CN107567335A - 支化的和线性的嵌合化合物、多核苷酸、它们的用途和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开涉及包含核酸和非核酸部分的支化的和线性的嵌合化合物、以及多核苷酸。本发明公开还涉及它们用于刺激免疫应答的用途,以及制备所述的支化的嵌合化合物的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年1月23日提交的美国临时申请No.62/107,291的权益,就所有目的而言,该申请以引用方式全文并入本文。
序列表以ASCII文本文件形式提交
以下以ASCII文本文件提交的内容以引用方式全文并入本文:序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称:377882005640SEQLIST.txt,记录日期:2016年1月22日,大小:7KB)。
技术领域
本发明涉及包含核酸和非核酸部分的支化的和线性的嵌合化合物、以及多核苷酸。本发明还涉及这些化合物刺激免疫应答的用途,以及支化的嵌合化合物的制备方法。
背景技术
Toll样受体(TLR)是识别保守的微生物分子的跨膜蛋白质家族,所述的微生物分子被称为病原体相关的分子模式,其不同于宿主的分子。由此,TLR在天然免疫应答中起重要作用。TLR3,TLR7,TLR8,TLR9和TLR13为核酸感测性TLR。
激动剂和拮抗剂在调控免疫应答中具有用途。TLR激动剂通常用于刺激免疫竞答,而TLR拮抗剂通常用于抑制免疫应答(Gosu et al.,Molecules,17:13503-13529,2012)。由多种抗原提呈细胞表达的TLR9识别核酸内非甲基化的CpG二核苷酸。因此,包含非甲基化的CpG二核苷酸的多核苷酸可以通过它们活化TLR9的能力而成为有效的佐剂。此外,包含非核酸部分和含非甲基化-CpG核酸部分的嵌合化合物能够刺激免疫应答。
TLR9激动剂的效力取决于核酸部分的长度,在非甲基化-CpG二核苷酸侧翼的残基,以及抗原提呈细胞吸收的功效(Marshall et al.,核酸s Research,31:5122-5133,2003)。某些支化的嵌合化合物(其中多个多核苷酸或线性嵌合化合物附着在多价的载体部分上,例如多糖)相对于非缀合的多核苷酸或线性的嵌合化合物,激发增强的免疫应答(Marshall et al.,如上所述)。高度支化的亲水性多糖(以by GE Healthcare出售)可以用作支化的嵌合化合物的多价载体部分。然而,在的缀合中使用的传统的连接体部分是疏水性的,其可以导致包含的合成中间体沉淀。这不利地影响用于制造支化的嵌合化合物的工艺、以及随后储存终产物的能力。此外,合成TLR激动剂的治疗用途受到其毒性的影响。
仍需要具有强力的免疫刺激活性的多核苷酸和嵌合化合物。此外,仍需要可以可再生地制造的强力的嵌合化合物。具有可接受的毒性谱的多核苷酸和嵌合化合物是特别理想的。
发明概述
本发明公开涉及包含核酸和非核酸部分的支化的和线性的嵌合化合物,以及多核苷酸。本发明公开还涉及它们刺激免疫应答的用途,以及支化的嵌合化合物的制备方法。
在一个方面中,本发明公开提供了式(I)所示的支化的嵌合化合物:[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F(I),其中:D为多核苷酸或线性的嵌合化合物;L1为包含烷硫基基团的第一连接体;L2为包含琥珀酰亚胺基团的第二连接体;L3为包含酰胺基团的第三连接体;PEG为式-(OCH2CH2)n–,其中n为2至8的整数;x为3至300的整数;以及F为分子量大约100,000至大约700,000道尔顿的蔗糖和表氯醇的支化共聚物,并且通过醚基团与L3连接,其中D的多核苷酸包含核苷酸序列:5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1),其中多核苷酸的长度低于50个核苷酸,并且其中核苷酸之间以及3’-末端核苷酸与L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键;并且其中D的线性的嵌合化合物包含3个核酸部分和2个六乙二醇(HEG)间隔,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2),其中线性的嵌合化合物包含低于50个核苷酸,并且其中核苷酸之间、核苷酸与HEG间隔之间、以及3’-末端核苷酸与L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,x为20-300,90-150,或100-140。在一些实施方案中,L2为在一些实施方案中,L3为在一些实施方案中,其中L3为在一些实施方案中,式-(OCH2CH2)n–的n为6,24,45或70。在一些实施方案中,F的分子量为大约300,000至大约500,000道尔顿。在一些实施方案中,F为PM400(GE Healthcare出售的聚合物)。在一些实施方案中,D为由核苷酸序列5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1)组成的多核苷酸。在一些实施方案中,D为由5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2)组成的线性的嵌合化合物。在一些实施方案中,L1为-(CH2)m-S-,其中m为2至9的整数。在一些实施方案中,x为20至200。在一些实施方案中,x为90至150,n为6,而m为3或6。在一些实施方案中,核苷酸之间所有的键、其中存在于核苷酸和HEG间隔之间的键、以及3’-末端核苷酸与L1之间的键为硫代磷酸酯键。多核苷酸或者线性的嵌合化合物的核酸部分的CpG二核苷酸是非甲基化的。
在另一个方面中,本发明公开提供了分离的多核苷酸,其包含核苷酸序列5’-TCGGCGC AACGTTC-3’(SEQ ID NO:3),其中所述的多核苷酸的长度低于50个核苷酸,并且其中核苷酸之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在相关的方面中,本发明公开提供了分离的多核苷酸,其包含核苷酸序列5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1),其中所述的多核苷酸的长度低于50个核苷酸,并且其中核苷酸之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,多核苷酸由5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列组成。在一些实施方案中,多核苷酸是单链的。在一些实施方案中,多核苷酸是2’-脱氧核糖多核苷酸。在一些实施方案中,所有的键均为硫代磷酸酯键。多核苷酸的CpG二核苷酸是非甲基化的。
在另一个方面中,本发明公开提供了包含2个核酸部分和六乙二醇(HEG)间隔的线性的嵌合化合物,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’(SEQ ID NO:4),其中线性的嵌合化合物包含低于50个核苷酸,并且其中核苷酸之间、以及核苷酸与HEG间隔之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在相关的方面中,本发明公开提供了包含3个核酸部分和2个六乙二醇(HEG)间隔的线性的嵌合化合物,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2),其中线性的嵌合化合物包含低于50个核苷酸,并且其中核苷酸之间的、以及核苷酸与HEG间隔之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,线性的嵌合化合物由5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ IDNO:2)组成。在一些实施方案中,核酸部分为2’-脱氧核糖多核苷酸。在一些实施方案中,所有的键为硫代磷酸酯键。
此外,本发明公开提供了药物组合物,其包含(i)药物可接受的赋形剂;以及(ii)支化的嵌合化合物、多核苷酸和上述发明概述的任一段落中所述的线性的嵌合化合物的一种。在一些实施方案中,支化的嵌合化合物、多核苷酸和线性的嵌合化合物均能够通过哺乳动物白细胞刺激细胞因子的产生,包括以下的一种或多种:通过人类外周血单核细胞刺激IFN-α的产生;通过人类B淋巴细胞刺激IL-6的产生;以及通过小鼠脾细胞刺激IL-12p40和IL-6的一者或二者的产生。在一些实施方案中,支化的嵌合化合物、多核苷酸和线性的嵌合化合物均能够刺激哺乳动物B淋巴细胞的增殖。在一些实施方案中,所述的组合物为无菌溶液。在其他的实施方案中,所述的组合物为无菌冻干的固体。在一些实施方案中,所述的组合物进一步包含与组合物中的支化的嵌合化合物、多核苷酸和线性的嵌合化合物非共价连接的抗原(例如抗原与组合物中的支化的嵌合化合物、多核苷酸和线性的嵌合化合物混合而非缀合)。组合物中存在的支化的嵌合化合物、多核苷酸和线性的嵌合化合物。在一些实施方案中,抗原为微生物抗原、变应原或肿瘤抗原。在一些实施方案中,抗原为分离的或重组的蛋白质。在一些实施方案中,组合物基本上是不含内毒素的。
此外,本发明公开提供了在哺乳动物受试对象中刺激免疫应答的方法,其包括将上文所述的药物组合物以足以刺激哺乳动物受试对象免疫应答的量给予哺乳动物受试对象。在一些实施方案中,刺激免疫应答包括以下的一种或多种:刺激IFN-α产生;刺激IL-6产生;刺激B淋巴细胞增殖;刺激干扰素途径相关的基因表达;刺激化学引诱物相关的基因表达;以及刺激浆细胞样树突状细胞(pDC)成熟。在一些实施方案中,当药物组合物进一步包含抗原时,刺激免疫应答包括诱导抗原特异性抗体应答,其中当所述的抗原与支化的嵌合化合物,多核苷酸或线性的嵌合化合物组合给予时,与当该抗原未与支化的嵌合化合物,多核苷酸或线性的嵌合化合物组合给予时相比,抗原特异性抗体应答的效价较高。在一些实施方案中,当所述的抗原与支化的嵌合化合物组合给予时,与当该抗原与相应的线性的嵌合化合物组合给予时相比,抗原特异性抗体应答的效价较高。
本发明公开提供了在哺乳动物受试对象(例如人类患者)中使用上文所述的药物组合物的多种方法。在一个方面中,提供了在哺乳动物受试对象中诱导抗原特异性抗体应答的方法,其包括将在哺乳动物受试对象中足以诱导抗原特异性抗原应答的量的药物组合物给予哺乳动物受试对象。在一个方面中,提供了在哺乳动物受试对象中预防感染性疾病的方法,其包括将在哺乳动物受试对象中足以预防感染性疾病的量的药物组合物给予哺乳动物受试对象。在一个方面中,提供用于治疗或预防哺乳动物受试对象的感染性疾病的方法,其包括将在哺乳动物受试对象中足以治疗或预防感染性疾病的量的药物组合物给予哺乳动物受试对象。在一个方面中,提供了用于减轻哺乳动物受试对象的感染性疾病的方法,其包括将在哺乳动物受试对象中足以减轻感染性疾病的症状的量的药物组合物给予哺乳动物受试对象。在一个方面中,提供了用于减轻哺乳动物受试对象的IgE相关的紊乱的症状的方法,其包括将在哺乳动物受试对象中足以减轻IgE相关紊乱的症状的量的药物组合物给予哺乳动物受试对象。在一个方面中,提供了用于治疗或预防哺乳动物受试对象的IgE相关的紊乱的方法,其包括将在哺乳动物受试对象中足以治疗或预防IgE相关紊乱的量的药物组合物给予哺乳动物受试对象。在一个方面中,提供了用于哺乳动物受试对象的治疗癌症的方法,其包括将在哺乳动物受试对象中足以治疗癌症的量的药物组合物给予哺乳动物受试对象。在一些实施方案中,治疗癌症包括缩小实体肿瘤的尺寸。在一些实施方案中,治疗癌症包括减少有活力的癌细胞的数量。在一些实施方案中,治疗癌症包括延长癌症患者的生存。在一些实施方案中,癌症为上皮组织癌(例如头和颈部的鳞状细胞癌)。在一些实施方案中,癌症为肉瘤。在一些实施方案中,癌症为黑素瘤。在一些实施方案中,癌症为淋巴瘤。
此外,本发明公开提供了制备式(I)所示的支化的嵌合化合物的方法:[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F(I),其中:D为多核苷酸或线性的嵌合化合物;L1为包含烷硫基基团的第一连接体;L2为包含琥珀酰亚胺基团的第二连接体;L3为包含酰胺基团的第三连接体;PEG为聚乙二醇;x为3至300的整数;以及F为分子量大约100,000至大约700,000道尔顿的蔗糖和表氯醇的支化共聚物,并且通过醚基团与L3连接,其中多核苷酸包含核苷酸序列:5’-TCGGCGCAACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1),其中多核苷酸的长度低于50个核苷酸,并且其中核苷酸之间以及3’-末端核苷酸与L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键;并且其中线性的嵌合化合物包含3个核酸部分和2个六乙二醇(HEG)间隔,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2),其中线性的嵌合化合物包含低于50个核苷酸,并且其中核苷酸之间、核苷酸与HEG间隔之间、以及3’-末端核苷酸与L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键,其中所述的方法包括:式D-L1a-SH所示的化合物(其中D如式(I)所定义,并且L1a为(CH2)m,其中m为2至9的整数)与式(II):[L2a-(PEG)-L3]y-F(II)所示的化合物(其中L3,PEG和F如式(I)所定义,L2a为而y为3至350的整数)反应。在一些实施方案中,x为20-300,90-150,或100-140;y为20-350,30-300,155-215,或165-205。在一些实施方案中,所述的方法进一步包括使式D-L1a-SS-L1a-OH所示的化合物与还原试剂反应,从而生成式D-L1a-SH所示的化合物。在一些实施方案中,所述的方法进一步包括使式(III):[NH2CH2CH2NHC(O)CH2]z-F(III)所示的化合物(其中F如式(I)所定义,并且z为3至400的整数)与式L2a-(PEG)-L3a-Lv所示的化合物(其中L2a和PEG如式所定义;L3a为-NHC(O)CH2CH2C(O)-或-C(O)–;而Lv为离去基团)反应,从而形成式(II)所示的化合物。在一些实施方案中,z为20-400,50-300,190-250,或200-240。在一些实施方案中,Lv为(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基。在一些实施方案中,方法D为5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2)。适用于本发明公开的方法中的D的多核苷酸和线性的嵌合化合物的改变在之前的段落中更充分的描述。
附图简述
图1提供了用于制备示例性支化的嵌合化合物,D56-05,(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)的制造方案的流程图。
图2示出示例性支化的嵌合化合物,D56-05,(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)的制备。
图3示出用于制备羧基甲基化-FICOLL的反应方案。
图4示出用于制备N-(2-氨基乙基)氨基甲酰基甲基化-FICOLL的反应方案。
图5A-5E示出琥珀酰亚胺-((N-马来酰亚胺丙酰胺)-聚乙二醇)酯和琥珀酰亚胺-((N-马来酰亚胺烷基)-聚乙二醇)酯异双功能连接体(SM-PEGn)的化学结构。
图6示出用于制备[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL的反应方案。
图7提供了[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL中试批次4和5的尺寸排阻色谱-高效液相色谱分析的结果。A1是由纯化的试批次4得到的,A2为粗品试批次4得到的,B1为由纯化的试批次5得到的,而B2是由粗品试批次5得到的。在各象限中上方和下方色谱分别代表了在215nm和260nm下的检测。[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL在大约7.2min时被洗脱。未反应的试剂盒小分子在大约11.2至17.3min时被洗脱。
图8示出由D56-02(SEQ ID NO:2)制备D56-03(SEQ ID NO:2)的反应方案,其不同于它们3’末端的非核苷酸部分。
图9A-D提供了纯化的D56-03的尺寸排阻色谱-高效液相色谱分析的结果。图9A为得自试批次4,图9B为得自试批次5部分1,图9C为得自试批次5部分2,而图9D为得结合的自试批次5。D56-03的停留时间为12.2min。TCEP((三(2-羧乙基)磷化氢)作为对照运行,并且作为单峰洗脱,停留时间为14.6min。
图10示出用于制备D56-05的反应方案。
图11A-E示出D56-05纳米颗粒,与单体D56-01相比,该颗粒增强了IFN调节的、趋化因子、细胞因子和跨内皮迁移相关的基因的表达,使得注射位点的肌肉得到增强的细胞募集。向BALB/c小鼠(n=6/组)i.m.注射10mg D56-05或D56-01(CpG-ODN基剂量)。在注射后6小时收集注射位点的肌肉,从而评估IFN调节的(图11A),趋化因子(图11B),细胞因子(图11C),和跨内皮迁移相关的(图11D)基因的表达。通过ΔΔCt评价(2-ΔΔCt)测定相对于注射PBS的对照的基因表达。数据以由单一试验得到的单个样品的平均值示出,并且95%CI。(图11E)通过流式细胞仪评价在12-24小时时注射D56-05与注射D56-01的小鼠(10mg)的肌肉中多种细胞群体的相对比例(相对于总细胞归一化)。在淋巴细胞的侧向散射光设门和去除后(CD3/CD19/CD49b倾倒通道),如下鉴定细胞群体:巨噬细胞(CD11b+/CD11c-/F4/80+/Ly6C+/Ly6G-),单核细胞(CD11b+/CD11c-/F4/80-/Ly6C+/Ly6G-),嗜中性粒细胞(CD11b+/CD11c-/Ly6G+),总CD11b+细胞,以及cDCs(CD11b-/CD11c+)。以平均值±SEM示出的数据为2个独立试验的平均值。
图12A-B示出D56-05的辅助作用依赖于TLR9的表达。在图12A种,向野生型(C57BL/6)或TLR92/2小鼠(n=6)i.m.注射10mg D56-05,并且在注射后6小时收集注射位点的肌肉,从而测定基因的表达。相对于注射PBS对照来计算单一的基因诱导倍数。数据以平均值±SEM示出。在图12B中,C57BL/6或TLR92/2小鼠(n=8–10)i.m.免疫5mg rPA,并结合10mgD56-05。在第14天时TNA效价水平以平均值示出。通过Mann–Whitney U检验,***p<0.001。
图13A-C示出D56-05纳米颗粒增强IFN调节的、趋化因子和细胞因子基因。BALB/c小鼠(n=6)s.c.免疫10mg D56-05或D56-01。在免疫后18小时收集腘窝淋巴结,从而评估IFN调节的(图13A)、趋化因子(图13B)和细胞因子(图13C)基因表达。通过ΔΔCt评价(2-ΔΔCt)测定相对于注射PBS的对照的基因表达。数据以由单一试验得到的单个样品的平均值示出,并且95%CI。
图14示出在引流淋巴结中D56-05纳米颗粒增强细胞募集。通过流式细胞仪分析在BALB/c小鼠(n=4–6)的腘窝淋巴结中不同细胞群体的相对比率,其中所述的BALB/c小鼠在48小时之前在足垫中s.c.免疫10mg D56-05或D56-01,并结合10或2mg rPA。根据侧向散射光设门,如下鉴定细胞群体:T细胞(CD3+/CD19-),B细胞(CD3-/CD19+),NK细胞(CD3-/CD19-/CD49b+),以及以下CD3-/CD19-/CD49b-细胞群体:cDCs(CD11b-/CD11c+/MHC II+),pDCs(CD11b-/CD11c+/MHC II+/PDCA1+或B220+),mDC(CD11b+/CD11c+/MHC II+),骨髓细胞(CD11b+/CD11c-/MHC II+),巨噬细胞(CD11b+/CD11c-/MHC II+/F4/80+/Ly6C+/Ly6G-),单核细胞(CD11b+/CD11c-/MHC II+/F4/80-/Ly6C+/Ly6G-),和嗜中性粒细胞(CD11b+/CD11c-/Ly6G+)。数据以平均值±SEM示出,并代表了4个独立的试验。
图15A-D示出rPA/D56-05接种在猴子中导致抗-rPA Ab应答的快速诱导以及持久的记忆。使用单独的10mg rPA或者与1000,250或50mg D56-05或者1000或250mg D56-01组合在第0天和第28天i.m.(↓)免疫食蟹猴(n=3–6/组)。所有的猴子在初始免疫后23wk接受单独的25mg rPA(↓)。在初始免疫后,在25wk内监测TNA和抗rPA IgG效价的水平。在图15A-B中,在初始免疫后2wk,效价以平均值显示,并且95%CI,而且该效价代表了3个独立的试验。使用Dunn posttest,通过Kruskal–Wallis,*p<0.05,**p<0.01。图15C示出在初始免疫后2wk,抗rPA IgG与TNA效价水平之间的相关性。Spearman等级相关性。图15D示出在整个研究中监测的TNA效价数据(平均值)。
图16A-C示出rPA/D56-05接种诱导强烈的记忆应答,在猴子预防炭疽挑战的模型中,介导完全保护而免于的雾化的炭疽杆菌(B.anthracis)孢子的挑战。食蟹猴(n=6–8/组)在第0天和/或第29天(13或23)i.m.(↓)免疫10mg rPA,并结合1000或250mg D56-05。还包含一组未接种的动物(n=6)。所有的猴子在第69,70或71(↓)天都暴露于目标剂量为200LD50当量的雾化的炭疽杆菌孢子。在图16A中,在挑战后,在28天内每天2次监测生存情况。在图16B中,在整个研究中并且在挑战后4wk内监测TNA效价水平。数据以平均值示出,并且95%CI。在第0天和第28天(↓),使用单独的10mg rPA,或者组合1000,50,20或5mg D56-05来免疫食蟹猴(n=4–6)。所有的猴子在初始免疫后10wk接受单独的25mg rPA(↓)。在图16C中,在12wk内监测TNA效价水平,并且效价以平均值示出。
图17A-B示出在小鼠中rPA/D56-05免疫会诱导更高的一级和二级TNA效价应答。在第0天和第29天,使用单独的5mg rPA,或者与2或0.5mg D56-05或D56-01组合,免疫SwissWebster小鼠(n=25/组)。在初次免疫后4wk(图17A)和在二次免疫后2wk(图17B)评估TNA效价水平。数据以平均值示出,并且95%CI。使用Dunn posttest,通过Kruskal–Wallis,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图18示出D56-05纳米颗粒保留在注射位点和引流淋巴结。使用100mg D56-05或D56-01,i.m.注射BALB/c小鼠(n=5)。在注射后1d,评估注射位点肌肉、引流淋巴结(腘窝、腹股沟、髋部、腰部和骶椎)、脾、肝脏和肾的寡核苷酸含量(微克/克组织)。数据以平均值示出,并且代表2个独立的试验。
图19提供了对小鼠给予1-4剂量(100μg)DV56-05或DV56-01的时间内的体重的图。
图20提供了示出接受D56-05或D56-30的小鼠的肿瘤尺寸的图。简言之,大约1000000E.G-7OVA细胞(ATCC编号CRL-2113)皮下注射至C57BL/6小鼠的侧腹。从研究的第0天开始(细胞移植后4天),向小鼠肿瘤内注射(即,注射至建立的肿瘤实体中)50微克(mcg)D56-05或对照非-CpG寡核苷酸(D56-30)(处于150μL PBS中)。在第0、3和7天给药注射。观察小鼠,并入所示测量重量尺寸(体积)。E.G7-OVA为转基因细胞系,衍生自C57BL/6(H-2b)小鼠淋巴瘤细胞系EL4,其构成性地分泌小鸡卵清蛋白。
发明详述
本发明涉及多核苷酸,以及包含核酸和非核酸部分的线性的和支化的嵌合化合物。本发明还涉及它们用于刺激免疫应答的用途,以及制备支化的嵌合化合物的方法。
一般方法和定义
除非另作说明,本发明公开的实施使用了分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的传统技术,这些技术都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中充分地说明,例如参见Animal Cell Culture,第六版(Freshney,Wiley-Blackwell,2010);Antibodies,A Laboratory Manual,第二版(Greenfield,ed.,Cold Spring HarborPublications,2013);Bioconjugate Techniques,第三版(Hermanson,Academic Press,1996);Current Protocols in Cell Biology(Bonifacino et al.,ed.,John Wiley&Sons,Inc.,1996,including supplements through 2014);Current Protocols inImmunology(Coligan et al.,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,1991including supplementsthrough 2014);Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,JohnWiley&Sons,Inc.,1987,including supplements through2014);Current Protocols inNucleic Acid Chemistry(Egli et al.,ed.,John Wiley&Sons,Inc.,2000,includingsupplements through 2014);Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Sambrook and Russell,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001);MolecularCloning:A Laboratory Manual,第四版(Green and Sambrook,Cold Spring HarborLaboratory Press,2012);Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications(Herdewijn,ed.,Humana Press,2004);Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Synthesis and Properties(Agrawal,ed.,Humana Press,1993);和Using Antibodies:ALaboratory Manual(Harlow and Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998)。
