，121 ℃灭菌20 min。
生物炭内部孔道受控刻蚀步骤处理后生物炭孔径为15~20um，玉米芯生物炭缓释营养基固定化生物菌剂与污染物土壤按1:100 (w/w)混合，经过10d的降解，能实现土壤中石油类污染物达80%的降解效率。
实施例2
本实施例是针对长庆油田石油烃类污染土壤开展的生物炭基缓释固定化生物修复菌剂的制备。
（1）利用秸秆为原料，木质素含量20%，总纤维素含量65%。将秸秆依次用自来水和纯净水洗净，65℃烘干10h，将干燥后的原料粉碎，过20目筛。
（2）取粉碎后的原料，置于加热炉中，以15℃/min升温速率升温到 500℃，热解4h，加热过程中氧气浓度控制在12%（v/v），冷却取出后，研磨，过200目筛。
（3）考虑到秸秆生长、收集中，与无机物接触频率较高，原料中无机物较高，需要更高的酸浓度和更长的时间进行酸解。冷却后的生物炭原料，置于2%（v/v）的硝酸、1%（v/v）的氢氟酸和15%（v/v）磷酸混合酸中，浸泡4h，沉淀后，去除上层残酸液。
（4）将去除酸液后的秸秆生物炭原料放入10%过氧化氢溶液中，浸泡60min，pH控制在4，静置、沉淀，去除过氧化氢上清液，确保生物炭原料含水率10%。
（5）过氧化氢浸泡后的秸秆生物炭基材料置于加热炉中进行生物炭内部孔道受控刻蚀造孔，以15℃/min升温速率升温到120℃，控制加热炉中气压1.2个大气压，氧气含量2%（v/v），温度达到120℃后，加热10min。预加热完成后，提高升温速率到35℃/min，升温到750℃，控制加热炉中气压1.5个大气压，氧气含量2%（v/v），加热4h。再以30℃/min的降温速率冷却到室温，冷却过程中，氧气含量0.5%（v/v）。
（6）将定向刻蚀后制得的秸秆生物炭中间产物与4%（v/v）的氢氧化钾浸泡，澄清后，以25℃/min升温速率升温到550℃，控制加热炉中气压1.2个大气压，氧气含量2%（v/v），以30℃/min的降温速率冷却到室温，冷却过程中，氧气含量0.5%（v/v）。
（7）再将生物炭原料至于120℃烘箱中烘干，置于加热炉中，以25℃/min升温速率升温到500℃，加热4h，冷却，干燥保存待用。
将碳酸氢铵加入到含0.1%琼脂的水溶液中，使溶液中碳酸氢铵浓度为30%，调节水中无机盐浓度，K2HPO4∙3H2O 2.266 g/L，KH2PO4 0.68 g/L，MgSO4∙7H2O 0.1 g/L，FeSO4∙7H2O 0.03 g/L，MnSO4∙H2O 0.03 g/L，CaCl2 0.0151 g/L，NH4Cl 1.325 g/L，制备缓释膜原溶液。将制备的生物炭载体按1:3放入缓释膜制备溶液中，浸泡30min，沉淀后，自然晾干。
（8）取已覆膜的生物炭原料，按质量比1:100的比例，加入到微生物液体培养基中，以10%接种量接入活化18h后的接种菌Micrococcus sp. (中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号10708)，置于温度为35℃、转速为130 r•min-1的摇床中固定20h。倒掉上层培养基，将下层固体转入离心管中，在6000 r/min离心10min，弃去上清液。用0.85%生理盐水洗涤下层固体后，离心5min，重复洗涤三次，离心所得固体物质即为固定化菌剂。
微生物液体培养基的配方为：蔗糖10 g、牛肉膏6 g、酵母粉1.5 g和1000 m L蒸馏水混合均匀，调节培养基中无机盐浓度，K2HPO4∙3H2O 2.266 g/L，KH2PO4 0.68 g/L，MgSO4∙7H2O 0.1 g/L，FeSO4∙7H2O 0.03 g/L，MnSO4∙H2O 0.03 g/L，CaCl2 0.0151 g/L，NH4Cl1.325 g/L，以pH试纸为指示，用NaOH或盐酸调节pH 7.4，121 ℃灭菌20 min。
生物炭内部孔道受控刻蚀步骤处理后生物炭孔径为15~20um，秸秆生物炭缓释营养基固定化生物菌剂与污染物土壤按1:200(w/w)混合，经过30d的降解，能实现土壤中石油类污染物达90%的降解效率。
实施例3
本实施例是针对长庆油田石油烃类污染土壤开展的生物炭基缓释固定化生物修复菌剂的制备。
（1）利用秸秆为原料，木质素含量18%，总纤维素含量68%。将秸秆依次用自来水和纯净水洗净，55℃烘干14h，将干燥后的原料粉碎，过20目筛。
（2）取粉碎后的原料，置于加热炉中，以12℃/min升温速率升温到 450℃，热解3.5h，加热过程中氧气浓度控制在11%（v/v），冷却取出后，研磨，过200目筛。
（3）冷却后的生物炭原料，置于1.5%（v/v）的硝酸、0.8%（v/v）的氢氟酸和13%（v/v）磷酸混合酸中，浸泡4h，沉淀后，去除上层残酸液。
（4）将去除酸液后的秸秆生物炭原料放入10%过氧化氢溶液中，浸泡45min，pH控制在3.5，静置、沉淀，去除过氧化氢上清液，确保生物炭原料含水率9%。
