KR20170100033A - 분지형 및 선형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드, 그것들의 용도 및 제조 방법 - Google Patents

분지형 및 선형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드, 그것들의 용도 및 제조 방법 Download PDF

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KR20170100033A
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KR1020177022789A
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게리 에스. 오트
로버트 제이. 밀레이
로버트 엘. 코프만
레드완 키완
홀거 칸즐러
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다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션
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Abstract

본 개시는 핵산 및 비-핵산 모이어티 둘 다와, 폴리뉴클레오티드를 함유하는 분지형 및 선형 키메라 화합물에 관한 것이다. 본 개시는 또한 면역 반응을 자극하기 위한 그것의 용도, 및 분지형 키메라 화합물의 제조 방법에도 관한 것이다.

Description

분지형 및 선형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드, 그것들의 용도 및 제조 방법
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2015년 1월 23일에 출원된 미국 임시출원 번호 의 유익을 주장하며, 상기 출원은 모든 목적에 대해 전체로 본원에 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일로서 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일에 대한 다음의 제출 내용이 전체로 본원에 참조로 포함된다: 서열 목록 (파일명: 377882005640SEQLIST.txt, 기록일: 2016년 1월 22일, 크기: 7 KB)의 컴퓨터 판독 형태 (CRF).
기술분야
본 발명은 핵산 및 비-핵산 모이어티 두가지를 모두 함유하는 분지형 및 선형 키메라 화합물, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역 반응을 자극하기 위한 그것들의 용도, 및 분지형 키메라 화합물의 제조 방법에도 관한 것이다.
Toll-유사 수용체 (TLR)는 병원체-관련된 분자 패턴으로서 언급되는, 숙주 분자와 구별 가능한 보존된 미생물 분자를 인지하는 경막 단백질 집단이다. 그로써 TLR은 선천적인 면역 반응에서 중요한 역할을 하고, TLR3, TLR7, TLR8, TLR9 및 TLR13은 핵산을 감지하는 TLR들이다.
TLR의 아고니스트 및 길항제들은 면역 반응을 조절하는 데 사용된다. TLR 아고니스트들은 전형적으로 면역 반응을 자극하기 위해 사용되는 반면, TLR 길항제들은 전형적으로 면역 반응을 억제하기 위해 사용된다 (Gosu et al., Molecules, 17:13503-13529, 2012). 다양한 항원 제공 세포에 의해 발현되는 TLR9는 핵산 내의 메틸화되지 않은 CpG 다이뉴클레오티드를 인지한다. 그러므로 메틸화되지 않은 CpG 다이뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 그것들의 TLR9를 활성화시키는 능력을 통해 효과적인 애주번트 (adjuvant)를 만들 수 있다. 추가로, 비-핵산 모이어티 및 메틸화되지 않은-CpG 함유 핵산 모이어티 둘 다를 함유하는 키메라 화합물은 면역 반응을 자극할 수 있다.
TLR9 아고니스트의 효능은 핵산 모이어티의 길이, 메틸화되지 않은-CpG 다이뉴클레오티드 양옆의 잔기들 및 항원 제공 세포 흡수의 효력에 따라 좌우된다 (Marshall et al., Nucleic Acids Research, 31:5122-5133, 2003). 다수의 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물이 다가의 담체 모이어티 (예컨대 다당류)에 부착되어 있는 특정 분지형 키메라 화합물은 콘쥬게이트되지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물에 비하여 증대된 면역 반응을 유도하였다 (Marshall et al., 상기 동일). GE Healthcare에 의해 FICOLL®로서 시판중인, 고도로 분지형인 친수성 다당은 분지형 키메라 화합물에 대한 다가 담체 모이어티로서 사용될 수 있다. 그러나, FICOLL®을 활용하여 사용되는 관례적인 링커 모이어티는 소수성이고, 그것은 FICOLL®을 함유하는 합성 중간체의 침전을 유발할 수 있다. 이것은 분지형 키메라 화합물을 제조하기 위해 사용된 과정들 및 후속적인 최종 생성물의 보관 능력에 부정적으로 영향을 준다. 더욱이, 합성 TLR 아고니스트의 치료적 활용서은 그것의 독성에 의해 영향을 받는다.
강력한 면역자극 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드 및 키메라 화합물에 대한 요구가 남아 있다. 추가로, 반복적으로 제조될 수 있는 강력한 키메라 화합물에 대한 요구도 남아 있다. 허용되는 독성 프로파일을 가지는 폴리뉴클레오티드 및 키메라 화합물이 특히 바람직하다.
본 개시는 핵산 및 비-핵산 모이어티 둘 다를 함유하는 분지형 및 선형 키메라 화합물, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 개시는 또한 면역 반응을 자극하기 위한 그것들의 용도, 및 분지형 키메라 화합물의 제조 방법에도 관한 것이다.
한 측면으로, 본 개시는 식 (I): [D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I)의 분지형 키메라 화합물을 제공하며, 식에서 D는 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물이고; L1은 알킬티오기를 포함하는 제1 링커이며; L2는 석신이미드기를 포함하는 제2 링커이고; L3은 아미드기를 포함하는 제3 링커이며; PEG는 식 -(OCH2CH2)n-의 것으로, n은 2 내지 80의 정수이고; x는 3 내지 300의 정수이며; F는 약 100,000 내지 약 700,000 달톤의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이고 에테르기를 통해 L3에 연결되며, D의 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열: 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하고, 이때 폴리뉴클레오티드는 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드들 사이 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합(linkage)은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이고; D의 선형 키메라 화합물은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)와 같이 세 개의 핵산 모이어티와 두 개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하며, 선형 키메라 화합물은 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유하고, 뉴클레오티드들 사이, 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, x는 20 내지 300, 90 내지 150 또는 100 내지 140이다. 일부 구체예에서, L2는
Figure pct00001
이다. 일부 구체예에서, L3은
Figure pct00002
이다. 일부 구체예에서, L3은
Figure pct00003
이다. 일부 구체예에서, 식 -(OCH2CH2)n-의 n은 6, 24, 45 또는 70이다. 일부 구체예에서, F는 약 300,000 내지 약 500,000 달톤의 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, F는 FICOLL® PM 400 (GE Healthcare에 의해 시판되는 중합체)이다. 일부 구체예에서, D는 뉴클레오티드 서열 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, D는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)로 구성되는 선형 키메라 화합물이다. 일부 구체예에서, L1은 -(CH2)m-S-이고, 여기서 m은 2 내지 9의 정수이다. 일부 구체예에서, x는 20 내지 200이다. 일부 구체예에서, x는 90 내지 150이고, n은 6이며 m은 3 또는 6이다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드들 사이의 모든 결합, 존재하는 경우 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 결합들 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 폴리뉴클레오티드의 CpG 다이뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물의 핵산 모이어티는 메틸화되지 않는다.
다른 측면으로 본 개시는 뉴클레오티드 서열 5'-TCGGCGC AACGTTC-3' (SEQ ID NO:3)을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 이때 폴리뉴클레오티드는 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 관련된 측면으로, 본 개시는 뉴클레오티드 서열 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 이때 폴리뉴클레오티드는 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 모든 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 폴리뉴클레오티드의 CpG 다이뉴클레오티드는 메틸화되지 않는다.
추가의 측면으로, 본 개시는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3' (SEQ ID NO:4)와 같이 두 개의 핵산 모이어티와 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하는 선형 키메라 화합물을 제공하며, 이때 선형 키메라 화합물은 50개보다 적은 뉴클레오티드를 함유하고, 뉴클레오티드들 사이 및 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 관련된 측면으로, 본 개시는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)와 같이 세 개의 핵산 모이어티와 두 개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하는 선형 키메라 화합물을 제공하고, 이때 선형 키메라 화합물은 50개보다 적은 뉴클레오티드를 함유하며, 뉴클레오티드들 사이 및 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, 선형 키메라 화합물은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)로 구성된다. 일부 구체예에서, 핵산 모이어티는 2'-데옥시리보폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 모든 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다.
더욱이, 본 개시는 (i) 제약학적으로 허용되는 부형제, 및 (ii) 분지형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드 및 상기 전술한 단락 중 어느 것의 선형 키메라 화합물로 구성되는 군 중 하나를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 분지형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드 및 선형 키메라 화합물은 각각 인간 말초혈 단핵 세포에 의한 IFN-알파의 생성을 자극하고; 인간 B 림프구에 의한 IL-6의 생성을 자극하며; 및 마우스 비장 세포에 의한 IL-12p40 및 IL-6 중 하나 또는 둘 다의 생성을 자극하는 것으로 구성되는 군 중 하나 이상을 포함하여, 포유류 백혈구에 의한 사이토카인 생성을 자극할 수 있다. 일부 구체예에서, 분지형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드 및 선형 키메라 화합물은 각각 포유류 B 림프구의 증식을 자극할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 멸균 용액이다. 다른 구체예에서, 조성물은 멸균 동결건조된 고체이다. 일부 구체예에서, 조성물은 조성물에 존재하는 분지형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드 및 선형 키메라 화합물에 공유-결합되어 있지 않은 항원을 더 포함한다 (예컨대 항원은 조성물에 존재하는 분지형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드 및 선형 키메라 화합물에 콘쥬게이트되기보다는 오히려 조성물에 존재하는 분지형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드 및 선형 키메라 화합물과 혼합된다). 일부 구체예에서, 항원은 미생물 항원, 알레르기 유발 항원 또는 종양 항원이다. 일부 구체예에서, 항원은 분리된 또는 재조합 단백질이다. 일부 구체예에서, 조성물은 본질적으로 내독소가 없다.
추가로 본 개시는 포유류 대상체에게 상기 기술된 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 면역 반응을 자극하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 면역 반응을 자극하는 것은 다음으로 구성되는 군에서 하나 이상을 포함한다: IFN-알파의 생성을 자극하기; IL-6의 생성을 자극하기; B 림프구 증식을 자극하기; 인터페론 경로-관련 유전자 발현을 자극하기; 화학유인물질-관련 유전자 발현을 자극하기; 및 형질 세포양 세포 수지상 세포 (pDC) 성숙을 자극하기. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물이 추가로 항원을 포함할 때, 면역 반응을 자극하는 것은 항원-특이적 항체 반응을 유도하는 것을 포함하며, 이때 항원-특이적 항체 반응의 역가는 항원이 분지형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물이 없이 투여될 때보다 항원이 분지형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물과 조합되어 투여될 때 더 높다. 일부 구체예에서, 항원-특이적 항체 반응의 역가는 항원이 상응하는 선형 키메라 화합물과 함께 투여될 때보다 항원이 분지형 키메라 화합물과 함께 투여될 때 더 높다.
본 개시는 인간 환자와 같은 포유류 대상체에서 상기 기술된 제약학적 조성물을 사용하는 복수의 방법을 제공한다. 한 측면으로, 포유류 대상체에게 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 항원-특이적 항체 반응을 유도하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 항원-특이적 항체 반응을 유도하는 방법들이 제공된다. 한 측면으로, 포유류 대상체에게 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 감염성 질환을 예방하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 감염성 질환을 예방하는 방법들이 제공된다. 한 측면으로, 포유류 대상체에게 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 감염성 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 감염성 질환을 치료 또는 예방하는 방법들이 제공된다. 한 측면으로, 포유류 대상체에게 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 감염성 질환의 증상을 개선하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 감염성 질환의 증상을 개선하는 방법들이 제공된다. 한 측면으로, 포유류 대상체에게 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 IgE-관련 장애의 증상을 개선하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 IgE-관련 장애의 증상을 개선하는 방법들이 제공된다. 한 측면으로, 포유류 대상체에게 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 IgE-관련 장애를 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 IgE-관련 장애를 치료 또는 예방하는 방법들이 제공된다. 한 측면으로, 포유류 대상체에게 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 암을 치료하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 암을 치료하는 방법들이 제공된다. 일부 구체예에서, 암을 치료하는 것은 고체 종양의 크기를 축소시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 암을 치료하는 것은 생존 가능한 암세포 수를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 암을 치료하는 것은 암환자의 생존을 연장시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 암종이다 (예컨대 두경부 편평세포 암종). 일부 구체예에서, 암은 육종이다. 일부 구체예에서, 암은 흑색종이다. 일부 구체예에서, 암은 림프종이다.
더욱이 본 개시는 식 (I)의 분지형 키메라 화합물: [D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I)의 제조 방법을 제공하며, 식에서 D는 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물이고; L1은 알킬티오기를 포함하는 제1 링커이며; L2는 석신이미드기를 포함하는 제2 링커이고; L3은 아미드기를 포함하는 제3 링커이며; PEG는 폴리에틸렌 글리콜이고; x는 3 내지 300의 정수이며; F는 약 100,000 내지 약 700,000 달톤의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이고 에테르기를 통해 L3에 연결되며, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열: 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하고, 이때 폴리뉴클레오티드는 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드들 사이 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이고, 선형 키메라 화합물은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)와 같이 세 개의 핵산 모이어티와 두 개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하며, 선형 키메라 화합물은 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유하고, 뉴클레오티드들 사이, 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이며, 방법은 식 D-L1a-SH의 화합물 (식에서 D는 식 (I)에 대해 정의된 것과 같고 L1a는 CH2)m이며, 여기서 m은 2 내지 9의 정수임)을 식 (II)의 화합물: [L2a-(PEG)-L3]y-F (II)와 반응시키는 단계를 포함하며, 식 (II)에서 L3, PEG 및 F는 식 (I)에 대해 정의된 것과 같고; L2a는
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이며, y는 3 내지 350의 정수이다. 일부 구체예에서, x는 20 내지 300, 90 내지 150, 또는 100 내지 140이고; y는 20 내지 350, 30 내지 300, 155 내지 215 또는 165 내지 205이다. 일부 구체예에서, 방법은 식 D-L1a-SS-L1a-OH의 화합물을 환원제와 반응시켜 식 D-L1a-SH의 화합물을 생성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 식 (III)의 화합물: [NH2CH2CH2NHC(O)CH2]z-F (III) (식에서 F는 식 (I)에 대해 정의된 것과 같고 z는 3 내지 400의 정수임)을 식 L2a-(PEG)-L3a-Lv의 화합물 (식에서 L2a 및 PEG는 식 (II)에 대해 정의된 것과 같고; L3a는 -NHC(O)CH2CH2C(O)- 또는 -C(O)-이며; Lv는 이탈기임)과 반응시켜서 식 (II)의 화합물을 형성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, z는 20 내지 400, 50 내지 300, 190 내지 250 또는 200 내지 240이다. 일부 구체예에서, Lv는 (2,5-다이옥소피롤리딘-1-일)옥시이다. 일부 구체예에서, 방법에서 D는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)이다. 본 개시의 방법들에 사용하기에 적합한 D의 폴리뉴클레오티드 및 선형 키메라 화합물의 변화는 선행 단락에서 보다 자세하게 기술되어 있다.
도 1은 예시적인 분지형 키메라 화합물, D56-05, (aka [(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)을 제조하기 위해 사용된 제조 계획도에 대한 순서도를 도시한다.
도 2는 예시적인 분지형 키메라 화합물, D56-05, (aka [(D56-01)-PEG6]x-FICOLL)의 제조를 도시한다.
도 3은 카르복시메틸화된-FICOLL의 제조를 위한 반응 계획도를 도시한다.
도 4는 N-(2-아미노에틸)카바밀메틸화된-FICOLL의 제조를 위한 반응 계획도를 도시한다.
도 5a 내지 5e는 석신이미딜-((N-말레이미도프로피온아미돌)-폴리에틸렌글리콜) 에스테르 및 석신이미딜-((N-말레이미도알킬)-폴리에틸렌글리콜) 에스테르 이종이중기능성 링커 (SM-PEGn)의 화학적 구조를 도시한다.
도 6은 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL의 제조를 위한 반응 계획도를 도시한다.
도 7은 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL 파일럿 로트 4 및 5의 크기 축출 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피 분석으로부터의 결과를 도시한다. A1은 정제된 파일럿 로트 4로부터의 결과이고, A2는 미정제 파일럿 로트 4로부터의 결과이며, B1은 정제된 파일럿 로트 5로부터의 결과이고, B2는 미정제 파일럿 로트 5로부터의 결과이다. 각각의 사분면의 상부 및 하부 크로마토그램은 각각 215 nm 및 260 nm에서의 검출을 나타낸다. [말레이미드-PEG6]y-FICOLL은 약 7.2분에 용출되었다. 미반응 시약 및 작은 분자들은 약 11.2 내지 17.3분으로부터 용출되었다.
도 8은 D56-02 (SEQ ID NO:2)로부터, 3' 단부에서의 비-뉴클레오티드 모이어티가 상이한 D56-03 (SEQ ID NO:2)을 제조하기 위한 반응 계획도를 도시한다.
도 9a 내지 9d는 정제된 D56-03의 크기 축출 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피 분석으로부터의 결과를 도시한다. 도 9a는 파일럿 로트 4로부터의 결과이고, 9b는 파일럿 로트 5 파트 1로부터의 결과이며, 도 9c는 파일럿 로트 5 파트 1로부터의 결과이고, 도 9d는 파일럿 로트 5 조합으로부터의 결과이다. D56-03 보유 시간은 12.2분이었다. TCEP ((트리스(2-카르복시에틸)포스핀)을 대조표준으로서 작동시켰고, 단일 피크로서 용출되었으며 보유 시간은 14.6분이었다.
도 10은 D56-05의 제조를 위한 반응 계획도를 도시한다.
도 11a 내지 11e는 D56-05 나노입자들이 단량체 D56-01과 비교하여, IFN-조절된, 케모카인, 사이토카인 및 내피세포 사이 이동 (transendothelial migration)-관련 유전자들의 발현을 증대시키고, 주사 부위 근육에서 증대된 세포 충원을 유도하는 것을 도시한다. BALB/c 마우스들 (n=6/그룹)이 10 mg의 D56-05 또는 D56-01 (CpG-ODN-기반 용량)로 근육 내 주사되었다. 주사 부위 근육은 주사 후 6시간 후 수집되어 IFN-조절된 (도 11a), 케모카인 (도 11b), 사이토카인 (도 11c) 및 내피세포 사이 이동-관련 (도 11d) 유전자 발현이 평가되었다. PBS-주사된 대조표준과 관련된 유전자 발현은 △△Ct 평가 (2-△△Ct)에 의해 측정되었다. 데이터는 개별 샘플의 평균으로서 제시되고 단일 실험으로부터 CI는 95%였다. 12 내지 24시간에 D56-05-주사된 대비 D56-01-주사된 마우스 (10 mg)의 근육에서의 다양한 세포 집단의 상대적 비율 (표준화된 세포 대 총 세포)이 유동 세포분석에 의해 평가되었다 (도 11e). 광산란 게이팅 및 림프구의 배제 (CD3/CD19/CD49b 덤프 채널) 후에 세포 집단이 다음과 같이 확인되었다: 대식세포 (CD11b+/CD11c-/F4/80+/Ly6C+/Ly6G-), 단핵 세포 (CD11b+/CD11c-/F4/80-/Ly6C+/Ly6G-), 호중구 (CD11b+/CD11c-/Ly6G+), 총 CD11b+ 세포, 및 cDCs (CD11b-/CD11c+). SEM을 포함한 평균으로서 표시된 데이터는 두 개의 독립적인 실험의 평균이다.
도 12a 및 12b는 TLR9 발현에 의존적인 D56-05의 보조제 효과를 도시한다. 도 12a에서 야생형 (C57BL/6) 또는 TLR92/2 마우스들 (n = 6)은 10 mg의 D56-05로 주사되었고, 주사 부위 근육이 주사 후 6시간 후에 수집되어 유전자 발현이 측정되었다. 개별적인 유전자 유도 배수는 PBS-주사된 대조표준에 비해 계산되었다. 데이터는 SEM을 포함한 평균으로서 제시된다. 도 112b에서 C57BL/6 또는 TLR92/2 마우스들 (n= 8 내지 10)이 10 mg의 D56-05와 함께 5 mg의 rPA로 근육 내 면역되었다. 14일째에 TNA 역가 수준은 평균으로서 제시된다. ***p<0.001, Mann-Whitney U 시험.