如本文交换使用的,术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包含单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、修饰寡核苷酸、寡核苷或者它们的组合。多核苷酸可以是线性、支化或环状构造的,或者多核苷酸可以包含1个或多个线性、支化和/或环状的链段。多核苷酸为通常通过硫酸二酯键连接的核苷的聚合物,但是还可以使用备选的键,例如硫代磷酸酯。核苷由与糖结合的嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)或它们的衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或它们的衍生物)碱基组成。DNA中4种核苷单元(或碱基)被称为脱氧腺苷,脱氧鸟苷,胸苷和脱氧胞苷。RNA中4种核苷单元(或碱基)被称为腺苷,鸟苷,尿苷和胞苷。核苷酸为核苷的磷酸酯。
本发明公开的多核苷酸,线性的嵌合化合物和支化的嵌合化合物包含14至50个核苷酸。在一些实施方案中,核苷酸的数量为大于(下限)13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,30,35,40或45。在一些实施方案中,核苷酸的数量为小于(上限)51,50,45,40,35,30,25 24,23,22,21或20。即,核苷酸的数量为大约14至50个,其中下限小于上限。
术语“3’”通常是指与同一多核苷酸中的另一个区域或位置的多核苷酸3’(下游)中的区域或位置。
术语“5’”通常是指与同一多核苷酸或寡核苷酸的另一个区域或位置的多核苷酸或寡核苷酸5’(上游)中的区域或位置。
术语“个体”和“受试对象”是指哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于人类、非人类灵长动物(例如猴子)、农场动物、运动动物、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)和宠物(例如狗和猫)。
术语“抗原”是指被抗体或T细胞抗原受体特异性识别和结合的物质。抗原可以包括肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、多糖、复合碳水化合物、糖、神经节苷脂、脂质和磷脂;它们的部分和组合。当抗原存在于本发明公开的组合物中时,其可以是合成的或者由自然界分离得到的。在本发明公开的方法中适用于给予的抗原包括能够激发抗原特异性B细胞或T细胞应答的任何分子。半抗原涵盖在“抗原”的范围之内。“半抗原”是低分子量化合物,其自身是非免疫原性的,但是当其与通常更大的免疫原性分子(载体)缀合时,其成为免疫原性的。
“多肽抗原”可以包括天然肽、合成肽、重组肽、肽提取物粗品、部分纯化的或未纯化的活性状态的肽(例如作为减毒或灭活病毒、微生物有机体或细胞的一部分的肽)、或此类肽的片段。多肽抗原的长度优选为至少6个氨基酸残基。
如本文所用,术语“免疫原性”是指在合适的状况下给予哺乳动物受试对象时激发适应性免疫应答的试剂(例如多肽抗原)。免疫应答可以为B细胞(体液)和/或T细胞(细胞)应答。
“佐剂”是指当与免疫原性试剂(例如抗原)混合时,非特异性地增强或强化受体暴露于混合物时对所述的试剂的免疫应答的物质。
术语“激动剂”使用其最广泛的意义,并且包含通过受体活化信号传递的任何分子。例如TLR9激动剂与TLR9受体结合,并且活化TLR9信号传递途径。
术语“拮抗剂”使用其最广泛的意义,并且包含阻断激动剂生物活性的任何分子。例如TLR9拮抗剂阻断TLR9信号传递途径。
术语“免疫刺激序列”和“ISS”是指能够刺激可测量的免疫应答的核酸序列(例如体外测量、体内测量和/或离体测量)。就本发明公开的目的而言,术语ISS是指包含非甲基化的CG二核苷酸的核酸序列。相反地,术语“免疫抑制序列”和“IIS”是指能够抑制可测量的免疫应答的核酸序列(例如体外测量、体内测量和/或离体测量)。可测量的免疫应答的实例包括但不限于抗原特异性抗体产生、细胞因子分泌、淋巴细胞活化、淋巴细胞增殖。
术语“CpG”和“CG”在本文中交换使用,是指通过磷酸分离的胞嘧啶和鸟嘌呤。这些术语是指与胞嘧啶和鸟嘌呤的碱基配对相反的线性序列。本发明公开的多核苷酸,线性的嵌合化合物和支化的嵌合化合物包含至少一个非甲基化CpG二核苷酸。即,CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化的(即,非5-甲基胞嘧啶)。
如本文所用,术语“反义”和“反义序列”是指多核苷酸的非编码链,该多核苷酸具有与mRNA的编码链互补的序列。在优选的实施方案中,本发明公开的多核苷酸并非为反义序列或RNAi分子(miRNA和siRNA)。换言之,在优选的实施方案中,本发明公开的多核苷酸与使用该多核苷酸的哺乳动物受试对象的转录物(或基因)不具有显著的同源性(或互补性)。例如在人类受试对象中用于调控免疫应答的本发明公开的多核苷酸在其长度长度上与人类基因座的核酸序列优选地具有低于80%的一致性(例如长度为50个核苷酸的多核苷酸与人类转录物的50个碱基中共有不超过40个碱基)。换言之,在优选的实施方案中,所述的多核苷酸与使用该多核苷酸的哺乳动物受试对象(例如人类、非人类的灵长动物、农场动物、狗、猫、兔子、大鼠、小鼠等)的核酸序列具有低于80%,75%,70%,65%,60%,55%,50%,45%,40%,35%,30%,25%或20%的一致性。
应答或参数的“刺激”包括当与其他相同的状况(除了所关注的参数以外)相比时,或者备选地与另一种状况相比时,引发和/或增强所述的应答或参数(例如与缺乏TLR激动剂的情况相比,在TLR激动剂存在下,TLR信号传递的增强)。例如免疫应答的“刺激”是指应答增强,这可以由应答的引发和/或增强而产生。例如免疫应答的“刺激”是指应答的增强。
应答或参数的“抑制”包括当与其他相同的状况(除了所关注的参数以外)相比是,或者备选地与另一种状况相比时,阻断和/或压制所述的应答或参数(例如与缺乏TLR拮抗剂存在TLR激动剂的情况相比,在TLR激动剂和TLR拮抗剂存在下,TLR信号传递减少)。例如免疫应答的“抑制”是指应答的减少。
本文所公开的试剂的“有效量”为足以执行具体陈述的目的的量。关于所述的目的,“有效量”可以凭经验和以常规的方式测定。试剂的“有效量”或“足量”是指足以发挥所需的生物学作用的量,例如有利的结果,包括有利的临床结果。术语“治疗有效量”是指在受试对象(例如哺乳动物,例如人类)中试剂(例如TLR抑制剂)有效地“治疗”疾病或紊乱的量。在过敏反应的情况下,试剂的治疗有效量减少了过敏反应的迹象或症状。
术语疾病的“治疗”(分词形式)或“治疗”(名词形式)是指执行方案,其可以包括向个体(人类或其他动物)给药一种或多种药品,以努力减轻疾病的迹象或症状。因此,“治疗”(分词形式)或“治疗”(名词形式)无需完全减轻迹象或症状,无需治愈,并且特意地包括对个体仅具有边缘效应的方案。如本文所用及如本领域公知的那样,“治疗”(名词形式)是指用于获得有益或所需结果的方法,包含临床结果。有益或所需的临床结果包括但不限于减轻或改善一种或多种症状,减弱疾病的程度,稳定(即,不恶化)疾病的状态,防止疾病扩散,延迟或减慢疾病的进程,改善或缓和疾病的状态,以及缓解(部分的或全部的),而无论是可检测的还是不可检测的。此外,“治疗”(名词形式)还可以指比未接受治疗的个体的预期生存延长的生存。
“减轻”疾病或紊乱是指与预期的未治疗的结果相比,疾病或紊乱的程度和/或不理想的临床表现被减少,和/或疾病或紊乱进展的时间过程被减慢。特别是在过敏反应的内容中,减轻可以在刺激对变应原(多种)的Th1免疫应答时发生。此外,减轻不需要通过给予一剂药剂时发生,而是通常在给予一系列剂量的药剂时发生。因此,足以减轻应答或紊乱的量可以在一个或多个剂量中给予。
如本文所用以及在所附的权利要求书中,单数形式“a”、“an”和“the”包含复数参照物,除非内容中另外或清楚地指示。例如“多核苷酸”包括一条或多条多核苷酸。
本文所述的“大约”一个值或参数描述了该值或参数的变化。例如关于大约400000道尔顿的分子量的描述涵盖了360000至440000道尔顿分子量。
应该理解的是本文中以“包括”进行描述的方面和实施方案包括“由实施方案组成”和“基本上由实施方案组成”。
I.多核苷酸和嵌合化合物
本发明公开提供了尤其用于调控哺乳动物受试对象(例如人类患者)的免疫应答的多核苷酸,线性的嵌合化合物和支化的嵌合化合物。本发明公开部分基于以下发现:一些包含与非核酸间隔部分和/或聚合载体共价结合的核酸部分的嵌合化合物具有免疫调控活性(特别是在人类细胞中),包括其中核酸部分具有这样的序列的情况:如果所述的序列以分离的多核苷酸存在,则其不会展示可观的免疫调控活性(例如低下的或不可测量的活性)。在一些实施方案中,免疫调控活性包括免疫刺激活性。在其他的实施方案中,免疫调控活性包括免疫抑制活性。
A.多核苷酸
在一个方面中,提供了包含非甲基化CpG二核苷酸的多核苷酸。该多核苷酸能够刺激免疫应答,或者构成用于刺激免疫应答的嵌合化合物。在一些实施方案中,提供了包含核苷酸序列5’-TCGGCGC AACGTTC-3’(SEQ ID NO:3)的多核苷酸。在一些实施方案中,提供了包含核苷酸序列5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸。在一些实施方案中,多核苷酸的长度为低于50个核苷酸(即,多核苷酸包含低于50个核苷酸)。在一些实施方案中,核苷酸之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,核苷酸之间的一个或多个键为磷酸二酯键。在优选的实施方案中,5’-TCGGCGC AACGTTC-3’(SEQ ID NO:3)或5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1)位于多核苷酸的5’末端(即,任何其他的核苷酸加入至3’末端)。在一些实施方案中,多核苷酸由5’-TCGGCGC AACGTTCTCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1)核苷酸序列组成。在一些实施方案中,多核苷酸是单链的。在一些实施方案中,多核苷酸为2’-脱氧核糖多核苷酸。在一些实施方案中,核苷酸之间所有的键均为硫代磷酸酯键。
B.线性的嵌合化合物
在另一个方面中,提供了包含核酸部分的线性的嵌合化合物,其中所述的核酸部分包含非甲基化CpG二核苷酸。线性的嵌合化合物能够刺激免疫应答,或者构成用于刺激免疫应答的支化的嵌合化合物。在一些实施方案中,提供了包含核酸部分和非核酸间隔部分的线性的嵌合化合物。在一些实施方案中,线性的嵌合化合物包含具有式N1-Sp1-N2或N1-Sp1-N2-Sp2-N3(其中N1,N2和N3为核酸部分,Sp1和Sp2为非核酸间隔部分,而Sp1和Sp2恰好与2个核酸部分共价结合)的核心结构。在这些实施方案的一些实施方案中,线性的嵌合化合物包含式(5’-N1-3’)-Sp1-(5’-N2-3’)所示的核心结构。在这些实施方案的一些实施方案中,线性的嵌合化合物包含式(5’-N1-3’)-Sp1-(5’-N2-3’)-Sp2-(5’-N3-3’)所示的核心结构。在一些实施方案中,间隔部分为六乙二醇(HEG)。在一些实施方案中,线性的嵌合化合物包含低于50个核苷酸(即,N1,N2和可任选的N3的总和低于50个)。在一些实施方案中,各个核酸部分N的长度为低于8个核苷酸,长度优选为7个核苷酸。
在一些实施方案中,提供了包含2个核酸部分和六乙二醇间隔的线性的嵌合化合物,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’(SEQ ID NO:4),其中所述的线性的嵌合化合物包含低于50个核苷酸(即,N1和N2的总和低于50个),并且其中核苷酸之间以及核苷酸与HEG间隔之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,提供了包含3个核酸部分和2个六乙二醇间隔的线性的嵌合化合物,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2),其中所述的线性的嵌合化合物包含低于50个核苷酸(即,N1,N2和N3的总和低于50个),并且其中核苷酸之间以及核苷酸与HEG间隔之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’(SEQ ID NO:4)或5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2)位于线性的嵌合化合物的5’末端(即,任何其他的核苷酸加入至3’末端)。在一些实施方案中,提供了由5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2)组成的线性的嵌合化合物。在一些实施方案中,核苷酸之间的一个或多个键为磷酸二酯键。在一些实施方案中,所有核苷酸之间的键以及核苷酸与HEG间隔之间的键均为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,线性的嵌合化合物的核酸部分为2’-脱氧核糖多核苷酸。线性的嵌合化合物的核酸部分的CpG二核苷酸是非甲基化的。
本发明公开进一步提供了线性的嵌合化合物,其包含以下的一种:
5'-TCGTTCG-3’-HEG-5’-TCGTTCG-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’(SEQ ID NO:9)(D56-16),
5'-TCGTTCG-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGTTCG-3’(SEQ ID NO:10)(D56-17),
5'-TCGGCGC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’(SEQ ID NO:11)(D56-18),
5'-TCGCCGG-3’-HEG-5’-TCGCCGG-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’(SEQ ID NO:12)(D56-19),
5'-TCGCCGG-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGCCGG-3’(SEQ ID NO:13)(D56-20),
5'-TCGATCG-3’-HEG-5’-TCGATCG-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’(SEQ ID NO:14)(D56-21),
5'-TCGTCGT-3’-HEG-5’-TCGTCGT-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’(SEQ ID NO:15)(D56-22),和
5'-TCGTCGT-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGTCGT-3’(SEQ ID NO:16)(D56-23)。在这些实施方案的一些实施方案中,线性的嵌合化合物包含低于50个核苷酸,并且核苷酸序列的5’-TCG-3’位于线性的嵌合化合物的5’末端(即,任何其他的核苷酸加入至3’末端)。在一些实施方案中,核苷酸之间以及核苷酸与HEG间隔之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,核苷酸之间的一个或多个键为磷酸二酯键。在一些实施方案中,所有核苷酸之间的键以及核苷酸与HEG间隔之间的键均为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,线性的嵌合化合物的核酸部分为2’-脱氧核糖多核苷酸。线性的嵌合化合物的核酸部分的CpG二核苷酸是非甲基化的。
C.支化的嵌合化合物
本发明公开的支化的嵌合化合物包含多核苷酸或线性的嵌合化合物,其通过聚乙二醇与蔗糖和表氯醇的支化的共聚物共价连接。本发明公开的支化的嵌合化合物的马来酰亚胺活化的FICOLL中间体(包含聚乙二醇)与之前公开的支化的嵌合化合物的中间体相比,具有改善的溶解性和稳定性。因此,本发明公开的支化的嵌合化合物与DynavaxTechnologies Corporation的美国专利No.8,597,665,8,114,418和7,785,610的支化的嵌合化合物C-137和C-138相比,具有改善的可制造性和可储存性。本发明公开的支化的嵌合化合物在体外和体内还具有强效的免疫调控活性(例如免疫刺激或免疫抑制活性)和较低的毒性。
在一些实施方案中,本发明公开提供了式(I)所示的支化的嵌合化合物:
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I)
其中:
D为多核苷酸或线性的嵌合化合物;
L1为包含烷硫基基团的第一连接体;
L2为包含琥珀酰亚胺基团的第二连接体;
L3为包含酰胺基团的第三连接体;
PEG为聚乙二醇;
x为3至300的整数;以及
F为蔗糖和表氯醇的支化的共聚物。
式(I)所示的支化的嵌合化合物包含3个或多个多核苷酸或线性的嵌合化合物D,其通过聚乙二醇(PEG)和多个连接体L1,L2和L3与多价部分F连接。D的线性的嵌合化合物的多核苷酸或核酸部分包含非甲基化CpG二核苷酸。
在一些实施方案中,D为包含核苷酸序列5’-TCGGCGC-3’的核苷酸。在一些实施方案中,D为包含核苷酸序列5’-TCGGCGC AACGTTC-3’(SEQ ID NO:3)的多核苷酸。在一些实施方案中,D为包含核苷酸序列5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸。在一些实施方案中,D的多核苷酸的长度低于50个核苷酸(即,D的多核苷酸包含低于50个核苷酸)。在一些实施方案中,核苷酸之间以及D的3’末端核苷酸与L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,D的5’-TCGGCGC AACGTTC-3’(SEQ ID NO:3)或5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1)位于多核苷酸的5’末端(即,任何其他的核苷酸加入至3’末端)。在一些实施方案中,D为由核苷酸序列5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1)组成的多核苷酸。在一些实施方案中,D的多核苷酸是单链的。在一些实施方案中,D的多核苷酸为2’-脱氧核糖多核苷酸。在一些实施方案中,核苷酸之间的一个或多个键为磷酸二酯键。在一些实施方案中,所有核苷酸之间的键以及D的3’末端核苷酸与L1之间的键为硫代磷酸酯键。D的多核苷酸的CpG二核苷酸是非甲基化的。
在一些实施方案中,D为包含核酸部分和非核酸间隔部分的线性的嵌合化合物。在一些实施方案中,线性的嵌合化合物包含具有式N1-Sp1-N2或N1-Sp1-N2-Sp2-N3(其中N1,N2和N3为核酸部分,Sp1和Sp2为非核酸间隔部分,而Sp1和Sp2恰好与2个核酸部分共价结合)的核心结构。在这些实施方案的一些实施方案中,线性的嵌合化合物包含式(5’-N1-3’)-Sp1-(5’-N2-3’)所示的核心结构。在这些实施方案的一些实施方案中,线性的嵌合化合物包含式(5’-N1-3’)-Sp1-(5’-N2-3’)-Sp2-(5’-N3-3’)所示的核心结构。在一些实施方案中,N1具有序列5’-TCGGCGC-3’。在一些实施方案中,N2具有序列5’-AACGTTC-3’。在一些实施方案中,N3具有序列5’-TCGGCGC-3’。在一些实施方案中,N1具有序列5’-TCGGCGC-3’,N2具有序列5’-AACGTTC-3’。在一些实施方案中,N1具有序列5’-TCGGCGC-3’,N2具有序列5’-AACGTTC-3’,N3具有序列5’-TCGGCGC-3’。在这些实施方案的一些实施方案中,间隔部分为六乙二醇(HEG)。在一些实施方案中,Sp1为六乙二醇(HEG)。在一些实施方案中,Sp2为六乙二醇(HEG)。在一些实施方案中,D的线性的嵌合化合物包含低于50个核苷酸(即,N1,N2和可任选的N3的总和低于50个)。在一些实施方案中,5’-TCGGCGC-3’位于线性的嵌合化合物的5’末端(即,任何其他的核苷酸加入至3’末端)。在一些实施方案中,各个核酸部分N的长度为低于8个核苷酸,长度优选为7个核苷酸。在一些实施方案中,各个核酸部分N的长度为4至7、优选为5至7、或者6或7个核苷酸。D的线性的嵌合化合物的核酸部分的CpG二核苷酸是非甲基化的。
在一些实施方案中,D为包含2个核酸部分和六乙二醇间隔的线性的嵌合化合物,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’(SEQ ID NO:4),其中所述的线性的嵌合化合物包含低于50个核苷酸(即,N1和N2的总和低于50个),并且其中核苷酸之间、核苷酸与HEG之间以及3’末端核苷酸与L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,D为包含3个核酸部分和2个六乙二醇间隔的线性的嵌合化合物,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2),其中所述的线性的嵌合化合物包含低于50个核苷酸(即,N1,N2和N3的总和低于50个),并且其中核苷酸之间以及核苷酸与HEG间隔之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’(SEQID NO:4)或5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2)位于线性的嵌合化合物的5’末端(即,任何其他的核苷酸加入至3’末端)。在一些实施方案中,D为由5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2)组成的线性的嵌合化合物。在一些实施方案中,核苷酸之间的一个或多个键为磷酸二酯键。在一些实施方案中,D的线性的嵌合化合物的所有核苷酸之间的键、核苷酸与HEG间隔之间的键以及3’末端核苷酸与L1之间的键均为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,D的线性的嵌合化合物的核酸部分为2’-脱氧核糖多核苷酸。D的线性的嵌合化合物的核酸部分的CpG二核苷酸是非甲基化的。
经衍生可以与核酸部分键合的多糖可以用作多价载体部分,从而作为本发明公开的支化的嵌合化合物的支化单元。合适的多糖可以是天然形成的多糖或合成的多糖。示例性的多糖包括例如右旋糖苷,甘露糖(mannin),壳聚糖,琼脂糖和淀粉。例如由于在免疫相关细胞类型的细胞(例如单核细胞和肺泡巨噬细胞)上具有甘露糖受体,所以可以使用甘露糖,这样多糖间隔部分可以用于靶向特定的细胞类型。在一些实施方案中,多糖是交联的。优选的多价载体部分为表氯醇交联的蔗糖(例如蔗糖与表氯醇的支化共聚物,商品名为GEHealthcare的)。
在一些实施方案物中,式(I)所示的F为蔗糖与表氯醇的支化共聚物,其分子量为大约100,000至大约700,000道尔顿,其通过醚基团与L3连接。醚基团衍生自共聚物的蔗糖羟基。在一些实施方案中,F为蔗糖与表氯醇的支化共聚物,其分子量大于(下限)大约100,000,200,000,300,000,400,000,500,000或600,000道尔顿。在一些实施方案中,F为蔗糖与表氯醇的支化共聚物,其分子量小于(上限)大约700,000,600,000,500,000,400,000,300,000或200,000道尔顿。即,F的分子量可以为大约100,000至大约700,000道尔顿的尺寸范围内的任意一种,其中下限低于上限。在一些实施方案中,F的分子量为大约300,00至500,00道尔顿(例如GE Healthcare的PM 400)。
应该意识到并且理解的是本发明中对于式(I)所示的支化的嵌合化合物详细说明的F的每一种改变都可以与本发明中对于式(I)所示的支化的嵌合化合物详细说明的D的每一种改变结合,如同每一种组合单独描述一样。例如在一些实施方案中,提供了式(I)所示的支化的嵌合化合物:
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I),
其中:
D为多核苷酸或线性的嵌合化合物;
L1为包含烷硫基基团的第一连接体;
L2为包含琥珀酰亚胺基团的第二连接体;
L3为包含酰胺基团的第三连接体;
PEG为聚乙二醇(例如-(OCH2CH2)n–,其中n为2至80的整数);
x为3至300的整数;以及
F为蔗糖与表氯醇的支化共聚物,其分子量为大约100,000至大约700,000道尔顿,并且通过醚基团与L3连接,
其中所述的多核苷酸包含核苷酸序列:5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ IDNO:1),其中D的多核苷酸的长度低于50个核苷酸,并且其中核苷酸之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键,并且
其中D的线性的嵌合化合物包含3个核酸部分和2个六乙二醇(HEG)间隔,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2),其中核苷酸之间、核苷酸与HEG间隔之间、以及3’-核苷酸与L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。
本发明公开提供了式(I)所示的支化的嵌合化合物,其包含通过聚乙二醇(PEG)和多个连接体L1,L2和L3(如-L1-L2-(PEG)-L3-,其中L1为包含烷硫基基团的第一连接体;L2为包含琥珀酰亚胺基团的第二连接体;L3为包含酰胺基团的第三连接体;而PEG为-(OCH2CH2)n–)与多价部分F连接的多核苷酸或线性的嵌合化合物D。
由于聚乙二醇无毒性、非免疫原性、亲和性、水溶性和高度的挠性,所以发现其广泛地用于缀合/修饰生物活性分子。本发明公开的嵌合化合物的含PEG部分单元与缀合物相比,为所述的这些化合物提供了更好的可溶性和稳定性,其中所述的缀合物使用了疏水性部分,例如在生物缀合中常用的甲基环己基(MC)部分。在PEG连接体中二乙醇单元的数量可以调整,从而优化支化的嵌合化合物的长度、亲水性和粒径。