（5）过氧化氢浸泡后的秸秆生物炭基材料置于加热炉中进行生物炭内部孔道受控刻蚀造孔，以13℃/min升温速率升温到110℃，控制加热炉中气压1.15个大气压，氧气含量1.5%（v/v），温度达到110℃后，加热8min。预加热完成后，提高升温速率到32℃/min，升温到720℃，控制加热炉中气压1.3个大气压，氧气含量1.5%（v/v），加热4h。再以30℃/min的降温速率冷却到室温，冷却过程中，氧气含量0.4%（v/v）。
（6）将定向刻蚀后制得的秸秆生物炭中间产物与3%（v/v）的氢氧化钾浸泡，澄清后，以22℃/min升温速率升温到520℃，控制加热炉中气压1.1个大气压，氧气含量1.5%（v/v），以25℃/min的降温速率冷却到室温，冷却过程中，氧气含量0.3%（v/v）。
（7）再将生物炭原料至于130℃烘箱中烘干，置于加热炉中，以22℃/min升温速率升温到450℃，加热3.5h，冷却，干燥保存待用。
将碳酸氢铵加入到含0.09%琼脂的水溶液中，使溶液中碳酸氢铵浓度为30%，调节水中无机盐浓度，K2HPO4∙3H2O 2.266 g/L，KH2PO4 0.68 g/L，MgSO4∙7H2O 0.1 g/L，FeSO4∙7H2O 0.03 g/L，MnSO4∙H2O 0.03 g/L，CaCl2 0.0151 g/L，NH4Cl 1.325 g/L，制备缓释膜原溶液。将制备的生物炭载体按1:2放入缓释膜制备溶液中，浸泡25min，沉淀后，自然晾干。
（8）取已覆膜的生物炭原料，按质量比1:100的比例，加入到微生物液体培养基中，以8%接种量接入活化17h后的接种菌Micrococcus sp. (中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号10708)，置于温度为35℃、转速为130 r•min-1的摇床中固定20h。倒掉上层培养基，将下层固体转入离心管中，在6000 r/min离心10min，弃去上清液。用0.85%生理盐水洗涤下层固体后，离心5min，重复洗涤三次，离心所得固体物质即为固定化菌剂。
微生物液体培养基的配方为：蔗糖10 g、牛肉膏6 g、酵母粉1.5 g和1000 m L蒸馏水混合均匀，调节培养基中无机盐浓度，K2HPO4∙3H2O 2.266 g/L，KH2PO4 0.68 g/L，MgSO4∙7H2O 0.1 g/L，FeSO4∙7H2O 0.03 g/L，MnSO4∙H2O 0.03 g/L，CaCl2 0.0151 g/L，NH4Cl1.325 g/L，以pH试纸为指示，用NaOH或盐酸调节pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。
生物炭内部孔道受控刻蚀步骤处理后生物炭孔径为15~20um，秸秆生物炭缓释营养基固定化生物菌剂与污染物土壤按1:200(w/w)混合，经过30d的降解，能实现土壤中石油类污染物达89%的降解效率。
本发明基于生物炭受控造孔联合表面改性的缓释营养基固定化菌剂制备方法本发明公开了一种用于土壤修复的，受控造孔联合表面碱化改性的生物炭基缓释营养基固定化菌剂制备方法。利用生物炭材料，如玉米芯、秸秆为原料，400-500℃，热解3-4h，然后利用1%~2%（v/v）的硝酸0.5%~1%（v/v）氢氟酸和10%~15%磷酸（v/v）混合酸，浸泡3~4h，去除原料中的无机组分并吸附营养物质磷。将生物炭原料用过氧化氢浸泡后，利用加热炉通过控制升温速率、反应温度、加热炉气压、加热炉中氧气含量以及反应时间进行生物炭内部孔道受控刻蚀造孔，造孔后的炭基载体用氢氧化钾进行表面碱化改性并吸附营养物质钾，在碳酸氢铵、琼脂糖和无机盐形成的缓释膜原溶液中浸泡20-30min，自然晾干，形成缓释膜层，并在缓释膜层上制备固定化生物膜，实现微生物的固定化。本发明为制备的生物炭具有良好的物理性状，微孔数量多，且多为微小介孔，孔道结构清晰，比表面积增大，其表面的羟基、羧基等疏水基团增加，材料表面疏水性能增加，形成缓释膜能有效将氮、磷、钾等营养物封闭在生物炭载体内，通过缓慢释放，持续为微生物的降解过程提供营养元素，降低营养物质随着降水过程的流失，同时促进微生物有效挂膜，提高了污染物的微生物降解效率。本发明具有材料来源广泛、修复效果好、简便易得，有利于农业废弃物处理，且可用于实际页岩气开场井场污染土壤和石油污染土壤修复使用等优点，为农业废弃物的处理和石油污染土壤的修复提供了一条有效途径。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，包括生物质材料，其特征在于：通过对生物质材料干燥粉碎、热解和冷却、酸化和碱化步骤，再经生物炭内部孔道受控刻蚀步骤处理，确保制备的生物炭内孔道结构有利于微生物的生长、代谢，再将生物炭表面经碱性溶液改性后，用缓释膜原溶液浸泡形成缓释膜层，用于炭基固定化微生物菌剂的制备。