도 13a 내지 13c는 D56-05 나노입자들이 IFN-조절된, 케모카인 및 사이토카인 유전자들을 증대시키는 것을 도시한다. BALB/c 마우스들 (n = 6)이 10 mg의 D56-05 또는 D56-01로 피하로 면역되었다. 오금의 림프절이 면역화 후 18시간 후에 수집되어 IFN-조절된 (도 13a), 케모카인 (도 13b) 및 사이토카인 (도 13c) 유전자 발현에 대해 평가되었다. PBS-주사된 대조표준과 관련된 유전자 발현은 △△Ct 평가 (2-△△Ct)에 의해 측정되었다. 데이터는 개별 샘플의 평균으로서 제시되고 단일 실험으로부터 CI는 95%였다.
도 14는 배수 림프절 (draining lymph node)에서 세포 충원을 증대시키는 것을 도시한다. 48시간 전에 10 또는 2 mg의 rPA와 조합된 10 mg의 D56-05 또는 D56-01로 발바닥에서 피하 면역된 BALB/c 마우스들 (n = 4 내지 6)의 오금 림프절의 상이한 세포 집단의 상대적 비율이 유동 세포분석에 의해 분석되었다. 광산란 게이팅 후에 세포 집단이 다음과 같이 확인되었다: T 세포 (CD3+/CD19-), B 세포 (CD3-/CD19+), NK 세포 (CD3-/CD19-/CD49b+) 및 다음의 CD3-/CD19-/CD49b- 세포 집단: cDCs (CD11b-/CD11c+/MHC II+), pDCs (CD11b-/CD11c+/MHC II+ /PDCA1+ 또는 B220+), mDCs (CD11b+/CD11c+/MHC II+), 골수 세포 (CD11b+/CD11c-/MHC II+), 대식세포 (CD11b+/CD11c-/MHC II+/F4/80+/Ly6C+/Ly6G-), 단핵 세포 (CD11b+/CD11c-/MHC II+/F4/80-/Ly6C+/Ly6G-) 및 호중구 (CD11b+/CD11c-/Ly6G+). 데이터는 SEM을 포함하는 평균으로서 제시되고 4개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 15a 내지 15d는 rPA/D56-05 백신접종이 원숭이에서 항-rPA Ab 반응의 신속한 유도 및 장기-지속 기억을 유도하는 것을 도시한다. 사이노몰구스 마카크 (Cynomolgus macaques, n = 3 내지 6마리/그룹)를 10 mg의 rPA 단독으로 (↓) 또는 1000, 250, 또는 50 mg의 D56-05 또는 1000 또는 250 mg의 D56-01로 0일 및 28일에 근육내 면역시켰다. 모든 원숭이는 초기 면역화 후 23주에 25 mg의 rPA 단독을 받았다 (↓). TNA 및 항-rPA IgG 역가 수준이 초기 면역화 후 25주 동안 모니터링되었다. 도 15a 및 15b에서, 초기 면역화 후 2주 후의 역가가 95% CI를 가지는 평균으로서 제시되고, 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. *p < 0.05, ** p < 0.01, Kruskal-Wallis에 의함, Dunn 사후검사. 도 15c는 초기 면역화 후 2주 후에 항-rPA IgG와 TNA 역가 수준 사이의 상관관계를 나타낸다. 도 15d는 연구 전체를 통해 모니터링된 TNA 역가 데이터 (평균)를 도시한다.
도 16a 내지 16c는 rPA/D56-05 백신접종이 강력한 기억 반응을 유도하여, 원숭이 예방 탄저병 도전 모델에서 에어로졸화된 바실러스 안트라시스 (B. anthracis) 포자로의 도전으로부터 완전한 보호를 중재하는 것을 도시한다. 사이노몰구스 마카크 (n=6 내지 8/그룹)를 1000 또는 250 mg의 D56-05와 조합된 10 mg의 rPA로 0 및/또는 29일 (13 또는 23일)에 근육 내로 면역화하였다 (↓). 백신접종되지 않은 동물의 그룹 (n=6)이 또한 포함되었다. 모든 원숭이들을 에어로졸화된 바실러스 안트라시스 포자의 200 LD50 동등물의 목적 용량에 69, 70 또는 71일에 노출시켰다 (↓). 도 16a에서, 생존이 도전 후 28일 동안 하루에 2회 모니터링되었다. 도 16b에서, TNA 역가 수준이 연구 전체를 통해 및 도전 후 4주 동안 모니터링되었다. 데이터는 평균으로서 제시되고 95% CI를 포함하였다. 사이노몰구스 마카크 (n=4 내지 6)를 10 mg의 rPA 단독으로 또는 1000, 50, 20 또는 5 mg의 D56-05와 조합하여 0 및 28일에 면역시켰다 (↓). 모든 원숭이들에게 25 mg의 rPA 단독을 초기 면역화 후 10주 후에 주었다 (↓). 도 16c에서 TNA 역가 수준이 12주 동안 모니터링되었고 역가는 평균으로서 제시된다.
도 17a 및 17b는 rPA/D56-05 면역화가 마우스에서 더 큰 일차 및 이차 TNA 역가 반응을 유도하는 것을 도시한다. 스위스 웹스터 (Swiss Webster) 마우스 (n=25/그룹)가 5 mg의 rPA 단독으로 또는 2 또는 0.5 mg의 D56-05 또는 D56-01과 함께 0 및 29일에 면역화되었다. TNA 역가 수준이 제1 면역화 후 4주 후에 평가되었고 (도 17a) 제2 면역화 후 2주 후에 평가되었다 (도 17b). 데이터는 95% CI를 포함하는 평균으로서 제시된다. Kruskal-Wallis에 의해 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, Dunn 사후 시험.
도 18은 주사 부위 및 배수 림프절에서 D56-05 나노입자들이 보유된 것을 도시한다. BALB/c 마우스 (n = 5)가 100 mg의 D56-05 또는 D56-01로 근육 내 주사되었다. 주사 부위 근육, 배수 림프절 (오금, 서혜부, 좌골, 요추 및 천골), 비장, 간 및 신장의 올리고뉴클레오티드 함량 (조직의 그램당 마이크로그램)이 주사 후 1일 후에 평가되었다. 데이터는 평균으로 제시되고 두 개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 19는 DV56-05 또는 DV56-01의 1 내지 4 용량 (100 μg)이 투여된 마우스의 시간 경과에 따른 체중을 보여주는 도표를 도시한다.
도 20은 D56-05 또는 D56-30을 받은 마우스들의 종양 크기를 보여주는 도표를 도시한다. 간단히 설명하면, 약 1백만 개의 E.G-7 OVA 세포 (ATCC 카탈로그 번호 CRL-2113)를 C57BL/6 마우스의 양옆구리에 피하 주사하였다. 0일 (세포 이식 후 4일)에 연구를 시작하여 마우스에 종양 내로 (즉 수립된 종양 덩어리 안으로) 50 마이크로그램 (mcg)의 D56-05 또는 대조 비-CpG 올리고뉴클레오티드 (D56-30)를 150 μL의 PBS로 주사하였다. 주사를 0, 3 및 7일에 투여하였다. 마우스들은 관찰되었고 종양 크기 (부피)가 표시된 바와 같이 측정되었다. E.G7-OVA는 C57BL/6 (H-2 b) 마우스 림프종 세포주 EL4로부터 유도된 유전자 도입 세포주이고, 닭 오브알부민을 구성적으로 분비한다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 핵산 및 비-핵산 모이어티 둘 다를 함유하는 선형 및 분지형 키메라 화합물에 관련된다. 본 발명은 또한 면역 반응을 자극하기 위한 그것의 용도 및 분지형 키메라 화합물의 제조 방법에도 관련된다.
일반적인 방법 및 정의
본 개시의 실시는 다르게 표시되지 않는 한, 기술분야의 숙련도 내에 있는, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학 및 면역학의 종래 기법들을 사용한다. 그런 기법들은 문헌, 예를 들면 다음에 전체적으로 기술된다: Animal Cell Culture, 제6 판 (Freshney, Wiley-Blackwell, 2010); Antibodies, A Laboratory Manual, 제2 판 (Greenfield, ed., Cold Spring Harbor Publications, 2013); Bioconjugate Techniques, 제3 판 (Hermanson, Academic Press, 1996); Current Protocols in Cell Biology (Bonifacino et al., ed., John Wiley & Sons, Inc., 1996, including supplements through 2014); Current Protocols in Immunology (Coligan et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 1991 including supplements through 2014); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 1987, including supplements through 2014); Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (Egli et al., ed., John Wiley & Sons, Inc., 2000, including supplements through 2014); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제3 판 (Sambrook and Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제4 판 (Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Herdewijn, ed., Humana Press, 2004); Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed., Humana Press, 1993); 및 Using Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998).
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"은 단일-가닥 DNA (ssDNA), 이중-가닥 DNA (dsDNA), 단일-가닥 RNA (ssRNA) 및 이중-가닥 RNA (dsRNA), 변형된 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오시드 또는 그것들의 조합을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 선형, 분지형 또는 원형의 형태일 수 있고, 또는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 선형, 분지형 및/또는 원형 분절을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, 대체 결합, 예컨대 포스포로티오에이트 에스테르가 또한 사용될 수 있지만, 포스포다이에스테르 결합을 통해 연결된 뉴클레오시드의 중합체이다. 뉴클레오시드는 당에 결합된 퓨린 (아데닌 (A) 또는 구아닌 (G) 또는 그것들의 유도체) 또는 피리미딘 (티민 (T), 사이토신 (C) 또는 우라실 (U) 또는 그것들의 유도체) 염기로 구성된다. DNA의 네 개의 뉴클레오시드 단위 (또는 염기)는 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 티미딘 및 데옥시시티딘으로 불린다. RNA의 네 개의 뉴클레오시드 단위 (또는 염기)는 아데노신, 구아노신, 우리딘 및 시티딘으로 불린다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 포스페이트 에스테르이다.
본 개시의 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 및 분지형 키메라 화합물은 14 내지 50개의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드의 수는 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 또는 45 (하한선)보다 크다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드의 수는 51, 50, 45, 40, 35, 30, 25 24, 23, 22, 21 또는 20 (상한선)보다 작다. 즉 뉴클레오티드의 수는 약 14 내지 50의 범위에 있고 하한선은 상한선보다 작다.
용어 "3'"는 일반적으로 동일한 폴리뉴클레오티드에서 다른 영역 또는 위치로부터 (하류로) 폴리뉴클레오티드 3'에 있는 영역 또는 위치를 나타낸다.
용어 "5'"는 일반적으로 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에서 다른 영역 또는 위치로부터 (상류로) 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 5'에 있는 영역 또는 위치를 나타낸다.
용어 "개체" 및 "대상체"는 포유류를 나타낸다. "포유류"는 한정하는 것은 아니지만, 인간, 비-인간 영장류 (예컨대 원숭이), 가축, 스포츠용 동물, 설치류 (예컨대 마우스 및 래트) 및 애완동물 (예컨대 개 및 고양이)을 포함한다.
용어 "항원"은 항체 또는 T 세포 항원 수용체에 의해 특이적으로 인지되고 결합되는 물질을 나타낸다. 항원은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 당단백질, 다당류, 복잡한 탄수화물, 당, 강글리오시드, 지질 및 인지질; 그것들의 일부 및 그것들의 조합을 포함할 수 있다. 항원은 본 개시의 조성물에 존재할 때 합성된 것이거나 자연으로부터 분리될 수 있다. 본 개시의 방법에서 투여에 적합한 항원들은 항원-특이적 B 세포 또는 T 세포 반응을 유도할 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 합텐은 "항원"의 범주 내에 포함된다. "합텐"은 그 자체로서는 면역원성이 아니지만 일반적으로 더 큰 면역원성 분자 (담체)와 콘쥬게이트될 때 면역원성이 되는 경향이 있는 저분자량 화합물이다.
"폴리펩티드 항원"은 정제된 천연 펩티드, 합성 펩티드, 재조합 펩티드, 미정제 펩티드 추출물 또는 부분적으로 정제된 또는 정제되지 않은 활성 상태의 펩티드 (예컨대 약화된 또는 비활성화된 바이러스, 미생물 또는 세포의 일부인 펩티드), 또는 그런 펩티드들의 단편을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 항원은 바람직하게는 길이가 적어도 6개의 아미노산 잔기이다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원성"은 포유류 대상체에게 적합한 조건하에서 투여될 때 적응성 면역 반응을 유도하는 제제 (예컨대 폴리펩티드 항원)을 나타낸다. 면역 반응은 B 세포 (체액성) 및/또는 T 세포 (세포성) 반응일 수 있다.
"보조제"는 항원과 같은 면역원성 제제와 혼합될 때, 그 혼합물에 대한 노출시 수령체에서 그 제제에 대한 면역 반응을 비특이적으로 증대시키거나 강화시키는 물질을 나타낸다.
용어 "아고니스트"는 광범위한 의미로 사용되고 수용체를 통한 신호화를 활성화하는 임의의 분자를 포함한다. 예를 들어 TLR9 아고니스트는 TLR9 수용체에 결합하여 TLR9-신호화 경로를 활성화시킨다.
용어 "길항제"는 광범위한 의미로 사용되고, 아고니스트의 생물학적 활성을 차단하는 임의의 분자를 포함한다. 예를 들어, TLR9 길항제는 TLR9-신호화 경로를 차단한다.
용어 "면역자극성 서열" 및 "ISS"는 측정 가능한 면역 반응 (예컨대 시험관 내에서, 생체 내에서 및/또는 생체 외에서 측정됨)을 자극하는 핵산 서열을 나타낸다. 본 개시의 목적에 대하여, 용어 ISS는 메틸화되지 않은 CG 다이뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 나타낸다. 역으로, 용어 "면역억제성 서열" 및 "IIS"는 측정 가능한 면역 반응 (예컨대 시험관 내에서, 생체 내에서 및/또는 생체 외에서 측정됨)을 억제하는 핵산 서열을 나타낸다. 측정 가능한 면역 반응의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 항원-특이적 항체 생성, 사이토카인 분비, 림프구 활성화 및 림프구 증식을 포함한다.
용어 "CpG" 및 "CG"는 포스페이트에 의해 분리된 시토신과 구아닌을 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 시토신과 구아닌의 염기-쌍과는 반대로 선형 서열을 나타낸다. 본 개시의 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 및 분지형 키메라 화합물은 적어도 하나의 메틸화되지 않은 CpG 다이뉴클레오티드를 함유한다. 즉 CpG 다이뉴클레오티드의 시토신은 메틸화되지 않는다 (즉 5-메틸시토신이 아님).
본원에서 사용되는 용어 "안티센스" 및 "안티센스 서열"은 mRNA의 코딩 가닥에 상보하는 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드의 비-코딩 가닥을 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 안티센스 서열 또는 RNAi 분자 (miRNA 및 siRNA)가 아니다. 즉 바람직한 구체예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 그것이 사용될 포유류 대상체의 전사물 (또는 유전자)에 대해 유의미한 상동성 (또는 상보성)을 갖지 않는다. 예를 들어, 인간 대상체에서 면역 반응을 조절하기 위한 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 인간 게놈의 핵산 서열에 대해 그것의 길이에 걸쳐 80% 미만이 동일하다 (예컨대 길이가 50개의 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드는 인간 전사물과 50개의 염기 중 40개 이상의 염기를 공유할 것이다). 즉, 바람직한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 그것이 사용될 포유류 대상체 (예컨대 인간, 비인간 영장류, 가축, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스 등)의 핵산 서열에 대해 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% 또는 20% 미만으로 동일하다.
반응 또는 매개변수의 "자극"은 관심의 매개변수를 제외한 것을 제외하고는 동일한 조건에 비교할 때, 또는 다르게는, 다른 조건과 비교하여 그 반응 또는 매개변수를 유도 및/또는 증대 (예컨대 TLR 아고니스트의 부재와 비교하여 TLR 아고니스트의 존재시에 TLR-신호화의 증가)시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 면역 반응의 "자극"은 반응의 증가를 의미한다.
반응 또는 매개변수의 "억제"는 관심의 매개변수를 제외한 것을 제외하고는 동일한 조건에 비교할 때, 또는 다르게는, 다른 조건과 비교하여 그 반응 또는 매개변수를 차단 및/또는 억제하는 것을 포함한다 (예컨대 TLR 길항제의 부재시에 TLR 아고니스트의 존재와 비교하여 TLR 아고니스트와 TLR 길항제의 존재시에 TLR-신호화의 감소). 예를 들어 면역 반응의 "억제"는 반응의 감소를 의미한다.
본원에 개시된 제제의 "유효량"은 구체적으로 진술된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 진술된 목적과 관련하여, 실험적으로 및 기본적인 방식으로 측정될 수 있다. 제제의 "유효량" 또는 "충분한 양"은 원하는 생물학적 효과, 예컨대 유익한 임상 결과를 포함하여 유익한 결과를 이루기에 적당한 양이다. 용어 "치료적 유효량"은 대상체 (예컨대 인간과 같은 포유류)에서 질환 또는 장애를 "치료"하기에 효과적인 제제의 양을 나타낸다. 알레르기의 경우, 치료적 유효량의 제제는 그 알레르기의 신호 또는 증상을 감소시킨다.
질환의 "치료하는" 또는 "치료"는 프로토콜을 실행하는 것을 나타내는데, 그것은 질환의 신호 또는 증상을 완화시키기 위한 노력으로, 하나 이상의 약물을 개체 (인간 또는 그 외)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 그러므로, "치료하는" 또는 "치료"는 신호 또는 증상의 완전한 완화를 필요로 하지 않고, 치유를 필요로 하지 않으며, 구체적으로 개체에게 일시적인 효과만을 나타내는 프로토콜을 포함한다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 및 기술분야에서 잘 이해되고 있는 것과 같이, "치료"는 임상 결과를 포함하여, 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 유익한 또는 원하는 임상 결과는, 한정하는 것은 아니지만, 검출 가능하든 검출 가능하지 않든간에, 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉 악화되지 않는) 상태, 질환의 확산의 방지, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화 및 차도 (부분적이거나 전체적인)를 포함한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 개체의 예상된 생존과 비교하여 연장된 생존을 의미할 수 있다.
질환 또는 장애를 "완화시키는 것"은 예상된 미처리 결과와 비교하여, 질환 또는 장애의 정도 및/또는 바람직하지 못한 임상적 표시가 감소되거나 및/또는 질환 또는 장애의 진행의 시간 과정이 느린 것을 의미한다. 특히 알레르기의 맥락에서, 완화는 알레르기 유발 항원(들)에 대한 Th1 면역 반응의 자극시에 발생할 수 있다. 나아가, 완화는 한 용량의 투여에 의해 반드시 발생하지는 않지만, 자주 일련의 ??량의 투여시에 발생한다. 그러므로, 반응 또는 장애를 완화시키기에 충분한 양은 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다.
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 것과 같이, 단일 형태를 나타내는 용어들은 다르게 표시되거나 맥락으로부터 명백하게 표시되지 않는 한 다수의 항목을 포함한다. 예를 들어 "폴리뉴클레오티드"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"약" 값 또는 매개변수에 대한 언급은 그 값 또는 매개변수의 변량을 기술한 것이다. 예를 들어, 약 400,000 달톤의 분자량을 언급하는 기술은 360,000 내지 440,000 달톤의 분자량을 포함한다.
본원에서 "포함하는"으로 기술된 측면 및 구체예들은 구체예들로 "구성되는" 및 "본질적으로 구성되는"을 포함하는 것으로 인지된다.
I. 폴리뉴클레오티드 및 키메라 화합물
본 개시는 그 중에서도 인간 환자와 같은 포유류 대상체에서 면역 반응을 조절하기에 유용한 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 및 분지형 키메라 화합물을 제공한다. 본 개시는 부분적으로는, 비-핵산 스페이서 모이어티 및/또는 중합체 담체에 공유적으로 결합된 핵산 모이어티를 함유하는 일부 키메라 화합물이, 핵산 모이어티가, 만약 분리된 폴리뉴클레오티드로서 존재한다면 인지할 정도의 면역조절 활성을 나타내지 않는 (예컨대 열등한 또는 측정할 수 없는 활성) 서열을 가지는 경우를 포함하여, 면역조절 활성 (특히 인간 세포에서)을 가진다는 발견을 기반으로 한다. 일부 구체예에서, 면역조절 활성은 면역자극 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, 면역조절 활성은 면역억제 활성을 포함한다.