在一些实施方案中,式(I)所示的PEG为式-(OCH2CH2)n–,其中n为2至80的整数。在一些实施方案中,n为大于(下限)2,4,6,8,10,12,14,16,18或20的整数。在一些实施方案中,n为小于(上限)80,70,60,50或40的整数。即,n为了为大约2至80的整数,其中下限小于上限。在一些实施方案中,n为2,4,6,24,45,48或70。在一些实施方案中,n为6,24,45或70。在一些实施方案中,n为2,4,6,24,28,45,48或70。在一些实施方案中,n为6,24,28,45或70。在优选的实施方案中,PEG为-(OCH2CH2)6–。
本发明公开的支化的嵌合化合物的PEG通过包含琥珀酰亚胺基团的连接体与D的多核苷酸或线性的嵌合化合物的3’-核苷酸的一个末端连接,并且通过包含酰胺基团的连接体与多价部分F的另一个末端连接。使用烷硫基基团,从而促进D的线性的嵌合化合物的多核苷酸的3’-核苷酸与琥珀酰亚胺基团之间的化学偶联。因此,第一连接体L1为包含烷硫基基团的连接体,其能够通过使包含L1的前体的末端巯基基团(-SH)与包含L2的前体中的马来酰亚胺基团发生反应的方式,将核酸的3’末端磷酸部分与第二连接体L2的琥珀酰亚胺基团连接,从而在L1和L2之间形成硫代琥珀酰亚胺键。在一些实施方案中,L1为式-L1a-S-,其中L1a为亚烷基,例如式(CH2)m所示的基团,其中m为2至9的整数。在一些实施方案中,L1为式-(CH2)mS–所示的烷硫基基团,其中m为2至9的整数。在一些实施方案中,m为2,3,4,5,6,7,8或9。在一些实施方案中,m为3至6。在一些实施方案中,m为3或6。在优选的实施方案中,m为6。在另一个优选的实施方案中,m为3。在一些实施方案中,L1为-(CH2)6S–or-(CH2)3S–。
第二连接体L2为包含琥珀酰亚胺基团的连接体。在一些实施方案中,L2进一步包含烷基间隔基团(例如-CH2CH2–)和/或烷基酰胺间隔基团(例如-CH2CH2C(O)NH–)。在一些实施方案中,L2为
在一些实施方案中,L2为
在一些实施方案中,L2为式其中L2b为烷基间隔基团(例如-CH2CH2–或-CH2CH2CH2CH2–)和/或烷基酰胺间隔基团(例如-CH2CH2C(O)NH–)。在一些实施方案中,L2b为-CH2CH2C(O)NHCH2CH2–。在一些实施方案中,L2b为-CH2CH2C(O)NHCH2CH2CH2–。
在一些实施方案中,-L1-L2–部分为
第三连接体L3为包含酰胺基团的连接体,其通过醚基团将PEG与多价部分F共价连接。在一些实施方案中,L3进一步包含一个或多个烷基间隔基团(例如-CH2CH2–),一个或多个酰胺间隔基团(例如-C(O)NH–或-NHC(O)–)或者它们的组合。在一些实施方案中,L3为式其中L3a为能够连接烷基基团和胺连接的间隔,例如式-NHC(O)CH2CH2C(O)–,-OC(O)–或-C(O)–所示的间隔。L3的(2-氨基乙基)氨基羰基甲基部分可以通过F上的羟基基团与氯乙酸盐反应、然后与亚乙基二胺偶联而与F连接。
在一些实施方案中,L3为
应该意识到并且理解的是本发明中对于式(I)所示的支化的嵌合化合物详细说明的L1,L2,L3和PEG的每一种改变都可以彼此结合,并且可以与本发明中对于式(I)所示的支化的嵌合化合物详细说明的D和F的每一种改变结合,如同每一种组合单独描述一样。例如在一些实施方案中,-L2-(PEG)-L3-部分为式(A),(B),(C),(D),(E),(F)和(G):
在一些实施方案中,-L1-L2-(PEG)-L3-部分为
在一些实施方案中,所述的支化的嵌合化合物为式
其中D为由5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2)组成的线性的嵌合化合物,其中核苷酸之间、核苷酸与HEG间隔之间、以及3’末端核苷酸与L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键,F为蔗糖与表氯醇的支化共聚物,其分子量为大约400000,n为6,24,45或70,而x为3至300的整数,其中F通过醚键与亚甲基基团连接。在一些实施方案中,n为6,而x为90至150。
在一些实施方案中,所述的支化的嵌合化合物为式
其中D为由5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2)组成的线性的嵌合化合物,其中核苷酸之间、核苷酸与HEG间隔之间、以及3’末端核苷酸与L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键,F为蔗糖与表氯醇的支化共聚物,其分子量为大约400000,n为6,24,45或70,而x为3至300的整数,其中F通过醚键与亚甲基基团连接。在一些实施方案中,n为6,而x为90至150。在一些实施方案中,n为45,而x为90至150。
式(I)所示的支化的嵌合化合物中,D的多核苷酸或线性的嵌合化合物的数量可以为3至大约300。即,x为3至300的整数。在一些实施方案中,x为大于(下限)3,6,9,12,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,155,165,190或200的整数。在一些实施方案中,x为小于(上限)300,275,250,225,215,210,205,200,190,180,160,150,140,130,120,110,100,90,80,70,60或50的整数。所述的x可以为大约3至300的整数,其中下限小于上限。例如在一些实施方案中,x为20至300、20至200、60至180、90至150、100至140、或者110至130。在一些实施方案中,x为大约120±30。在优选的实施方案中,x为大约120。
本发明公开的嵌合化合物的典型制备物为由嵌合化合物组成的异源混合物,其中所述的嵌合化合物具有装载率分布,以及特定的平均分子量,或者每个多价载体部分F具有大致数量的D部分,但是试剂和反应条件可以控制,从而取得可再生的所需的装载率。在一个方面中,提供了一种组合物,其包含式(I)所示的一种或多种支化的嵌合化合物或其本发明所述的变体。在一些实施方案中,所述的组合物包含大量的定义装载率和平均分子量的支化的嵌合化合物。在一些实施方案中,所述的组合物包含式(I)所示的化合物的异源混合物,其中D,PEG,L1,L2,L3,F和x独立地如本发明中针对式(I)所述,其中所述混合物的嵌合化合物的F部分的平均分子量为大约200000至大约600000道尔顿,并且其中所述混合物的嵌合化合物的平均装载率(x)为大约60至大约180。
在一些实施方案中,所述的组合物包含式(I)所示的化合物的异源混合物,其中D,PEG,L1,L2,L3,F和x独立地如本发明中针对式(I)所述的那样,其中所述的混合物的嵌合化合物的F部分的平均分子量为大约300000至大约500000(例如大约400000)道尔顿。在一些实施方案中,所述的混合物的嵌合化合物的F部分的平均分子量为大约400,000±100,000道尔顿。在一些实施方案中,所述的组合物包含式(I)所示的化合物的异源混合物,其中D,PEG,L1,L2,L3,F和x独立地如本发明中针对式(I)所述的那样,其中所述的混合物的嵌合化合物的平均装载率(x)为大约90至大约150、或者大约100至大约140(例如大约120)。在一些实施方案中,所述的混合物的嵌合化合物的装载率(x)为大约120±30或大约120±20。在一些实施方案中,所述的组合物包含式(I)所示的支化的嵌合化合物的异源混合物,其中D,PEG,L1,L2,L3,F和x独立地如本发明中针对式(I)所述的那样,其中所述混合物的支化的嵌合化合物的F部分的分子量为大约400,000±100,000道尔顿,并且其中所述的混合物的支化的嵌合化合物的平均装载率为大约120±30。
本发明公开的核苷酸,线性的嵌合化合物和支化的嵌合化合物具有客观的免疫调控活性(例如比非免疫调控对照高至少3倍)。在一些实施方案中,免疫调控活性包括免疫刺激活性。在一些实施方案中,免疫调控活性包括免疫抑制活性。多核苷酸可以是单链的或双链的。多核苷酸可以是RNA,DNA或RNA/DNA杂合体。核苷酸之间的键、核苷酸与HEG间隔之间的键、以及3’末端核苷酸与连接体L1之间的键可以为磷酸酯或硫代磷酸酯。
在一些实施方案中,本发明公开的多核苷酸,线性的嵌合化合物和支化的嵌合化合物具有免疫刺激活性。在这些实施方案中,D包括SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。在一些实施方案中,D包括SEQ ID NOS:9-16中的一者。D的多核苷酸或核酸部分的CpG二核苷酸是非甲基化的。在一些实施方案中,D的多核苷酸或核酸部分的5’-TCG-3’位于5’末端(例如任何其他的核苷酸被加入3’末端)。在优选的实施方案中,多核苷酸不包括Toll样受体(TLR)抑制基元。在优选的实施方案中,多核苷酸不包括TLR7,TLR8和/或TLR9抑制基元。示例性的TLR7抑制基元包括5’-Qz’TGC-3’,5’-Qz’UGC-3’,5’-Qz’TIC-3’和5’-Qz’TTC-3’,其中Q为核苷酸或核苷酸类似物,而z’为0,1或2。即,Qz为多核苷酸的5’末端。示例性的TLR8抑制基元为5’-X1X2X3-My’-3’,其中X1为A,T或C,X2为G或I,X3为I或A,M为核苷酸或核苷酸类似物,而y’为0或1。即,My为多核苷酸的3’末端。示例性的TLR9抑制基元为5’-S1S2S3S4-3’,其中S1,S2,S3和S4均独立地为G或I(次黄嘌呤核苷或2’-脱氧肌苷)。在其中TLR9抑制基元为5’-S1S2S3S4-3’的实施方案中,S1,S2,S3和S4均独立地为G或者能够防止G-tetrad形成和/或防止Hoogsteen碱基配对的分子,例如次黄嘌呤核苷,7-脱氮杂-鸟嘌呤核苷,7-脱氮杂-2'-脱氧黄嘌呤核苷,7-脱氮杂-8-氮杂-2'-脱氧鸟嘌呤核苷,2'-脱氧水粉蕈素,异脱氧鸟嘌呤核苷和8-含氧-2'-脱氧鸟嘌呤核苷。
用于评估免疫刺激活性的测试是本领域已知的,并且在实施例B1和B2中描述。就本发明公开的目的而言,通过在测试化合物存在或缺乏下温育后,通过测量人类外周血单核细胞产生的干扰素α,可以测定免疫刺激活性。据信,在测试化合物存在下产生至少2倍以上的干扰素α时,测试化合物具有免疫刺激活性。应该理解的是阳性和阴性对照用于免疫刺激活性的测试。用于免疫刺激活性的合适的因阴性对照为单独的介质。另一种合适的阴性对照为由核苷酸序列5’-TGACTGTGAA CCTTAGAGAT GA-3’(D56-30,在SEQ ID NO:5中列出)组成的多核苷酸。用于免疫刺激活性的合适的阳性对照为由核苷酸序列5’-TGACTGTGAACGTTCGAGAT GA-3’(D56-10,在SEQ ID NO:6中列出)组成的多核苷酸。
II.嵌合化合物的合成
本发明公开进一步提供了用于制备本发明所述的嵌合化合物(例如支化的嵌合化合物)的方法,以及其中使用的组合物和中间体。
在一个方面中,本发明公开提供了用于制备式(I)所示的支化的嵌合化合物的方法:
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I),
其中:
D为多核苷酸或线性的嵌合化合物;
L1为包含烷硫基基团的第一连接体;
L2为包含琥珀酰亚胺基团的第二连接体;
L3为包含酰胺基团的第三连接体;
PEG为聚乙二醇(例如-(OCH2CH2)n–,其中n为2至80的整数);
x为3至300的整数;以及
F为蔗糖和表氯醇的支化共聚物,其分子量为大约100,000至大约700,000道尔顿,并且通过醚基团与L3连接,
其中所述的多核苷酸包含核苷酸序列:
5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1),其中所述的多核苷酸的长度为低于50个核苷酸,并且其中核苷酸之间的一个或多个键、以及3’末端核苷酸与L1之间的键为硫代磷酸酯键,和
其中所述的线性的嵌合化合物包含3个多核苷酸和2个六乙二醇(HEG)间隔,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2),其中核苷酸之间的一个或多个键、核苷酸与HEG间隔之间的键以及3’末端核苷酸与L1之间的键为硫代磷酸酯键,
其中所述的方法包括:
使式D-L1a-SH所示的化合物与式(II)所示的化合物反应,其中在D-L1a-SH中,D如式(I)所定义,L1a为(CH2)m,其中m为2至9的整数,其中式(II)为:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
其中L3,PEG和F如式(I)所定义;
L2a为 和
y为3至350的整数。
在一些实施方案中,L2a为
在一些情况下,式(II)所示的化合物中每个马来酰亚胺基团与核酸部分D反应。因此,在一些实施方案中,y等于x。在其他的情况下,式(II)所示的化合物中仅一些马来酰亚胺基团与核酸部分D反应,而一些马来酰亚胺基团不与核酸部分D反应。因此,在一些实施方案中,y为大于x的整数。在一些实施方案中,y为大于(下限)3,6,9,12,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,155,165,190或200的整数。在一些实施方案中,y为小于(上限)350,300,275,250,225,215,210,205,200,190,180,160,150,140,130,120,110,100,90,80,70,60或50的整数。所述的y可以为大约3至350的整数,其中下限小于上限。例如在一些实施方案中,y为20至350、30至300、155至215、165至205、20至250、90至250、120至250、120至220、160至220、20至200、60至180、90至150、100至140、或者110至130。在优选的实施方案中,y为大约195、大约185、大约150或者大约120。在一些实施方案中,y为大约190±30或大约185±30。在一些实施方案中,当y为大于x的整数时,不与核酸部分D反应的马来酰亚胺基团被带帽和/或水解。在一些实施方案中,当y为大于x的整数时,不与核酸部分D反应的马来酰亚胺基团被半胱氨酸带帽和/或被水水解。
反应性硫醇化合物D-L1a-SH通常是在使用前由更稳定的二硫化合物制备的。在一些实施方案中,所述的方法进一步包括是式D-L1a-SS-L1a-OH所示的二硫化合物与还原试剂(例如磷化氢化合物)反应。在一些实施方案中,D如式(I)所定义,并且L1a为(CH2)m,其中m为2至9的整数。在这些实施方案的一些实施方案中,m为2,3,4,5,6,7,8或9。在一些实施方案中,m为3至6。在这些实施方案的一些实施方案中,m为3或6。在一个实施方案中,m为6。在一个实施方案中,m为3。还原试剂的一个实例为三(2-羧乙基)磷化氢氢氯化物(TCEP)。
本发明还提供了式D-L1a-SH所示的化合物,或式D-L1a-SS-L1a-OH所示的化合物,其中D为多核苷酸或线性的嵌合化合物,例如本发明详述多核苷酸,或本发明详述的线性的嵌合化合物,并且L1a为(CH2)m,其中m为2至9。在这些实施方案的一些实施方案中,D为包含核苷酸序列的多核苷酸:5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1),其中D的多核苷酸的长度小于50个核苷酸,并且其中核苷酸之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在这些实施方案的一些实施方案中,D为包含3个核酸部分和2个六乙二醇(HEG)间隔的线性的嵌合化合物,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2),其中线性的嵌合化合物包含少于50个核苷酸,并且其中核苷酸之间、核苷酸与HEG间隔之间、以及3’-核苷酸与L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。在这些实施方案的一些实施方案中,D为由5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2)组成的线性的嵌合化合物。在一些实施方案中,D的线性的嵌合化合物中所有的核苷酸之间的键、核苷酸与HEG间隔之间的键、以及3’末端核苷酸与L1之间的键为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,D的线性的嵌合化合物的核酸部分为2’-脱氧核糖核苷酸。在这些实施方案的一些实施方案中,m为2,3,4,5,6,7,8或9。在一些实施方案中,m为3至6。在这些实施方案的一些实施方案中,m为3或6。在一个实施方案中,m为6。在一个实施方案中,m为3。
在一些实施方案中,D-L1a-SH为5'-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’-(CH2)m-SH(SEQ ID NO:2),其中m为2至9的整数。在一些实施方案中,D-L1a-SS-L1a-OH为5'-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’-(CH2)m-SS-(CH2)m-OH(SEQ ID NO:2),其中m为2至9的整数。在这些实施方案的一些实施方案中,m为3或6。在一个实施方案中,m为6。在一个实施方案中,m为3。
本发明所述的多核苷酸、线性的嵌合化合物和二硫化物改性的核酸可以使用本领域已知的方法制备,例如美国专利No.8,114,418中所述的方法。例如多核苷酸可以根据制造商的方案使用亚磷酰胺化学通过固相合成制造,并氧化硫化、纯化和分离。所用的核苷酸单体的实例是5’-二甲氧基三苯甲基保护的-2’-脱氧核苷。线性的嵌合化合物是通过将HEG间隔(例如得自Glen Research,Sterling,VA的Space Phorphoramidite 18)引入多核苷酸中而制成的。在一些实施方案中,多核苷酸和/或线性的嵌合化合物是在固相合成仪上合成的,所述的固相合成仪经程序化而按照所需的顺序加入核苷酸单体、HEG间隔和连接体,并且合成以3’至5’的方向发生。3’-核苷或连接体基团(例如3’-Thiol-Modifier C6S-S CPG)与固体支撑体连接。在一些实施方案中,合成循环由使用酸的脱三苯甲基步骤(例如处于甲苯中的二氯乙酸)、使用亚磷酰胺单体加温和的酸性活化剂的偶联步骤(例如糖精1-甲基咪唑)、氧化硫化步骤(例如处于吡啶中的0.2M Xanthane Hydride)和用于未反应基团的带帽步骤(例如异丁酸酐和N-甲基咪唑)组成。重复合成循环,直至PN和CC序列完全组装。受保护的多核苷酸和嵌合化合物可以被切割并由固体支撑体上脱保护(例如使用处于乙腈中的20%叔丁胺除去氰乙基磷酸保护基团,然后使用浓缩的氨水处理,从而由支撑体上切割PN或CC,以及将所得的溶液在环境温度下保持72小时,从而除去核苷酸上的保护基团)。多核苷酸可以纯化(例如使用阴离子交换色谱)、脱盐(例如通过使用切向流过滤系统超滤/渗滤)、冻干和以冻干固体形式储存。
式(II)所示的化合物中的PEG可以通过使多价多糖F的胺衍生物与包含PEG的活化酯化合物反应而引入。在一些实施方案中,制备式(I)所示的化合物的方法包括使式(III)所示的化合物与式L2a-(PEG)-L3a-Lv所示的化合物反应,其中式(III)所示的化合物:[NH2CH2CH2NHC(O)CH2]z-F(III),其中F如式(I)所定义而z为3至400的整数,其中在式L2a-(PEG)-L3a-Lv中,L2a和PEG如式(II)所定义;L3a为-NHC(O)CH2CH2C(O)–or-C(O)–;而Lv为离去基团,从而形成式(II)所示的化合物。
在一些实施方案中,包含PEG的活化的酯的化合物为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS或HOSu)酯,而Lv为(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)阳极(即,OSu)。本领域已知的其他活化的羧酸或酯可以用于与式(III)所示的胺反应,从而形成式(II)所示的化合物。
在一些实施方案物中,F为蔗糖与表氯醇的支化共聚物,其分子量为大约100,000至大约700,000道尔顿。在一些实施方案中,F为蔗糖与表氯醇的支化共聚物,其分子量为大约400,000±100,000道尔顿(例如PM 400),并且式(III)所示的化合物为400的化合物。根据活化的酯L2a-(PEG)-L3a-Lv(例如NHS酯L2a-(PEG)-L3a-OSu)与所用的式(III)所示的化合物(例如400的化合物)的相对量,式(III)所示的化合物中的一些或所有氨基基团均可以是PEG化的。因此,在一些实施方案中,z等于y。在一些实施方案中,z为大于y的整数。在一些实施方案中,z为大于(下限)3,6,9,12,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,155,165,190或200的整数。在一些实施方案中,z为小于(上限)400,350,300,275,250,225,215,210,205,200,190,180,160,150,140,130,120,110,100,90,80,70,60或50的整数。所述的z可以为大约3至400的整数,其中下限小于上限。例如在一些实施方案中,z为20至400、50至300、190至250、200至240、20至350、30至300、155至215、165至205、20至250、90至250、120至250、120至220、160至220、20至200、60至180、90至150、100至140、110至130。在优选的实施方案中,z为大约220、大约190、大约150、或者大约120。在一些实施方案中,z为大约220±30或者大约220±20。在当z为大于y的整数的实施方案中,过量的胺被带帽。在z为大于y的整数的实施方案中,过量的胺被硫代-NHS-乙酸酯或NHS-乙酸酯带帽。
是使蔗糖与表氯醇交联而合成的,其得到高度支化的结构。氨基乙基羧基甲基-FICOLL()可以通过Inman,1975,J.Imm.114:704-709所述的方法制备。然后,AECM-FICOLL可以与异源双官能交联试剂反应,例如6-马来酰亚胺羊油酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯,然后与硫醇衍生的核酸部分缀合(参见Lee et al.,1980,Mol.Imm.17:749-56)。其他的多糖可以类似地修饰。
在本发明的方法中使用NHS酯(L2a-(PEG)-L3a-OSu)可以得自商业来源,或者通过本领域已知的方法制备。
在一些实施方案中,提供了式(II)所示的化合物:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
其中:
L2a为包含马来酰亚胺基团的部分;
L3为包含酰胺基团的接体;
PEG为聚乙二醇;
y为3至350的整数;以及
F为蔗糖和表氯醇的支化共聚物,并且通过醚基团与L3连接。
在式(II)所示的化合物的一些实施方案中,L3,PEG和F如式(I)所定义或者本发明详细描述的任何变体:
L2a为其中L2b如式(I)所详细描述的那样,或者是它们的任何变体(例如-CH2CH2C(O)NHCH2CH2CH2–,-CH2CH2C(O)NHCH2CH2–,-CH2CH2–或-CH2CH2CH2CH2–);以及
y为本发明式(II)所详细描述的那样。
例如在式(II)所示的化合物的一些实施方案中,F的分子量为大约300,000至500,000道尔顿(例如GE Healthcare的PM 400)。在一些实施方案中,y为大于(下限)3,6,9,12,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140或150的整数。在一些实施方案中,y为大于(下限)3,6,9,12,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,155,165,190或200的整数。在一些实施方案中,y为小于(上限)350,300,275,250,225,215,210,205,200,190,180,160,150,140,130,120,110,100,90,80,70,60或50的整数。所述的y可以为大约3至350的整数,其中下限小于上限。例如在一些实施方案中,为20至350、30至300、155至215、165至205、20至250、90至250、120至250、120至220、160至220、20至200、60至180、90至150、100至140、或者110至130。在优选的实施方案中,y为大约190、大约185、大约150、或者大约120。在一些实施方案中,y为大约190±30或者大约185±30。在一些实施方案中,PEG为式-(OCH2CH2)n–,其中n为2至80的整数。在优选的实施方案中,PEG为-(OCH2CH2)6–。在一些实施方案中,L2a为在一些实施方案中,L3为式其中L3a为能够连接烷基基团和胺的间隔,例如式-NHC(O)CH2CH2C(O)–or-C(O)–所示的间隔。
在一些实施方案中,提供了制备式(II)所示的化合物的方法:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
其中:
L2a为包含马来酰亚胺基团的部分;
L3为包含酰胺基团的接体;
PEG为聚乙二醇(例如-(OCH2CH2)n–,其中n为2至80的整数);
y为3至350的整数;以及
F为蔗糖和表氯醇的支化共聚物,并且通过醚基团与L3连接,
所述的方法包括式(III)所示的化合物与式L2a-(PEG)-L3a-Lv所示的化合物反应,其中式(III)所示化合物为:
[NH2CH2CH2NHC(O)CH2]z-F (III),
其中在式(III)中,F为式(II)所定义,并且z为3至400的整数,并且在式L2a-(PEG)-L3a-Lv中,其中L2a和PEG如式(II)所定义;L3a为-NHC(O)CH2CH2C(O)–,-OC(O)–或-C(O)–;并且Lv为离去基团(例如(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)。