2.如权利要求1所述的一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述生物质材料木质素含量15~20%，总纤维素含量65%~70%，碱性溶液为2~4%的的氢氧化钾溶液。
3.如权利要求1所述的一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述生物炭内部孔道受控刻蚀步骤处理后生物炭孔径为15~20um。
4.如权利要求1所述的一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)干燥粉碎：将生物质材料55-65℃烘干10-14h，粉碎；
(2)热解冷却：取粉碎后的原料以10-15℃/min升温到400-500℃，热解3-4h，加热过程中氧气体积浓度为10~12%，冷却、研磨；
(3)酸化：冷却后的生物炭原料于硝酸、氢氟酸和磷酸混合酸中浸泡3~4h，过滤；
(4)碱化：过滤物放入过氧化氢溶液中浸泡30~60min，pH=3~4，静置、沉淀，生物炭原料含水率8~10%；
(5) 生物炭内部孔道受控刻蚀：将(4)制得的生物炭原料置于加热炉中进行生物炭内部孔道受控刻蚀；
(6)表面改性处理：将(5)中的生物炭原料于氢氧化钾浸泡、澄清，生物炭原料含水率8~15%；以20-25℃/min速率升温到500~550℃，控制加热炉中气压1.1~1.2个大气压，氧气含量1%~2%，再以20~30℃/min速率冷却到室温，冷却过程中氧气含量0.1%~0.5%；
(7)干燥后制膜：烘干后以20-25℃/min速率升温到400-500℃，加热时间3-4h，冷却、干燥；再按1:1~3的质量比例将生物炭原料放入缓释膜制备溶液中，浸泡20~30min，沉淀后、晾干；
(8) 固化：按1:100的质量比例，将制膜后的生物炭加入到微生物液体培养基中，以5-10%接种量接入接种菌，置于摇床中固定、离心、洗涤后再离心，所得固体物质即为固定化菌剂。
5.如权利要求1所述的一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述硝酸、氢氟酸、磷酸、过氧化氢溶液和氢氧化钾为体积百分比浓度为1%~2%的硝酸、0.5%~1%的氢氟酸和10%~15%的磷酸混合酸，8~10%的过氧化氢溶液，2~4%的氢氧化钾；所述步骤（8）中接入活化16-18h后的接种菌。
6.如权利要求1-5中任一项所述的一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，其特征在于：生物炭载体内孔道受控刻蚀步骤在有氧过程中反应，具体如下：
（1）预加热：以10-15℃/min速率升温到100~120℃，控制加热炉中气压1.1~1.2个大气压，温度达到100~120℃后，加热5~10min；
（2）预加热完成后，以速率30-35℃/min升温到700~750℃，控制加热炉中气压1.2~1.5个大气压，加热3~4h；
（3）以20~30℃/min速率冷却到室温。
7.如权利要求6所述的一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）和步骤（2）控制加热中氧气体积百分含量1%~2%，所述步骤（3）冷却过程中氧气体积百分含量0.1%~0.5%。
8.如权利要求4中所述的一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（7）中缓释膜制备溶液，即向水中加入碳酸氢铵，使碳酸氢铵浓度为25%~30%，再加入琼脂糖浓度为0.08%-0.1%，调节水中无机盐浓度，K2HPO4∙3H2O 2.266 g/L，KH2PO4 0.68 g/L，MgSO4∙7H2O 0.1 g/L，FeSO4∙7H2O 0.03 g/L，MnSO4∙H2O 0.03 g/L，CaCl20.0151 g/L，NH4Cl 1.325 g/L，即可。
9.如权利要求4所述的一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（8）中微生物液体培养基为将所述微生物液体培养基为将蔗糖10 g、牛肉膏6g、酵母粉1.5 g和1000 m L蒸馏水混合均匀，调节培养基中无机盐浓度为K2HPO4∙3H2O2.266 g/L，KH2PO4 0.68 g/L，MgSO4∙7H2O 0.1 g/L，FeSO4∙7H2O 0.03 g/L，MnSO4∙H2O 0.03g/L，CaCl2 0.0151 g/L，NH4Cl 1.325 g/L，再用NaOH或盐酸调节pH，温度121 ℃灭菌20 min即可。
10.如权利要求9所述的一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述pH 7.0~7.4。
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