A. 폴리뉴클레오티드
한 측면으로, 메틸화되지 않은 CpG 다이뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 면역 반응을 자극하거나 면역 반응을 자극하기 위하여 키메라 화합물을 구성할 수 있다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열 5'-TCGGCGC AACGTTC-3' (SEQ ID NO:3)을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이다 (즉 폴리뉴클레오티드는 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유한다). 일부 구체예에서, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합은 포스포다이에스테르 결합이다. 바람직한 구체예에서, 5'-TCGGCGC AACGTTC-3' (SEQ ID NO:3) 또는 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 위치한다 (즉 임의의 추가의 뉴클레오티드가 3'-말단에 첨가된다). 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드들 사이의 모든 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다.
B. 선형 키메라 화합물
다른 측면으로, 메틸화되지 않은 CpG 다이뉴클레오티드를 포함하는 핵산 모이어티를 포함하는 선형 키메라 화합물이 제공된다. 선형 키메라 화합물은 면역 반응을 자극하거나 면역 반응을 자극하기 위해 분지형 키메라 화합물을 구성할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 모이어티 및 비-핵산 스페이서 모이어티를 포함하는 선형 키메라 화합물이 제공된다. 일부 구체예에서, 선형 키메라 화합물은 식 N1-Sp1-N2 또는 N1-Sp1-N2-Sp2-N3을 가지는 코어 구조를 포함한다 (식에서, N1, N2 및 N3은 핵산 모이어티이고, Sp1 및 Sp2는 비-핵산 스페이서 모이어티이며, Sp1 및 Sp2는 정확하게 두 핵산 모이어티에 공유 결합된다). 이들 구체예중 일부에서, 선형 키메라 화합물은 식 (5'-N1-3')-Sp1-(5'-N2-3')의 코어 구조를 포함한다. 이들 구체예중 일부에서, 선형 키메라 화합물은 식 (5'-N1-3')-Sp1-(5'-N2-3')-Sp2-(5'-N3-3')의 코어 구조를 포함한다. 일부 구체예에서, 스페이서 모이어티는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG)이다. 일부 구체예에서, 선형 키메라 화합물은 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유한다 (즉 N1, N2 및 임의로 N3의 합계가 50 미만이다). 일부 구체예에서, 각 핵산 모이어티 N은 길이가 8 뉴클레오티드 미만, 바람직하게는 길이가 7 뉴클레오티드이다.
일부 구체예에서, 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3' (SEQ ID NO:4)와 같이 두 핵산 모이어티와 헥사에틸렌 글리콜 스페이서를 포함하는 선형 키메라 화합물이 제공되며, 이때 선형 키메라 화합물은 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유하고 (즉 N1 및 N2 의 합계가 50 미만임), 뉴클레오티드들 사이 및 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)와 같이 세 개의 핵산 모이어티와 두 개의 헥사에틸렌 글리콜 스페이서를 포함하는 선형 키메라 화합물이 제공되며, 이때 선형 키메라 화합물은 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유하고 (즉 N1, N2 및 N3의 합계가 50 미만임), 뉴클레오티드들 사이 및 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3' (SEQ ID NO:4) 또는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)는 선형 키메라 화합물의 5'-말단에 위치한다 (즉 임의의 추가 뉴클레오티드는 3'-말단에 첨가된다). 일부 구체예에서, 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)로 구성되는 선형 키메라 화합물이 제공된다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합은 포스포다이에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드들 사이의 모든 결합 및 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 결합들은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, 선형 키메라 화합물의 핵산 모이어티는 2'-데옥시리보폴리뉴클레오티드이다. 선형 키메라 화합물의 핵산 모이어티의 CpG 다이뉴클레오티드는 메틸화되지 않는다.
본 개시는 추가로 다음으로 구성되는 군의 하나를 포함하는 선형 키메라 화합물을 제공한다:
5'-TCGTTCG-3'-HEG-5'-TCGTTCG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3' (SEQ ID NO: 9) (D56-16),
5'-TCGTTCG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGTTCG-3' (SEQ ID NO: 10) (D56-17),
5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3' (SEQ ID NO: 11) (D56-18),
5'-TCGCCGG-3'-HEG-5'-TCGCCGG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3' (SEQ ID NO: 12) (D56-19),
5'-TCGCCGG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGCCGG-3' (SEQ ID NO: 13) (D56-20),
5'-TCGATCG-3'-HEG-5'-TCGATCG-3'-HEG-5'-AACGTTC-3' (SEQ ID NO: 14) (D56-21),
5'-TCGTCGT-3'-HEG-5'-TCGTCGT-3'-HEG-5'-AACGTTC-3' (SEQ ID NO: 15) (D56-22) 및
5'-TCGTCGT-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGTCGT-3' (SEQ ID NO: 16) (D56-23).
이들 구체예 중 일부에서, 선형 키메라 화합물은 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유하고, 뉴클레오티드 서열의 5'-TCG-3'는 선형 키메라 화합물의 5'-말단에 위치한다 (즉 임의의 추가의 뉴클레오티드는 3'-말단에 첨가된다). 일부 구체예에서, 뉴클레오티드들 사이 및 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합은 포스포다이에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드간 모든 결합 및 뉴클레오티와 HEG 스페이서 사이의 결합들은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, 선형 키메라 화합물의 핵산 모이어티는 2'-데옥시리보폴리뉴클레오티드이다. 선형 키메라 화합물의 핵산 모이어티의 CpG 다이뉴클레오티드는 메틸화되지 않는다.
C. 분지형 키메라 화합물
본 개시의 분지형 키메라 화합물은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리에틸렌 글리콜을 통하여 수크로오스 및 에피클로로히드린의 분지형 공중합체에 공유적으로 연결된 선형 키메라 화합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 본 개시의 분지형 키메라 화합물의 말레이미드-활성화된 FICOLL 중간체는 이전에 개시된 분지형 키메라 화합물의 중간체와 비교하여 개선된 용해도 및 안정성을 가진다. 그러므로, 본 개시의 분지형 키메라 화합물은 다이나박스 테크놀로지스 코포레이션 (Dynavax Technologies Corporation)의 미국 특허 제 8,597,665호, 8,114,418호 및 7,785,610호의 분지형 키메라 화합물 C-137 및 C-138과 비교하여 개선된 제조 가능성 및 보관성을 가진다. 본 개시의 분지형 키메라 화합물은 또한 시험관 내 및 생체 내에서 강력한 면역조절 활성 (예컨대 면역자극 또는 면역억제 활성) 및 낮은 독성을 가진다.
일부 구체예에서, 본 개시는 식 (I)의 분지형 키메라 화합물을 제공한다:
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I)
식에서,
D는 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물이고;
L1은 알킬티오기를 포함하는 제1 링커이며;
L2는 석신이미드기를 포함하는 제2 링커이고;
L3은 아미드기를 포함하는 제3 링커이며;
PEG는 폴리에틸렌 글리콜이고;
x는 3 내지 300의 정수이며; 및
F는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이다.
식 (I)의 분지형 키메라 화합물은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 다양한 링커 L1, L2 및 L3을 통하여 다가 모이어티 F에 연결된 3 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물 D를 포함한다. D의 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물의 핵산 모이어티는 메틸화되지 않은 CpG 다이뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예에서, D는 뉴클레오티드 서열 5'-TCGGCGC-3'를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, D는 뉴클레오티드 서열 5'-TCGGCGC AACGTTC-3' (SEQ ID NO:3)를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, D는 뉴클레오티드 서열 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, D의 폴리뉴클레오티드는 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이다 (즉 D의 폴리뉴클레오티드는 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유한다). 일부 구체예에서, 뉴클레오티드들 사이 및 D의 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, D의 5'-TCGGCGC AACGTTC-3' (SEQ ID NO:3) 또는 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한다 (즉 임의의 추가의 뉴클레오티드는 3'-말단에 첨가된다). 일부 구체예에서, D는 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, D의 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥이다. 일부 구체예에서, D의 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합은 포스포다이에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드들 사이의 모든 결합 및 D의 3'-말단 뉴클레오티와 L1 사이의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. D의 폴리뉴클레오티드의 CpG 다이뉴클레오티드는 메틸화되지 않는다.
일부 구체예에서, D는 핵산 모이어티와 비-핵산 스페이서 모이어티를 포함하는 선형 키메라 화합물이다. 일부 구체예에서, 선형 키메라 화합물은 식 N1-Sp1-N2 또는 N1-Sp1-N2-Sp2-N3을 가지는 코어 구조를 포함한다 (식에서, N1, N2 및 N3은 핵산 모이어티이고, Sp1 및 Sp2는 비-핵산 스페이서 모이어티이며, Sp1 및 Sp2는 정확하게 두 핵산 모이어티에 공유 결합된다). 이들 구체예중 일부에서, 선형 키메라 화합물은 식 (5'-N1-3')-Sp1-(5'-N2-3')의 코어 구조를 포함한다. 이들 구체예중 일부에서, 선형 키메라 화합물은 식 (5'-N1-3')-Sp1-(5'-N2-3')-Sp2-(5'-N3-3')의 코어 구조를 포함한다. 일부 구체예에서, N1은 서열 5'-TCGGCGC-3'를 가진다. 일부 구체예에서, N2는 서열 5'-AACGTTC-3'를 가진다. 일부 구체예에서, N3은 서열 5'-TCGGCGC-3'를 가진다. 일부 구체예에서, N1은 서열 5'-TCGGCGC-3'를 가지고 N2는 서열 5'-AACGTTC-3'를 가진다. 일부 구체예에서, N1은 서열 5'-TCGGCGC-3'를 가지고, N2는 서열 5'-AACGTTC-3'를 가지며, N3은 서열 5'-TCGGCGC-3'를 가진다. 이들 구체예 중 일부에서, 스페이서 모이어티는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG)이다. 일부 구체예에서, Sp1은 헥사에틸렌 글리콜 (HEG)이다. 일부 구체예에서, Sp2는 헥사에틸렌 글리콜 (HEG)이다. 일부 구체예에서, D의 선형 키메라 화합물은 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유한다 (즉 N1, N2 및 임의로 N3의 합계는 50 미만이다). 일부 구체예에서, 5'-TCGGCGC-3'는 선형 키메라 화합물의 5'-말단에 위치한다 (즉 임의의 추가의 뉴클레오티드는 3'-말단에 첨가된다). 일부 구체예에서, 각 핵산 모이어티 N은 길이가 8 뉴클레오티드 미만, 바람직하게는 길이가 7 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 각각의 핵산 모이어티 N은 길이가 4 내지 7, 바람직하게는 5 내지 7 또는 6 또는 7 뉴클레오티드이다. D의 선형 키메라 화합물의 핵산 모이어티의 CpG 다이뉴클레오티드는 메틸화되지 않는다.
일부 구체예에서, D는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3' (SEQ ID NO:4)와 같이 두 핵산 모이어티와 헥사에틸렌 글리콜 스페이서를 포함하는 선형 키메라 화합물이고, 여기서 선형 키메라 화합물은 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유하며 (즉 N1 및 N2의 합계는 50 미만임), 뉴클레오티드들 사이, 뉴클레오티드와 HEG 사이 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, D는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)와 같이 세 개의 핵산 모이어티와 두 개의 헥사에틸렌 글리콜 스페이서를 포함하는 선형 키메라 화합물이고, 여기서 선형 키메라 화합물은 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유하며 (즉 N1, N2 및 N3의 합계는 50 미만임), 뉴클레오티드들 사이 및 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, D의 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3' (SEQ ID NO:4) 또는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)는 선형 키메라 화합물의 5'-말단에 위치한다 (즉 임의의 추가의 뉴클레오티드는 3'-말단에 첨가된다). 일부 구체예에서, D는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)로 구성되는 선형 키메라 화합물이다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합은 포스포다이에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, D의 선형 키메라 화합물에서 뉴클레오티드간 모든 결합, 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 결합들 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, D의 선형 키메라 화합물의 핵산 모이어티는 2'-데옥시리보폴리뉴클레오티드이다. D의 선형 키메라 화합물의 핵산 모이어티의 CpG 다이뉴클레오티드는 메틸화되지 않는다.
핵산 모이어티에 대한 연결을 허용하기 위해 유도체화된 다당은 본 개시의 분지형 키메라 화합물에 대한 분지 단위로서 작용하는 다가 담체 모이어티로서 사용될 수 있다. 적합한 다당은 자연적으로 발생하는 다당 또는 합성 다당일 수 있다. 예시적인 다당으로는, 예컨대 덱스트란, 만닌, 키토산, 아가로오스 및 전분을 포함한다.예를 들면, 면역학적으로 관련된 세포 유형, 예컨대 단핵세포 및 폐포 대식세포 상의 만닌 (만노오스) 수용체가 있고, 그로써 다당 스페이서 모이어티가 특별한 세포 유형을 표적화하기 위해 사용될 수 있기 때문에, 만닌이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 다당은 교차-결합된다. 바람직한 다가 담체 모이어티는 에피클로로히드린-교차결합된 수크로오스 (예컨대 GE Healthcare에 의해 FICOLL®로서 명명된 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체)이다.
일부 구체예에서 식 (I)의 F는 약 100,000 내지 약 700,000 달톤의 분자량을 가지고, 에테르기를 통해 L3에 연결되어 있는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이다. 에테르기는 공중합체의 수크로오스 하이드록실로부터 유도된다. 일부 구체예에서, F는 약 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000 또는 600,000 달톤 (하한선)의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이다. 일부 구체예에서, F는 약 700,000, 600,000, 500,000, 400,000, 300,000 또는 200,000 달톤 (상한선)의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이다. 즉 F의 분자량은 약 100,000 내지 약 700,000 달톤의 크기 범위의 어느 것일 수 있고, 이때 하한선은 상한선보다 작다. 일부 구체예에서, F는 약 300,000 내지 5000,000 달톤 (예컨대 GE Healthcare의 FICOLL® PM 400)의 분자량을 가진다.
본원에서 식 (I)의 분지형 키메라 화합물에 대해 상세하게 설명된 F의 각각의 및 모든 변화는 본원에서 식 (I)의 분지형 키메라 화합물에 대해 상세하게 설명된 D의 각각의 및 모든 변이와, 각각의 및 모든 조합이 개별적으로 기술되는 것처럼 조합될 수 있는 것으로 의도되고 인지된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 식 (I)의 분지형 키메라 화합물:
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I)이 제공되며,
식에서:
D는 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물이고;
L1은 알킬티오기를 포함하는 제1 링커이며;
L2는 석신이미드기를 포함하는 제2 링커이고;
L3은 아미드기를 포함하는 제3 링커이며;
PEG는 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대 -(OCH2CH2)n-, n은 2 내지 80의 정수임)이고;
x는 3 내지 300의 정수이며; 및
F는 약 100,000 내지 약 700,000 달톤의 분자량을 가지고 에테르기를 통해 L3에 연결되는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이며,
폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열: 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)를 포함하고, 여기서 D의 폴리뉴클레오티드는 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이고,
D의 선형 키메라 화합물은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)와 같이 세 개의 핵산 모이어티와 두 개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하며, 뉴클레오티드들 사이, 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이 및 3'-뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다.
본 개시는 -L1-L2-(PEG)-L3-와 같이, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 다양한 링커 L1, L2 및 L3을 통해 다가 모이어티 F에 연결된 D의 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물을 포함하는 식 (I)의 분지형 키메라 화합물을 제공하며, 여기서 L1은 알킬티오기를 포함하는 제1 링커이고; L2는 석신이미드기를 포함하는 제2 링커이며; L3은 아미드기를 포함하는 제3 링커이고 PEG는 -(OCH2CH2)n-이다.
폴리에틸렌 글리콜은 그것이 무독성이고, 면역원성이 아니며, 친수성이고, 수용성이며 가요성이 높기 때문에 생물학적으로 활성인 분자들을 콘주게이트하고/변형시키는데 광범위하게 사용되었다. 본 개시의 키메라 화합물들의 PEG 함유 모이어티는 통상적으로 바이오-콘주게이션 (bio-conjugation)에 사용되는 메틸사이클로헥실 (MC) 모이어티와 같은 소수성 모이어티를 사용하는 콘쥬게이트들과 비교하여 이들 화합물에 대해 더 나은 용해도 및 안정성을 제공한다. PEG 링커의 에틸렌 글리콜 단위의 수는 분지형 키메라 화합물의 길이, 친수성 및 입자 크기를 최적화하기 위하여 맞춰질 수 있다.
일부 구체예에서, 식 (I)의 PEG는 식 -(OCH2CH2)n-의 것이고, 여기서 n은 2 내지 80의 정수이다. 일부 구체예에서, n은 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20 (하한선)보다 큰 정수이다. 일부 구체예에서, n은 80, 70, 60, 50 또는 40 (상한선)보다 작은 정수이다. 즉, n은 2 내지 80의 범위의 정수일 수 있고, 하한선은 상한선보다 작다. 일부 구체예에서, n은 2, 4, 6, 24, 45, 48 또는 70이다. 일부 구체예에서, n은 6, 24, 45 또는 70이다. 일부 구체예에서, n은 2, 4, 6, 24, 28, 45, 48 또는 70이다. 일부 구체예에서, n은 6, 24, 28, 45 또는 70이다. 바람직한 구체예에서, PEG는 -(OCH2CH2)6-이다.
본 개시의 분지형 키메라 화합물의 PEG는 한 단부에서 D의 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물의 3'-뉴클레오티드에 석신이미드기를 포함하는 링커를 통해 부착되고 아미드기를 포함하는 링커를 통해 다가 모이어티 F에 대해 다른 단부에서 부착된다. 알킬티오기는 D의 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물의 3'-뉴클레오티드와 석신이미드기 사이의 화학적 결합을 용이하게 하기 위해 사용된다. 그러므로, 제1 링커 L1은 알킬티오기를 포함하는 링커이고, 핵산의 3'-말단 포스페이트 모이어티를 제2 링커 L2의 석신이미드기에, L2를 포함하는 전구체의 말레이미드기와 반응하는 L1을 포함하는 전구체의 말단 설프하이드릴기 (-SH)에 의하여 결합시켜서 L1과 L2 사이에 티오석신이미도 결합을 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, L1은 식 -L1a-S-의 것이고, 식에서 L1a는 알킬렌기, 예를 들면 식 (CH2)m의 기이며, 여기서 m은 2 내지 9의 정수이다. 일부 구체예에서, L1은 식 -(CH2)mS-의 알킬티오기이고, 식에서 m은 2 내지 9의 정수이다. 일부 구체예에서, m은 이다. 일부 구체예에서, m은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이다. 일부 구체예에서, m은 3 내지 6이다. 바람직한 구체예에서, m은 3 또는 6이다. 다른 바람직한 구체예에서, m은 6이다. 일부 구체예에서, L1은 -(CH2)6S- 또는 -(CH2)3S-이다.
제2 링커 L2는 석신이미드기를 포함하는 링커이다. 일부 구체예에서, L2는 추가로 알킬 스페이서기 (예컨대 -CH2CH2-) 및/또는 알킬 아미드 스페이서기 (예컨대 -CH2CH2C(O)NH-)를 포함한다. 일부 구체예에서, L2는
Figure pct00005
,
Figure pct00006
또는
Figure pct00007
이다.
일부 구체예에서, L2는
Figure pct00008
이다.
일부 구체예에서, L2는 식:
Figure pct00009
의 것이고, 식에서 L2b는 알킬 스페이서기 (예컨대 -CH2CH2- 또는 -CH2CH2CH2CH2-) 및/또는 알킬 아미드 스페이서기 (예컨대 -CH2CH2C(O)NH-)이다. 일부 구체예에서, L2b는 -CH2CH2C(O)NHCH2CH2-이다. 일부 구체예에서, L2b는 -CH2CH2C(O)NH CH2CH2CH2-이다.
일부 구체예에서, -L1-L2- 모이어티는
Figure pct00010
또는
Figure pct00011
이다.
제3 링커 L3은 아미드기를 포함하는 링커로, PEG를 에테르기를 통하여 다가 모이어티 F에 공유 연결시킨다. 일부 구체예에서, L3은 추가로 하나 이상의 알킬 스페이서기 (예컨대 -CH2CH2-), 하나 이상의 아미드 스페이서기 (예컨대 -C(O)NH- 또는 -NHC(O)-), 또는 그것들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, L3은 식:
Figure pct00012
의 것이고, 식에서 L3a는 알킬기와 아민을 연결시킬 수 있는 스페이서, 예컨대 식 -NHC(O)CH2CH2C(O)-, -OC(O)- 또는 -C(O)-의 스페이서이다. L3의 (2-아미노에틸)아미노카르보닐메틸 모이어티는 F 상의 하이드록실기를 클로로아세테이트와 반응시킨 후 에틸렌 다이아민과 결합시킴으로써 F에 부착될 수 있다.