在一些实施方案中,提供了一种组合物,其包含式(II)所示的化合物的异源混合物,其中L2a,PEG,L3,F和y在本发明中独立地如式(II)所描述,其中式(II)所示化合物的异源混合物的F部分的平均分子量为大约200000至大约600000道尔顿,并且其中在异源混合物中,式(II)所示的化合物的平均装载比(y)为大约60至大约250。在一些实施方案中,式(II)所示化合物的异源混合物的F部分的平均分子量为大约300000至大约500000道尔顿。在一些实施方案中,式(II)所示化合物的异源混合物的F部分的平均分子量为大约400000±100,000道尔顿。在一些实施方案中,在异源混合物中,式(II)所示的化合物的平均装载比(y)为大约60至大约250、大约90至大约250、大约120至大约250、大约120至大约220、大约160至大约220、大约60至大约200、大约60至大约180、或者大约90至大约150。在一些实施方案中,在异源混合物中,式(II)所示的化合物的平均装载比为(y)为大约120±30,大约150±30,大约185±30或者大约190±30。在一些实施方案中,所述的组合物包含式(II)所示的化合物的异源混合物,其中L2a,PEG,L3,F和y在本发明中独立地如式(II)所描述,其中式(II)所示的化合物的异源混合物的F部分的平均分子量为大约400,000±100,000道尔顿,并且其中在异源混合物中,式(II)所式的化合物的平均装载率(y)为大约120±30,大约150±30,大约185±30或者大约190±30。
本发明还提供了由本发明详细描述的式(II)所式的化合物的分布制备混合物的方法,所述的混合物包含本发明详细描述的式(I)所式的化合物的分布。在一个方面中,提供了制备式(I)所式的支化的嵌合化合物的异源混合物的方法:
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I)
其中:
D独立地为多核苷酸或线性的嵌合化合物;
L1独立地为包含烷硫基基团的第一连接体;
L2独立地为包含琥珀酰亚胺基团的第二连接体;
L3独立地为包含酰胺基团的第三连接体;
PEG独立地为聚乙二醇(例如-(OCH2CH2)n–,其中n为2至80的整数);x独立地为3至300的整数;以及
F独立地为蔗糖和表氯醇的支化共聚物,其分子量为大约100,000至大约700,000道尔顿,并且通过醚基团与L3连接,
其中所述的多核苷酸包含核苷酸序列:5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ IDNO:1),其中所述的多核苷酸的长度独立地小于50个核苷酸,并且其中核苷酸之间的一个或多个键、以及3’末端核苷酸与L1之间的键为硫代磷酸酯键,以及
其中所述的线性的嵌合化合物独立地包含3个多核苷酸和2个六乙二醇(HEG)间隔,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2),其中核苷酸之间的一个或多个键、核苷酸与HEG间隔之间的键、以及3’末端核苷酸与L1之间的键为硫代磷酸酯键,
所述的方法包括:
使式包含D-L1a-SH所示的化合物的组合物与包含式(II)所示化合物的异源混合物的组合物反应,其中在D-L1a-SH中,D独立地如式(I)所定义,并且L1a为(CH2)m,其中m独立地为2至9的整数,其中式(II)为:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
其中L3,PEG和F独立地如式(I)所定义;
各个L2a独立地为 以及y独立地为3至350的整数;
并且其中包含式(II)所示的化合物的组合物包含式(II)所示的化合物的异源混合物,其中式(II)所示的化合物的异源混合物的F部分的平均分子量为大约200,000至大约600,000道尔顿,并且其中所述的混合物中的式(II)所示的化合物的平均装载率(y)为大约60至大约250。在一些实施方案中,式(II)所示的化合物的异源混合物的F部分的平均分子量为大约400,000±100,000道尔顿。在一些实施方案中,在异源混合物中式(II)所示的化合物的平均装载率(y)为大约120±30,大约150±30,大约185±30或大约190±30。
在一些实施方案中,各个L2a独立地为
在一些实施方案中,提供了一种用于制备组合物的方法,所述的组合物包含式(II)所示的化合物的异源混合物:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
其中:
L2a独立地为包含马来酰亚胺基团的部分;
L3独立地为包含酰胺基团的连接体;
PEG独立地为聚乙二醇(例如-(OCH2CH2)n–,其中n为2至80的整数);y独立地为3至350;以及
F独立地为蔗糖与表氯醇的支化共聚物,并且通过醚基团与L3连接,
所述的方法包括使包含式(III)所示化合物的混合物的组合物与式L2a-(PEG)-L3a-Lv所示的化合物反应,其中式(III)所示化合物为:
[NH2CH2CH2NHC(O)CH2]z-F (III),
其中F如式(II)所定义,并且z独立地为3至400的整数,并且在式L2a-(PEG)-L3a-Lv中,L2a和PEG如式(II)所定义;L3a为-NHC(O)CH2CH2C(O)–,-OC(O)–或-C(O)–;并且Lv为离去基团(例如(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基),并且其中式(III)所示化合物的混合物的F部分的平均分子量为大约200,000至大约600,000道尔顿,并且式(III)所示化合物的混合物的平均装载率(z)为大约60至大约280。
在用于制备组合物的方法的一些实施方案中,其中所述的组合物包含式(II)所示的化合物的异源混合物,L2a,PEG,L3a和Lv如本发明详细描述的那样,并且其中式(III)所示化合物的混合物的F部分的平均分子量为大约300,000至大约500,000道尔顿。在一些实施方案中,式(III)所示化合物的混合物的F部分的平均分子量为大约400,000至大约100,000道尔顿。在一些实施方案中,式(III)所示化合物的混合物的平均装载率(z)为大约50至大约350,大约50至大约280,大约60至大约250,大约60至大约180,大约60至大约150,大约90至大约280,大约90至大约250,大约90至大约200,大约90至大约150,大约120至大约280,大约120至大约250,大约150至大约280,大约150至大约250,大约180至大约280,大约180至大约250,大约200至大约250或者大约210至大约230。在一些实施方案中,式(III)所示化合物的混合物的平均装载率(z)为大约120±30,大约150±30,大约180±30,大约220±30或大约220±20。在一些实施方案中,式(III)所示化合物的混合物为AECM400。
在一些实施方案中,用于制备式(I)所示的支化的嵌合化合物的异源混合物的方法进一步包括使包含本发明详细描述的式(III)所示化合物的混合物的组合物与本发明详细描述的式L2a-(PEG)-L3a-Lv所示的化合物反应。
在一些实施方案中,制备式(I)所示的化合物或者包含式(I)所示化合物的异源混合物的组合物的方法进一步包括纯化式(I)所示的嵌合化合物,和/或中间体化合物的任意一种,例如式(II)所示的化合物和式(III)所示的化合物。在一些实施方案中,所述的方法进一步包括通过渗透来纯化式(I)所示的嵌合化合物。在一些实施方案中,所述的方法进一步包括通过使用100000截留分子量(MWCO)膜的渗透,来纯化式(I)所示的嵌合化合物。
III.药物组合物
还提供为了包含本发明公开的多核苷酸、线性的嵌合化合物或支化的嵌合化合物(例如活性试剂)的药物组合物。所述的药物组合物通常包含药物可接受的赋形剂。在一些实施方案中,所述的药物组合物进一步包含抗原。本发明公开的药物组合物可以为溶液或冻干的固体形式。本发明公开的药物组合物优选为无菌的,并且优选为基本上不含内毒素。
A.赋形剂
本发明公开的药物可接受的赋形剂包括例如溶剂、膨胀剂、缓冲剂、毒性调节剂和防腐剂(例如参见Pramanick et al.,Pharma Times,45:65-77,2013)。在一些实施方案中,药物组合物可以包含作为溶剂、膨胀剂、缓冲剂和毒性调节剂的一种或多种的赋形剂(例如生理盐水中的氯化钠可以作为水性媒介物和毒性调节剂)。本发明公开的药物组合物适用于肠胃外给予。即,本发明公开的药物组合物无意于肠内给予。
在一些实施方案中,药物组合包含水性媒介物作为溶剂。合适的媒介物包括例如无菌水、生理盐水溶液、磷酸盐缓冲生理盐水和Ringer溶液。在一些实施方案中,组合物为等渗的或高渗的。
药物组合物可以包含膨胀剂。当组合物在给予之前待被冻干时,膨胀剂是特别有用的。在一些实施方案中,膨胀剂为有助于在冷冻干燥和/或储存过程中稳定和防止活性试剂降解的冻干保护剂。合适的膨胀剂为糖(单糖、二糖和多糖),例如蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖和棉子糖。
药物组合物可以包含缓冲剂。缓冲剂控制pH,从而抑制活性试剂在处理、储存和可任选的重新构建过程中的降解。合适的缓冲剂包括例如盐,包括乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或硫酸盐。其他合适的缓冲剂包括例如氨基酸,例如精氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。缓冲剂可以进一步包含盐酸或氢氧化钠。在一些实施方案中,缓冲剂保持组合物的pH为4至9。在一些实施方案中,pH大于(下限)4,5,6,7或8。在一些实施方案中,pH小于(上限)9,8,7,6或5。即,pH为大约4.0至9.0,其中下限小于上限。
药物组合物可以包含毒性调节剂。合适的毒性调节剂包括例如右旋糖、甘油、氯化钠、丙三醇和甘露醇。
药物组合物可以包含防腐剂。合适的防腐剂包括例如抗氧化剂和抗微生物试剂。然而,在优选的实施方案中,在无菌条件下制备药物组合物,并且药物组合物处于一次性使用的容器中,因此,无需包含防腐剂。
B.抗原
本发明公开进一步提供了药物组合物,其除了包含多核苷酸、线性的嵌合化合物或支化的嵌合化合物以外,还包含抗原和赋形剂。在包含抗原的本发明公开的组合物中,抗原与多核苷酸、线性的嵌合化合物或支化的嵌合化合物不形成共价连接。在一些优选的实施方案中,抗原为蛋白质抗原。在一些优选的实施方案中,抗原为多糖抗原,其优选地与载体蛋白质共价连接。在一些实施方案中,抗原为微生物抗原、变应原或肿瘤抗原。
所述的药物组合物可以包含选自病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原和寄生虫抗原的微生物抗原。在一些实施方案中,微生物抗原得自会导致非人类、哺乳动物受试对象感染性疾病的微生物。在一些实施方案中,微生物抗原得自会导致人类受试对象感染性疾病的微生物。在一些实施方案中,感染性疾病是由病毒、细菌、真菌或原生动物寄生虫导致的。合适的微生物抗原包括例如腺病毒4型,腺病毒7型,炭疽,结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis),白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(例如白喉类毒素),破伤风杆菌(Clostridium tetani)(例如破伤风类毒素),百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis),流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)B型,甲型肝炎病毒,乙型肝炎病毒(例如HBsAg),人乳头状瘤病毒(6,11,16,18,31,33,45,52和58型)流感病毒A和B型(比如血凝素,neuraminadase),流感病毒B型,副流感病毒,日本脑炎病毒,麻疹病毒,腮腺炎病毒,风疹病毒,魏克塞尔包姆氏杆菌(Neisseria menigitidis)(A,B,C,Y和W-135组),肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(1,3,4,5,6A,6B,7F,9V,14,18C,19A,19F和23F血清型),脊髓灰质炎病毒,狂犬病病毒,轮状病毒,牛痘病毒,伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhi),水痘-带状疱疹病毒,和黄热病病毒(例如参见“www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines”)的抗原。在一些实施方案中,微生物抗原为单纯疱疹病毒1和2型,人类疱疹病毒,人类免疫缺陷病毒1型,和呼吸道合胞体病毒的病毒抗原。在一些实施方案中,微生物抗原为白念珠菌(Candida albicans),黄曲霉(Aspergillus flavus),新型隱球菌(Cryptococcus neoformans),夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum),和肺炎肺囊虫(Pneumocystis carinii)的真菌抗原。在一些实施方案中,微生物抗原为利什曼原虫属的物种,疟原虫属的物种,血吸虫属的物种或锥体虫属的物种的寄生虫抗原。
药物组合物可以包含变应原。在一些实施方案中,变应原为环境抗原,例如哺乳动物、昆虫、植物和霉菌变应原。在一些实施方案中,哺乳动物变应原包括毛和皮屑。合适的哺乳动物变应原包括例如猫Fel d 1,牛Bos d2,狗Can f I和Can f II,马Equ c1,和小鼠MUP。在一些实施方案中,昆虫变应原包括昆虫粪便和毒液。示例性的昆虫变应原包括蚂蚁Sol i2,蜜蜂PLA和Hya,蟑螂Bla g Bd9OK,Bla g4,GST和Per a3,尘螨Der p2,Der f2,Derp10和Tyr p2,马蜂Dol m V,蚊子Aed a 1,以及小黄蜂透明质酸酶和磷脂酶。在一些实施方案中,植物变应原包括草、杂草和树变应原(例如花粉)。合适的草变应原包括例如草地早熟禾,牛尾草,野茅,小糠草,黑麦草,黄花草和梯牧草的变应原。示例性的植物变应原包括大麦Hor v 9,桦树Bet v1和v2,樱桃Pru a 1,玉米Zml3,草Phl p 1,2,4,5,6,7,11和12,Hol15,Cyn d 7和d12,雪松Jun a 2,Cry j 1和j2,杜松Jun o2,胶乳Hev b7,黄芥末Sin a I,油菜籽Bra r 1,豚草Amb a 1,和黑麦Lol p1。在一些实施方案中,霉菌变应原为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)变应原,例如Asp f1,2,3,4和6。在一些实施方案中,变应原为食物变应原,例如水生贝壳类变应原,豆科植物变应原,坚果变应原或奶变应原。示例性的食物变应原包括虾原肌球蛋白,花生Ara h 1,2,3,8和9,胡桃Jug r 1和3,榛实Cor a 1,14和8LTP,牛奶中的乳清蛋白,干酪素和乳铁传递蛋白。
药物组合物可以包含肿瘤抗原。在一些实施方案中,肿瘤抗原为哺乳动物抗原。合适的肿瘤抗原如本领域所述(例如参见Cheever et al.,Clinical Cancer Research,15:5323-5337,2009)。例如合适的肿瘤抗原包括WT1,MUC1,LMP2,HPV E6E7,EGFRvIII,Her-2/neu,独特型,MAGE A3,p53,NY-ESO-1,PSMA,GD2,CEA,MelanA/Mart1,Ras,gp100,蛋白酶3(PR1),bcr-able,酪氨酸酶,存活素,PSA,hTERT,肉瘤易位断点,EphA2,PAP,MP-IAP,AFP,EpCAM,ERG,NA17,PAX3,ALK,雄激素受体,细胞周期蛋白B1,多唾液酸,MYCN,PhoC,TRP-2,GD3,岩藻糖,GM1,间皮素,PSCA,MAGE A1,sLe(a),CYP1B1,PLAC1,GM3,BORIS,Tn,GloboH,ETV6-AML,NY-BR-1,RGS5,SART3,STn,碳酸酐酶IX,PAX5,OY-TES1,精子蛋白17,LCK,HMWMAA,AKAP-4,SSX2,XAGE 1,B7H3,豆荚蛋白,Tie 2,Page4,VEGFR2,MAD-CT-1,FAP,PDGFR-β,MAD-CT-2,和Fos相关抗原1。
IV.使用方法
本发明公开的药物组合物适用于与需要该药物组合物的哺乳动物受试对象中调控免疫应答有关的多种用途。哺乳动物受试对象包括但不限于人类、非人类灵长动物、啮齿动物、宠物和农场动物。在一些实施方案中,调控免疫应答包括刺激免疫应答。在一些实施方案中,调控免疫应答包括抑制免疫应答。在一些实施方案中,药物组合物可以以足以取得特定结果的量给予受试对象。
A.给予的剂量和方式
如同所有药物组合物,给予的有效量和方式可以根据本领域任一技术人员显而易见的多种因素改变。待考虑的因素包括药物组合物是否包含多核苷酸,线性的嵌合化合物或支化的嵌合化合物(例如活性试剂),以及药物组合物是否进一步包含抗原。通常,多价活性试剂(例如支化的嵌合化合物)的剂量第一一价活性试剂(例如多核苷酸和线性的嵌合化合物)的剂量。待考虑的其他因素包括待取得的结果以及待给予的剂量的数量。
合适的剂量范围为提供所需的结果的范围。可以通过给予受试对象的多核苷酸,线性的嵌合化合物或支化的嵌合化合物的量来测定剂量。在受试对象体重所传递的量中,给予的多核苷酸,线性的嵌合化合物或支化的嵌合化合物的示例性剂量范围为大约1至1000mcg/kg。在一些实施方案中,剂量大于大约(下限)1,5,10,50,100,150,200,250,300,350,400,450或500mcg/kg。在一些实施方案中,剂量小于大约(上限)1000,900,800,700,600,500,450,400,350,300,250,200,150或100mcg/kg。即,剂量为大约1至1000mcg/kg的任何剂量,其中下限小于上限。在待传递给受试对象的量中,给定的多核苷酸,线性的嵌合化合物或支化的嵌合化合物的示例性剂量范围为大约100至5000mcg。在一些实施方案中,剂量为大于大约(下限)100,500,1000,1500,2000,2500,3000,3500或4000mcg。在一些实施方案中,剂量为小于大约(上限)5000,4500,4000,3500,3000,2500,2000,1500或1000mcg。即,剂量为大约100至5000mcg的任何剂量,其中下限小于上限。
在一些实施方案中,当药物组合物进一步包含抗原时,待传递给受试对象的量的给定抗原剂量范围为大约1mcg至50mcg。在一些实施方案中,抗原剂量大于大约(下限)1,5,10,15,20,25,30,35或40mcg。在一些实施方案中,抗原剂量小于大约(上限)50,45,40,35,30,25,20,15或10mcg。即,抗原剂量为大约1至50mcg的范围的任何剂量,其中下限小于上限。
类似地,合适的给予途径为提供所需的作用的途径。通常,本发明公开的药物组合物意图用于肠胃外给予(例如非口服给予或直肠给予)。合适的给予途径包括注射、局部和吸入。具体而言,本发明公开的药物组合物可以通过诸如肌肉内,皮下,表皮静脉(基因枪),经皮和吸入之类的途径给予。适用于吸入给予的装置包括例如雾化器,蒸馏器,喷雾器,和干燥粉末的吸入传递装置。在一些实施方案中,当所述的药物组合物意图用于治疗实体肿瘤时,所述的组合物通过肿瘤内给予。
合适的定量给予方案为在预防或治疗内容中提供所需的作用的剂量方案。通过所选途径给予的剂量的数量可以为一剂或多于一剂。定量给予的频率可以为每周、每两周、每月、每两个月、或者3至12个月(剂量之间)。在一些实施方案中,给予2个剂量,并且第二剂量在第一剂量之后的1至2个月给予。在一些实施方案中,给予3个剂量,并且在第一剂量之后的1至2个月给予第二剂量,而且在第二剂量之后的1至5个月给予第三剂量。在其他的实施方案中,给予每两周或每个月给予3或4个剂量。在其他的实施方案中,在剂量之间可以经过更短或更长的时间。在某些实施方案中,连续剂量之间的间隔可以在周的数量或月的数量方面改变。在一个实施方案中,每周可以给予2,3,4,5或6剂的系列,然后在其后的时间点每周给予一定数量的剂量的第二系列。本领域的任一技术人员能够通过测量生物学结果来调节剂量方案,例如实施例中举例说明的那样,例如抗原特异性抗体赢应答或肿瘤消退。
B.免疫应答的刺激
本发明公开的药物组合物适用于与在需要该药物组合物的哺乳动物受试对象中调控免疫应答有关的多种用途。在一些实施方案中,哺乳动物受试对象为人类患者。在一些实施方案中,药物组合物用于刺激哺乳动物受试对象的免疫应答。在一些实施方案中,药物组合物用于抑制哺乳动物受试对象的免疫应答。在一些实施方案中,将药物组合物给予受试对象,从而得到特定的结果。
简言之,本发明公开提供了刺激哺乳动物受试对象的免疫应答的方法,其包括向哺乳动物受试对象给予足以刺激哺乳动物受试对象的免疫应答的量的药物组合物。“刺激”免疫应答是指增加免疫应答,其可以由激发新的免疫应答(例如由于初始接种方案的结果)或者增强现有的免疫应答(例如加强接种方案的结果)产生。在一些实施方案中,刺激免疫应答包括以下的一种或多种:刺激IFN-α产生;刺激IL-6产生;刺激B淋巴细胞增殖;刺激干扰素途径相关的基因表达;刺激化学引诱物相关的基因表达;以及刺激浆细胞样树突状细胞(pDC)成熟。用于测量免疫应答的刺激的方法是本领域已知的,并且在本发明公开的生物学实例中有所描述。在其中药物组合物进一步包含抗原的实施方案中,刺激免疫应答包括诱导抗原特异性抗体的应答。
例如在其中药物组合物进一步包含抗原的一些实施方案中,本发明公开提供了通过向哺乳动物受试对象给予足以在哺乳动物受试对象中诱导抗原特异性抗体应答的量的药物组合物而在哺乳动物受试对象中诱导抗原特异性抗体应答的方法。“诱导”抗原特异性抗体应答是指将抗原特异性抗体的效价增高至阈值水平以上,例如预给予的基线效价或血清保护水平。
本发明公开进一步提供了预防哺乳动物受试对象的感染性疾病的方法,其包括向哺乳动物受试对象给予足以预防哺乳动物受试对象的感染性疾病的量的药物组合物。即,在一些实施方案中,本发明公开提供了预防性疫苗。在一些实施方案中,哺乳动物受试对象处于暴露于感染性试剂的风险之下。“预防”感染性疾病是指保护受试对象免疫发展成感染性疾病。在一些实施方案中,预防感染性疾病进一步包括保护受试对象免于被感染性试剂感染(例如保护受试对象免于发展成急性或慢性感染)。此外,本发明公开提供了减轻哺乳动物受试对象中感染性疾病的症状的方法,其包括向哺乳动物受试对象给予足以减轻该哺乳动物受试对象的感染性疾病的症状的量的药物组合物。即,在一些实施方案中,本发明公开提供了治疗疫苗。在一些实施方案中,受试对象被感染性试剂急性或慢性感染。感染性疾病可以为病毒、细菌、真菌或寄生虫疾病。在一些实施方案中,药物组合物可以进一步包含病毒、细菌、真菌或寄生虫抗原。“减轻”感染性疾病的症状是指改善症状,优选的是减弱疾病的程度。
此外,本发明公开提供了减轻哺乳动物受试对象中IgE相关紊乱的症状的方法,其包括向哺乳动物受试对象给予足以减轻哺乳动物受试对象中IgE相关紊乱的症状的量的药物组合物。在一些优选的实施方案中,IgE相关紊乱为过敏反应。过敏反应包括但不限于过敏性鼻炎(枯草热)、鼻窦炎、湿疹和荨麻疹。在一些实施方案中,药物组合物可以进一步包含变应原。“减轻”IgE相关紊乱的症状是指改善症状,优选的是减弱紊乱的程度。例如如果IgE相关紊乱为过敏性鼻炎,则减轻症状是指减少鼻粘膜的肿胀、减少流鼻涕(流鼻水)和/或减少打喷嚏。
此外,本发明公开提供了治疗哺乳动物受试对象的方法,其包括向哺乳动物受试对象给予足以治疗该哺乳动物受试对象的癌症的量的药物组合物。“治疗”癌症是指得到大致有利的临床结果,例如与缺乏治疗的预期生存相比,得到消退或者以其他方式延长生存。在一些实施方案中,当癌症为实体肿瘤时,“治疗”癌症包括缩小实体肿瘤的尺寸,或者以其他方式减少活力癌细胞的数量。在其他的实施方案中,当癌症为实体肿瘤时,“治疗”癌症包括延迟实体肿瘤的生长。
免疫应答的分析(定性和定量)可以为本领域已知的任何方法,包括但不限于测量抗原特异性抗体的产生(包括测量特异性抗体亚类)、淋巴细胞(例如B细胞和辅助T细胞)特异性群体的活化、细胞因子(例如IFN-α,IL-6,IL-12)的产生和/或组胺的释放。用于测量抗原特异性抗体应答的方法包括酶联免疫吸附测试(ELISA)。可以通过增殖测试和荧光激活细胞分类术(FACS)来测量淋巴细胞的特异性群体的活化。还可以通过ELISA测量细胞因子的产生。
优选的是,刺激(即,激发或增强)Th1型免疫应答。对于本发明公开,与未使用活性试剂处理的对照细胞相比,通过测量使用本发明公开的活性试剂(多核苷酸,线性的嵌合化合物或支化的嵌合化合物)处理的细胞的细胞因子的产生可以体外或离体测定刺激Th1型免疫应答。“Th1型细胞因子”的实例包括但不限于IL-2,IL-12,IFN-γ和IFN-α。相反,“Th2型细胞因子”包括但不限于IL-4,IL-5和IL-13。用于测定免疫刺激活性的细胞包括免疫系统的细胞,例如抗原提呈细胞淋巴细胞,优选的是巨噬细胞和T细胞。合适的免疫细胞包括原代细胞,例如外周血单核细胞,包括浆细胞样树突状细胞和B细胞,或者由哺乳动物受试对象分离得到的脾细胞。
通过测量在给予前和给予后的IL-2,IL-12和干扰素的水平或者与未使用活性试剂处理的对照受试对象相比,还可以在使用本发明公开的活性试剂(多核苷酸,线性的嵌合化合物或支化的嵌合化合物)处理的哺乳动物受试对象中测定刺激Th1型免疫应答。还可以通过测量Th1型与Th2型抗体效价的比值来测定刺激Th1型免疫应答。“Th1型”抗体包括人类IgG1和IgG3、以及鼠科IgG2a。相反,“Th2型”抗体包括人类IgG2,IgG4和IgE,以及鼠科IgG1和IgE。
在一些实施方案中,本发明公开提供了试剂盒,其包含药物组合物(包含赋形剂以及多核苷酸、线性的嵌合化合物或支化的嵌合化合物),以及一组将所述的组合物用于本发明所述的方法中的相关说明书。试剂盒的药物组合物都被适当地包装。例如如果药物组合物是冷冻干燥的粉末,则通常使用具有弹性塞的小瓶,使得粉末可以容易地通过将流体注射通过弹性塞而再次悬浮。在一些实施方案中,所述的试剂盒进一步包含用于给予药物组合物的装置(例如注射器和针)。与药物组合物的用途有关的说明书通常包括用于预期使用方法的关于剂量、时间表和给予途径有关的信息。在其中试剂盒包含抗原的一些实施方案中,抗原可以与多核苷酸,线性的嵌合化合物或支化的嵌合化合物包装或不包装在相同的容器中。
实施例
缩写:BCC(支化的嵌合化合物);CC(嵌合化合物);HEG(六乙二醇);LCC(线性的嵌合化合物);MWCO(截留分子量);PEG(聚乙二醇);PN(多核苷酸);Sp(间隔);TFF(正切流动过滤)。
尽管清晰和理解,通过举例和实例大致详细地描述了本发明公开,但是对于本领域的那些技术人员而言显而易见的是某些变化和修改是可以实施的。因此,以下合成和生物学实例不应该解释为限定本发明公开的范围,本发明公开的范围是通过所附的权利要求书描述的。
合成实施例
实施例S1:多核苷酸和嵌合化合物的结构
表S1-1示出实施例中所指的多核苷酸(PN)和嵌合化合物(CC)的结构。多核苷酸和嵌合化合物中的核苷酸为2’-脱氧核糖多核苷酸。HEG为六乙二醇间隔部分。其他间隔在说明书和附图中描述。除了表S1-1或者具体实例中所述的那些,所有核苷酸之间的键以及核苷酸部分与间隔部分之间的键均为硫代硫酸酯键。表S1-1还是出具有末端连接基团(例如-(CH2)6-SS-(CH2)6-OH,-(CH2)6-SH,-(CH2)3SS-(CH2)3-OH,-(CH2)3SH,HO(CH2)6-SS-(CH2)6-和HS(CH2)6-)的CC(例如D56-02,D56-03,D56-07,D56-08,D56-10,D56-11),其中所述的末端连接基团用于连接具有支化的载体部分的那些分子(例如[马来酰亚胺-PEGn]y-FICOLL),从而创建支化的CC。这些连接基团通过末端核苷酸或间隔部分使多核苷酸或CC与磷硫酰键连接。通过缀合策略制备支化的CC(例如[(D56-01)-PEGn]x-FICOLL),其具有实施例中所述的连接基团。
表S1-1:多核苷酸(PN)和嵌合化合物(CC)的结构
当化合物与具有定义的SEQ ID NO的化合物的唯一差异处于与D的3’核苷酸连接的非核酸部分时,该化合物以相同的SEQ ID NO给出。此外,核酸部分包含少于10个核苷酸的化合物未指定SEQ ID NO,因此命名上文所述的NA(不适用)。FICOLL简称为FIC。
实施例S2:多核苷酸(PN)和嵌合化合物(CC)的合成
根据制造商的方案,使用亚硫酰胺化学以及氧化硫化通过固相合成来制造多核苷酸,并纯化和分离(Molecules 2013,18,14268-14284)。所用的核苷酸单体为5’-二甲氧基三苯甲基保护的-2’-脱氧核苷,3’-((2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基))-亚磷酰胺。对于CC,使用18-O-二甲氧基三苯甲基六乙二醇,1-((2-氰基乙基)-(N,N-异丙基))-亚磷酰胺(例如得自Glen Research,Sterling,VA的Space Phorphoramidite 18)引入HEG间隔。对于D56-11,使用1-O-二甲氧基三苯甲基-己基-二硫化物-1’-((2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基))-亚磷酰胺(例如得自Glen Research,Sterling,VA的Thiol-Modifier C6S-S)引入5’-C6-二硫化物连接体。对于D56-07,使用1-O-二甲氧基三苯甲基-丙基-二硫化物,1’-琥珀酰基-固体支撑体(例如得自Glen Research,Sterling,VA的3’-Thiol-Modifier C3S-S CPG)引入3’-C3-二硫化物连接体。对于D56-02,使用1-O-二甲氧基三苯甲基-己基-二硫化物,1’-琥珀酰基-固体支撑体(例如得自Glen Research,Sterling,VA的3’-Thiol-Modifier C6S-S CPG或者作为得自Prime Synthesis的定制订单)引入3’-C6-二硫化物连接体。
在固相合成仪上合成PN和CC,其中所述的固相合成仪经编程以所需的顺序加入核苷酸单体、HEG间隔和连接体,并且合成以3’至5’的方向进行。3’-核苷或连接体基团(例如3’-Thiol-Modifier C6S-S CPG)与固体支撑体连接。合成循环由使用酸的脱三苯甲基步骤(例如处于甲苯中的二氯乙酸)、使用亚磷酰胺单体加温和的酸性活化剂的偶联步骤(例如糖精1-甲基咪唑)、氧化硫化步骤(例如处于吡啶中的0.2M Xanthane Hydride)和用于未反应基团的带帽步骤(例如异丁酸酐和N-甲基咪唑)组成。重复合成循环,直至PN和CC序列完全组装。受保护的PN和CC被切割并由固体支撑体上脱保护(例如使用处于乙腈中的20%叔丁胺除去氰乙基磷酸保护基团,然后使用浓缩的氨水处理,从而由支撑体上切割PN或CC,以及将所得的溶液在环境温度下保持72小时,从而除去核苷酸上的保护基团)。使用阴离子交换色谱纯化多核苷酸、使用切向流过滤系统通过超滤/渗滤脱盐、并冻干。PN和CC以冻干固体的形式储存。
以10mmol规模制造D56-02。其外观为白色粉末,发现分子量为7780(理论值为7785Da),反相HPLC的纯度为85%,通过离子交换HPLC的纯度为86%。
通过TriLink Biotechnologies(San Diego,CA)制备Alexa555-(D56-01)(aka荧光标记的D56-01)。Alexa牌荧光染料由Molecular Probes,Inc.(Eugene,OR)出售。
实施例S3:D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)的制造
D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)的制造方案由3个阶段组成,如图1所示。其他与FICOLL的PN或CC缀合物可以通过相同的制造途径,通过改变PN或CC序列、PN或CC的硫醇连接体和/或与胺的交联剂的硫醇来制备。
在阶段1中,FICOLL在多个步骤中改性,从而包含反应性马来酰亚胺基团,由此得到[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL。在阶段2中,D56-02(aka(D56-01)-3’-SS)中的二硫化物被还原成硫醇,从而形成D56-03(aka(D56-01)-3’-SH)。在阶段3中,[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL与D56-03反应,从而形成D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)。纯化在所述的工艺的各个步骤中进行。最终的D56-05溶液经无菌过滤并表征。D56-05溶液储存在<-60℃下。
图2概括了用于制造FICOLL中间体羧甲基化(CM)-FICOLL,氨基乙基氨基甲酰基甲基化[AECM]z-FICOLL,和[马来酰亚胺(Mal)-PEG6]y-FICOLL,以及最终产物D56-05,aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL的工艺。
I.FICOLL PM400的组成。FICOLL PM400(FICOLL400)为合成的中性的高度支化的蔗糖聚合物,其报告分子量为400,000+/-100,000,其以纳米颗粒的悬液形式存在。其是通过蔗糖与表氯醇的共聚而形成。FICOLL PM400以喷雾干燥的粉末形式购自GE Healthcare(Pittsburgh,PA)。
II.阶段1,步骤1:羧甲基化-FICOLL(CM-FICOLL)的制备。
CM-FICOLL通过Inman,J.Immunology,1975,114:704-709的方法由FICOLL PM400制备,不同之处在于实施使用切向流分级(TFF)(100kDa MWCO膜)的纯化替代使用标准的脱盐过程(例如使用5kDa截留分子量(MWCO)膜的透析)。类似于标准的脱盐过程,TFF纯化除去小分子和过量的试剂。
在碱性条件下通过使FICOLL PM400与氯乙酸钠反应来生产CM-FICOLL。反应方案如图3所示。在Milli-Q去离子水中制备130mg/mL的FICOLL PM400(13g)溶液。在40-45min内,将溶液转移至与40℃循环水浴连接的夹套反应容器中。向该FICOLL溶液中加入92.5mL2.7M氯乙酸钠溶液,50mL 10N氢氧化钠溶液和7.5mL Milli-Q去离子水。反应在40℃下进行2.5小时,同时进行搅拌。然后,将反应溶液转移至冰冷的玻璃瓶中并放置在冰上。此后,立即将10mL 2M磷酸钠缓冲剂pH 4加入至反应溶液中,并通过加入20%氯乙酸溶液将pH调节至7.0。将粗品CM-FICOLL保持在低温下(在冰上)直至易于纯化。使用切向流分级(TFF)膜(100kDa MWCO)的系统设置,通过透析纯化粗品CM-FICOLL。针对0.2M氯化钠水溶液透析粗品CM-FICOLL,总计大约15-18个体积的交换。在215nm下测量各个渗透diavolume的吸光率,并且在渗透吸光率达到0.1AU时终止透析。将纯化的CM-FICOLL溶液浓缩至大约30mg/mL并储存在-80℃下。通过该工艺制备3批CM-FICOLL,每批均由13g FICOLL PM400开始。CM-FICOLL的产率为6.7g,7.1g和7.7g。
III.阶段1,步骤2:N-(2-氨基乙基)氨基甲酰基甲基化-FICOLL(aka[AECM]z-FICOLL)的制备。通过Inman(J.Immunology,1975,114:704-709)的方法,由CM-FICOLL制备[AECM]z-FICOLL,不同之处在于实施使用切向流分级(TFF)(100kDa MWCO膜)的纯化替代使用标准的脱盐过程(例如使用5kDa截留分子量(MWCO)膜的透析)(如部分B中针对CM-FICOLL所述)。
通过使CM-FICOLL与大量过量的乙二胺和水溶性碳二亚胺反应来生产[AECM]z-FICOLL。反应方案如图4所示。在20-30min内,将CM-FICOLL溶液(大约30mg/mL,处于0.2M氯化钠水溶液中)转移至与22℃循环水浴连接的夹套反应容器中。向该CM-FICOLL溶液中,加入乙二胺二氢氯化物(大约13800摩尔当量/FICOLL),并完全溶解。使用1N氢氧化钠水溶液将上述溶液的pH调节至4.7。接着,经过10min的时间将N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺氢氯化物(EDC-HCl,大约835摩尔当量/FICOLL)加入至混合物中,同时进行搅拌。检查溶液的pH,如果需要,使用1N氢氧化钠水溶液或1N氯化氢水溶液将pH调节至4.7。所述的反应在22℃下进行3.5小时,并且在该过程中,如果需要,将pH调节至4.7。使用切向流分级(TFF)膜(100kDa MWCO)的系统设置,通过透析纯化粗品[AECM]z-FICOLL。针对100mM磷酸钠和150mM氯化物,pH 7.5缓冲剂透析粗品[AECM]z-FICOLL,总计大约15-20个体积的交换。在215nm下测量各个渗透diavolume的吸光率,并且在渗透吸光率达到0.1AU时终止透析。将纯化的[AECM]z-FICOLL溶液浓缩至大约33mg/mL并使用0.22μm孔径的过滤器过滤、等分,再储存于-80℃下。通过该工艺制备3批[AECM]z-FICOLL,每批由6.5g,7.0g和7.5g CM-FICOLL开始。[AECM]z-FICOLL的分别产率为5.4g,5.9g和6.9g。使用实施例S4和实施例S5中所述的过程测定的胺与FICOLL摩尔比(z)分别为221、218和224。
IV.SM-PEG6异源双官能连接体的组成。(琥珀酰亚胺-((N-马来酰亚胺丙酰胺)-六乙二醇)酯)得自Thermo Scientific(编号#22105Rockford,IL)。SM-PEG6为分子量601.6的胺-与-硫氢基连接体,其包含6个乙二醇单元的亲水性聚乙二醇(PEG)间隔臂。间隔臂的长度为大约32埃。SM-PEGn的一般化学结构如图5所示。对于SM-PEG6,n=6,并且所用的化合物的结构如图5A所示。对于实施例S13中D56-25,D56-26和D56-27的制备,分别使用n=24,45和70的SM-PEGn。
V.阶段1,步骤3:使用SM-PEG6的[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL的制备。通过使[AECM]z-FICOLL与SM-PEG6反应来制备[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL。反应方案如图6所示。将[AECM]z-FICOLL溶液(20mg/mL,处于100mM磷酸钠和150mM氯化钠,pH 7.5缓冲剂中,胺与FICOLL摩尔比(z)=218-224)转移至包含搅拌棒的塑料瓶中。在分开的玻璃瓶中,将SM-PEG6溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,至最终浓度为100mg/mL溶液。将SM-PEG6溶液(5当量/胺)缓慢加入至[AECM]z-FICOLL中,同时进行搅拌。将反应瓶转移至25℃干燥空气培养箱中,并使反应进行40min,同时温和的搅拌。然后将反应瓶转移至室温(22-24℃)。
使用磺基-N-羟基琥珀酰亚胺-乙酸酯(Su-NHS-Ac,Thermo Scientific,Rockford,IL)将FICOLL上未反应的胺带帽。将Su-NHS-Ac溶解于玻璃瓶中的DMSO中至浓度为100mg/mL。将Su-NHS-Ac溶液(5当量/胺)加入至[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL溶液中,并在室温下搅拌15min。该带帽反应将FICOLL上未反应的胺转化成乙酰胺,其对于所得的FICOLL产物的物理化学性质是重要的。
使用甘氨酸猝灭未反应的SM-PEG6和Su-NHS-Ac。将甘氨酸溶解于100mM磷酸钠和150mM氯化钠,pH 7.5缓冲剂中,至浓度为100mg/mL,并使用0.22μm孔径的过滤器过滤溶液。将甘氨酸溶液(10当量/SM-PEG6和Su-NHS-Ac的总量)加入至[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL溶液中,并在室温下搅拌15min。
将[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL粗品制备物保持在低温(湿冰上)下,直至易于纯化,其在缀合反应当天进行。使用切向流分级(TFF)膜(100kDa MWCO)的系统设置,通过透析纯化粗品[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL。使用100mM磷酸钠和150mM氯化物,pH 7.5缓冲剂将粗品[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL稀释至大约5.8mg/mL,并针对100mM磷酸钠和150mM氯化物,pH 7.5缓冲剂透析,总计大约24-29个体积的交换。在215nm下测量各个渗透diavolume的吸光率,并且在渗透吸光率达到0.1AU时终止透析。将纯化的[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL等分至无菌聚丙烯瓶中,并储存于-80℃下。浓度为大约5.3mg/mL。对于2个最大规模的反应(试批次4和5),使用655mg和1900mg[AECM]z-FICOLL,并分离444mg和1288mg纯化的[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL。
通过在实施例S4和实施例S6中概括的过程来测定[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL的马来酰亚胺与FICOLL摩尔比(y)。表S3-1示出使用3批不同的[AECM]z-FICOLL、2批不同的SM-PEG6连接体和2个不同规模的生产而生产的[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL的一致性。具有特定范围的马来酰亚胺:FICOLL摩尔比(y为大约162-221)的[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL的生产需要控制以下试剂盒工艺参数:1)胺:FICOLL摩尔比(z)为大约218-224的[AECM]z-FICOLL的制备;2)具有高纯度SM-PEG6的连接体;以及3)关于试剂浓度、化学计量比、离子强度、pH、时间和温度的定义的反应条件。
表S3-1:使用3批不同的[AECM]z-FICOLL和2批不同的SM-PEG6在Bench和中试级别下[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL的一致生产
通过尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC),使用表S3-2中所示的参数来评估[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL中试批次4和5的纯度。用于粗品和纯化的中试批次4和5的色谱示于图7中。纯化的中试批次4和5分别是100%和99.6%纯的。
表S3-2:用于纯度测定的SEC-HPLC方法
体积 | TOSOH TSK-Gel G3000PWXL |
维度 | 7.8mm x 30cm |
床体积 | 14.3ml |
流速 | 0.75ml/min |
流动相 | 10mM磷酸钠,141.7mM氯化钠,pH 7.2缓冲剂 |
运行时间 | 20min |
检测 | UV,在215和260nm下 |
注射体积 | 20μl |
使用SM-PEG6连接体制造的[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL比使用磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)连接体制造的[马来酰亚胺-MC]y-FICOLL明显更溶解于水性缓冲剂中,这之前在美国专利No.8,597,665中有所描述。磺基-SMCC连接体得到疏水性甲基环己基(MC)连接基团,这导致[马来酰亚胺-MC]y-FICOLL在冷冻/溶解循环(多个)后出油和/或在水性缓冲剂中沉淀,并导致与硫醇活化的多核苷酸(PN)或嵌合化合物(CC)不可靠的反应。如果[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL或[马来酰亚胺-MC]y-FICOLL不在它们制备的当天使用,则它们必须冷冻储存,使得马来酰亚胺基团保持活性。[马来酰亚胺-MC]y-FICOLL的异源混合物不能用于与D56-03(aka(D56-01)-3’-SH)的缀合反应中,这是由于它们较差的稳定性。[马来酰亚胺-MC]y-FICOLL的合成,参照实施例S14。
F.阶段2,步骤1:D56-03(aka(D56-01)-3’-SH)的制备。通过D56-02(二硫化物)与过量的三(2-羧乙基)磷化氢氢氯化物(TCEP)反应来制备D56-03(硫醇)。反应方案如图8所示。在生产的当天,由冷冻柜中除去D56-02(aka(D56-01)-3’-SS),并使其在室温下平衡至少1-2小时,然后打开瓶子,使得吸湿的冻干固体的水份吸收最少。将D56-02溶解于活化缓冲剂(100mM磷酸钠,150mM氯化钠,1mM乙二胺四乙酸(EDTA),pH7.5)中,至公称浓度大约56mg/mL。使用22.65mg/mL-1cm-1消光系数在260nm下通过吸光率来测定溶液的实际浓度。使用活化缓冲剂将浓度调节至大约25mg/ml,并通过在260nm下的吸光率证实。
TCEP-HCl得自Thermo Scientific(Catalog#20490,Rockford,IL)。在生产的当天,将TCEP-HCl溶解于活化缓冲剂中,至浓度48±1mg/mL。将TCEP溶液保持在环境lab温度下并在3小时内使用。
在室温下向D56-02溶液中加入TCEP溶液(5当量),并搅拌。将反应容器转移至40±2℃水浴中,并使还原步骤进行120±10min。使所得的粗品D56-03溶液在室温下冷却大约10-15min,然后纯化。对于中试批次4,在989mg D56-02上实施所述的反应,对于中试批次5,在1814mg和1836mg D56-02两份上实施所述的反应。
使用包装于XK50/30柱(GE Healthcare)中的Sephadex G-25Fine(编号#17-0032,GE Healthcare,Pittsburgh,PA),根据制造商建议的过程通过凝胶过滤进行D56-03的纯化。通过AKTA净化器色谱系统(GE Healthcare,formerly Amersham Pharmacia Biotech)控制G25脱盐色谱柱。将粗品D56-03溶液以样品体积与柱体积的比例15-16%装载至G25柱中。将流动相以流速30cm/hr施加于柱上。在215nm和260nm下监测柱的洗脱液,并且在洗脱液吸光率升高至高于大约100mAU时,开始样品收集。收集装载在柱上的样品体积的大约1.6至1.7倍的总体积。等分纯化的D56-03溶液,并储存在-80℃下。中试批次4和5的纯化细节如表S3-3详细描述。
表S3-3:D56-03中试批次4和5的纯化
使用表S3-2中概括的过程,通过SEC-HPLC测定D56-03的纯度,并且对于中试批次4和5,纯度为100%(图9)。对于中试批次4和5,分别分离802mg和2904mg D56-03。
G.阶段3,步骤1:D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL的制备。通过使[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL与D56-03(aka(D56-01)-3’-SH)反应来制备D56-05。反应方案如图10所示。
[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL和D56-03均是反应性的,并且彼此小心处理。将材料在-80℃下冷冻储存,并恰好在使用前的几小时内在4℃的水浴中解冻。将[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL溶液(大约5.3mg/mL,马来酰亚胺:FICOLL摩尔比(y)=206-221)转移至包含搅拌棒的塑料瓶中。向该溶液中加入D56-03溶液(大约11.5mg/mL,0.64-0.69当量/马来酰亚胺,141当量/FICOLL),同时进行搅拌。使用100mM磷酸钠,150mM氯化钠,pH 7.5来调节反应瓶中的体积,从而获得D56-03最终浓度5mg/mL。然后,将缀合的反应物转移至25℃干燥空气培养箱中,并在温和搅拌下使反应进行1小时。对于中试批次4,使用218mg[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL和600mg D56-03。对于中试批次5,使用874mg[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL和2400mg D56-03。
使用处于100mM磷酸钠,150mM氯化钠,pH 7.5缓冲剂中的100mg/mL半胱氨酸溶液(10当量/马来酰亚胺)在室温下将FICOLL上未反应的马来酰亚胺基团带帽。然后,将粗品[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL转移至冷藏室(2-8℃)中并过夜储存。该带帽反应将半胱氨酸引入至FICOLL上(通过硫的共价键),并且对于D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)产物的物理化学性质而言是重要的。
如表S3-4中所述,通过透析实施D56-05的纯化。使用10mM磷酸钠,142mM氯化钠,pH7.5缓冲剂调节粗品D56-05的体积。在各diavolume(渗透的体积等于供料库中起始样品的体积)中,取得渗透样品从而测定在215nm下的吸光率。在渗透吸光率降低至0.05AU以下时终止透析。在透析完全时,由TFF系统回收D56-05样品,并使用0.22μm过滤器无菌过滤。将D56-05等分,并储存在<-60℃下。表征D56-05中试批次并将结果提供于实施例S9中。
表S3-4:用于D56-05中试批次4和5透析的参数和条件
a Diavolume为渗透的体积,其相当于供料库中样品的体积。各个diavolume为一个缓冲剂交换。
b透析后D56-05中试5的体积为近似值。未实施实际体积测量。
实施例S4:在包含FICOLL中间体和产物中测定FICOLL浓度的过程
使用the Pierce Glycoprotein Carbohydrate Estimation Kit(产品编号#23260,Thermo Scientific,Rockford,IL)根据制造商的方案测定包含FICOLL的中间体和产物的FICOLL浓度,不同之处在于使用FICOLL PM400创建用于测试的标准曲线。
实施例S5:测定[AECM]z-FICOLL溶液中胺浓度和胺:FICOLL摩尔比(z)的过程
使用the Pierce Fluoraldehyde OPA Reagent Solution(产品编号#26025,Thermo Scientific,Rockford,IL)根据制造商的方案,测定[AECM]z-FICOLL的胺浓度。使用甘氨酸来创建用于测试的标准曲线。通过胺浓度除以FICOLL浓度来计算胺:FICOLL摩尔比(z),其中如实施例S4中所述来测定FICOLL浓度并且浓度以摩尔浓度单位计。
实施例S6:测定[马来酰亚胺]y-FICOLL溶液中马来酰亚胺浓度和马来酰亚胺:FICOLL摩尔比(y)的过程
使用Ellman试剂(5,5’-二硫-双-(2-硝基苯甲酸),产品编号No.22582,ThermoScientific,Rockford,IL来测定[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL和[马来酰亚胺-MC]y-FICOLL的马来酰亚胺浓度。根据制造商的方案,[马来酰亚胺]y-FICOLL与过量的半胱氨酸反应,并使用半胱氨酸标准曲线来定量剩余的半胱氨酸。由初始半胱氨酸浓度减去剩余的半胱氨酸浓度来测定马来酰亚胺浓度。通过马来酰亚胺浓度除以FICOLL浓度来计算马来酰亚胺:FICOLL摩尔比(y),其中如实施例S4中所述来测定FICOLL浓度并且浓度以摩尔浓度单位计。
实施例S7:测定FICOLL缀合物(例如D56-05,aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)中多核苷酸(PN)或嵌合化合物(CC)浓度、以及PN:FICOLL或CC:FICOLL摩尔比(x)的过程
使用紫外分光光度计和Beer定律方程来测定D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)的D56-01(CC)浓度。(注意传统上,与FICOLL连接的嵌合化合物以序列名称命名,D56-01,即使在该阶段使用具有连接体的嵌合化合物D56-03来形成所述的化合物)。测定在260nm下的吸光率,并且对于D56-01,使用消光系数22.65mg/ml-1x cm-1。FICOLL和连接体在260nm下不吸收光,因此吸光仅是由于CC(D56-01)吸收光。对于D56-01,使用游离酸的分子量将D56-01浓度(以mg/mL计)转化成摩尔浓度。通过CC浓度除以FICOLL浓度来测定CC:FICOLL摩尔比(x),其中如实施例S4中所述来测定FICOLL浓度并且浓度以摩尔浓度单位计。如果合适,对于所用的PN或CC,使用消光系数和游离酸分子量来测定其他PN-FICOLL或CC-FICOLL溶液的浓度。