일부 구체예에서, L3은
Figure pct00013
,
Figure pct00014
또는
Figure pct00015
이다.
본원에서 식 (I)의 분지형 키메라 화합물에 대해 상세하게 설명한 L1, L2, L3 및 PEG의 각각 및 모든 변화는 서로 조합될 수 있고, 추가로 식 (I)의 분지형 키메라 화합물에 대해 본원에서 상세하게 설명한 D 및 F의 각각 및 모든 변화와, 마치 각각 및 모든 조합이 개별적으로 기술된 것처럼 조합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, -L2-(PEG)-L3- 모이어티는 다음 식 (A), (B), (C), (D), (E), (F) 또는 (G)의 것이다:
Figure pct00016
(A)
Figure pct00017
(B)
Figure pct00018
(C)
Figure pct00019
(D)
Figure pct00020
(E)
Figure pct00021
(F)
Figure pct00022
(G).
일부 구체예에서, -L1-L2-(PEG)-L3- 모이어티는
Figure pct00023
또는
Figure pct00024
이다.
일부 구체예에서, 분지형 키메라 화합물은 식:
Figure pct00025
의 것이고, 식에서 D는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)로 구성되는 선형 키메라 화합물이며, 이때 뉴클레오티드들 사이, 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이고, F는 약 400,000 달톤의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이며. n은 6, 24, 45 또는 70이고, x는 3 내지 300의 정수이며, 이때 F는 에테르 결합을 통해 메틸렌기에 연결된다. 일부 구체예에서, n은 6이고 x는 90 내지 150이다.
일부 구체예에서, 분지형 키메라 화합물은 식:
Figure pct00026
의 것이고, 식에서 D는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)로 구성되는 선형 키메라 화합물이며, 이때 뉴클레오티드들 사이, 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이고, F는 약 400,000의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이며. n은 6, 24, 45 또는 70이고, x는 3 내지 300의 정수이며, 이때 F는 에테르 결합을 통해 메틸렌기에 연결된다. 일부 구체예에서, n은 6이고 x는 90 내지 150이다. 일부 구체예에서, n은 45이고 x는 90 내지 150이다.
식 (I)의 분지형 키메라 화합물에서 D의 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물의 수는 3 내지 약 300의 범위일 수 있다. 즉, x가 3 내지 300의 정수이다. 일부 구체예에서, x는 3, 6, 9, 12, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 155, 165, 190 또는 200 (하한선)보다 큰 정수이다. 일부 구체예에서, x는 300, 275, 250, 225, 215, 210, 205, 200, 190, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50 (상한선)보다 작은 정수이다. 즉 x는 약 3 내지 300의 범위일 수 있고, 이때 하한선은 상한선보다 작다. 예를 들어 일부 구체예에서, x는 20 내지 300, 20 내지 200, 60 내지 180, 90 내지 150, 100 내지 140 또는 110 내지 130이다. 일부 구체예에서, x는 약 120 ± 30이다. 바람직한 구체예에서, x는 약 120이다.
개시의 키메라 화합물의 전형적인 제제는 다가 담체 모이어티 F당 D 모이어티의 명시된 평균 분자량 또는 대략적인 수를 가지는 로딩 비율의 분포를 가지는 키메라 화합물들로 구성된 이종성 혼합물이지만, 시약 및 반응 조건들이 재생적으로 원하는 로딩 비율을 이루기 위해 조절될 수 있다. 한 측면으로, 본원에 기술된 식 (I)의 하나 이상의 분지형 키메라 화합물 또는 그것의 변형을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 조성물은 규정된 로딩 비율 및 평균 분자량의 복수의 분지형 키메라 화합물을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 식 (I)의 화합물의 이종성 혼합물을 포함하고, 식에서 D, PEG, L1, L2, L3, F 및 x는 독립적으로 식 (I)에 대해 본원에서 기술된 것과 같으며, 혼합물의 키메라 화합물의 F 모이어티는 약 200,000 내지 약 600,000 달톤의 평균 분자량을 가지고, 혼합물의 키메라 화합물은 약 60 내지 약 180의 평균 로딩 비율 (x)을 가진다.
일부 구체예에서, 조성물은 식 (I)의 화합물의 이종성 혼합물을 포함하고, 식에서 D, PEG, L1, L2, L3, F 및 x는 독립적으로 식 (I)에 대해 본원에서 기술된 것과 같으며, 혼합물의 키메라 화합물의 F 모이어티는 약 300,000 내지 약 500,000 (예컨대 약 400,000) 달톤의 평균 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, 혼합물의 키메라 화합물의 F 모이어티는 약 400,000 ± 100,000 달톤의 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, 조성물은 식 (I)이 화합물의 이종성 혼합물을 포함하고, 식에서 D, PEG, L1, L2, L3, F 및 x는 독립적으로 식 (I)에 대해 본원에서 기술된 것과 같으며, 혼합물의 키메라 화합물은 약 90 내지 약 150 또는 약 100 내지 약 140 (예컨대 약 120)의 평균 로딩 비율 (x)을 가진다. 일부 구체예에서, 혼합물의 키메라 화합물은 약 120 ± 30 또는 약 120 ± 20의 로딩 비율 (x)을 가진다. 일부 구체예에서, 조성물은 식 (I)의 분지형 키메라 화합물의 이종성 혼합물을 포함하고, 식에서 D, PEG, L1, L2, L3, F 및 x는 독립적으로 식 (I)에 대해 본원에서 기술된 것과 같으며, 혼합물의 분지형 키메라 화합물의 F 모이어티는 약 400,000 ± 100,000 달톤의 분자량을 가지고, 혼합물의 분지형 키메라 화합물은 약 120 ± 30의 평균 로딩 비율을 가진다.
본 개시의 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 및 분지형 키메라 화합물은 인지할만한 면역조절 활성 (예컨대 비-면역조절 대조표준보다 적어도 3-배 더 높음)을 가진다. 일부 구체예에서, 면역조절 활성은 면역자극 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, 면역조절 활성은 면역억제 활성을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA 또는 RNA/DNA 하이브리드일 수 있다. 뉴클레오티드간 모든 결합, 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 결합들 및 3'-말단 뉴클레오티드와 링커 L1 사이의 결합은 포스페이트 또는 티오포스페이트 에스테르일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 및 분지형 키메라 화합물은 면역자극 활성을 가진다. 이들 구체예에서, D는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4를 포함한다. 일부 구체예에서, D는 SEQ ID NO:9 내지 16으로 구성되는 군의 하나를 포함한다. D의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 모이어티의 CpG 다이뉴클레오티드는 메틸화되지 않는다. 일부 구체예에서, D의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 모이어티의 5'-TCG-3'는 5'-말단에 위치한다 (예컨대 임의의 추가의 뉴클레오티드는 3'-말단에 첨가된다). 바람직한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 Toll-유사 수용체 (TLR) 억제 모티프를 포함하지 않는다. 바람직한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 TLR7, TLR8 및/또는 TLR9 억제 모티프를 포함하지 않는다. 예시적인 TLR7 억제 모티프는 5'-Qz'TGC-3', 5'-Qz'UGC-3', 5'-Qz'TIC-3' 및 5'-Qz'TTC-3'를 포함하고, 여기서 Q는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체이며, z'는 0, 1 또는 2이다. 즉 Qz '는 폴리뉴클레오티드의 5'-단부에 있다. 예시적인 TLR8 억제 모티프는 5'-X1X2X3-My'-3'이고, 여기서 X1은 A, T 또는 C이며, X2는 G 또는 I이고, X3은 I 또는 A이며, M은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체이고, y'는 0 또는 1이다. 즉 My'는 폴리뉴클레오티드의 3'-단부에 있다. 예시적인 TLR9 억제 모티프는 5'-S1S2S3S4-3'이고, 여기서 S1, S2, S3 및 S4 의 각각은 독립적으로 G 또는 I (이노신 또는 2'-데옥시이노신)이다. TLR9 억제 모티프가 5'-S1S2S3S4-3'인 일부 구체예에서, S1, S2, S3 및 S4 의 각각은 독립적으로 G 또는 G-테트라드 형성을 방지하거나 및/또는 이노신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-2'-데옥시크산토신, 7-데아자-8-아자-2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시네불라린, 아이소데옥시구아노신 및 8-옥소-2'-데옥시구아노신과 같은 후그스틴형 염기쌍을 방지할 수 있는 분자이다.
면역자극 활성을 평가하기 위한 분석은 기술분야에 알려져 있고, 실시예 B1 및 B2에 기술되어 있다. 본 개시의 목적에 대해, 면역자극 활성은 시험 화합물의 존재 및 부재하에 인큐베이션된 후 인간 말초혈 단핵 세포에 의한 인터페론-알파 생성을 측정함으로써 측정될 수 있다. 시험 화합물은 시험 화합물의 존재하에 적어도 2-배 이상의 인터페론-알파가 생성된 때 면역자극 활성을 가지는 것으로 말할 수 있다. 포지티브 및 네거티브 대조표준이 면역자극 활성에 대한 분석에서 유용한 것으로 인지된다. 면역자극 활성에 적합한 네거티브 대조표준은 배지 단독이다. 다른 적합한 네거티브 대조표준은 뉴클레오티드 서열 5'-TGACTGTGAA CCTTAGAGAT GA-3' (SEQ ID NO:5로서 표시되는 D56-30)로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 면역자극 활성에 적합한 포지티브 대조표준은 뉴클레오티드 서열 5'-TGACTGTGAA CGTTCGAGAT GA-3' (SEQ ID NO:6으로 표시되는 D56-10)로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다.
II. 키메라 화합물의 합성
개시는 추가로 본원에 상세하게 설명된 키메라 화합물 (예컨대 분지형 키메라 화합물)의 제조 방법, 뿐만 아니라 그 안에서 유용한 조성물 및 중간체를 제공한다.
한 측면으로, 개시는 다음 식 (I):
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I),
식에서:
D는 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물이고;
L1은 알킬티오기를 포함하는 제1 링커이며;
L2는 석신이미드기를 포함하는 제2 링커이고;
L3은 아미드기를 포함하는 제3 링커이며;
PEG는 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대 -(OCH2CH2)n-, n은 2 내지 80의 정수임)이고;
x는 3 내지 300의 정수이며; 및
F는 약 100,000 내지 약 700,000 달톤의 분자량을 가지고 에테르기를 통해 L3에 연결되는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이며,
폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열: 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)를 포함하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이고, 및
선형 키메라 화합물은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)와 같이 세 개의 폴리뉴클레오티드와 두 개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하며, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합, 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 결합들 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합인 식 (I)의 분지형 키메라 화합물의 제조 방법을 제공하는데, 그 방법은:
식 D-L1a-SH의 화합물 (식에서 D는 식 (I)에 대해 정의된 것과 같고 L1a는 (CH2)m이며 여기서 m은 2 내지 9의 정수임)을 식 (II)의 화합물:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
(식에서 L3, PEG 및 F는 식 (I)에 대해 정의된 것과 같고;
L2a는
Figure pct00027
,
Figure pct00028
,
Figure pct00029
또는
Figure pct00030
이며; 및
y는 3 내지 350의 정수이다)과 반응시키는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, L2a는
Figure pct00031
,
Figure pct00032
또는
Figure pct00033
이다.
일부 경우에, 식 (II)의 화합물의 모든 말레이미드기가 핵산 모이어티 D와 반응한다. 그러므로 일부 구체예에서, y는 x와 같다. 다른 경우에, 식 (II)의 화합물의 말레이미드기의 단지 일부만이 핵산 모이어티 D와 반응하는 한편, 일부는 핵산 모이어티 D와 반응하지 않는다. 그러므로 일부 구체예에서, y는 x보다 큰 정수이다. 일부 구체예에서, y는 3, 6, 9, 12, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 155, 165, 190 또는 200 (하한선)보다 큰 정수이다. 일부 구체예에서, y는 350, 300, 275, 250, 225, 215, 210, 205, 200, 190, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50 (상한선)보다 작은 정수이다. y는 약 2 내지 350의 범위의 정수일 수 있고, 하한선은 상한선보다 작다. 예를 들어, 일부 구체예에서, y는 20 내지 350, 30 내지 300, 155 내지 215, 165 내지 205, 20 내지 250, 90 내지 250, 120 내지 250, 120 내지 220, 160 내지 220, 20 내지 200, 60 내지 180, 90 내지 150, 100 내지 140 또는 110 내지 130이다. 바람직한 구체예에서, y는 약 190, 약 185, 약 150 또는 약 120이다. 일부 구체예에서, y는 약 190 ± 30 또는 약 185 ± 30이다. 일부 구체예에서 y는 x보다 큰 정수이고, 핵산 모이어티 D와 반응하지 않는 말레이미드기는 캡핑되거나 및/또는 가수분해된다. 일부 구체예에서 y가 x보다 큰 정수일 때, 핵산 모이어티 D와 반응하지 않는 말레이미드기는 시스테인으로 캡핑되거나 및/또는 물에 의해 가수분해된다.
반응성 티올 화합물 D-L1a-SH는 자주 사용 전에 더 안정한 이황화 화합물로부터 제조된다. 일부 구체예에서, 방법은 식 D-L1a-SS-L1a-OH 의 이황화 화합물을 환원제 (예컨대 포스핀 화합물)와 반응시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, D는 식 (I)에 대해 본원에서 정의된 것과 같고 L1a는 (CH2)m이며, 여기서 m은 2 내지 9의 정수이다. 일부 구체예에서, m은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이다. 일부 구쳉PDp서, m은 3 내지 6이다. 일부 구체예에서, m은 3 또는 6이다. 한 구체예에서, m은 6이다. 한 구체예에서, m은 3이다. 환원제의 한 실례는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염 (TCEP)이다.
본 발명은 또한 식 D-L1a-SH의 화합물 또는 식 D-L1a-SS-L1a-OH의 화합물을 제공하며, 식에서 D는 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물, 예컨대 본원에서 상세하게 기술된 폴리뉴클레오티드 또는 본원에서 상세하게 기술된 선형 키메라 화합물이고, L1a는 (CH2)m이며, m은 2 내지 9의 정수이다. 이들 구체예 중 일부에서, D는 뉴클레오티드 서열: 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)를 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, D의 폴리뉴클레오티드는 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 이들 구체예의 일부에서, D는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)와 같이 세 개의 핵산 모이어티와 두 개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하는 선형 키메라 화합물이고, 여기서 선형 키메라 화합물은 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유하며, 뉴클레오티드들 사이, 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이 및 3'-뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 이들 구체예의 일부에서, D는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)로 구성되는 선형 키메라 화합물이다. 일부 구체예에서, D의 선형 키메라 화합물의 뉴클레오티드간 모든 결합, 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 결합들 및 3'-뉴클레오티드와 L1 사이의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 일부 구체예에서, D의 선형 키메라 화합물의 핵산 모이어티는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, m은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이다. 일부 구체예에서, m은 3 내지 6이다. 일부 구체예에서, m은 3 또는 6이다. 일부 구체예에서, m은 6이다. 일부 구체예에서, m은 3이다.
일부 구체예에서, D-L1a-SH는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3'-(CH2)m-SH (SEQ ID NO:2)이고, 여기서 m은 2 내지 9의 정수이다. 일부 구체예에서, D-L1a-SS-L1a-OH는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3'-(CH2)m-SS-(CH2)m-OH (SEQ ID NO:2)이고, 여기서 m은 2 내지 9의 정수이다. 일부 구체예에서, m은 3 또는 6이다. 일부 구체예에서, m은 6이다. 일부 구체예에서, m은 3이다.
본원에 기술된 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 및 이황화 변형된 핵산은 기술분야에 공지된 방법들, 예컨대 미국 특허 제 8,114,418호에 기술된 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 산화성 황화가 포함된 포스포라미다이트 화학을 사용한 고상 합성에 의해 제조되고, 제조자의 프로토콜을 따라 정제 및 분리될 수 있다 (Molecules 2013, 18, 14268-14284). 사용된 뉴클레오시드 단량체의 실례는 5'-다이메톡시트리틸-보호된-2'-데옥시뉴클레오시드였다. 선형 키메라 화합물은 HEG 스페이서를 폴리뉴클레오티드에 통합시킴으로써 만들어진다 (예컨대 Space Phorphoramidite 18 from Glen Research, Sterling, VA). 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 및/또는 선형 키메라 화합물은 뉴클레오티드 단량체, HEG 스페이서 및 링커를 원하는 순서로 첨가되도록 프로그램된 고상 합성기 상에서 합성되고, 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어난다. 3'-뉴클레오시드 또는 링커 기 (예컨대 3'-티올-변형제 C6 S-S CPG)가 고체 지지체에 부착된다. 일부 구체예에서, 합성 사이클은 산 (예컨대 톨루엔 중의 다이클로로아세트산)을 사용한 트리틸 보호기의 제거, 포스포라미다이트 단량체 플러스 약간 산성인 활성화제 (예컨대 사카린 1-메틸이미다졸)를 사용한 결합 단계, 산화성 황화 단계 (예컨대 피리딘 중의 0.2 M 크산탄 하이드라이드) 및 미반응 기를 위한 캡핑 단계 (예컨대 아이소부티르 무수물 및 N-메틸이미다졸)로 구성된다. 합성 사이클은 PN과 CC 서열이 완전히 조립될 때까지 반복된다. 보호된 폴리뉴클레오티드 및 키메라 화합물은 고체 지지체로부터 절단되고 탈보호될 수 있다 (예컨대 아세토니트릴 중의 20% t-부틸아민을 사용한 시아노에틸 포스페이트 보호기의 제거, 이어서 농축 수성 암모니아로 처리함으로써 지지체로부터 PN 또는 CC의 제거, 및 그 결과의 용액을 72시간 동안 주변 온도에서 유지하여 뉴클레오티드 상의 보호기가 제거됨). 폴리뉴클레오티드는 정제되고 (예컨대 음이온 교환 크로마토그래피를 사용함), 탈염되고 (예컨대 접선 유동 여과 시스템을 사용한 한외여과/투석여과에 의해), 동결건조되고, 동결건조된 고체로서 냉동 보관될 수 있다.
식 (II)의 화합물의 PEG는 PEG를 포함하는 활성화된 에스테르 화합물과 반응하는 다가 다당 F의 아민 유도체를 통해 도입될 수 있다. 일부 구체예에서, 식 (I)의 화합물의 제조 방법은 추가로 식 (III)의 화합물:
[NH2CH2CH2NHC(O)CH2]z-F (III) (식에서 F는 식 (I)에 대해 정의된 것과 같고 z는 3 내지 400의 정수임)을 식 L2a-(PEG)-L3a-Lv의 화합물 (L2a 및 PEG는 식 (II)에 대해 정의된 것과 같고; L3a는 -NHC(O)CH2CH2C(O)- 또는 -C(O)-이며; 및 Lv는 이탈기임)과 반응시켜서 식 (II)의 화합물을 형성하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, PEG를 포함하는 활성화된 에스테르 화합물은 N-하이드록시석신이미드 (NHS 또는 HOSu) 에스테르이고, Lv는 (2,5-다이옥소피롤리딘-1-일-옥시 (즉 OSu)이다. 기술분야에 알려져 있는 다른 활성화된 카르복실산 또는 에스테르는 식 (III)의 아민과 반응하여 식 (II)의 화합물을 형성할 수 있다.
일부 구체예에서, F는 약 100,000 내지 700,000 달톤의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이다. 일부 구체예에서, F는 약 400,000 ± 100,000 달톤의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체 (예컨대 FICOLL® PM 400)이고, 식 (III)의 화합물은 AECM-FICOLL®400의 화합물이다. 활성화된 에스테르 L2a-(PEG)-L3a-Lv (예컨대 NHS 에스테르 L2a-(PEG)-L3a-OSu)의 사용된 식 (III)의 화합물 (예컨대 AECM-FICOLL®400의 화합물)에 대한 상대적인 양에 따라, 식 (III)의 화합물 중의 일부 또는 전부의 아미노기가 페길화 (PEGylated)될 수 있다. 그러므로 일부 구체예에서, z는 y와 동등하다. 일부 구체예에서, z는 y보다 큰 정수이다. 일부 구체예에서, z는 3, 6, 9, 12, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 155, 165, 190 또는 200 (하한선)보다 큰 정수이다. 일부 구체예에서, z는 400, 350, 300, 275, 250, 225, 215, 210, 205, 200, 190, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50 (상한선)보다 작은 정수이다. 즉 z는 약 3 내지 400의 범위의 정수일 수 있고 하한선은 상한선보다 작다. 예를 들어, 일부 구체예에서, z는 20 내지 400, 50 내지 300, 190 내지 250, 200 내지 240, 20 내지 350, 30 내지 300, 155 내지 215, 165 내지 205, 20 내지 250, 90 내지 250, 120 내지 250, 120 내지 220, 160 내지 220, 20 내지 200, 60 내지 180, 90 내지 150, 100 내지 140 또는 110 내지 130이다. 바람직한 구체예에서, z는 약 220, 약 190, 약 150 또는 약 120이다. 일부 구체예에서, z는 약 220 ± 30 또는 약 220 ± 20이다. 일부 구체예에서, z가 y보다 큰 정수일 때, 과잉 아민은 캡핑된다. 일부 구체예에서, z가 y보다 큰 정수일 때, 과잉 아민은 설포-NHS-아세테이트 또는 NHS-아세테이트로 캡핑된다.
FICOLL®은 수크로오스를 에피클로로히드린과 교차-결합시켜 고도로 분지된 구조를 초래함으로써 합성된다. 아미노에틸카르복시메틸-FICOLL (AECM-FICOLL®)은 Inman, 1975, J. Imm. 114:704-709의 방법에 의해 제조될 수 있다. AECM-FICOLL은 다음에 이종이중기능성 교차결합제, 예컨대 6-말레이미도 카프로익 아실 N-하이드록시석신이미드 에스테르와 반응될 수 있고, 다음에 티올-유도체화된 핵산 모이어티에 콘쥬게이트될 수 있다 (Lee et al., 1980, Mol. Imm. 17:749-56 참조). 다른 다당도 유사하게 변형될 수 있다.
방법에 사용된 NHS 에스테르 (L2a-(PEG)-L3a-OSu)는 상업적 공급원으로부터 얻거나 기술분야에 공지되어 있는 방법들에 의해 제조될 수 있다.
일부 구체예에서, 식 (II)의 화합물이 제공된다:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
식에서:
L2a는 말레이미드기를 포함하는 모이어티이고;
L3은 아미드기를 포함하는 링커이며;
PEG는 폴리에틸렌 글리콜이고;
y는 3 내지 350의 정수이며; 및
F는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이며 에테르기를 통해 L3에 연결된다.
식 (II)의 화합물의 일부 구체예에서, L3, PEG 및 F는 식 (I)에 대해 정의된 것과 같거나 본원에서 상세하게 기술된 임의의 변형이고;
L2a는
Figure pct00034
이며, 여기서 L2b는 식 (I)에 대해 본원에서 상세하게 기술된 것과 같거나 그것들의 임의의 변형 (예컨대 -CH2CH2C(O)NHCH2CH2CH2-, -CH2CH2C(O)NHCH2CH2-, -CH2CH2- 또는 -CH2CH2CH2CH2-)이고; 및
y는 식 (II)에 대해 본원에서 상세하게 기술된 것과 같다.
예를 들어, 식 (II)의 화합물의 일부 구체예에서, F는 약 300,000 to 500,000 달톤의 분자량을 가진다 (예컨대 GE Healthcare의 FICOLL® PM 400). 일부 구체예에서, y는 3, 6, 9, 12, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150 (하한선)보다 큰 정수이다. 일부 구체예에서, y는 3, 6, 9, 12, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 155, 165, 190 또는 200 (하한선)보다 큰 정수이다. 일부 구체예에서, y는 350, 300, 275, 250, 225, 215, 210, 205, 200, 190, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50 (상한선)보다 작은 정수이다. 즉 y는 약 3 to 350의 범위의 정수일 수 있고 하한선은 상한선보다 작다. 예를 들어, 일부 구체예에서, y는 20 내지 350, 30 내지 300, 155 내지 215, 165 내지 205, 20 내지 250, 90 내지 250, 120 내지 250, 120 내지 220, 160 내지 220, 20 내지 200, 60 내지 180, 90 내지 150, 100 내지 140 또는 110 내지 130이다. 바람직한 구체예에서, y는 약 190, 약 185, 약 150 또는 약 120이다. 일부 구체예에서, y는 약 190 ± 30 또는 약 185 ± 30이다. 일부 구체예에서, PEG는 식 -(OCH2CH2)n-의 것이고, 여기서 n은 2 내지 80의 정수이다. 바람직한 구체예에서, PEG는 -(OCH2CH2)6-이다. 일부 구체예에서, L2a는
Figure pct00035
이다. 일부 구체예에서, L3은 식
Figure pct00036
의 것이고, 식에서 L3a는 알킬기와 아민을 연결시킬 수 있는 스페이서, 예컨대 식 -NHC(O)CH2CH2C(O)- 또는 -C(O)-의 스페이서이다.
일부 구체예에서, 다음 식 (II)의 화합물:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
(식에서:
L2a는 말레이미드기를 포함하는 모이어티이고;
L3은 아미드기를 포함하는 링커이며;
PEG는 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대 -(OCH2CH2)n-, n은 2 내지 80의 정수임)이고;
y는 3 내지 350의 정수이며; 및
F는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이며 에테르기를 통해 L3에 연결된다)의 제조 방법이 제공되는데,
방법은 식 (III)의 화합물:
[NH2CH2CH2NHC(O)CH2]z-F (III) (식에서 F는 식 (II)에 대해 정의된 것과 같고 z는 3 내지 400의 정수임)을 식 L2a-(PEG)-L3a-Lv의 화합물 (식에서 L2a 및 PEG는 식 (II)에 대해 정의된 것과 같고; L3a는 -NHC(O)CH2CH2C(O)-, -OC(O)- 또는 -C(O)-이며; Lv는 이탈기 (예컨대 (2,5-다이옥소피롤리딘-1-일)옥시)임)과 반응시키는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 식 (II)의 화합물의 이종성 혼합물을 포함하는 조성물이 제공되는데, 식에서 L2a, PEG, L3, F 및 y는 독립적으로 식 (II)에 대해 본원에서 기술된 것과 같고, 식 (II)의 화합물의 이종성 혼합물의 F 모이어티는 약 200,000 내지 약 600,000 달톤의 평균 분자량을 가지며, 이종성 혼합물 중의 식 (II)의 화합물은 약 60 내지 약 250의 평균 로딩 비율 (y)을 가진다. 일부 구체예에서, 식 (II)의 화합물의 이종성 혼합물의 F 모이어티는 약 300,000 내지 약 500,000 달톤의 형균 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, 식 (II)의 화합물의 이종성 혼합물의 F 모이어티는 약 400,000 ± 100,000 달톤의 평균 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, 이종성 혼합물의 식 (II)의 화합물은 약 60 내지 약 250, 약 90 내지 약 250, 약 120 내지 약 250, 약 120 내지 약 220, 약 160 내지 약 220, 약 60 내지 약 200, 약 60 내지 약 180,, 또는 약 90 내지 약 150의 평균 로딩 비율 (y)을 가진다. 일부 구체예에서, 이종성 혼합물의 식 (II)의 화합물은 약 120 ± 30, 약 150 ± 30, 약 185 ± 30 또는 약 190 ± 30의 평균 로딩 비율 (y)을 가진다. 일부 구체예에서, 조성물은 식 (II)의 화합물의 이종성 혼합물을 포함하고, 이때 L2a, PEG, L3, F 및 y는 독립적으로 식 (II)에 대해 본원에서 기술된 것과 같으며, 식 (II)의 화합물의 이종성 혼합물의 F 모이어티는 약 400,000 ± 100,000 달톤의 평균 분자량을 가지고, 이종성 혼합물의 식 (II)의 화합물은 약 120 ± 30, 약 150 ± 30, 약 185 ± 30 또는 약 190 ± 30의 평균 로딩 비율 (y)을 가진다.
본 발명은 또한 본원에 상세하게 기술된 식 (II)의 화합물의 분포로부터 본원에 상세하게 기술된 식 (I)의 화합물의 분포를 포함하는 혼합물의 제조 방법을 제공한다. 한 측면으로, 식 (I):
[D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I)
식에서:
D는 독립적으로 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물이고;
L1은 독립적으로 알킬티오기를 포함하는 제1 링커이며;
L2는 독립적으로 석신이미드기를 포함하는 제2 링커이고;
L3은 독립적으로 아미드기를 포함하는 제3 링커이며;
PEG는 독립적으로 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대 -(OCH2CH2)n-, n은 2 내지 80의 정수임)이고;
x는 독립적으로 3 내지 300의 정수이며; 및
F는 독립적으로 약 100,000 내지 약 700,000의 분자량을 가지고 에테르기를 통해 L3에 연결되는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이며,
폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열: 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)를 포함하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 독립적으로 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이고, 및
선형 키메라 화합물은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)와 같이 세 개의 폴리뉴클레오티드와 두 개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하며, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합, 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 결합들 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합인 분지형 키메라 화합물의 이종성 혼합물의 제조 방법이 제공되며, 방법은
식 D-L1a-SH의 화합물 (식에서 D는 독립적으로 식 (I)에 대해 정의된 것과 같고 L1a는 (CH2)m이며, 이때 m은 독립적으로 2 내지 9의 정수임)을 포함하는 조성물을 식 (II)의 화합물:
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II),
(식에서 L3, PEG 및 F는 독립적으로 식 (I)에 대해 정의된 것과 같고;
각각의 L2a는 독립적으로
Figure pct00037
,
Figure pct00038
,
Figure pct00039
또는
Figure pct00040
이며; 및
y는 독립적으로 3 내지 350의 정수이다)의 이종성 혼합물을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하며;
식 (II)의 화합물을 포함하는 조성물은 식 (II)의 화합물의 이종성 혼합물을 포함하고, 식 (II)의 화합물의 이종성 혼합물의 F 모이어티는 약 200,000 내지 약 600,000 달톤의 평균 분자량을 가지며, 혼합물의 식 (II)의 화합물은 약 60 내지 약 250의 평균 로딩 비율 (y)을 가진다. 일부 구체예에서, 식 (II)의 화합물의 이종성 혼합물의 F 모이어티는 약 400,000 ± 100,000 달톤의 평균 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, 이종성 혼합물의 식 (II)의 화합물은 약 120 ± 30, 약 150 ± 30, 약 185 ± 30 또는 약 190 ± 30의 평균 로딩 비율 (y)을 가진다.
일부 구체예에서, 각각의 L2a는 독립적으로
Figure pct00041
,
Figure pct00042
,
Figure pct00043
또는
Figure pct00044
이다.
일부 구체예에서, 식 (II):
[L2a-(PEG)-L3]y-F (II),
식에서:
L2a는 독립적으로 말레이미드기를 포함하는 모이어티이고;
L3은 독립적으로 아미드기를 포함하는 링커이며;
PEG는 독립적으로 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대 -(OCH2CH2)n-, n은 2 내지 80의 정수임)이고;
y는 독립적으로 3 내지 350의 정수이며; 및
F는 독립적으로 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이며 에테르기를 통해 L3에 연결된 화합물의 제조 방법이 제공되는데,
방법은 식 (III)의 화합물:
[NH2CH2CH2NHC(O)CH2]z-F (III) (식에서 F는 식 (II)에 대해 정의된 것과 같고 z는 3 내지 400의 정수임)을 식 L2a-(PEG)-L3a-Lv의 화합물 (식에서 L2a 및 PEG는 식 (II)에 대해 정의된 것과 같고; L3a는 -NHC(O)CH2CH2C(O)- , -OC(O)- 또는 -C(O)-이며; Lv는 이탈기 (예컨대 (2,5-다이옥소피롤리딘-1-일)옥시)임)과 반응시키는 단계를 포함하고,
식 (III)의 화합물의 혼합물의 F 모이어티는 약 200,000 내지 약 600,000 달톤의 평균 분자량을 가지며, 식 (III)의 화합물의 혼합물은 약 60 내지 약 280의 평균 로딩 비율 (z)을 가진다.
식 (II)의 화합물의 이종성 혼합물을 포함하는 조성물의 제조 방법의 일부 구체예에서, L2a, PEG, L3a 및 Lv는 본원에서 상세하게 기술된 것과 같고, 식 (III)의 화합물의 혼합물의 F 모이어티는 약 300,000 내지 약 500,000 달톤의 평균 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, 식 (III)의 화합물의 혼합물의 F 모이어티는 약 400,000 ± 100,000 달톤의 평균 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, 식 (III)의 화합물의 혼합물은 약 50 내지 약 350, 약 50 내지 약 280, 약 60 내지 약 250, 약 60 내지 약 180, 약 60 내지 약 150, 약 90 내지 약 280, 약 90 내지 약 250, 약 90 내지 약 200, 약 90 내지 약 150, 약 120 내지 약 280, 약 120 내지 약 250, 약 150 내지 약 280, 약 150 내지 약 250, 약 180 내지 약 280, 약 180 내지 약 250, 약 200 내지 약 250 또는 약 210 내지 약 230의 평균 로딩 비율 (z)을 가진다. 일부 구체예에서, 식 (III)의 화합물의 혼합물은 약 120 ± 30, 약 150 ± 30, 약 180 ± 30, 약 220 ± 30 또는 약 220 ± 20의 평균 로딩 비율 (z)을 가진다. 일부 구체예에서, 식 (III)의 화합물의 혼합물은 AECM FICOLL® 400이다.
일부 구체예에서, 식 (I)의 분지형 키메라 화합물의 이종성 혼합물의 제조 방법은 본원에서 상세하게 기술된 식 (III)의 화합물의 혼합물을 포함하는 조성물을 본원에서 상세하게 기술된 식 L2a-(PEG)-L3a-Lv의 화합물과 반응시키는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 식 (I)의 화합물 또는 식 (I)의 화합물의 이종성 혼합물을 포함하는 조성물의 제조 방법은 식 (I)의 키메라 화합물, 및/또는 식 (II)의 화합물 및 식 (III)의 화합물과 같은 중간체 화합물 중 어느 것을 정제하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 식 (I)의 키메라 화합물을 투석여과에 의해 정제하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 식 (I)의 키메라 화합물을 100,000 분자량 컷 오프 (MWCO) 멤브레인을 사용하는 투석여과에 의해 정제하는 단계를 더 포함한다.
III. 제약학적 조성물
본 개시의 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 또는 분지형 키메라 화합물 (예컨대 활성 제제)을 포함하는 제약학적 조성물이 또한 제공된다. 제약학적 조성물은 기본적으로 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유한다. 제약학적 조성물은 추가로 항원을 포함한다. 본 개시의 제약학적 조성물은 용액 또는 냉동 건조된 고체의 형태로 있을 수 있다. 본 개시의 제약학적 조성물은 바람직하게는 멸균되고, 바람직하게는 본질적으로 내독소가 없다.
A. 부형제
본 개시의 제약학적으로 허용되는 부형제는 예를 들면 용매, 벌크화제, 완충제, 등장성 조정제 및 보존제를 포함한다 (예컨대 Pramanick et al., Pharma Times, 45:65-77, 2013 참조). 일부 구체예에서 제약학적 조성물은 용매, 벌크화제, 완충제 및 등장성 조정제 중 하나 이상으로서 작용하는 부형제를 포함할 수 있다 (예컨대 식염수의 염화나트륨은 수성 비히클 및 등장성 조정제 둘 다로서 작용할 수 있다). 본 개시의 제약학적 조성물은 비경구 투여에 적합하다. 즉 본 개시의 제약학적 조성물은 장 투여를 위해 의도되지 않는다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 용매로서 수성 비히클을 포함한다. 적합한 비히클은 예를 들면 멸균수, 식염수 용액, 포스페이트 완충 식염수 및 링거액을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 등장성이거나 고장성이다.
제약학적 조성물은 벌크화제를 포함할 수 있다. 벌크화제는 제약학적 조성물이 투여 전에 동결건조되어야 할 때 특히 유용하다. 일부 구체예에서, 벌크화제는 냉동-건조 중에 및/또는 보관 중에 활성 제제의 안정화 및 분해의 방지를 돕는 동결건조 보호제이다. 적합한 벌크화제는 수크로오스, 락토오스, 트레할로오스, 만니톨, 소르비톨, 글루코오스 및 라피노오스와 같은 당 (단일-, 이- 및 다당)이다.
제약학적 조성물은 완충제를 포함할 수 있다. 완충제는 처리, 보관 및 선택적으로 복원 중에 활성 제제의 분해를 억제하기 위해 pH를 조절한다. 적합한 완충제는 예를 들면 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트 또는 설페이트를 포함하는 염을 포함한다. 다른 적합한 완충제는 예를 들면 아르기닌, 글리신, 히스티딘 및 라이신과 같은 아미노산을 포함한다. 완충제는 추가로 염산 또는 수산화나트륨을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 완충제는 4 내지 9의 범위 내에서 조성물의 pH를 유지한다. 일부 구체예에서, pH는 4, 5, 6, 7 또는 8 (하한선) 보다 크다. 일부 구체예에서, pH는 9, 8, 7, 6 또는 5 (상한선)보다 작다. 즉, pH는 약 4.0 내지 9.0의 범위에 있고 하한선은 상한선보다 작다.
제약학적 조성물은 등장성 조정제를 포함할 수 있다. 적합한 등장성 조정제는 예를 들면 덱스트로오스, 글리세롤, 염화나트륨, 글리세린 및 만니톨을 포함한다.
제약학적 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제는 예를 들면 항산화제 및 항미생물제를 포함한다. 그러나, 바람직한 구체예에서, 제약학적 조성물은 멸균 조건하에서 제조되고 단일 사용 용기에 있으며, 따라서 보존제의 포함을 필요로 하지 않는다.
B. 항원
본 개시는 나아가 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 또는 분지형 키메라 화합물에 더불어 항원 및 부형제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 항원을 포함하는 본 개시의 조성물에서, 항원은 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 또는 분지형 키메라 화합물에 공유적으로 결합되지 않는다. 일부 바람직한 구체예에서, 항원은 단백질 항원이다. 일부 바람직한 구체예에서, 항원은 다당 항원이고, 그것은 바람직하게 담체 단백질에 공유적으로 부착된다. 일부 구체예에서, 항원은 미생물 항원, 알레르기 유발 항원 또는 종양 항원이다.
제약학적 조성물은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원 및 기생충 항원으로 구성되는 군으로부터 선택된 미생물 항원을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 미생물 항원은 비인간, 포유류 대상체에서 감염성 질환을 유발하는 미생물로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 미생물 항원은 인간 대상체에서 감염성 질환을 유발하는 미생물로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 감염성 질환은 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생동물 기생충에 의해 유발된다. 적합한 미생물 항원은 예를 들면 아데노바이러스 타입 4, 아데노바이러스 타입 7, 탄저병, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 코리네박테리움 디프테리아에 (Corynebacterium diphtheriae)(예컨대 디프테리아 변독소), 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani) (예컨대 파상풍 변독소), 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis), 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 타입 B, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스 (예컨대 HBsAg), 인간 유두종바이러스 (타입 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 및 58) 인플루엔자 바이러스 타입 A 및 B (예컨대 헤마글루티닌, 뉴라미니다제), 인플루엔자 바이러스 타입 B, 파라인플루엔자 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스, 나이세리아 메닝기티디스 (Neisseria menigitidis)(그룹 A, B, C, Y 및 W-135), 스트렙토코커스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae)(혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F), 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, 로타바이러스, 백시니아 바이러스, 살모넬라 타이피 (Salmonella typhi), 바리셀라 조스터 바이러스 및 황색열 바이러스를 포함한다 (예컨대 "www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines" 참조). 일부 구체예에서, 미생물 항원은 단순 포진 바이러스 타입 1 또는 2, 인간 포진 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 타입 1 및 호흡기 세포융합 바이러스의 바이러스 항원이다. 일부 구체예에서, 미생물 항원은 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 아스페르길루스 플라부스 (Aspergillus flavus), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅슐라툼 (Histoplasma capsulatum) 및 뉴모시스티스 카리니이 (Pneumocystis carinii)의 진균 항원인다. 일부 구체예에서, 미생물 항원은 라이슈마니아 (Leishmania) 종, 플라스모디움 (Plasmodium) 종, 스키스토소마 (Schistosoma) 종 또는 트리파노소마 (Trypanosoma) 종의 기생충 항원이다.