实施例S8:测定粒径的过程
使用Malvern Zetasizer设备通过动态光散射(DLS)测量FICOLL样品的粒径(Z平均粒径)和标准偏差(SD)。将样品在10mM磷酸钠,142mM氯化钠,pH 7.2缓冲剂中稀释成FICOLL浓度为0.5mg/mL,并在所定义的设备系统下测量。分析中包含校准的50nm聚苯乙烯纳米球样品(产品编号#3050A,Thermo Scientific,Rockford,IL)作为系统合适的对照,并且粒径为49±6nm。
实施例S9:纯化的D56-05,aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL物理化学表征
使用实施例S3中概括的过程来制造5个中试批次的D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)。将这些批次表征,并将结果概括于表S9-1中。使用表S3-2中概括的过程,通过SEC-HPLC测定纯度,并且在215nm下检测,纯度范围为>99%至100%。通过实施例S4中描述的过程来测定FICOLL浓度。通过控制渗透中滞留物的最终浓度可以靶向FICOLL浓度。通过实施例S7中所述的过程来测定D56-01浓度和D56-01:FICOLL比(x)。D56-01:FICOLL摩尔比(x)范围为117至140,证明实施例S3中所述的制造过程提供了用于将嵌合化合物装载于FICOLL上的高水平的对照。该工艺的靶向D56-01:FICOLL摩尔比(x)为120±30。如实施例S8中所述测定D56-05的粒径。
表S9-1:纯化的D56-05中试批次的物理特征的概括
a通过视觉评价测定外观。
b使用SEC-HPLC二氧化硅基柱,使用表S3-2中的参数,并且在215nm下检测来测定纯度和残余的D56-03(aka(D56-01)-3’-SH)。
c如实施例S4中所述来测定FICOLL浓度。
d如实施例S7中所述来D56-0浓度和D56-01:FICOLL摩尔比(x)。
e如实施例S8中所述来测定平均粒径。
表S9-1中所示的结果表明5个连续生产的中试批次D56-05的生产的一致性。通过使用实施例S3中概括的试剂和过程取得D56-05的重要属性D56-01:FICOLL摩尔比(x)和粒径的高水平的控制。使用SM-PEG6连接体替代磺基-SMCC连接体来制造[马来酰亚胺]y-FICOLL是关键的,这是因为SM-PEG6连接体使得产生明显更高的水溶性,从而得到马来酰亚胺:FICOLL摩尔比(y)和与D56-03的反应性的改善的控制。此外,试剂的品质(纯度)以及工艺参数(包括当量数量、浓度、pH、离子强度、时间和温度,如实施例S3中所述)的控制对于取得一致的结果是关键的。在实施例S4-S8中所述的分析过程的研发对于所述的工艺的控制也是必须的。
实施例S10:D56-05冻干配制物
D56-05溶液配制物储存在高于5℃下的稳定性的局限导致D56-05冻干配制物的研发,并且其目的在于在受控室温下取得良好的稳定性(参见实施例S11)。待冻干的配制物的组成的选择基于使用Generally Regarded as Safe(GRAS)赋形剂的预配制研究,从而控制pH和离子强度,这可以影响热稳定性。针对冷冻/解冻稳定性来测试基于D56-05灵长动物剂量的一系列测试配制物,并在溶液澄清度和HPLC排阻色谱上评价。包含1mg/ml D56-05(中试批次2),10mM磷酸钾(pH=7.5)和300mM海藻糖的配制物通过10个循环试验显示理想的色谱行为和动态光散射谱,并对其进行选择以用于进一步的研发。上文所述的配制物经过冻干循环,其由在大约-35℃下的搁架式冷冻(~60μbar真空)、在-35℃下36小时的初步干燥、2小时过度至30℃的搁架温度、以及另外24小时的二次干燥组成。冻干的产物(40小瓶)为可接受的块状,其显示残余水份为1-1.4%。在1mL水中再次构建配制物,并且当在配制或者在冻干或再次构建工艺后直接分析产物时,通过SEC-HPLC,该产物显示一致的发挥作用。
实施例S11:D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)溶液和冻干配制物的稳定性
本实施例描述了液体和冻干物质的稳定性。
A.D56-05溶液配制物的稳定性。评价经过12个月的储存,D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)溶液配制物的稳定性。溶液配制物由D56-05溶解于10mM磷酸钠,142mM氯化钠,pH 7.2缓冲剂中组成,浓度为大约3-5mg/mL。在-80℃、5℃和37℃的储存温度下评价D56-05溶液配制物(中试批次4)的稳定性。稳定性测试包括pH、D56-01浓度(实施例S7)、通过SEC-HPLC的D56-05的%纯度(表S3-2,在215nm下检测)和粒径分析(实施例S8)。
表S11-1和表S11-2显示在-80℃、5℃和37℃下储存至多12个月的D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)溶液配制物中试批次4的稳定性结果。时间0的结果示于表S9-1中。表S11-1:D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)溶液配制物,中试批次4的稳定性结果
a聚合物柱(TSK-Gel G3000PWXL)用于测试1个月的稳定性样品。二氧化硅柱(TSK-Gel G3000SWXL)用于测试3,6,9和12个月稳定性时间点的样品。在215nm下测定纯度。
b储存在37℃的以下样品由于帽管断裂而损害,因此不能分析。这些样品以N/A报告(数据不可利用)。
表S11-2:D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)溶液配制物,中试批次4稳定性样品的粒径分布
对于D56-05溶液配制物中试批次4,pH、D56-01浓度、D56-05纯度和粒径在至多12个月内不会随着在冷冻(-80℃)或冷藏(5℃)条件下储存而显著改变。然而,在37℃下,pH和D56-05纯度会随着较长的储存时间而显著降低,而D56-01浓度和粒径保持一致。在不同储存条件下D56-05粒径的一致性显示D56-05不会随着时间而聚集。
B.D56-05冻干配制物的稳定性。评价D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)冻干配制物经历12个月后的稳定性。冻干的配制物如实施例S10所述。在4℃、25℃和37℃的储存温度下评价D56-05冻干配制物的稳定性。稳定性测试包括pH、D56-01浓度(实施例S7)、通过SEC-HPLC的D56-05的%纯度(表S3-2,在215nm下检测)和粒径分析(实施例S8)。
表S11-3示出在至多12个月内储存在4℃、25℃和37℃下的D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)冻干配制物的稳定性结果。表S11-3中还包含冻干之前(冻干前)D56-05配制物的数据。
表S11-3:D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)冻干配制物(实施例S10中的配制物)的稳定性结果
对于D56-05冻干配制物,pH、D56-01浓度和D56-05纯度在至多12个月内不会随着在4℃、25℃和37℃下储存而显著改变。粒径在至多12个月内在4℃下储存也是稳定的。然而,对于在25℃下储存12个月的产品而言,观察到粒径最小的增大,而对于在37℃下储存12个月的样品而言,粒径大幅增大(大约6x)是明显的。不过,在任何温度下在12个月的储存以后,体外生物学活性(人类B细胞IL-6产生)未变。得到的结论是冻干的配制物在25℃下在至少12个月内是足够稳定的。
尽管D56-05溶液配制物在冷冻(-80℃)和冷藏(5℃)储存条件下是稳定的,但是与处于溶液中的D56-05相比,D56-05冻干的配制物展现出增强的稳定性,特别是在25℃和37℃的较高的储存温度下更是如此。
实施例S12:使用不同的马来酰亚胺:FICOLL摩尔比(y)的[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL的制备、以及D56-01:FICOLL摩尔比(x)在纯化的D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)中的影响
使用实施例S3部分E所述的过程,由(AECM)z-FICOLL(胺:FICOLL摩尔比(z)=224)生产具有不同马来酰亚胺:FICOLL摩尔比(y)的[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL批次,不同之处在于在更小的规模下,并且使用不同量的SM-PEG6(0.25,0.5,0.75,1.0,&2.0当量/胺)。通过实施例S4和S6中所述的过程来测定马来酰亚胺:FICOLL摩尔比(y)。表S12-1中的结果显示加入不同量的SM-PEG6得到马来酰亚胺:FICOLL摩尔比(y)为8至185的[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL批次。然后,[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL批次与D56-03(1.1当量/马来酰亚胺)反应,并且所得的D56-05批次如实施例S3部分G中所述进行纯化。D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)批次的D56-01:FICOLL摩尔比(x)如实施例S4和S7中所述来测定,并且范围为24-154(表S12-1)。这些结果显示在D56-05中D56-01的装载可以通过[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL制备物中使用的SM-PEG6的量来控制。对于这些化合物的体外效力,参见实施例B9。
表S12-1:具有不同马来酰亚胺:FICOLL比值(y)的[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL批次制备物的概括、以及D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)中D56-01摩尔比(x)的作用
ND=未进行
实施例S13:使用n分别=24,45和70的SM-PEGn连接体的D56-25,D56-26和D56-27(aka[(D56-01)-PEGn]x-FICOLL)的制备
使用实施例S3部分E中所述的过程,由(AECM)z-FICOLL(胺:FICOLL摩尔比(z)=224)生产具有不同PEG连接体长度的[马来酰亚胺-PEGn]y-FICOLL批次,不同之处在于在更小的规模下,并且使用n分别=24,45和70的SM-PEGn连接体(对于SM-PEGn的化学结构,参见图5)。所用的SM-PEG24试剂得自Thermo Fisher(Rockford,IL),其具有图5A中所示的结构,其中n为24。所用的SM-PEG45和SM-PEG70试剂得自Nanocs Inc.,(New York,NY);并且结构如图5-B所示(n分别为45和70)。所得的[马来酰亚胺-PEGn]y-FICOLL批次的马来酰亚胺:FICOLL摩尔比(y)如实施例S4和S6中所述,并且结果示于表S13-1中。马来酰亚胺:FICOLL摩尔比(y)的范围为199至227,显示PEG连接体的长度不会显著影响所得的马来酰亚胺:FICOLL摩尔比。
如实施例S3部分G所述,由3个[马来酰亚胺-PEGn]y-FICOLL批次来制备D56-25,D56-26和D56-27(aka[(D56-01)-PEGn]x-FICOLL,其中n分别=24,45和70),不同之处在于在更小的规模下。如实施例S4和S7所述,测定[(D56-01)-PEGn]x-FICOLL批次(D56-05(n=6),D56-25(n=24),D56-26(n=45)和D56-27(n=70))的D56-01:FICOLL摩尔比(x),并且如实施例S8所述,测定平均粒径。D56-01:FICOLL摩尔比(x)的范围为108至116(表S13-1),显示PEG连接体的长度不会显著影响所得的D56-01:FICOLL摩尔比。然而,平均粒径增加(55nm至91nm),这与PEG连接体长度的增加有关(表S13-1)。对于这些化合物的体外效力,参见实施例B10。
表S13-1:SM-PEGn连接体长度对[(D56-01)-PEGn]x-FICOLL性质的影响
a如实施例S8所述来测定平均粒径。
实施例S14:[马来酰亚胺-MC]y-FICOLL的制备
如美国专利No.8,597,665所述,使用磺基-SMCC连接体由[AECM]z-FICOLL制造[马来酰亚胺-MC]y-FICOLL。[马来酰亚胺-MC]y-FICOLL在水性缓冲剂中显示溶解性问题,观察到出油和/或沉淀。处理马来酰亚胺-MC-FICOLL中的困难使得与硫醇活化的多核苷酸(PN)或嵌合化合物(CC)的缀合反应不一致。
实施例S15:Alexa555-(D56-05)(aka Alexa555/[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)的制备
Alexa555(Alexa555-NHS酯)的胺反应性衍生物购自LifeTechnologies(Foster City,CA)。根据实施例S3中所述而制备的AECM-FICOLL通过与Alexa555-NHS酯和SM-PEG6的混合物反应而被活化,从而形成Alexa555/[马来酰亚胺-PEG6]y-FICOLL,如实施例S3所述,其与D56-03(aka(D56-01)-3’-SH)反应,从而产生Alexa555-(D56-05)(aka Alexa555/[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)。
实施例S16:D56-08,D56-09,D56-12和D56-13的制备
如美国专利No.8,597,665所述,制备D56-08,D56-09,D56-12和D56-13。
实施例S17:Alexa647-(D56-05)(aka Alexa647/[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)的制备
Fluor 647–NHS酯(Life Technologies)与rPA反应,从而产生Alexa647/rPA,并且所得的比为一个Alexa647/rPA。
生物实施例
实施例B1:人类白细胞的分离和刺激
通过测量人类外周血单核细胞(PBMC)和分离的B细胞的细胞因子的分泌以及通过测量B细胞增殖,体外评估多核苷酸(PN)和嵌合化合物(CC)的活性。通过酶联免疫吸附测试(ELISA)来测量分泌至细胞培养介质中的细胞因子的水平。
由健康的人类供者,在知情同意下获得人类血液。通过FICOLL-Paque(GEHealthcare,UK)密度梯度离心而分离PBMC。使用抗CD19微珠(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)通过阳性选择来分离人类B细胞。使用抗BDCA-2微珠(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)通过阳性分泌来分离人类浆细胞样树突状细胞(pDC)。将分离的pDC加回至总PBMC池中,得到供者的总PBMC中的最终pDC浓度为0.5至2.4%。
将细胞再次悬浮于RPMI-1640(BioWhittaker,Walkersville,MD)中,其补充有10%热灭活的胎牛血清(FBS)(Gemini,West Sacramento,CA),加上50U/ml青霉素,50μg/ml链霉素,2mM L-谷氨酰胺,10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲剂和1mM丙酮酸钠(BioWhittaker,Walkersville,MD)。对于B细胞的刺激而言,将细胞以0.75x 106/mL在96孔圆底板(具有浓度范围为5.5-0.0054μM的PN或CC)中以2个平行培养90-93h。对于PBMC和pDC富集的PBMC刺激而言,将细胞以2.5x106/mL在96孔圆底板(具有浓度范围为2.5-0.0012μM的PN或CC)中以3个平行培养21-24h。
ELISA测试。使用市售可得的抗体对(MabTech,Inc.Cincinnati,OH)测试IL-6和IFN-α水平;对于IL-6,最低检测极限为31pg/mL,对于IFN-α,最低检测极限为23pg/mL。96孔Maxisorp Immuno板涂敷细胞因子特异性Ab,然后使用处于DPBS中的1%BSA封闭。加入细胞培养物样品,通过加入生物素标记的二级抗体,然后加入辣根过氧化物酶和过氧化物酶特异性比色底物检测结合的细胞因子。使用购自R&D Systems(Minneapolis,MN)(用于IL-6)和MabTech(用于IFN-α)的重组细胞因子生成标准曲线。使用SpectraMax 190或VersaMax微板读取器(Molecular Devices Corporation,Sunnyvale,CA),在450nm下测定吸光率值,并且背景减除(650nm)。通过插值所列的所有供者的累积平均值,由各个单个的供者计算半数有效浓度(EC50)值。EC50定义为PN或CC浓度,得到等于最大细胞因子水平的一半的值。
实施例B2:小鼠脾细胞的分离和刺激
通过测量小鼠脾细胞细胞因子的分泌,体外评估多核苷酸(PN)和嵌合化合物(CC)的活性。通过酶联免疫吸附测试(ELISA)来测量分泌至细胞培养介质中的细胞因子的水平。
收获8至20周龄BALB/c小鼠的脾,并使用标准的分离部件分离脾细胞,再使用ACK裂解缓冲剂(BioWhittaker,Inc.Walkersville,MD)处理。试验中汇集了4个脾。将细胞再次悬浮于RPMI-1640中,其补充有10%热灭活的胎牛血清(FBS),加上50μM 2-巯基乙醇,50U/ml青霉素,50μg/ml链霉素,2mM L-谷氨酰胺,10mM HEPES和1mM丙酮酸钠。为了刺激,将脾细胞以3.5x 106/mL在96孔平底板(具有浓度范围为22-0.0003μM的PN或CC)中以3个平行培养20-24h。
ELISA测试。使用市售可得的抗体对(BD Biosciences,San Jose,CA)测试IL-6和IL-12p40水平;对于IL-6,最低检测极限为31pg/mL,对于IL-12p40,最低检测极限为63pg/ml。96孔Maxisorp Immuno板涂敷细胞因子特异性Ab,然后使用处于DPBS中的1%BSA封闭。加入培养物上清液,通过加入生物素标记的二级抗体,然后加入HRP和过氧化物酶特异性比色底物检测结合的细胞因子。使用购自BD Biosciences的重组细胞因子生成标准曲线。使用SpectraMax 190或VersaMax微板读取器(Molecular Devices Corporation,Sunnyvale,CA),在450nm下测定吸光率值,并且背景减除(650nm)。EC50定义为PN或CC浓度,得到等于最大细胞因子水平的一半的值。使用X=Log(X)转化数据(使用GraphPad Prism软件)的sigmoidal剂量应答曲线拟合来测定IL-6和IL-12p40的EC50值。
实施例B3:线性的嵌合化合物(CC)的序列优化
实施2个分开的试验。在以下表格中,平均值是指几何平均数。
A.试验1。线性CC D56-14之前显示会由人类PBMC诱导IFN-α,由人类B细胞诱导IL-6,并且刺激小鼠脾细胞(美国专利No.8597665)。实施序列优化以测定IFN-α活性是否相对于D56-14被改善。在初步筛选测试中检验7种新的线性CC,即,人类PBMC IFN-α活性和人类B细胞IL-6活性(参见实施例B1的过程)。在本实施例中使用的线性CC的一般结构N1-S1-N2-S2-N3可以用于描述CC内的核酸基元(N)的位置。在本研究中6种新的CC在N3位置处均包含小鼠基元5-AACGTTC-3’。D56-24在N2位置处包含小鼠基元,并且包含在筛选中以研究线性CC内容中小鼠活性基元的不同位置。D56-10是已知的CpG-B免疫刺激序列(ISS),并且作为阳性对照包含在面板中。
表B3-1:试验1的CC面板,人类PBMC IFN-α应答EC50(mM)
供者# | D56-10 | D56-14 | C56-15 | D56-16 | D56-18 | D56-19 | D56-21 | D56-22 | D56-24 |
Do 1 | NC | 0.061 | 0.057 | 0.045 | 0.047 | 0.104 | ND | ND | ND |
Do 2 | NC | 0.102 | 0.109 | 0.058 | 0.104 | 0.105 | ND | ND | ND |
Do 3 | NC | 0.072 | 0.068 | 0.054 | 0.059 | 0.078 | 0.112 | 0.067 | 0.029 |
Do 4 | NC | 0.071 | 0.094 | 0.065 | 0.085 | 0.095 | 0.142 | 0.070 | 0.051 |
Do 5 | NC | 0.055 | 0.110 | 0.096 | 0.056 | 0.121 | 0.227 | 0.053 | 0.042 |
Do 6 | NC | 0.068 | 0.079 | 0.059 | 0.077 | 0.145 | 0.187 | 0.056 | 0.050 |
Do 7 | NC | ND | 0.129 | 0.096 | ND | 0.125 | 0.377 | 0.122 | 0.081 |
Do 8 | NC | 0.056 | 0.112 | 0.059 | 0.100 | 0.109 | 0.333 | 0.093 | 0.052 |
Ave | NC | 0.069 | 0.095 | 0.066 | 0.076 | 0.110 | 0.230 | 0.077 | 0.051 |
SD | NC | 0.016 | 0.025 | 0.019 | 0.022 | 0.021 | 0.106 | 0.026 | 0.017 |
计数 | 0 | 7 | 8 | 8 | 7 | 8 | 6 | 6 | 6 |
SEM | NC | 0.006 | 0.009 | 0.007 | 0.008 | 0.007 | 0.043 | 0.011 | 0.007 |
平均值 | NC | 0.068 | 0.092 | 0.064 | 0.073 | 0.109 | 0.210 | 0.074 | 0.048 |
NC=不可由剂量应答曲线计算的;ND=特定供者不能测定的。
表B3-2:试验1的CC面板,人类B细胞IL-6应答EC50(mM)
供者# | D56-10 | D56-14 | C56-15 | D56-16 | D56-18 | D56-19 | D56-21 | D56-22 | D56-24 |
Do 9 | 0.101 | 0.126 | 0.270 | 0.075 | 0.264 | ND | ND | ND | ND |
Do 10 | 0.097 | 0.053 | 0.119 | 0.052 | 0.154 | 0.128 | 0.235 | 0.044 | 0.056 |
Do 11 | NC | 0.068 | 0.144 | 0.078 | 0.159 | 0.146 | 0.341 | 0.066 | ND |
Do 12 | 0.048 | 0.048 | 0.078 | 0.066 | ND | ND | ND | ND | ND |
Do 13 | ND | 0.056 | ND | 0.056 | 0.148 | 0.137 | 0.407 | 0.047 | 0.059 |
Do 14 | 0.052 | 0.053 | 0.072 | 0.051 | 0.156 | 0.075 | 0.256 | 0.050 | 0.059 |
Do 15 | 0.120 | 0.081 | 0.183 | 0.056 | 0.213 | 0.184 | 0.747 | ND | ND |
Do 16 | 0.084 | 0.128 | 0.217 | 0.116 | 0.219 | ND | ND | ND | ND |
Do 17 | 0.075 | 0.066 | 0.217 | 0.064 | 0.171 | 0.144 | 0.303 | 0.057 | 0.052 |
Ave | 0.082 | 0.075 | 0.162 | 0.068 | 0.185 | 0.136 | 0.382 | 0.053 | 0.057 |
SD | 0.026 | 0.031 | 0.071 | 0.020 | 0.042 | 0.035 | 0.189 | 0.009 | 0.003 |
计数 | 7 | 9 | 8 | 9 | 8 | 6 | 6 | 5 | 4 |
SEM | 0.010 | 0.010 | 0.025 | 0.007 | 0.015 | 0.014 | 0.077 | 0.004 | 0.002 |
平均值 | 0.079 | 0.071 | 0.147 | 0.066 | 0.182 | 0.131 | 0.352 | 0.052 | 0.056 |
NC=不可由剂量应答曲线计算的;ND=不可测定的
线性CC D56-16,D56-18,D56-19,D56-22和D56-24显示与D56-14相比,相似的或改善的PBMC IFN-α活性(表B3-1)、以及相似的或稍微降低的人类B细胞活性(表B3-2)。线性CCD56-24显示所检验的序列的最佳的PBMC IFN-α和人类B细胞活性。如上文所述,D56-24与其他序列之间的基本差异在于N2和N3人类和小鼠基元在D56-24中分别转换,使得与其他新的CC中的N3位置相比,小鼠基元位于N2位置中。
B.试验2。基于试验1的结果,设计一组新的CC序列,其目的在于增加人类和小鼠的活性。具体而言,设计与D56-16,D56-18,D56-19和D56-22有关的4条新的序列:D56-17,D56-01,D56-20和D56-23,其中小鼠基元移动至N2位置。在小鼠脾细胞上实施新CC的初始体外筛选(表B3-3和表B3-4)。在N2位置中具有小鼠基元的所有序列均显示与N3位置具有小鼠基元的相应的CC相比,强烈改善的IL-6和IL-12p40效力。D56-01和D56-23显示所检验CC的最佳IL-6效力,同时D56-01具有最佳的IL-12p40效力。