제약학적 조성물은 알레르기 유발 항원을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 알레르기 유발 항원은 포유류, 곤충, 식물 및 곰팡이 알레르기 유발 항원과 같은 환경적 항원이다. 일부 구체예에서, 포유류 알레르기 유발 항원은 모피 및 비듬을 포함한다. 적합한 포유류 알레르기 유발 항원은 예를 들면 고양이 Fel d 1, 소 Bos d 2, 개 Can f I 및 Can f II, 말 Equ c1 및 마우스 MUP를 포함한다. 일부 구체예에서, 곤충 알레르기 유발 항원은 곤충 분비물 및 독 (venom)을 포함한다. 예시적인 곤충 알레르기 유발 항원은 개미 Sol i2, 벌 PLA 및 Hya, 바퀴벌레 Bla g Bd9OK, Bla g4, GST 및 Per a3, 집먼지 진드기Der p2, Der f2, Der p10 및 Tyr p2, 말벌 Dol m V, 모기 Aed a 1 및 황색 자켓 히알루로니다제 및 포스포리파제를 포함한다. 일부 구체예에서, 식물 알레르기 유발 항원은 풀, 잡초 및 나무 알레르기 유발 항원 (예컨대 꽃가루)을 포함한다. 적합한 풀 알레르기 유발 항원은 예를 들면, 켄터키 블루그래스, 메도우 페스큐우, 새발풀, 잔디, 다년생 라이그래스, 향기풀 및 티모시를 포함한다. 예시적인 식물 알레르기 유발 항원은 보리 Hor v 9, 자작나무 Bet v1 및 v2, 체리 Pru a 1, 옥수수 Zml3, 풀 Phl p 1, 2, 4, 5, 6, 7, 11 및 12, Hol 1 5, Cyn d 7 및 d12, 삼나무 Jun a 2, Cry j 1 및 j2, 노간주나무 Jun o2, 라텍스 Hev b7, 황색 머스타드 Sin a I, 평지씨 Bra r 1, 돼지풀 Amb a 1 및 귀리 Lol p1을 포함한다. 일부 구체예에서, 곰팡이 알레르기 유발 항원은 Asp f 1, 2, 3, 4 및 6과 같은 아스페르길루스 푸미가투스 (Aspergillus fumigatus) 알레르기 유발 항원이다. 일부 구체예에서, 알레르기 유발 항원은 갑각류 알레르기 유발 항원, 콩과 식물 알레르기 유발 항원, 견과류 알레르기 유발 항원 또는 우유 알레르기 유발 항원과 같은 식품 알레르기 유발 항원이다. 예시적인 식품 알레르기 유발 항원은 새우 트로포미오신, 땅콩 Ara h 1, 2, 3, 8 및 9, 호두 Jug r 1 및 3, 헤이즐넛 Cor a 1, 14 및 8 LTP, 소의 우유 락트알부민, 카제인 및 락토페린을 포함한다.
제약학적 조성물은 또한 종양 항원을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 포유류 항원이다. 적합한 종양 항원은 기술분야에 기술되어 있다 (예컨대 Clinical Cancer Research, 15:5323-5337, 2009 참조). 예를 들어, 적합한 종양 항원은 WT1, MUC1, LMP2, HPV E6 E7, EGFRvIII, Her-2/neu, 이디오타입, MAGE A3, p53, NY-ESO-1, PSMA, GD2, CEA, MelanA/Mart1, Ras, gp100, 프로테이나제3 (PR1), bcr-able, 티로시나제, 수르비빈, PSA, hTERT, 육종 전위 중단점, EphA2, PAP, MP-IAP, AFP, EpCAM, ERG, NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알산, MYCN, PhoC, TRP-2, GD3, 푸코실, GM1, 메조텔린, PSCA, MAGE A1, sLe(a), CYP1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, 탄산 탈수효소 IX, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구마인, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PDGFR-베타, MAD-CT-2, 및 Fos-관련 항원 1을 포함한다.
IV. 사용 방법
본 개시의 제약학적 조성물은 필요로 하는 포유류 대상체에서 면역 반응을 조절하는 것을 포함하는 복수의 용도에 적합한다. 포유류 대상체는 한정하는 것은 아니지만 인간, 비인간 영장류, 설치류, 애완동물 및 가축을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 반응을 조절하는 것은 면역 반응을 자극하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 반응을 조절하는 것은 면역 반응을 억제하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 특수한 결과를 이루기 위해 효과적인 양으로 대상체에게 투여될 수 있다.
A. 단위용량 및 투여 방식
모든 제약학적 조성물과 같이, 유효량 및 투여 방식은 기술분야의 숙련자에게 명백한 여러 인자들을 기준으로 달라질 수 있다. 고려해야 한 인자는 제약학적 조성물이 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 또는 분지형 키메라 화합물 (예컨대 활성 제제)을 포함하는지의 여부와 제약학적 조성물이 추가로 항원을 함유하는지의 여부를 포함한다. 일반적으로, 분지형 키메라 화합물과 같은 다가 활성 제제의 단위용량은 폴리뉴클레오티드 및 선형 키메라 화합물과 같은 일가 활성 제제의 단위용량보다 낮다. 고려해야 하는 다른 인자는 이루어져야 할 결과, 및 투여되는 용량의 회수를 포함한다.
적합한 단위용량 범위는 원하는 효과를 제공하는 범위이다. 단위용량은 대상체에게 투여될 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 또는 분지형 키메라 화합물의 양에 의해 결정될 수 있다. 대상체 체중에 의해 전달될 양으로 제공되는 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 또는 분지형 키메라 화합물의 예시적인 단위용량 범위는 약 1 내지 1000 mcg/kg이다. 일부 구체예에서, 단위용량은 약 1, 5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 mcg/kg (하한선)보다 크다. 일부 구체예에서, 단위용량은 약 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 또는 100 mcg/kg (상한선)보다 작다. 즉, 단위용량은 약 1 내지 1000 mcg/kg의 범위의 임의의 값이고 이때 하한선은 상한선보다 작다. 대상체에게 전달될 양으로 제공되는 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 또는 분지형 키메라 화합물의 예시적인 단위용량 범위는 약 100 내지 5000 mcg이다. 일부 구체예에서, 단위용량은 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 또는 4000 mcg (하한선)보다 크다. 일부 구체예에서, 단위용량은 약 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500 또는 1000 mcg (상한선)보다 작다. 즉, 단위용량은 약 100 내지 5000 mcg의 범위의 임의의 값이고 이때 하한선은 상한선보다 작다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물이 항원을 더 포함할 때, 대상체에게 전달될 양으로 제공되는 항원 단위용량 범위는 약 1 mcg 내지 50 mcg이다. 일부 구체예에서, 항원 단위용량은 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40 mcg (하한선)보다 크다. 일부 구체예에서, 항원 단위용량은 약 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 또는 10 mcg (상한선)보다 작다. 즉, 항원 단위용량은 약 1 내지 50 mcg의 범위의 임의의 값이고 이때 하한선은 상한선보다 작다.
마찬가지로, 적합한 투여 경로는 원하는 효과를 제공하는 것이다. 일반적으로, 본 개시의 제약학적 조성물은 비경구 투여를 위해 의도된다 (예컨대 경구 또는 직잘 투여가 아님). 적합한 투여 경로는 주사, 국소적 및 흡입을 포함한다. 특히, 본 개시의 제약학적 조성물은 근육 내, 피하, 정맥 내, 표피 (유전자 총), 경피 및 흡입과 같은 경로에 의해 투여될 수 있다. 흡입에 의한 투여에 적합한 장치는, 예를 들면 분무기, 증발기, 네뷸라이저 및 건조 분말 흡입 전달 장치를 포함한다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물이 고체 종양을 치료하기 위해 의도된 경우, 조성물은 종양 내로 투여된다.
적합한 투약 양생법은 예방적 또는 치료적 맥락에서 원하는 효과를 제공하는 것이다. 선택된 경로에 의해 투여된 용량의 횟수는 1회 또는 1회 이상일 수 있다. 투약의 빈도는 주 1회, 주 2회, 월 1회, 월 2회 또는 용량 사이에 3 내지 12개월의 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 용량 후 1 내지 2개월 후에 제2 용량이 투여되는 2회 용량이 투여된다. 일부 구체예에서, 제1 용량 후 1 내지 2개월 후에 제2 용량이 투여되고, 제2 용량 후 1 내지 5개월 후에 제3 용량이 투여되는 3회 용량이 투여된다. 다른 구체예에서, 주 2회 또는 월 1회 기준으로 3 또는 4회 용량이 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 더 짧거나 더 긴 기간이 용량 사이에 경과할 수 있다. 특정 구체예에서, 연속적인 단위용량 사이의 간격은 주 수 또는 개월 수와 관련하여 다를 수 있다. 한 구체예에서, 연속적인 2, 3, 4, 5, 또는 6주마다의 용량이 투여된 후 나중의 시점에서 제2의 연속적인 많은 주마다의 용량이 이어질 수 있다. 기술분야의 숙련자는 실시예에서 예시된 것과 같이, 항원-특이적 항체 반응 또는 종양 퇴행과 같은 생물학적 결과를 측정함으로써 단위용량 양생법을 조정할 수 있을 것이다.
B. 면역 반응의 자극
본 개시의 제약학적 조성물은 필요로 하는 포유류 대상체에서 면역 반응을 조절하는 것을 포함하는 복수의 용도에 적합한다. 일부 구체예에서, 포유류 대상체는 인간 환자이다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 포유류 대상체에서 면역 반응을 자극하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 포유류 대상체에서 면역 반응을 억제하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 특수한 결과를 이루기 위해 대상체에게 투여된다.
간단히 설명하면, 본 개시는 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 면역 반응을 자극하기에 충분한 양으로 포유류 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 면역 반응을 "자극하는 것"은 데노보 면역 반응 (예컨대 초기 백신접종 양생법의 결과로서)을 유도하는 것 또는 기존의 면역 반응 (예컨대 부스터 백신접종 양생법의 결과로서)을 증대시키는 것으로부터 발생할 수 있는, 면역 반응을 증가시키는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 면역 반응을 자극하는 것은 다음으로 구성되는 군 중 하나 이상을 포함한다: IFN-알파 생성의 자극; IL-6 생성의 자극; B 림프구 증식의 자극; 인터페론 경로-관련 유전자 발현의 자극; 화학유인물질-관련 유전자 발현의 자극; 및 형질세포양 수지상 세포 (pDC) 성숙의 자극. 면역 반응의 자극을 측정하는 방법은 기술분야에 알려져 있고 본 개시의 생물학적 실시예에서 기술된다. 제약학적 조성물이 추가로 항원을 포함하는 구체예에서, 면역 반응을 자극하는 것은 항원-특이적 항체 반응을 유도하는 것을 포함한다.
예를 들어, 제약학적 조성물이 추가로 항원을 포함하는 일부 구체예에서, 본 개시는 포유류 대상체에서 항원-특이적 항체 반응을 유도하기에 충분한 양으로 제약학적 조성물을 포유류 대상체에게 투여함으로써 포유류 대상체에서 항원-특이적 항체 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 항원-특이적 항체 반응을 "유도하는 것"은 투여-전 기준선 역가 또는 혈청보호적 수준과 같은 한계값 수준 이상으로 항원-특이적 항체의 역가를 증가시키는 것을 의미한다.
본 개시는 나아가 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 감염성 질환을 예방하기에 충분한 양으로 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 감염성 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 즉, 일부 구체예에서, 본 개시는 예방용 백신을 제공한다. 일부 구체예에서, 포유류 대상체는 감염성 제제에 노출될 위험이 있다. 감염성 질환을 "예방하는 것"은 감염성 질환을 발달시키는 것으로부터 대상체를 보호하는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 감염성 질환을 예방하는 것은 추가로 대상체를 감염성 제제로 감염되는 것으로부터 보호하는 것을 포함한다 (예컨대 대상체가 급성 또는 만성 감염을 발달시키는 것으로부터 보호함). 추가로 본 개시는 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 감염성 질환의 증상을 개선하기에 충분한 양으로 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 감염성 질환의 증상을 개선하는 방법을 제공한다. 즉, 일부 구체예에서, 본 개시는 치료용 백신을 제공한다. 일부 구체예에서, 대상체는 감염성 제제로 급성으로 또는 만성으로 감염된다. 감염성 질환은 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충 질환일 수 있다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 추가로 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충 항원을 포함할 수 있다. 감염성 질환의 증상을 "개선하는 것"은 질환의 증상을 개선하는, 바람직하게는 정도를 감소시키는 것을 의미한다.
더욱이 본 개시는 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 IgE-관련 장애의 증성을 개선하기에 충분한 양으로 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 IgE-관련 장애의 증상을 개선하는 방법을 제공한다. 일부 바람직한 구체예에서, IgE-관련 장애는 알레르기이다. 알레르기는 한정하는 것은 아니지만 알레르기성 비염 (건초열), 부비강염, 습진 및 두드러기를 포함한다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 알레르기 유발 항원을 추가로 포함할 수 있다. IgE-관련 장애의 증상을 "개선하는 것"은 장애의 증상을 개선하는, 바람직하게는 정도를 감소시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 만약 IgE-관련 장애가 알레르기성 비염이라면, 증상을 개선하는 것은 코 점막의 팽윤을 감소시키고, 비루 (콧물)를 감소시키며, 및/또는 재채기를 감소시키는 것을 의미한다.
나아가, 본 개시는 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 암을 치료하기에 충분한 양으로 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 암을 "치료하는 것"은 치료가 없을 때 예상된 생존과 비교하여 차도 또는 그렇지 않으면 생존의 연장과 같은 유익한 임상 결과를 가져오는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 암이 고체 종양일 때, 암을 "치료하는 것"은 고체 종양의 크기를 축소시키는 것 또는 그렇지 않으면 생존 가능한 암세포 수를 감소시키는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 암이 고체 종양일 때, 암을 "치료하는 것"은 고체 종양의 성장을 지연시키는 것을 포함한다.
면역 반응의 (정성적 및 정량적 둘 다의) 분석은 한정하는 것은 아니지만, 항원-특이적 항체 생성 (특이적 항체 하위부류를 포함함), B 세포 및 헬퍼 T 세포와 같은 림프구의 특이적 집단의 활성화, IFN-알파, IL-6, IL-12와 같은 사이토카인의 생성 및/또는 히스타민의 방출을 측정하는 것을 포함하여 기술분야에 공지되어 있는 임의의 방법에 의한 것일 수 있다. 항원-특이적 항체 반응을 측정하는 방법은 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)을 포함한다. 림프구의 특이적 집단의 활성화는 증식 분석에 의하여, 및 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)로 측정될 수 있다. 사이토카인의 생성은 또한 ELISA에 의해 측정될 수 있다.
바람직하게, Th1-형 면역 반응이 자극된다 (즉 유도되거나 증대된다). 본 개시를 참조하면, Th1-형 면역 반응을 자극하는 것은 활성 제제로 치료되지 않은 대조 세포들과 비교하여 시험관 내에서 또는 생체 외에서 본 개시의 활성 제제 (폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 또는 분지형 키메라 화합물)로 치료된 세포들로부터의 사이토카인 생성을 측정함으로써 측정될 수 있다. "Th1-형 사이토카인"의 실례는, 한정하는 것은 아니지만, IL-2, IL-12, IFN-감마 및 IFN-알파를 포함한다. 대조적으로, "Th2-형 사이토카인"은 한정하는 것은 아니지만, IL-4, IL-5 및 IL-13을 포함한다. 면역자극 활성의 측정에 유용한 세포는 면역 시스템의 세포, 예컨대 항원 제공 림프구, 바람직하게는 대식세포 및 T 세포를 포함한다. 적합한 면역 세포는 형질세포양 수지상 세포 및 B 세포를 포함하여, 말초혈 단핵 세포와 같은 일차 세포, 또는 포유류 대상체로부터 분리된 비장세포를 포함한다.
Th1-형 면역 반응을 자극하는 것은 또한 본 개시의 활성 제제 (폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 또는 분지형 키메라 화합물)로 치료된 포유류 대상체에서 활성 제제로 치료되지 않은 대조 대상체와 비교하여 투여 전과 후의 IL-2, IL-12 및 인터페론의 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. Th1-형 면역 반응을 자극하는 것은 또한 Th1-형 항체 역가의 Th2-형 항체 역가에 대한 비율을 측정함으로써 측정될 수 있다. "Th1-형" 항체는 인간 IgG1 및 IgG3, 및 쥐과의 IgG2a를 포함한다. 대조적으로, "Th2-형" 항체는 인간 IgG2, IgG4 및 IgE 및 쥐과의 IgG1 및 IgE를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시는 제약학적 조성물 (부형제 및 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 또는 분지형 키메라 화합물을 포함함) 및 본원에 기술된 방법을 위해 조성물의 사용 방법과 관련된 일련의 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 키트의 제약학적 조성물은 적절하게 포장된다. 예를 들어, 만약 제약학적 조성물이 냉동-건조된 분말이면, 탄력적 스토퍼가 달린 바이알이 보통 사용되어 탄력적 스토퍼를 통해 유체를 주입함으로써 분말이 쉽게 현탁될 수 있다. 일부 구체예에서, 키트는 제약학적 조성물의 투여를 위한 장치 (예컨대 주사기와 바늘)를 더 포함한다. 제약학적 조성물의 사용과 관련된 설명서는 일반적으로 의도된 사용 방법을 위한 투여의 단위용량, 스케줄 및 경로와 같은 정보를 포함한다. 키트가 항원을 포함하는 일부 구체예에서, 항원은 폴리뉴클레오티드, 선형 키메라 화합물 또는 분지형 키메라 화합물과 동일한 용기에 포장될 수도 있고 또는 그렇지 않을 수도 있다.
실시예
약어: BCC (분지형 키메라 화합물); CC (키메라 화합물); HEG (헥사에틸렌 글리콜); LCC (선형 키메라 화합물); MWCO (분자량 컷-오프); PEG (폴리에틸렌 글리콜); PN (폴리뉴클레오티드); Sp (스페이서); TFF (접선 유동 여과).
비록 본 개시가 명료성 및 이해의 목적으로 예시 및 실시예에 의해 일부 상세하게 기술되었지만, 기술분야의 숙련자들에게는 특정 변화 및 변형히 실시될 수 있다는 것이 드러날 것이다. 그러므로, 다음의 합성 및 생물학적 실시예는 첨부된 청구범위에 의해 묘사되는 본 개시의 범주를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
합성 실시예
실시예 S1: 폴리뉴클레오티드 및 키메라 화합물의 구조.
표 S1-1은 실시예들에서 언급되는 폴리뉴클레오티드 (PN) 및 키메라 화합물 (CC)의 구조를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드 및 키메라 화합물의 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보폴리뉴클레오티드이다. HEG는 헥사에틸렌 글리콜 스페이서 모이어티이다. 다른 스페이서는 명세서 및 도면에 기술되어 있다. 표 S1-1 또는 특정 실시예에서 주지된 경우를 제외하고, 모든 뉴클레오티드간 결합 및 핵산 모이어티들 사이의 결합 및 스페이서 모이어티는 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다. 표 S1-1은 또한 분지된 CC를 생성하기 위해 분지형 담체 모이어티 (예컨대 [말레이미드-PEGn]y-FICOLL)를 이들 분자와 연결시키기 위해 사용된 단부 연결기 (예컨대 -(CH2)6-SS-(CH2)6-OH, -(CH2)6-SH, -(CH2)3SS-(CH2)3-OH, -(CH2)3SH, HO(CH2)6-SS-(CH2)6- 및 HS(CH2)6-)를 가지는 CC (예컨대 D56-02, D56-03, D56-07, D56-08, D56-10, D56-11)를 나타낸다. 이들 연결기는 포스포로티오에이트 결합을 사용하여 말단 뉴클레오티드 또는 스페이서 모이어티를 통해 폴리뉴클레오티드 또는 CC에 연결된다. 분지된 CC (예컨대 [(D56-01)-PEGn]x-FICOLL)는 콘쥬게이션 전략에 의해 제조되고 실시예에 기술된 것과 같은 연결기들을 가진다.