表B3-3:试验2的CC面板,小鼠脾细胞IL-6应答EC50(mM)
表B3-4:试验2的CC面板,小鼠脾细胞IL-12p40应答EC50(mM)
人类PBMC IFN-α活性和人类B细胞IL-6活性的结果分别示于表B3-5和表B3-6中。令人吃惊的是,在N2位置处具有小鼠基元还会显著改善人类PBMC IFN-α效力。通常,对于N2位置处具有小鼠基元的CC而言,人类IL-6效力也改善。
在所实施的体外测试中,认为IFN-α效力最能预示在癌症、抗病毒、哮喘和过敏反应模型中良好的体内活性。基于此,认为D56-01,D56-17,D56-20,D56-23和D56-24是先导候选物。这些序列还显示良好的人类B细胞IL-6和小鼠IL-6活性。令人吃惊的是,与其他N2小鼠基元序列相比,D56-01具有显著改善的IL12p40效力。
表B3-5:试验2的CC面板,人类PBMC IFN-α应答EC50(mM)
ND=未测定
表B3-6:试验2的CC面板,人类B细胞IL-6应答EC50(mM)
实施例B4:D56-05比D56-01诱导更有效的体外应答
基于人类和小鼠细胞因子的诱导效力,选择D56-01作为先导候选物来研发纳米颗粒配制物。如实施例S3中所述,D56-01序列与FICOLL缀合,从而生成D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)。然后针对用于诱导人类PBMC IFN-α和人类B细胞IL-6的相对体外效力,比较D56-01和D56-05。人类PBMC IFN-α活性和人类B细胞IL-6活性的结果分别示于表B4-1和表4-2中。序列D56-10和D56-14在本试验中用作历史阳性对照。
纳米颗粒配制物D56-05在IFN-α(表B4-1)和IL-6或(表B4-2)的诱导中是引人侧目的更有效的。
表B4-1:人类PBMC IFN-α对D56-01和D56-05EC50(mM)的应答
NC=不可由剂量应答曲线计算;ND=不可测定
表B4-2:人类B细胞IL-6对D56-01和D56-05EC50(mM)的应答
供者# | D56-10 | D56-14 | D56-01 | D56-05 |
Do 17 | 0.067 | 0.074 | 0.076 | 0.019 |
Do 18 | 0.078 | 0.072 | 0.065 | 0.015 |
Do 19 | 0.078 | 0.080 | 0.089 | 0.018 |
Do 20 | 0.061 | 0.067 | 0.063 | 0.014 |
Do 21 | ND | 0.077 | 0.069 | 0.020 |
Do 22 | ND | 0.050 | 0.050 | 0.014 |
Do 23 | ND | 0.051 | 0.054 | 0.011 |
Do 24 | ND | 0.073 | 0.073 | 0.018 |
Do 25 | ND | 0.057 | 0.061 | 0.013 |
Ave | 0.071 | 0.074 | 0.072 | 0.017 |
SD | 0.008 | 0.005 | 0.010 | 0.003 |
计数 | 4 | 5 | 5 | 5 |
SEM | 0.004 | 0.002 | 0.005 | 0.001 |
几何平均值 | 0.071 | 0.074 | 0.072 | 0.017 |
ND=不可测定
实施例B5:D56-05比D56-01诱导更有效的体内应答
评价在将D56-05和D56-01给予小鼠和食蟹猴后天然免疫应答的诱导。在猴子中,在给予D56-05和D56-01之前和之后24小时收集的血液样品中,测量干扰素途径相关的基因表达。在小鼠中,在化合物给予后18小时收获的注射位点引流淋巴结中,测量干扰素途径和趋化因子相关的基因表达。在化合物注射后24小时由小鼠收获的注射位点引流淋巴结中,评价获得D56-05和D56-01的抗原提呈细胞群体的相对能力。此外,在由化合物注射后20小时收获的淋巴结得到的浆细胞样树突状细胞(pDC)上,测量成熟标志物的表达(CD69,CD86)。
在Valley Biosystems,(West Sacramento,CA)或者在Battelle BiomedicalResearch Center(Columbus,OH)饲养食蟹猴(Macaca fascicularis),其中实施所有的生命过程。在各个研究中仅使用健康的成年动物。在免疫前和免疫后将全血收集于PAXgene管(QIAGEN,Venlo,NL)中,并根据制造商提供的说明书冷冻用于后期RNA的提取。使用得自(Annapolis,MD)的单独的10μg炭疽重组保护性抗原(rPA),或者与处于1mL PBS中的1000,250或50μg D56-05、或者1000或250μg D56-01组合,通过肌肉内途径(四头肌)免疫3至6组猴子。
就免疫原性研究而言,使用rPA通过i.m.(四头肌)或s.c.途径免疫多组食蟹猴,其中所述的rPA具有/不具有处于总体积1ml Dulbecco’s PBS(DPBS)(得自BioWhittaker(Walkersville,MD))的一定剂量的D56-01或D56-05,并且随后抽血以评估佐剂对Ab应答的作用。
Swiss Webster,BALB/c和C57BL/6小鼠(8-12周龄)均购自Charles RiverLaboratoies(Hollister,CA),并且在Pacific BioLabs(Hercules,CA)或Murigenics(Vallejo,CA)饲养,其中实施所有的生命过程。TLR9-/-小鼠被保持在SimonsenLaboratories(Gilroy,CA)中,并且在8-16周龄时使用。
对于免疫原性、组织分布和系统毒性研究而言,使用具有/不具有rPA的佐剂,或者单独使用rPA在四头肌处注射小鼠。对于评估肌肉组织应答的研究而言,使用单独的佐剂在四头肌处双侧注射小鼠。对于引流淋巴结应答,包括基因表达和流式细胞系评估,使用具有/不具有rPA的佐剂在2个后足垫中注射小鼠。当使用D56-01–Alexa555时,其与未标记的D56-01以匹配Alexa555/D56-05–特异性相对荧光的比例结合使用。所有的免疫均是在总量50μL DPBS或10mM磷酸钠缓冲剂中实施的。
对于基因表达分析而言,使用DPBS或者10μg D56-05或D56-01通过肌肉内或皮下途径(足垫)注射小鼠。在6小时或18小时分别将肌肉组织和引流淋巴结收获至RNAlater(QIAGEN,Venlo,The Netherlends)中,并根据制造商提供的说明书冷冻,以用于后期的RNA提取。为了通过流式细胞仪定量化合物的细胞吸收,在注射25μg荧光标记的D56-01或D56-05后24小时,收获引流淋巴结。分别参照用于制造Alexa555-(D56-01)和Alexa555-(D56-05)的实施例S2和S15。对于使用流式细胞仪的细胞表面标志物的分析而言,在注射5,2或0.2μg非荧光标记的D56-01或D56-05后20小时,收获引流淋巴结。对于流式细胞仪试验而言,由处理组汇集的淋巴结制备单一细胞的悬液。
在RNAlater(Qiagen,Venlo,The Netherlands)中冷冻器官。使用Rneasy纤维组织迷你试剂盒(Qiagen)由30mg每种单个的均化肌肉分离总RNA,并使用Rneasy迷你试剂盒(Qiagen)由整个均化的腘窝淋巴结分离总RNA,并且二者均进行柱上DNase I消化。
逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。使用Recombinant RNasin RibonucleaseInhibitor(Promega,Madison,WI),Oligo(dT)15(Promega),Random Primers(Promega),dNTP(Invitrogen,Carlsbad,CA)和SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)由总RNA样品制备cDNA。使用Power SYBR Green master mix(LifeTechnologies)进行mRNA定量。循环条件为:95℃,15min;然后在95℃,15秒,60℃,1min,40轮;并且使用StepOne v2.1软件通过Applied Biosystems(Carlsbad,CA)StepOnePlusReal Time PCR系统进行分析。泛素用作参照基因。在PCR后,测定Ct值,并且归一化的数据表示为高于预免疫或DPBS对照升高的倍数。备选地,通过RT2First Strand Kit(Qiagen),与用于细胞因子和趋化因子的RT2Profiler PCR array system(Qiagen)一起使用,根据制造商提供的指导逆转录RNA。
流式细胞仪。由小鼠组织制备单细胞悬液,并将试验组汇聚,除了肌肉,其首先使用2mg/ml胶原酶2型(Worthington Biochemical Lakewood,NJ)在37℃下消化45min。将细胞使用克隆的2.4G2mAb封闭FcgR后在包含0.1%BSA的DPBS(具有/不具有2mM EDTA)中在4℃下染色30min。将细胞在最终浓度1%的福尔马林中固定最少20min,然后洗涤,并再次悬浮于FACS流动缓冲剂中。针对CD3ε(145-2C11),CD4(GK1.5),CD8a(53-6.7),CD11b(M1/70),CD11c(HL3),CD19(6D5),CD45R/B220(RA3-6B2),CD49b(DX5),CD69(H1.2F3),CD86(GL-1),CD95(Jo2),CD279(J43),CD317/PDCA-1(eBio927),CXCR5(2G8),F4/80(BM8),Ly-6C(AL-21),Ly-6G(1A8),MHC II类(MHC II;I-A/I-E)(M5/114.15.2),以及T和B细胞活化Ag(GL7)的Ab购自BD Biosciences(San Jose,CA),BioLegend(San Diego,CA)或eBioscience(SanDiego,CA)。生物素标记的花生凝集素(PNA)购自Vector Laboratories(Burlingame,CA)。在LSR II(BD Biosciences,San Jose,CA)流式细胞仪上收集流式细胞仪数据,并使用FlowJo software(Tree Star,Ashland,OR)分析。在ImageStreamX mk II(Amnis,Seattle,WA)上收集多色成像流式细胞仪数据,并使用IDEAS v6.1软件分析。使用具有0.9数值孔径和2.5-mm有效景深的360镜头捕获图像。借助于明亮细节相似性(BDS)识别可能具有共同定位的荧光信号的的细胞。BDS评分通过比较空间位置和重叠程度,定量细胞内荧光标志物之间的共同定位,从而计算图像的非均值归一化的Pearson相关系数。BDS评分超过2阈值水平的事件可能具有荧光共同定位,这可以视觉证实。使用抗体将淋巴结细胞染色,从而识别pDCs(CD3-,CD19-,CD49b-,MHCII+,CD11c+,以及B220+或PDCA-1+),cDCs(MHCII+,CD11b-,CD11c+)和mDC(MHCII+,CD11b+,CD11c+),以及细胞成熟的标志物(CD69和CD86)。初步门控通过光散射、双峰排除和淋巴细胞系排除门控。使用FlowJo软件(TreeStar,Ashland,OR)测定pDC,cDC和mDC上荧光标记的D56-05和D56-01吸收的程度、以及在分开的试验中pDC上成熟标志物的表达(几何平均荧光强度;gMFI)。
统计学分析。如附图简述具体说明的那样,Mann–Whitney或Kruskal–Wallis检验以及Dunn posttest用于测定统计学意义。认为p值小于或等于0.05有意义。
结果。表B5-1显示在猴子血液中,IFN途径相关的基因表达(超过免疫前成倍增加)。这些数据表明尽管D56-01诱导IFN相关基因表达,但是D56-05在灵长动物中在使用rPA免疫后诱导更强烈的IFN相关基因的表达。
为了评估在局部组织中的早期D56-05作用(与单体D56-01相比,其可能与改善的佐剂活性有关),在注射后6小时,在注射位点的肌肉中分析转录的变化。使用不具有rPA的佐剂以相等的CpG-基剂量注射小鼠,并且注射PBS的动物作为对照。与单体D56-01的作用相比,D56-05对大量基因的诱导以及基因诱导的水平都具有更有效的作用,其中所述的物质均用于多个IFN调节的基因(IRG)(图11A)和趋化因子(图11B)。类似地,D56-05诱导更高水平的IL-1和TNF超家族的细胞因子(图11C)。在D56-05处理后的注射位点的肌肉中,粘附分子、整合素和间质金属蛋白酶也以更高的程度被诱导(图11D)。因此,纳米颗粒样配制物中的D56-01与单体D56-01相比,在注射位点处更高效地诱导早期免疫活化标志物。为了测定纳米颗粒和单体D56-01是否差异性地影响细胞在注射位点肌肉中的募集,通过流式细胞仪分析免疫细胞群体的相对比率。在24h时,与注射D56-01的组织相比,总的CD45+细胞在注射D56-05的肌肉中富集3倍(大约212,000与大约67,000细胞/g肌肉)。与给予单体D56-01的小鼠相比,注射D56-05的注射肌肉中会诱导相对更高比率的传统DC(cDC),骨髓DC(mDC),骨髓细胞,巨噬细胞,单核细胞和嗜中性粒细胞(图11E)。
为了检验D56-05诱导的炎性基因表达和用于rPA诱导的Ab应答的辅助性是否与独立于TLR9的途径有关,在TLR9-/-小鼠中测试应答。在i.m.注射D56-05后,在野生型C57BL/6小鼠中观察到IRG、趋化因子和细胞因子基因被诱导,但是在TLR9-/-小鼠中未观察到(图12A)。因此,在TLR9-/-小鼠中未观察到D56-05佐剂活性(图12B)。在注射位点诱导的炎性应答和在TLR9-/-小鼠中佐剂的作用的缺乏证明D56-05的活性依赖于TLR9信号传递。
在s.c.注射后18小时,与D56-05相比,在淋巴结中,D56-05使得干扰素调节基因(图13A)、趋化因子(图13B)和细胞因子(图13C)的转录产生更高的增加。多个趋化因子更强烈的诱导的可能结果是,D56-05注射与注射D56-01的小鼠相比,使得引流淋巴结中多种抗原提呈细胞(APC)群体的数量更多。MHC II+pDC特别受影响,在D56-05处理后存在5倍以上的数量的该细胞(平均值为940与187细胞/淋巴结)(图14)。综上,这些数据证明在注射位点以及引流淋巴结中,对于引发免疫应答而言,D56-05比单体D56-01更有效。
测定在D56-05处理后细胞运输(trafficking)的相对增加是否伴有对佐剂的细胞吸收的不同影响。广泛的细胞群体与适应性免疫应答的起始有关,包括MHC II+pDC和mDC,骨髓细胞,巨噬细胞,单核细胞以及嗜中性粒细胞,所有都证明在注射D56-05后荧光更强。在注射D56-05的小鼠中相当比例的mDC,骨髓细胞,巨噬细胞和单核细胞具有高水平的Alexa 555荧光,而仅mDC以相似的程度内化D56-01。Alexa 555标记的D56-01-Ficoll或D56-01的淋巴细胞吸收是可忽略的。表B5-2显示在细胞中通过A555标记的D56-05或D56-01的几何平均荧光强度(gMFI)测量的、荧光标记的D56-05或D56-01的吸收。这些数据表明小鼠体内注射后,引流淋巴结pDC,cDC和mDC吸收D56-05或D56-01。通常,在不同的细胞群体中,D56-05的吸收比D56-01的吸收更高,如更高的gMFI值所示。
D56-05对APC和淋巴细胞的活化状态也发挥更大的作用,如同单体D56-01在引流淋巴结中那样。在注射D56-05之后,pDC,CD8+DC,cDC,mDC和骨髓细胞均展示更高的CD86表达,而与由注射单体D56-01的小鼠收获的淋巴结细胞相比,B和NK细胞展示更高的CD69表达。表B5-3展示在由小鼠淋巴结得到的pDC上CD69和CD86的表达水平。这些数据表明D56-05和D56-01均诱导pDC上CD69和CD86的表达,但是D56-05与D56-01相比,在诱导体内pDC成熟中更有效。因此,Ficoll上D56-01的纳米颗粒配制物大幅改善重要的APC群体的吸收和活化,从而有助于适应性免疫力的有效诱导。
为了测定Ficoll缀合是否增加CpG-ODN和Ag吸收至相同细胞中效率小鼠接受荧光标记的佐剂(如上文所述)加上Alexa647标记的rPA的足垫注射。在注射后24小时或48小时收获腘窝淋巴结细胞用于流式细胞仪分析。对于所检查的各种APC类型而言,很多细胞仅引入了Ag或佐剂;然而,还存在一些细胞群体,其获得rPA以及D56-05或D56-01。使用D56-05和rPA免疫的小鼠证明具有同时Ag和佐剂吸收的APC的频率最高,以及仅吸收佐剂的细胞的频率最高。在2个额外的试验中,多色成像流式细胞仪以及随后的BDS评分计算用于测定Alexa555标记的D56-05和Alexa647标记的rPA是否特定的共同定位于相同的细胞中。大约11%pDC,7%mDC,5%骨髓细胞和<1%cDC、以及关联的D56-05和rPA吸收证明BDS得分大于2,表明Ag和佐剂在测量时可能共同定位于细胞中。
评价在注射位点的引流淋巴结中D56-05对GC B和T滤泡辅助(TFH)细胞应答的影响。这是通过流式细胞仪直接评价的,其中识别GC B细胞作为B220+/GL7+/PNA+/CD95+细胞,识别TFH细胞作为CD4+/CXCR5+/PD1+细胞。使用具有/不具有D56-05或D56-01的rPA或者媒介物对照在足垫中将小鼠免疫一次,并且在2wk内监测GC B或TFH细胞的数量。到第5天,在rPA/D56-05免疫的小鼠的引流淋巴结中检测更高比例的GC B和TFH细胞,并且在第14天时保持升高。与注射媒介物的小鼠相比,在仅rPA免疫的小鼠中,GC B和TFH应答最低。综上,这些数据表明用于诱导天然免疫力的、D56-05高于D56-01的增加的效力是早期GC B和T细胞应答的反应。
表B5-1:在对rPA±D56-05或D56-01的免疫应答中,在单个猴子的血液中,超过免疫前的IFN途径相关基因的成倍诱导
表B5-2:在由给予D56-05或D56-01的小鼠得到的引流淋巴结细胞中,荧光标记的化合物的吸收(几何平均荧光强度)
表B5-3:在由给予D56-05或D56-01的小鼠得到的引流淋巴结pDC上,CD69和CD86表达的几何平均荧光强度
实施例B6:D56-05佐剂的快速的、高效价的毒性中和抗体对rPA的应答并保护猴子对抗活炭疽杆菌孢子的致命性攻击
在使用D56-05+rPA免疫的猴子中评价D56-05在哺乳动物受试对象中诱导保护性抗原特异性抗体应答的能力(即,免疫原性)。为了比较,将另外几组猴子使用D56-01+rPA或单独的rPA免疫。为了测试在使用D56-05的一次或两次免疫后的保护,使用致命剂量的炭疽孢子攻击猴子,并针对生存情况进行监测。
用于猴子免疫原性研究的生命过程在实施例B5中描述。对于炭疽杆菌气溶胶攻击研究而言,在Battelle Biomedical Research Center(Columbus,OH)饲养猴子(食蟹猴),其中实施所有的生命过程。将之前未暴露炭疽杆菌的25只雄性和25只雌性健康猴子根据体重随机分组,每组8只(4只雄性、4只雌性)或者6只(3只雄性、3只雌性)。在第0天和/或第29天,使用10μg rPA,并组合1000或250μg D56-05(处于总体积1mL DPBS中)在四头肌中通过i.m.途径免疫动物。由6只未免疫的动物组成的组也被包含在内。在研究过程中收集血清样品,从而证明抗体应答的发展。在第69,70或71天,使猴子暴露于靶剂量200x 50%致命剂量(LD50)当量的雾化的炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)Ames孢子。将猴子随机分入3个攻击天数中之一,并且由各组得到的至少2只猴子被指定给每一天。在攻击后的28天,针对生存情况和疾病的临床迹象每日2次监测动物。被判断为垂死的任何动物都被立即安乐死。通过将30–40ml EDTA全血快速移动至血液琼脂平板上,并在37℃下温育至少48h,从第62天开始评估定性菌血症。得到符合炭疽芽孢杆菌形态学(g-溶血、白色集落、直径4-10mm,并具有粗糙的外观和不规则的边缘)的任何集落的样品记录为阳性。
毒性中和测试(TNA)。通过体外Toxin Neutralization Assay(TNA)评估对rPA的抗体效价的发展。所述的测试测量血清抗体对rPA的能力,从而特异性地保护J774.1细胞对抗炭疽芽孢杆菌致命毒性的细胞毒性。在系列稀释的血清样品存在或缺乏下,J774.1鼠科巨噬细胞(American Type Culture Collection,Manassas,VA)暴露于PA和致命因子(LF;List Biological Laboratories,Campbell,CA)。通过加入MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)评估生活力。效价计算为血清样品稀释的倒数,其得到50%中和的毒性介导的细胞毒性(ED50),相当于中和曲线的四参数逻辑拟合法的拐点。TNA结果报告为测试样品的ED50与参照标准的ED50的商(NF50)。使用SoftMaxPro 4.7.1版(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)计算测试终点。通过Dynavax Technologies进行TNA测试,不同之处在于由第-1,+1,+3,+5,+7,+14,+21和+28天相对于在Battelle实施的攻击产生的血清,并且使用人类参照标准AVR801计算NF50值。使用SAS(JMP,Cary,NC)计算测试终点。使用SoftMaxPro 5.0.1版(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)或SAS(SAS Institute,Cary,NC),通过SpectraMax 190或Versa-Max进行数据获取和分析。定量的下限(LLOQ)为100。得到不可检测的值的样品被指定为等于LLOQ的一半的值。
抗rPA IgG定量。平板(96孔)涂敷rPA并过夜温育。以2个平行测试在合适的稀释系列下的标准血清和测试血清。HRP缀合的山羊抗人IgG(SouthernBiotech,Birmingham,AL)用于检测,并使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺Microwell Peroxidase Substrate System(KPL,Gaithersburg,MD)显色。效价计算为稀释的倒数(ED50),相当于四参数逻辑拟合曲线的拐点。结果报告为测试样品的ED50和参照标准(NF50)的ED50的商。使用SoftMaxProv5.0.1软件(Molecular Devices),通过SpectraMax 190或VersaMax进行数据获取和分析。
结果。表B6-1和图15A示出免疫原性研究数据,具体为在单次注射单独的rPA、rPA+D56-05或rPA+D56-01后2周,在猴子血清中诱导的TNA效价(单一效价、几何平均值和95%置信区间)。2个最高剂量的D56-05诱导了平均TNA效价,与通过D56-01加入而引起的不显著的增加相比,其明显高于仅给予rPA的动物。在最高剂量的D56-05下,与单独的rPA相比TNA效价计算增加31倍可能低估了佐剂的效力,这是因为在仅给予rPA的动物中的效价均低于TNA测试的检测水平。此外,接受250–1000mg D56-05的所有动物(11只动物中的全部)均是血清阳性的,而使用250–1000mg D56-01免疫的11只动物中的5只低于LLOQ。这些数据表明rPA+D56-05和rPA+D56-01与使用单独的rPA的免疫相比,快速诱导毒性中和抗体的有效效价,但是在使用相等CC量的D56-05免疫的猴子中,TNA效价最高。
类似地,在使用rPA/D56-05免疫后,在第14天总的抗rPA IgG的效价显著升高(图15B),并且与TNA结果显著相关(图15C)。在第28天的二次免疫后,在所有的组中,TNA应答加强>15倍是明显的,并且效价在至少18wk内保持升高。在这些动物中还评价在二次免疫后大约5mo对抗原攻击的记忆应答。TNA效价进一步增加至少15倍(图15D)证明快速强力的应答,表明潜在的保护性免疫力。
为了直接评价免疫,使用rPA和D56-05,一次(第29天)或两次(第0天和29天)i.m.免疫食蟹猴,并且在第70±1天使用靶剂量的200LD50当量的雾化炭疽芽孢杆菌孢子攻击。在攻击后,在28天中监测生存情况、菌血症和临床疾病的症状,并且在攻击前和攻击后收集血清样品用于TNA效价测定。图16A示出在使用rPA+D56-05进行一次或两次免疫后,对使用雾化的活炭疽杆菌孢子攻击的猴子进行的Kaplan-Meier生存分析。在接受单次接种rPA和1000mg D56-05、或者两次接种250或1000mg D56-05的所有猴子中取得得自炭疽杆菌攻击的完全保护,而所有未接种的动物在攻击的9天内死于疾病。这些数据清楚地表明使用rPA+D56-05的单次免疫保护100%的猴子免于致命的攻击。两次免疫的动物也被保护。
此外,使用rPA/D56-05接种的动物在攻击后的任何时间点均未显示菌血症或临床症状。在攻击后,所有动物的TNA效价均产生快速的增加,表明强烈的记忆应答。记忆应答在接受单次rPA/D56-05免疫的猴子中是醒目的,其在感染性攻击的7天内快速地升高至相当于两次免疫动物的水平(图16B)。综上,这些数据证明rPA加上1000mg D56-05的单次免疫引发动物主要的回忆应答,并且提供针对雾化的炭疽芽孢杆菌孢子的致命性攻击的保护。
尽管针对炭疽杆菌暴露的快速单次注射保护代表了未满足的需求,但是D56-05的有效的佐剂活性表明在两次注射的预防方案是可行的情况下,大幅减少的剂量可以是有效的。因此,在分开的试验中,在第0和28天,在使用rPA以及1000,50,20或5mg D56-05免疫的猴子中监测TNA应答。在两次免疫方案中,即使使用5mg D56-05剂量(最低检测剂量),激发高于1000的TNA效价,并且通过Ag的唯一注射(用作细菌孢子暴露的替代品),进一步加强至高于10000(图16C)。因此,在两次免疫的方案内容中,数据表明使用D56-05剂量的1/200的保护性能力(经证明该剂量在猴子中在单次免疫方案中具有保护性)。
此外,在小鼠中评价通过D56-05纳米颗粒配制物的改善的佐剂活性。事实上,在小鼠中在初级和二次免疫后,rPA/D56-05诱导了现在较高的TNA效价,证明在调查D56-05作用机制的研究中,物种的相关性(图17A-B)。
表B6-1:在使用rPA+D56-05,rPA+D56-01或rPA初次免疫后2周,猴子血清的TNA效价
实施例B7:在相等的剂量下,在小鼠中与游离的线性的嵌合化合物D56-01相比,纳米颗粒配制物D56-05证明安全性益处
为了测试纳米颗粒配制物在体内对CC序列的安全性/耐受性的作用,通过肌肉内途径向小鼠重复给予高剂量注射D56-05和D56-01。作为其中评估毒性的物种,小鼠证明与灵长动物相比,由于TLR9表达在小鼠中更广泛的细胞分布,所以对含CpG ODN的核苷酸产生扩大的药物应答。在每2周一次(总计4次注射)接受100μg(基于D56-01重量)D56-05或D56-01的小鼠中我们测量血清细胞因子应答并监测体重变化,以便评估游离和纳米颗粒形式的CC的相对安全性。
雌性BALB/c小鼠(6-10周龄)购自Charles River,并且在Murigenics(Vallejo,CA)饲养,其中实施所有的生命过程。向各组的5只小鼠一次、两次、三次或四次给予100μgD56-05或D56-01,并且两次注射之间为2周。在各次注射后2小时处死选择组。对于对照,一组不接受注射,而另一组给予注射媒介物(生理盐水,50μL)。在第4次注射后18小时处死这些组。在处死时通过心脏穿刺收获血清。在处死时收获脾、肝脏和肾并称重。在整个研究中每周两次对小鼠称重。
ELISA。如实施例B1中所述,使用市售可得的抗体对测量血清样品中的细胞因子的水平。用于检测小鼠IL-6和IL-12p40的抗体对来源于BD Biosciences(San Jose,CA)。用于检测小鼠IP-10,MCP-1和TNF-α的试剂来源于R&D Systems(Minneapolis,MN)。这些测试的检测极限为大约20pg/mL至大约150pg/mL。使用SoftMaxPro v5.0.1软件(MolecularDevices)通过SpectraMax 190或VersaMax进行数据获取和分析。
通过酶联杂交测试或杂交测试进行D56-05或D56-01的组织定量。使用theTissueLyser II(Qiagen),在20mM Tris(pH 8),20mM EDTA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO),100mM氯化钠,0.2%SDS(Teknova,Hollister,CA)中均化脾、肝脏、肾或注射位点肌肉(25–50mg/组织/单个动物)和引流淋巴结(每单个动物汇集的),并使其在50℃下以1.2U/mg组织经过蛋白酶K(New England BioLabs,Ipswitch,MA)消化6-20小时。使用处于0.1M磷酸钠(Teknova)中的30ng/ml捕获探针(SEQ ID NO:18列出的5’-GCGCCGAGAA CGTTGCGCCG A-3’,用于D56-01定量;以及SEQ ID NO:19列出的5’-AGCCGCGTTG CAAGAGAAGC GATGCGCGGCTCG-3’,用于D56-05定量)过夜涂敷Nunc Immobilizer氨基酶标板。为了D56-05的定量,将与0.6mg/ml检测探针(SEQ ID NO:18列出的5’-GCGCCGAGAACGTTGCGCCG A-3’)等体积混合的均化样品在52℃下温育75min。为了D56-01的定量,将与SSC加上2%N-月桂酰肌氨酸钠盐缓冲剂等体积混合的均化样品在45℃下温育2小时,并在室温下使其冷却30min。在0.5mM生物素化的dUTP和50mM dNTP(New England BioLabs)存在下,通过1.25U Klenow片段(NewEngland BioLabs)分析带帽D56-01的互补性39末端的合成。HRP缀合的链霉亲和素(ThermoScientific,Waltham,MA)用于佐剂检测,并且使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物系统(KPL)显色。佐剂用作标准品。对于D56-05和D56-01,LLOQ分别为6.24和7.62ng/g组织。使用SoftMaxPro v5.0.1软件(Molecular Devices)通过SpectraMax 190或VersaMax实施所有的数据获取和分析。
结果。为了测试D56-05和单体D56-01在i.m.注射后是否展示不同的组织分布动力学,将小鼠注射D56-05或D56-01,并测量在注射位点和引流淋巴结、以及远端位点(脾、肝脏和肾)的佐剂水平。小鼠接受高剂量(100μg)的佐剂从而有利于回收,并且在注射后1天收获组织。如上文所述,通过杂交测试来定量D56-05和D56-01。D56-05在注射位点的肌肉和淋巴结(腘窝、腹股沟、坐骨、腰椎和骶骨)处浓缩,而D56-01快速地系统性分布(图18)。在注射位点和淋巴结处检测最低水平的D56-01,而并非在脾、肝脏和肾处浓缩。这些数据表明纳米颗粒和单体D56-01在注射24小时内差异性地分布,表明D56-05的优选的局部停留有助于其作为佐剂的增加的效力。
在CpG-ODN给予后在小鼠中常观察到的所有系统毒性在注射D56-05的动物中都比注射D56-01的动物大幅降低。表B7-1示出在给予初次剂量的D56-05或D56-01后的2小鼠,在小鼠中的血清细胞因子水平。炎性细胞因子IL-6,IL-12p40,IP-10,MCP-1和TNF-α在D56-01注射后2小时的血液中均高水平的诱导,但是对D56-05无应答。
此外,在注射D56-05的小鼠中,较少关于延迟的系统性作用的证据。在4次(每两周一次)注射D56-05后处死的小鼠证明脾和肝脏重量类似于注射sham的小鼠。给予D56-01但未给予D56-05的小鼠在2次注射后发展成脾肿大和肝肿大现象,该现象在3和4次注射后变得更明显。该数据概括于表B7-2中。对肾的重量没有作用。在注射D56-05的小鼠中,组织病理学改变最小,而重复的D56-01注射得到增加的脾髓外造血活性和肝改变,包括窦状隙细胞浸润、肝细胞改变和轻度/中度肝坏死。
图19示出接受D56-05和D56-01的小鼠在研究中的组均体重(group-averagedbody weight)。在每两周给予一次D56-01注射的动物中发生明显的体重损失、啮齿动物特异的TNF-α依赖的CpG诱导的毒性时间。相反,对于每两周给予一次高剂量D56-05注射的小鼠,体重仅稍微低于对照动物。该数据经调整而除去了由于给予D56-01的小鼠中的脾肿大和肝肿大的其他重量的影响,并且证明整体体重随着连续给予高剂量的D56-01而降低,但是D56-05并非如此。总之,这些数据显示纳米颗粒配制的D56-05高于游离CC D56-01的明显的安全性益处。与游离的CC不同,纳米颗粒配制物不会诱导炎性血清细胞因子应答,适当的器官肿大或者体重的急剧降低,即使在重复高剂量注射后也是如此。因此,D56-05纳米颗粒高于单体D56-01的改善的佐剂活性伴有降低的系统性毒性信号。
表B7-1:在100μg D56-05或D56-01的单剂量之后2h,小鼠中的血清细胞因子水平
表B7-2:在给予1-4剂量的100μg D56-05或D56-01的小鼠中的器官组织重量
实施例B8:在患有淋巴瘤细胞系EG7-OVA肿瘤的小鼠中肿瘤内给予D56-05抑制肿瘤生长
为了测试D56-05在癌症免疫治疗的模型中的应用(Moore et al.,Cell,54:777,1998),使用淋巴瘤细胞系EG7l OVA来评估肿瘤内注射D56-05或者对照不含CpG的寡核苷酸(D56-30)对所建立的肿瘤生长的作用。
雌性C57BL/6小鼠(6-10周龄)购自Harlan,并且在Murigenics(Vallejo,CA)饲养,其中实施所有的生命过程。将1x10*6EG-7细胞(American Type Culture Collection,Manassas,VA)皮下注射至C57BL/6小鼠的侧腹。从研究的第0天开始(细胞移植后的4天),向小鼠(N=5/组)的所建立的肿块中给予50μg D56-05或者对照非CpG寡核苷酸(D56-30)(处于150μL PBS中)的注射。在第0、3和7天每天给予注射。观察动物并测量重量尺寸(体积)。
肿瘤体积数据示于图20中。该数据证明通过瘤内途径给予的D56-05在这种鼠科肿瘤模型中会抑制肿瘤体积的增大。
实施例B9:具有不同的D56-01:FICOLL摩尔比(x)的D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)缀合物的体外效力评价
通过体外分析来评估改变D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)缀合物中D56-01:FICOLL摩尔比(x)对生物学应答效力的作用。如实施例B1所述,针对具有不同D56-01:FICOLL摩尔比(x):D56-05x=24,D56-05x=53,D56-05x=82,D56-05x=124和D56-05x=154的D56-05缀合物,测定人类B细胞中的体外效力。用于人类B细胞IL-6测试的结果示于表9-1中。对于具有不同D56-01:FICOLL摩尔比(x)的D56-05的合成,参见实施例S12。
这些数据表明具有较高D56-01:FICOLL摩尔比(x)的D56-05缀合物与D56-05相比在人类IL-6测试中显示相似的效力。
表B9-1:在不同的D56-01:FICOLL摩尔比(x)下生产的D56-05(aka[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)缀合物诱导人类B细胞的IL-6(以EC50(mM)计)
ND=未测定;x=140的D56-05为中试批次2,并且在本试验中用作阳性对照。
实施例B10:使用n=6,24,45和70的SM-PEGn制造的D56-05,D56-25,D56-26和D56-27(aka[(D56-01)-PEGn]x-FICOLL)的体外效力评价
通过测量体外生物学应答的效力来测试改变[(D56-01)-PEGn]x-FICOLL中SM-PEGn连接体分子的长度(n)的作用。对于[(D56-01)-PEGn]x-FICOLL缀合物,D56-05,D56-25,D56-26和D56-27(使用n=6,24,45和70的SM-PEGn制造,分别如实施例S3和实施例S13所述),如实施例B1所述,测定人类pDC富集的PBMC和B细胞的体外效力。人类pDC富集的PBMC IFN-α测试和人类B细胞IL-6测试的结果分别示于表B10-1和表B10-2中。具有较长的PEG连接体的[(D56-01)-PEGn]x-FICOLL缀合物在IFN-α测试中显示稍微增加的效力,并且在IL-6测试中显示稍微降低的效力。
表B10-1:通过使用不同的SM-PEGn连接体生产的[(D56-01)-PEGn]x-FICOLL缀合物诱导人类pDC富集的PBMC的IFN-α(以EC50(mM)计)
a中试批次4。
表B10-2:通过使用不同的SM-PEG(n)连接体生产的[(D56-01)-PEGn]x-FICOLL缀合物诱导人类B细胞的IL-6(以EC50(mM)计)
a中试批次4。
序列表
<110> G·S·奥特
R·J·米勒
R·L·科夫曼
R·基万
H·坎茨勒
<120> 支化的和线性的嵌合化合物、多核苷酸、它们的用途和制备方法
<130> 377882005640
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/107,291
<151> 2015-01-23
<160> 19
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
tcggcgcaac gttctcggcg c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<222> (7)...(8)
<223> 位置7和8通过六-(乙二醇)部分连接
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<222> (14)...(15)
<223> 位置14和15通过六-(乙二醇)部分连接
<400> 2
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<220>
<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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tcggcgctcg gcgcaacgtt c 21
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tcgccggtcg ccggaacgtt c 21
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<400> 13
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<223> 合成构建体
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tcgatcgtcg atcgaacgtt c 21
<210> 15
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
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<223> 位置14和15通过六-(乙二醇)部分连接
<400> 15
tcgtcgttcg tcgtaacgtt c 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<222> (7)...(8)
<223> 位置7和8通过六-(乙二醇)部分连接
<221> misc_feature
<222> (14)...(15)
<223> 位置14和15通过六-(乙二醇)部分连接
<400> 16
tcgtcgtaac gttctcgtcg t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<221> misc_feature
<222> (7)...(8)
<223> 位置7和8通过六-(乙二醇)部分连接
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<222> (14)...(15)
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<400> 17
tcgacgtaac gttctcgacg t 21
<210> 18
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
gcgccgagaa cgttgcgccg a 21
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
agccgcgttg caagagaagc gatgcgcggc tcg 33
Claims (43)
1.一种式(I)所示的支化的嵌合化合物:
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I)
其中:
D为多核苷酸或线性的嵌合化合物;
L1为包含烷硫基基团的第一连接体;
L2为包含琥珀酰亚胺基团的第二连接体;
L3为包含酰胺基团的第三连接体;
PEG为式-(OCH2CH2)n–,其中n为2至80的整数;
X为3至300的整数;以及
F为蔗糖和表氯醇的支化的共聚物,其分子量为大约100,000至大约700,000道尔顿,并且通过醚基团与L3连接;
其中所述的D的多核苷酸包含所述的核苷酸序列:5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1),其中所述的多核苷酸的长度小于50个核苷酸,并且其中所述的核苷酸之间、以及所述的3’末端核苷酸与L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键;以及
其中所述的D的线性的嵌合化合物包含3个核酸部分和2个六乙二醇(HEG)间隔,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2),其中所述的线性的嵌合化合物包含小于50个核苷酸,并且其中所述的核苷酸之间、所述的核苷酸与所述的HEG间隔之间、以及所述的3’末端核苷酸与所述的L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。
2.权利要求1所述的支化的嵌合化合物,其中L2为:
3.权利要求1或2所述的支化的嵌合化合物,其中L3为:
4.权利要求1至3的任意一项所述的支化的嵌合化合物,其中所述的式-(OCH2CH2)n–的n为6,24,45或70。
5.权利要求1至4的任意一项所述的支化的嵌合化合物,其中所述的F的分子量为大约300,000至大约500,000道尔顿。
6.权利要求1至5的任意一项所述的支化的嵌合化合物,其中所述的D为由所述的核苷酸序列5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1)组成的多核苷酸。
7.权利要求1至5的任意一项所述的支化的嵌合化合物,其中所述的D为由5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2)组成的线性的嵌合化合物。
8.权利要求1至7的任意一项所述的支化的嵌合化合物,其中所述的L1为-(CH2)m-S-,其中m为2至9的整数。
9.权利要求1至8的任意一项所述的支化的嵌合化合物,其中所述的x为20至200。
10.权利要求9所述的支化的嵌合化合物,其中所述的x为90至150,n为6,并且m为3或6。
11.权利要求1至10的任意一项所述的支化的嵌合化合物,其中所述的核苷酸之间的所有的键,其中所述的核苷酸与所述的HEG间隔之间存在的键、以及所述的3’末端核苷酸与所述的L1之间的键为硫代磷酸酯键。
12.一种包含所述的核苷酸序列5’-TCGGCGC AACGTTC-3’(SEQ ID NO:3)的分离的多核苷酸,其中所述的多核苷酸的长度小于50个核苷酸,并且其中所述的核苷酸之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。
13.一种包含所述的核苷酸序列5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1)的分离的多核苷酸,其中所述的多核苷酸的长度小于50个核苷酸,并且其中所述的核苷酸之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。
14.权利要求13所述的多核苷酸,其中所述的多核苷酸由所述的核苷酸序列5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:1)组成。
15.权利要求12至14的任意一项所述的多核苷酸,其中所述的多核苷酸为单链的。
16.权利要求12至15的任意一项所述的多核苷酸,其中所述的多核苷酸为2’-脱氧核糖多核苷酸。
17.权利要求12至16的任意一项所述的多核苷酸,其中所有的所述的键为硫代磷酸酯键。
18.一种线性的嵌合化合物,其包含2个核酸部分和六乙二醇(HEG)间隔,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’(SEQ ID NO:4),其中所述的线性的嵌合化合物包含少于50个核苷酸,并且其中所述的核苷酸之间以及所述的核苷酸与所述的HEG间隔之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。
19.一种线性的嵌合化合物,其包含3个核酸部分和2个六乙二醇(HEG)间隔,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2),其中所述的线性的嵌合化合物包含少于50个核苷酸,并且其中所述的核苷酸之间以及所述的核苷酸与所述的HEG间隔之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键。
20.权利要求19所述的线性的嵌合化合物,其中所述的线性的嵌合化合物由5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2)组成。
21.权利要求18至20的任意一项所述的线性的嵌合化合物,其中所述的核酸部分为2’-脱氧核糖多核苷酸。
22.权利要求18至21的任意一项所述的线性的嵌合化合物,其中所有的所述的键为硫代磷酸酯键。
23.一种药物组合物,其包含(i)药物可接受的赋形剂,以及(ii)由权利要求1-11的任意一项所述的支化的嵌合化合物、权利要求12-17的任意一项所述的多核苷酸、以及权利要求18-22的任意一项所述的线性的嵌合化合物组成的组。
24.权利要求23所述的药物组合物,其中所述的支化的嵌合化合物、所述的多核苷酸和所述的线性的嵌合化合物能够通过哺乳动物白细胞刺激细胞因子的产生,其包括以下的一种或多种:
通过人类外周血单核细胞刺激IFN-α的产生;
通过人类B淋巴细胞刺激IL-6的产生;以及
通过小鼠脾细胞刺激IL-12p40和/或IL-6的产生。
25.权利要求23或权利要求24所述的药物组合物,其中所述的支化的嵌合化合物、所述的多核苷酸和所述的线性的嵌合化合物均能够刺激哺乳动物B淋巴细胞的增殖。
26.权利要求23至25的任意一项所述的药物组合物,其中所述的组合物为无菌溶液。
27.权利要求23至26的任意一项所述的药物组合物,其中所述的组合物进一步包含与所述的支化的嵌合化合物、所述的多核苷酸和所述的线性的嵌合化合物非共价连接的抗原。
28.权利要求27所述的药物组合物,其中所述的抗体为微生物抗原、变应原或肿瘤抗原。
29.权利要求23至28的任意一项所述的药物组合物,其中所述的组合物基本不含内毒素。
30.一种刺激哺乳动物受试对象中免疫应答的方法,其包括向哺乳动物受试对象给予足以刺激所述的哺乳动物受试对象的免疫应答的量的、权利要求23至29的任意一项所述的药物组合物。
31.权利要求30所述的方法,其中刺激免疫应答包括以下的一种或多种:
刺激IFN-α的产生;
刺激IL-6的产生;
刺激B淋巴细胞增殖;
刺激干扰素途径相关基因的表达;
刺激化学引诱物相关基因的表达;以及
刺激浆细胞样树突状细胞(pDC)成熟。
32.权利要求30或31所述的方法,其中当所述的药物组合物进一步包含抗原时,刺激免疫应答包括诱导抗原特异性抗体应答,其中当所述的抗原与所述的支化的嵌合化合物、所述的多核苷酸或所述的线性的嵌合化合物组合给予时,比所述的抗原未与所述的支化的嵌合化合物、所述的多核苷酸或所述的线性的嵌合化合物组合给予时,所述的抗原特异性抗体应答的效价更高。
33.一种诱导哺乳动物受试对象的抗原特异性抗体应答的方法,其包括向哺乳动物受试对象给予足以诱导所述的哺乳动物受试对象的抗原特异性抗体应答的量的、权利要求27至29的任意一项所述的药物组合物。
34.一种预防哺乳动物受试对象的感染性疾病的方法,其包括向哺乳动物受试对象给予足以预防所述的哺乳动物受试对象的感染性疾病的量的、权利要求23至29的任意一项所述的药物组合物。
35.一种减轻哺乳动物受试对象的感染性疾病的症状的方法,其包括向哺乳动物受试对象给予足以预防所述的哺乳动物受试对象的感染性疾病的症状的量的、权利要求23至29的任意一项所述的药物组合物。
36.一种减轻哺乳动物受试对象的IgE相关紊乱的症状的方法,其包括向哺乳动物受试对象给予足以预防所述的哺乳动物受试对象的IgE相关紊乱的症状的量的、权利要求23至29的任意一项所述的药物组合物。
37.一种治疗哺乳动物受试对象的癌症的方法,其包括向哺乳动物受试对象给予足以治疗所述的哺乳动物受试对象的癌症的量的、权利要求23至29的任意一项所述的药物组合物。
38.权利要求37所述的方法,其中治疗癌症包括缩小实体肿瘤的尺寸。
39.一种制备式(I)所示的支化的嵌合化合物的方法:
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I)
其中:
D为多核苷酸或线性的嵌合化合物;
L1为包含烷硫基基团的第一连接体;
L2为包含琥珀酰亚胺基团的第二连接体;
L3为包含酰胺基团的第三连接体;
PEG为聚乙二醇;
x为3至300的整数;以及
F为蔗糖和表氯醇的支化的共聚物,其分子量为大约100,000至大约700,000道尔顿,并且通过醚基团与L3连接;
其中所述的多核苷酸包含所述的核苷酸序列:5’-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3’(SEQID NO:1),其中所述的多核苷酸的长度小于50个核苷酸,并且其中所述的核苷酸之间、以及所述的3’末端核苷酸与L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键;以及
其中所述的线性的嵌合化合物包含3个核酸部分和2个六乙二醇(HEG)间隔,如5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2),其中所述的线性的嵌合化合物包含小于50个核苷酸,并且其中所述的核苷酸之间、所述的核苷酸与所述的HEG间隔之间、以及所述的3’末端核苷酸与所述的L1之间的一个或多个键为硫代磷酸酯键,
其中所述的方法包括:
使所述的式D-L1a-SH所示的化合物与式(II)所示的化合物反应,其中在所述的式D-L1a-SH中,D如式(I)所定义,并且L1a为(CH2)m,其中m为2至9的整数,其中式(II)为:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
其中L3,PEG和F如式(I)所定义;
L2a为以及
y为3至350的整数。
40.权利要求39所述的方法,其进一步包括使所述的式D-L1a-SS-L1a-OH所示的化合物与还原试剂反应,从而生产所述的式D-L1a-SH所示的化合物。
41.根据权利要求39或40所述的方法,其进一步包括使所述的式(III)所示的化合物与所述的式L2a-(PEG)-L3a-Lv所示的化合物反应从而形成所述的式(II)所示的化合物,其中式(III):
[NH2CH2CH2NHC(O)CH2]z-F (III)
其中F如式(I)所定义,并且z为3至400的整数,其中在所述的式L2a-(PEG)-L3a-Lv中,其中L2a和PEG如式所定义;L3a为-NHC(O)CH2CH2C(O)–或-C(O)–;以及Lv为离去基团。
42.根据权利要求41所述的方法,其中Lv为(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基。
43.根据权利要求39至42的任意一项所述的方法,其中D为5’-TCGGCGC-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGGCGC-3’(SEQ ID NO:2)。
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