Figure pct00045
Figure pct00046
^화합물들은 규정된 SEQ ID NO를 가지는 화합물로부터의 유일한 차리가 D의 3' 뉴클레오티드에 연결된 비-핵산 모이어티에 있을 때 동일한 SEQ ID NO가 제공된다. 추가로, 10개보다 적은 뉴클레오티드를 함유하는 핵산 모이어티를 가지는 화합물들은 SEQ ID NO가 배정되지 않고 따라서 상기에서 NA (적용가능하지 않음)로서 표시된다. FICOLL은 FIC로 약칭된다.
실시예 S2: 폴리뉴클레오티드 (PN) 및 키메라 화합물 (CC)의 합성.
폴리뉴클레오티드를 산화성 황화를 포함한 포스포라미다이트 화학을 사용하여 고상 합성에 의해 제조하고, 제조자의 프로토콜을 따라 정제 및 분리하였다 (Molecules 2013, 18, 14268-14284). 사용된 뉴클레오시드 단량체는 5'-다이메톡시트리틸-보호된-2'-데옥시뉴클레오시드, 3'-((2-시아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필))-포스포라미다이트였다. CC에 대해, HEG 스페이서를 18-O-다이메톡시트리틸헥사에틸렌글리콜, 1-((2-시아노에틸)-(N,N-아이소프로필))-포스포라미다이트 (예컨대 Glen Research, Sterling, VA로부터의 스페이스 포스포라미다이트 18)를 사용하여 통합시켰다. D56-11에 대해, 5'-C6-다이설파이드 링커를 1-O-다이메톡시트리틸-헥실-다이설파이드-1'-((2-시아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필))-포스포라미다이트 (예컨대 Glen Research, Sterling, VA로부터의 티올-변형제 C6 S-S)를 사용하여 통합시켰다. D56-07에 대해, 3'-C3-다이설파이드 링커를 1-O-다이메톡시트리틸-프로필-다이설파이드, 1'-석신일-고체 지지체 (예컨대 Glen Research, Sterling, VA로부터의 3'-티올-변형제 C3 S-S CPG)를 사용하여 통합시켰다. D56-02에 대해, 3'-C6-다이설파이드 링커를 1-O-다이메톡시트리틸-헥실-다이설파이드, 1'-석신일-고체 지지체 (예컨대 Glen Research, Sterling, VA로부터의 3'-티올-변형제 C6 S-S CPG 또는 로부터의 주문 제작)를 사용하여 통합시켰다.
PN 및 CC를 뉴클레오티드 단량체, HEG 스페이서 및 링커를 원하는 순서로 첨가하도록 프로그래밍된 고상 합성기 상에서 합성하였고, 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어났다. 3'-뉴클레오시드 또는 링커기 (예컨대 3'-티올-변형제 C6 S-S CPG)를 고체 지지체에 부착시켰다. 합성 사이클은 산 (예컨대 톨루엔 중의 다이클로로아세트산)을 사용한 탈트리틸화 단계, 포스포라미다이트 단량체 플러스 약하게 산성인 활성화제 (예컨대 사카린 1-메틸이미다졸)를 사용한 커플링 단계, 산화성 황화 단계 (예컨대 피리딘 중의 0.2 M 크산탄 하이드라이드) 및 미반응 기 (예컨대 아이소부티르산 무수물 및 N-메틸이미다졸)에 대한 캡핑 단계로 구성되었다. 합성 사이클을 PN 및 CC 서열이 완전히 조립될 때까지 반복하였다. 보호된 PN 및 CC를 절단하고 고체 지지체로부터 탈보호하였다 (예컨대 아세토니트릴 중의 20% t-부틸아민을 사용한 시아노에틸 포스페이트 보호기의 제거, 이어서 PN 또는 CC를 지지체로부터 절단하기 위한 농축된 수성 암모니아로의 처리, 및 뉴클레오티드 상의 보호기를 제거하기 위하여 그 결과의 용액을 주변 온도에서 72시간 동안 보유하기). 폴리뉴클레오티드를 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 접선 유동 여과 (TFF) 시스템을 사용한 한외여과/투석여과에 의해 탈염시키고 동결건조시켰다. PN 및 CC를 동결건조된 고체로서 냉동 상태로 보관한다.
D56-02를 10 mmol 규모로 제조하였다. 외관은 백색 분말이었고, 실측 분자량은 7780이었으며 (이론값은 7785 Da임), 역상 HPLC에 의한 순도는 85%였고 이온 교환 HPLC에 의한 순도는 86%였다.
Alexa Fluor® 555-(D56-01) (형광 표지된 D56-01로도 알려짐)을 TriLink Biotechnologies (San Diego, CA)에 의해 준비하였다. Alexa Fluor® 상표 형광 염료는 Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR)에서 구매한다.
실시예 S3: D56-05 ([(D56-01)-PEG 6 ] x -FICOLL로도 알려짐)의 제조.
D56-05 ([(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐) 제조 계획도는 도 1에 도시된 것과 같이, 3 스테이지로 구성된다. FICOLL에 대한 다른 PN 또는 CC 콘쥬게이트는 PN 또는 CC 서열, 티올 링커를 PN 또는 CC로, 및/또는 티올을 아민 교차결합제로 바꿈으로써 동일한 제조 경로에 의해 제조될 수 있다.
스테이지 1에서, FICOLL을 반응성 말레이미드 기를 포함시키기 위하여 여러 단계로 변형시키고, 결과적으로 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL이 생성된다. 스테이지 2에서, D56-02 ((D56-01)-3'-SS으로도 알려짐)의 다이설파이드를 티올로 환원시켜서 D56-03 ((D56-01)-3'-SH로도 알려짐)을 형성한다. 스테이지 3에서, [말레이미드-PEG6]y-FICOLL 및 D56-03을 반응시켜서 D56-05 ([(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐)를 형성한다. 정제는 방법의 각 단계에서 일어난다. 최종 D56-05 용액을 멸균 여과하고 특성화한다. D56-05를 < -60℃에서 보관한다.
도 2는 FICOLL 중간체 카르복시메틸화된 (CM)-FICOLL, 아미노에틸카르바밀메틸화된 [AECM]z-FICOLL 및 [말레이미드 (Mal)-PEG6]y-FICOLL, 및 최종 생성물인, [(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 불리는 D56-05의 제조 방법을 대략적으로 보여준다.
I. FICOLL PM400의 조성물. FICOLL PM400 (FICOLL400)은 보고된 분자량이 400,000 +/- 100,000이고 나노입자들의 현탁액으로서 존재하는 수크로오스의 합성된 중성, 고도-분지형 중합체이다. 그것은 수크로오스의 에피클로로히드린과의 공중합에 의해 형성된다. FICOLL PM400을 GE Healthcare (Pittsburgh, PA)로부터 분무 건조된 분말로서 구입하였다.
II. 스테이지 1, 단계 1: 카르복시메틸화된-FICOLL (CM-FICOLL)의 제조
CM-FICOLL을 FICOLL PM400으로부터 Inman, J. Immunology, 1975, 114: 704-709)의 방법에 의하여 제조하였고, 단 표준 탈염 과정 (예컨대 5 kDa 분자량 컷-오프 (MWCO) 막을 사용하는 투석) 대신, 100 kDa MWCO 막으로 접선 유동 분별 (TFF)을 사용하는 정제를 수행하였다. TFF 정제는 표준 탈염 과정에 유사하게 작은 분자들 및 과잉 시약들을 제거하였다.
CM-FICOLL은 염기성 조건하에서 나트륨 클로로아세테이트와 FICOLL PM400을 반응시킴으로써 제조한다. 반응 계획도는 도 3에 도시된다. FICOLL PM400 (13 g)의 용액을 Milli-Q 탈이온수에서 130 mg/mL로 제조하였다. 그 용액을 40℃ 순환 수조에 연결된 자켓식 반응조에 40 내지 45분 동안 옮겼다. 이 FICOLL 용액에, 92.5 mL의 2.7 M 나트륨 클로로아세테이트 용액, 50 mL의 10 N 수산화 나트륨 용액 및 7.5 mL의 Milli-Q 탈이온수를 첨가하였다. 반응을 2.5시간 동안 40℃에서 교반하면서 진행시켰다. 다음에, 반응 용액을 냉각된 유리병에 옮기고 얼음 위에 놓았다. 직후에 10 mL의 2 M 나트륨 포스페이트 pH 4를 반응 용액에 첨가하고, pH를 20%의 클로로아세트산 용액의 첨가에 의해 7.0으로 조정하였다. 미정제 CM-FICOLL을 정제를 위해 준비될 때가지 저온에서 (얼음 위에서) 유지하였다. 미정제 CM-FICOLL을 100 kDa MWCO를 가지는 접선 유동 분별 (TFF) 막을 포함한 시스템 설정을 사용하여 투석여과에 의해 정제하였다. 미정제 CM-FICOLL을 0.2 M 수성 염화나트륨에 대해 총 대략 15 내지 18 부피 교환 동안 투석여과하였다. 각 투과 투석부피의 흡광도를 215 nm에서 측정하고 투석여과를 투과 흡광도가 0.1 AU에 도달했을 때 중단하였다. 정제된 CM-FICOLL 용액을 약 30 mg/mL로 농축하였고 -80℃에서 보관하였다. CM-FICOLL의 세 개의 로트를 이 방법에 의해 준비하였는데, 각각 13 g의 FICOLL PM400으로 시작하였다. CM-FICOLL의 수율은 6.7 g, 7.1 g 및 7.7 g이었다.
III. 스테이지 1, 단계 2: N-(2-아미노에틸)카르바밀메틸화된-FICOLL ([AECM]z-FICOLL로도 알려짐)의 제조. [AECM]z-FICOLL을 CM-FICOLL로부터 Inman (J. Immunology, 1975, 114: 704-709)의 방법에 의해 제조하였고, 단 표준 탈염 과정 (예컨대 5 kDa 분자량 컷-오프 (MWCO) 막을 사용하는 투석) 대신, 100 kDa MWCO 막으로 접선 유동 분별 (TFF)을 사용하는 정제를 수행하였다 (단원 B에서 CM-FICOLL에 대해 기술된 것과 같음).
[AECM]z-FICOLL을 CM-FICOLL과 과잉량의 에틸렌다이아민 및 수용성 카르보다이이미드와 반응시킴으로써 제조한다. 반응 계획도는 도 4에 도시된다. CM-FICOLL 용액 (0.2 M 수성 염화나트륨 중의 약 30 mg/mL)을 22℃ 순환 수조에 연결된 자켓식 반응조에 20 내지 30분 동안 옮겼다. 이 CM-FICOLL 용액에, 에틸렌다이아민 2-염산염 (FICOLL당 대략 13800 몰 당량)을 첨가하고, 완전히 용해시켰다. 용액의 pH를 1 N 수성 수산화나트륨으로 4.7로 조정하였다. 다음에, N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보다이이미드 염산염 (EDC-HCl, FICOLL당 대략 835 몰당량)을 교반하면서 10분의 시간에 걸쳐 혼합물에 첨가하였다. 용액의 pH를 체크하고 필요하다면 1 N 수성 수산화 나트륨 또는 1 N 수성 염화수소로 4.7로 조정하였다. 반응을 3.5시간 동안 22℃에서 진행시키고, 이 시간 동안 pH를 필요에 따라 4.7로 조정하였다. 미정제 [AECM]z-FICOLL을 투석여과에 의해 100 kDa MWCO를 가지는 접선 유동 분별 (TFF) 막을 사용하는 시스템 설정을 사용하여 정제하였다. 미정제 [AECM]z-FICOLL을 100 mM 인산 나트륨 및 150 mM 염화나트륨, pH 7.5 완충액에 대하여 총 대략 15 내지 20 부피 교환 동안 투석여과하였다. 각 투과 투석부피의 흡광도를 215 nm에서 측정하고 투석여과를 투과 흡광도가 0.1 AU에 도달했을 때 중단하였다. 정제된 [AECM]z-FICOLL 용액을 약 33 mg/mL로 농축하였고, 0.22 μm 기공 크기 필터를 사용하여 여과하고, 부분표본화한 후, -80℃에서 보관하였다. [AECM]z-FICOLL의 세 개의 로트를 이 방법에 의해 준비하였는데, 각각 6.5 g, 7.0 g 및 7.5 g의 CM-FICOLL로 시작하였다. [AECM]z-FICOLL의 수율은 각각 5.4 g, 5.9 g 및 6.9 g이었다. 아민 대 FICOLL 몰 비율 (z)은, 실시예 S4 및 실시예 S5에서 기술되는 과정을 사용하여 각각 221, 218 및 224였다.
IV. SM-PEG6 이종이중기능성 링커의 조성물. SM-PEG6 (석신이미딜-((N-말레이미도프로피온아미돌)-헥세틸렌글리콜) 에스테르)를 Thermo Scientific (카탈로그 # 22105 Rockford, IL)으로부터 얻었다. SM-PEG6은 분자량이 601.6이고 6개의 에틸렌 글리콜 단위의 친수성 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 스페이서 아암을 함유하는 아민-대-설프하이드릴 교차결합제이다. 스페이서 아암 길이는 약 32 옹스트롬이다. SM-PEGn의 일반적인 화학적 구조는 도 5에 도시된다. SM-PEGn에 대해, n=6이고 사용된 화합물의 구조는 도 5a에 도시된 것과 같다. 실시예 S13의 D56-25, D56-26 및 D56-27의 제조를 위해서는, n이 각각 24, 45 및 70인 SM-PEGn을 사용하였다.
V. 스테이지 1, 단계 3: SM-PEGn을 사용한 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL의 제조. [말레이미드-PEG6]y-FICOLL을 [AECM]z-FICOLL과 SM-PEG6을 반응시킴으로써 제조하였다. 반응 계획도를 도 6에 도시한다. [AECM]z-FICOLL 용액 (100 mM 인산 나트륨 및 150 mM 염화 나트륨, pH 7.4 완충액 중의 20 mg/mL, 아민 대 FICOLL 몰비 (z) =218 내지 224)을 교반 막대를 함유하는 플라스틱병에 옮겼다. 별도의 유리병에서, SM-PEG6을 다이메틸설폭사이드 (DMSO)에 100 mg/mL 용액의 최종 농도로 녹였다. SM-PEG6 용액 (아민당 5당량)을, 교반하면서 서서히 [AECM]z-FICOLL에 첨가하였다. 반응 병을 25 건조 공기 인큐베이터에 옮기고, 반응을 40분 동안 부드럽게 교반하면서 진행시켰다. 반응병을 다음에 실온 (22 내지 24℃)으로 옮겼다.
FICOLL 상의 미반응 아민을 설포-N-하이드록시석신이미딜-아세테이트 (Su-NHS-Ac, Thermo Scientific, Rockford, IL)를 사용하여 캡핑하였다. Su-NHS-Ac를 유리 바이알에서 DMSO에 100 mg/mL의 농도로 녹였다. Su-NHS-Ac 용액 (아민당 5 당량)을 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL 용액에 첨가하고 15분 동안 실온에서 교반하였다. 이 캡핑 반응은 FICOLL 상의 미반응 아민을 아세트아미드로 변환시키고, 그것은 결과적으로 생성되는 FICOLL 생성물의 물리화학적 특성에 중요하다.
미반응 SM-PEG6 및 Su-NHS-Ac를 글리신으로 퀀칭하였다. 글리신을 100 mM 인산 나트륨 및 150 mM 염화나트륨, pH 7.5 완충액에 100 mg/mL의 농도로 녹이고 그 용액을 0.22 μm 기공 크기 필터를 사용하여 여과하였다. 글리신 용액 (총 SM-PEG6 및 Su-NHS-Ac 당 10 당량)을 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL 용액에 첨가하고 15분 동안 실온에서 교반하였다.
[말레이미드-PEG6]y-FICOLL 미정제 제제를 저온 (젖은 얼음 상에서)에서 정제에 대해 준비될 때까지 유지하고, 그것을 콘쥬게이션 반응과 동일한 날에 수행하였다. 미정제 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL을 100 kDa MWCO를 가지는 접선 유동 분별 (TFF) 막을 사용하는 시스템 설정을 사용하여 투석여과에 의해 정제하였다. 미정제 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL을 100 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, pH 7.5 완충액을 사용하여 약 5.8 mg/mL로 희석하고, 100 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, pH 7.5 완충액에 대하여 총 대략 24 내지 29 부피 교환 동안 투석여과하였다. 각 투과 투석부피의 흡광도를 215 nm에서 측정하고 투석여과를 투과 흡광도가 0.1 AU에 도달했을 때 중단하였다. 정제된 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL을 멸균된 폴리프로필렌 바이알에 부분표본화하고 -80℃에서 보관하였다. 농도는 약 5.3 mg/mL이었다. 두 개의 가장 큰 규모의 반응 (파일럿 로트 4 및 5)에 대해, 655 mg 및 1900 mg의 [AECM]z-FICOLL을 사용하였고 444 mg 및 1288 mg의 정제된 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL을 분리하였다.
[말레이미드-PEG6]y-FICOLL의 말레이미드 대 FICOLL 몰 비율 (y)을 실시예 S4 및 실시예 S6에서 개관한 과정에 의해 측정하였다. 표 S3-1은 3개의 상이한 로트의 [AECM]z-FICOLL, 2개의 상이한 로트의 SM-PEG6 링커 및 2개의 상이한 규모의 생성을 사용하여 제조된 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL의 일관성을 나타낸다. 명시된 범위의 말레이미드:FICOLL 몰비 (y 약 162-221)를 가지는 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL의 제조는 다음의 시약 및 방법 매개변수의 조절을 필요로 한다: 1) 약 218 내지 224의 아민:FICOLL 몰 비율 (z)을 가지는 [AECM]z-FICOLL의 제제, 2) 고도로 순수한 링커를 가지며, 3) 및 시약 농도, 화학양론, 이온 강도, pH, 시간 및 온도에 대한 규정된 반응 조건.
Figure pct00047
[말레이미드-PEG6]y-FICOLL 파일럿 로트 4 및 5의 순도를 표 S3-2에 나타낸 매개변수들을 사용하여 크기 축출 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피 (SEC-HPLC)에 의해 평가하였다. 미정제 및 정제된 파일럿 로트 4 및 5에 대한 크로마토그램을 도 7에 도시한다. 정제된 파일럿 로트 4 및 5는 각각 100% 및 99.6% 순수하였다.
Figure pct00048
SM-PEG6 링커를 사용하여 제조된 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL은, 이전에 미국 특허 제 8,597,665호에서 기술된, 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (설포-SMCC) 링커를 사용하여 제조된 [말레이미드-MC]y-FICOLL보다 수성 완충액에서 유의미하게 더 가용성이었다. 설포-SMCC 링커는 소수성 메틸사이클로헥실 (MC) 연결기를 초래하고, 그것은 [말레이미드-MC]y-FICOLL이 냉동/해동 사이클(들) 후에 수성 완충액에서 빠져 나가거나 및/또는 침전되는 것을 유발하여, 티올-활성화된 폴리뉴클레오티드 (PN) 또는 키메라 화합물 (CC)와의 믿을 수 없는 반응을 초래한다. 만약 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL 또는 [말레이미드-MC]y-FICOLL이 그것들이 제조된 날에 사용되지 않는다면, 그것들은 냉동 보관되어 말레이미드 기가 활성을 유지해야 한다. [말레이미드-MC]y-FICOLL의 이종성 혼합물은 D56-03 ((D56-01)-3'-SH로도 알려짐)와의 콘쥬게이션 반응에 그것의 빈약한 안정성으로 인해 사용하지 않았다. [말레이미드-MC]y-FICOLL의 합성에 대해서는 실시예 S14를 참조한다.
F. 스테이지 2, 단계 1: D56-03 ((D56-01)-3'-SH로도 알려짐)의 제조. D56-03 (티올)을 D56-02 (다이설파이드)와 과잉의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염 (TCEP)와의 반응에 의해 제조하였다. 반응 계획도는 도 8에 도시된다. 제조일에, D56-02 ((D56-01)-3'-SS로도 알려짐)를 냉동기로부터 제거하여 병을 열기 전에 적어도 1 내지 2시간 동안 실온으로 평형화되는 것을 허용하여 흡습성 동결건조된 고체에서 수분 흡수를 최소화하였다. D56-02를 활성화 완충액 (100 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, 1 mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA), pH 7.5)에 약 56 mg/mL의 공칭 농도로 녹였다. 용액의 실제 농도를 22.65 mg/mL-1 cm-1의 흡광 계수를 사용하여 260 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다. 농도를 활성화 완충액으로 대략 25 mg/ml로 조정하고, 260 nm에서의 흡광도에 의해 확인하였다.
TCEP-HCl을 Thermo Scientific (카탈로그 # 20490, Rockford, IL으로부터 얻었다. 제조 일에, TCEP-HCl을 활성화 완충액에 48 ± 1 mg/mL의 농도로 녹였다. TCEP 농도를 주변 실험실 온도에서 유지하였고 3시간 내에 사용하였다.
D56-02 용액에, TCEP 용액 (5당량)을 실온에서 교반하면서 첨가하였다. 반응 용기를 40 ± 2℃ 수조에 옮기고, 환원 단계를 120 ± 10분 동안 진행시켰다. 그 결과의 미정제 D56-03 용액을 정제 전에 약 10 내지 15분 동안 실온으로 냉각되도록 허용하였다. 이 반응을 파일럿 로트 4에 대해서 989 mg의 D56-02에 대해 및 파일럿 로트 5에 대해 1814 mg 및 1836 mg에 대해 두 부분으로 수행하였다.
D56-03의 정제를 XK50/30 칼럼 (GE Healthcare)에 팩킹된 세파덱스 G-25 Fine (카탈로그 Catalog # 17-0032, GE Healthcare, Pittsburgh, PA)을 사용하여 제조자의 권장 과정을 따라 겔 여과에 의해 이루었다. G25 탈염 크로마토그래피 칼럼을 AKTA 정제기 크로마토그래피 시스템 (GE Healthcare, 구 Amersham Pharmacia Biotech)에 의해 조절하였다. 미정제 D56-03 용액을 G25 칼럼 위에 15 내지 16%의 샘플 부피 대 칼럼 부피의 비율로 로딩하였다. 이동상을 30 cm/시간의 유량으로 칼럼에 적용하였다. 칼럼으로부터의 용출액을 215 nm 및 260 nm에서 모니터링하였고, 샘플 수집을 용출액 흡광도가 대략 100 mAU를 초과하여 발생했을 때 시작하였다. 칼럼에 로딩된 샘플 부피의 약 1.6 내지 1.7배의 총 부피를 수집하였다. 정제된 D56-03 용액을 부분표본화하고 -80℃에 보관하였다. 파일럿 로트 4 및 5의 정제의 상세한 내용을 표 S3-3에 상세하게 기술한다.
Figure pct00049
Figure pct00050
D56-03의 순도를 표 S3-2에 개관된 과정을 사용하여 SEC-HPLC에 의하여 측정하였고 파일럿 로트 4 및 5에 대해 100%였다 (도 9). 파일럿 로트 4 및 5에 대해 각각 802 mg 및 2904 mg의 D56-03을 분리하였다.
G. 스테이지 3, 단계 1: D56-05 ([(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐)의 제조. D56-05를 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL과 D56-03 ((D56-01)-3'-SH로도 알려짐)의 반응에 의해 제조하였다. 반응 계획도를 도 10에 나타낸다.
[말레이미드-PEG6]y-FICOLL과 D56-03 둘 다 반응성이고 조심스럽게 취급해야 한다. 두 물질을 -80℃에서 보관하였다가 사용 전에 4℃ 수조에서 여러 시간 동안 해동하였다. [말레이미드-PEG6]y-FICOLL 용액 (약 5.3 mg/mL, 말레이미드:FICOLL 몰 비율 (y) = 206 내지 221)을 교반 막대를 함유하고 있는 플라스틱 병에 옮겼다. 이 용액에. D56-03의 용액 (약 11.5 mg/mL, 말레이미드당 0.64 내지 0.69 당량, FICOLL당 141 당량)을 교반하면서 첨가하였다. 반응 용기의 부피를 100 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, pH 7.5를 사용하여 조정하여 5 mg/ml의 최종 D56-03 농도를 얻었다. 콘쥬게이션 반응을 다음에 25℃ 건조 공기 인큐베이터로 옮기고, 반응을 1시간 동안 부드럽게 교반하면서 진행시켰다. 파일럿 로트 4에 대해 218 mg의 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL 및 600 mg의 D56-03을 사용하였다. 파일럿 로트 5에 대해, 874 mg의 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL 및 2400 mg의 D56-03을 사용하였다.
FICOLL 상의 미반응 말레이미드 기를 15분 동안 실온에서 100 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, pH 7.5 완충액 (말레이미드에 대해 10 당량) 중의 100 mg/mL의 시스테인 용액을 사용하여 캡핑하였다. 미정제 [(D56-01)-PEG6]x-FICOLL을 다음에 저온 (2 내지 8℃)으로 옮기고 밤새 교반하였다. 이 캡핑 반응은 시스테인을 FICOLL로 (황을 통한 공유 결합을 통하여) 도입하고, D56-05 ([(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐) 생성물의 물리화학적 특성에 중요할 수 있다.
D56-05의 정제를 표 S3-4에 기술된 것과 같이, 투석여과에 의해 수행하였다. 미정제 D56-05의 부피를 10 mM 인산 나트륨, 142 mM 염화 나트륨, pH 7.2 완충액으로 조정하였다. 각각의 투석부피 (공급 저장소의 출발 샘플 부피와 동등한 투과물의 부피)에서, 투과물의 샘플을 취하여 215 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 투과흡광도가 0.05 AU 아래로 떨어졌을 때 투석여과를 종결하였다. 투석여과가 완료되었을 때, D56-05 샘플을 TFF 시스템으로부터 회수하고 0.22 μm 필터를 사용하여 멸균 여과하였다. D56-05를 부분표본화하고 < -60℃에서 보관하였다. D56-05 파일럿 로트들을 특성화하고 그 결과를 실시예 S9에서 제시한다.
Figure pct00051
a 투석부피는 공급 저장소의 샘플 부피와 동등한 투과물의 부피이다. 각 투석부피는 1 완충액 교환이다.
b 투석여과 후 D56-05 파일럿 5의 부피는 대략적이었다. 실제 부피 측정은 수행하지 않았다.
실시예 S4: FICOLL-함유 중간체 및 생성물의 FICOLL 농도를 측정하기 위한 과정.
FICOLL-함유 중간체 및 생성물의 FICOLL 농도를 Pierce 당단백질 탄수화물 산정 키트 (제품 # 23260, Thermo Scientific, Rockford, IL)를 사용하여 측정하였고, 단 FICOLL PM400을 사용하여 분석용 표준 곡선을 작성하였다.
실시예 S5: [AECM] z -FICOLL 용액 중의 아민 농도 및 아민:FICOLL 몰 비율 (z)을 측정하기 위한 과정.
[AECM]z-FICOLL의 아민 농도를 Pierce 플루오르알데하이드 OPA 시약 용액 (제품 # 26025, Thermo Scientific, Rockford, IL)을 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 측정하였다. 글리신을 사용하여 분석용 표준 곡선을 작성하였다. 아민:FICOLL 몰 비율 (z)을 아민 농도를 FICOLL 농도로 나눔으로써 계산하였고, 이때 FICOLL 농도는 실시예 S4에서 기술한 대로 측정하였으며 농도는 몰 농도의 단위였다.
실시예 S6: [말레이미드] y -FICOLL 용액 중의 말레이미드 농도 및 말레이미드:FICOLL 몰 비율 (y)을 측정하기 위한 과정.
[말레이미드-PEG6]y-FICOLL 및 [말레이미드-MC]y-FICOLL의 말레이미드 농도를 엘만 시약 (5,5'-다이티오-비스-(2-니트로벤조산), 제품 번호 22582 (Thermo Scientific, Rockford, IL)를 사용하여 측정하였다. [말레이미드]y-FICOLL을 제조자의 프로토콜대로 과잉 시스테인과 반응시켰고, 나머지 시스테인을 시스테인 표준 곡선을 사용하여 정량하였다. 말레이미드 농도를 FICOLL 농도로 나눔으로써 말레이미드:FICOLL 몰 비율 (y)을 계산하였고, 여기서 FICOLL 농도는 실시예 S4에서 기술한 대로 측정하였으며 농도는 몰 농도의 단위였다.
실시예 S7: FICOLL 콘쥬게이트 (예컨대 D56-05, [(D56-01)-PEG 6 ] x -FICOLL로도 알려짐) 중의 폴리뉴클레오티드 (PN) 또는 키메라 화합물 (CC) 농도 및 PN:FICOLL 또는 CC:FICOLL 몰 비율 (x)을 측정하기 위한 과정.
D56-05 ([(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐)의 D56-01 (CC) 농도를 자외선 분광학 및 베에르 법칙 방정식 (Beer's law equation)을 사용하여 측정하였다. (관례상, 이 스테이지에서 링커, D56-03과 함께 키메라 화합물이 이 화합물을 형성하기 위해 사용되었을지라도 FICOLL에 부착된 키메라 화합물은 서열 명칭, D56-01에 의해 표시되는 것이 주지된다.) 260 nm에서의 흡광도를 측정하였고 D56-01에 대해 22.65 mg/ml-1 x cm-1의 흡광 계수를 사용하였다. FICOLL과 링커는 260 nm에서 흡수하지 않고, 따라서 흡광도는 CC, D56-01DML 흡광도로 인해 유일하다. mg/mL의 D56-01 농도는 D56-01에 대한 유리 산의 분자량을 사용하여 몰 농도로 변환시켰다. CC:FICOLL 몰 비율 (x)을 CC 농도를 FICOLL 농도로 나눔으로써 측정하였고, 이때 FICOLL 농도는 실시예 S4에서 기술한 대로 측정하였고 농도는 몰 농도의 단위였다. 다른 PN-FICOLL 또는 CC-FICOLL 용액의 농도를 적절하게, 사용된 PN 또는 CC에 대한 흡광 계수 및 유리 산 분자량을 사용하여 측정하였다.
실시예 S8: 입자 크기를 측정하기 위한 과정.
FICOLL 샘플 (예컨대 D56-05)의 입자 크기 (Z-평균) 및 표준 편차 (SD)를 Malvern Zetasizer 기기를 사용하여 동적 광산란 (DLS)에 의해 측정하였다. 샘플을 10 mM 인산 나트륨, 142 mM 염화 나트륨, pH 7.2 완충액 중의 0.5 mg/mL의 FICOLL 농도로 희석하고, 규정된 기기 환경하에서 측정하였다. 보정된 50 nm 폴리스티렌 나노스피어 샘플 (제품 # 3050A, Thermo Scientific, Rockford, IL)을 분석에 시스템 적합성 대조표준으로서 포함시켰고 49 ± 6 nm의 입자 크기를 가졌다.
실시예 S9: [(D56-01)-PEG 6 ] x -FICOLL로도 불리는 정제된 D56-05의 물리화학적 특성화.
D56-05 ([(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐)의 5개의 파일럿 로트를 실시예 S3에서 개관한 과정을 사용하여 제조하였다. 이들 로트를 특성화하였고 그 결과를 표 S9-1에 요약한다. 순도를 215 nm에서의 검출을 포함한 표 S3-2에 개관한 과정을 사용하여 SEC-HPLC에 의해 측정하였고, >99% 내지 100%의 범위였다. FICOLL 농도를 실시예 S4에 기술된 과정에 의해 측정하였다. FICOLL 농도는 투석여과의 농축물의 최종 농도를 조절함으로서 표적화될 수 있다. D56-01 농도 및 D56-01:FICOLL 비율 (x)을 실시예 S7에 기술된 과정에 의해 측정하였다. D56-01:FICOLL 몰 비율 (x)은 117 내지 140이었고, 그것은 실시예 S3에 기술된 제조 과정이 FICOLL 상의 키메라 화합물의 로딩에 대한 대조표준의 고수준을 제공하는 것을 증명한다. 이 방법에 대한 표적 D56-01:FICOLL 몰 비율 (x)은 120 ± 30이다. D56-05의 입자 크기는 실시예 S8에서 기술한 대로 측정하였다.
Figure pct00052
Figure pct00053
a 외관을 육안 평가에 의해 측정하였다.
b 순도 및 잔류 D56-03 ((D56-01)-3'-SH로도 알려짐)을 215 nm에서의 검출을 포함하여 표 S3-2의 매개변수들을 사용하여 SEC-HPLC 실리카-기반 칼럼을 사용하여 측정하였다.
c FICOLL 농도를 실시예 S4에서 기술한 대로 측정하였다.
d D56-01 농도 및 D56-10:FICOLL 몰 비율 (x)을 실시예 S7에서 기술한 대로 측정하였다.
e 평균 입자 직경을 실시예 S8에서 기술한 대로 측정하였다.
표 S9-1에 나타낸 결과들은 D56-05의 5개의 연속적으로 제조된 파일럿 로트의 제조의 일관성을 예시한다. 핵심 속성 D56-01:FICOLL 몰 비율 (x) 및 D56-05의 입자 크기에 대한 조절의 이런 고수준은 실시예 S3에 개관된 시약 및 과정을 사용함으로써 이루어졌다. [말레이미드]y-FICOLL을 제조하기 위해 설포-SMCC 링커 대신 SM-PEG6 링커를 사용하는 것은, SM-PEG6 링커가 생성물을 유의미하게 더 수용성이 되게 만들어서 말레이미드:FICOLL 몰 비율 (y) 및 D56-03과의 반응성의 개선된 조절을 유도하였기 때문에, 결정적이었다. 추가로, 동등물의 수, 농도, pH, 이온 강도, 시간 및 온도 (실시예 S3에서 기술한 것과 같음)를 포함하여, 시약의 품질 (순도) 및 방법 매개변수들의 조절은 일관된 결과를 이루기 위해 결정적이었다. 실시예 S4 내지 S8에서 기술한 분석 과정들의 개발 또한 방법의 조절에 필요하였다.
실시예 S10: D56-05 동결건조 제형.
5℃보다 위의 온도에서 보관된 D56-05 용액 제형의 안정성에서의 제한은 D56-05 동결건조 제형의 개발을 유도해냈고, 이때 목표는 조절된 실온에서 양호한 안정성을 이루는 것이었다 (실시예 S11 참조). 동결건조될 제형의 조성물의 선택은 열 안정성에 영향을 미칠 수 있는 pH 및 이온 강도를 조절하기 위해 일반적으로 안전하다고 인정된 물질 (Generally Regarded as Safe (GRAS))을 사용하는 사전-제형 연구를 기반으로 하였다. D56-05 영장류 단위용량을 기반으로 한 일련의 시험 제형을 냉동/해동 안정성에 대해 시험하였고 용액 투명성 및 HPLC 사이징 크로마토그래피를 기준으로 평가하였다. 1　mg/ml의 D56-05 (파일럿 로트 2), 10 mM의 인산 칼륨 (pH = 7.5) 및 300 mM의 트레할로오스를 함유한 제형은 10-사이클 실험을 통하여 동일한 크로마토그래피 행동방식 및 동적 광산란 프로파일을 나타냈고 추가의 개발을 위해 선택하였다. 상기 기술된 제형을 대상으로 대략 -35℃에서의 저장-냉동, 이어서 36시간의 -35℃에서의 일차 건조 (~ 60 μ바 진공), 30℃에서의 저장 온도로의 2-시간 전이, 및 추가로 24시간 동안의 이차 건조로 구성되는 동결건조 사이클을 수행하였다. 동결건조된 생성물 (40 바이알)은 잔류 습기가 1 내지 1.4%인 것으로 밝혀진 허용되는 케이크였다. 제형을 1 mL의 물에 복원하였고 생성물은 제형 후 또는 동결건조 및 복원 과정 후 직접 분석되었을 때 SEC-HPLC에 의해 동일하게 행동하는 것으로 나타났다.
실시예 S11: D56-05 ([(D56-01)-PEG 6 ] x -FICOLL로도 알려짐) 용액 및 동결건조된 제형의 안정성.
이 실시예는 액체 및 동결건조된 물질의 안전성을 기술한다.
A. D56-05 용액 제형 안정성. D56-05 ([(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐) 용액 제형의 12개월의 보관에 걸친 안정성을 평가하였다. 용액 제형은 10 mM 인산 나트륨, 142 mM 염화 나트륨, pH 7.2 완충액에 약 3 내지 5 mg/mL의 농도로 용해된 D56-05로 구성되었다. D56-05 용액 제형 (파일럿 로트 4)의 안정성을 -80℃, 5℃ 및 37℃의 보관 온도에서 평가하였다. 안정성 시험은 pH, D56-01 농도 (실시예 S7), HPLC에 의한 D56-05의 % 순도 (표 S3-2, 215 nm에서의 검출) 및 입자 크기 분석 (실시예 S8)을 포함하였다.
표 S11-1 및 표 S11-2는 최대 12개월까지 -80℃, 5℃ 및 37℃에서 보관된 D56-05 ([(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐) 용액 제형, 파일럿 로트 4에 대한 안정성 결과를 나타낸다. 시간 0 결과는 표 S9-1에 제시한다.
Figure pct00054
Figure pct00055
a 중합체 칼럼 (TSK-Gel G3000PWXL)을 사용하여 1-개월 안정성 샘플을 시험하였다. 실리카 칼럼 (TSK-Gel G3000SWXL)을 사용하여 3, 6, 9 및 12-개월 안정성 시점 샘플을 시험하였다. 순도를 215 nm에서 측정하였다.
b 37℃에서 보관된 일부 샘플은 튜브 뚜껑에 균열로 인해 손상되었고 따라서 분석하지 않았다. 이들 샘플을 N/A로서 기록한다 (데이터는 활용할 수 없음).
Figure pct00056
D56-05 용액 제형, 파일럿 로트 4에 대해 pH, D56-01 농도, D56-05 순도 및 입자 크기는 최대 12개월 동안 냉동 보관 (-80℃) 또는 냉장 (5℃) 조건에서 유의미하게 변화하지 않았다. 그러나, 37℃에서, pH 및 D56-05 순도는 보관 시간이 길어질수록 유의미하게 감소한 한편, D56-01 농도 및 입자 크기는 일정하게 유지되었다. 상이한 보관 조건하에서 D56-05 입자 크기의 일관성은 D56-05가 시간 경과에 따라 응집하지 않음을 보여준다.
B. D56-05 동결건조된 제형 안정성. 12개월의 보관에 걸쳐 D56-05 ([(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐) 동결건조 제형의 안정성을 평가하였다. 동결건조 제형은 실시예 S10에서 기술된다. D56-05 동결건조 제형의 안정성을 4℃, 25℃ 및 37℃의 보관 온도에서 평가하였다. 안정성 시험은 D56-01 농도 (실시예 S7), SEC-HPLC에 의한 D56-05의 % 순도 (215 nm에서의 검출이 포함된 표 S3-2) 및 입자 크기 분석 (실시예 S8)을 포함하였다.
표 S11-3은 4℃, 25℃ 및 37℃에서 최대 12개월 동안 보관된 D56-05 ([(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐) 동결건조 제형의 안정성을 나타낸다. 동결건조 전 (pre-lyo)의 D56-05 제형에 대한 데이터가 또한 표 S11-3에 포함된다.
Figure pct00057
Figure pct00058
D56-05 동결건조 제형에 대하여, pH, D56-01 농도 및 D56-05 순도는 최대 12개월 동안 4℃, 25℃ 및 37℃에서 보관시 유의미하게 변화하지 않았다. 입자 크기 또한 4℃에서 최대 12개월 동안 보관시 안정하였다. 그러나, 입자 크기의 미미한 증가가 25℃에서 12개월 동안 보관한 생성물에 대해 관찰되었고, 한편 입자 크기의 큰 증가 (약 6x)는 37℃에서 12개월 동안 보관한 샘플에 대해 증명되었다. 그러나, 시험관 내 생물학적 활성 (인간 B-세포 IL-6 생성)은 임의의 온도에서 12개월 보관한 후에도 변하지 않았다. 동결건조 제형은 적어도 12개월 동안 25℃에서 충분히 안정한 것으로 결론내렸다.
비록 D56-05 용액 제형이 냉동시 (-80℃) 및 냉장 (5℃) 보관 조건에서 안정하지만, D56-05 동결건조 제형은 용액 상태의 D56-05와 비교하여, 특히 25℃ 및 37℃의 더 높은 보관 온도에서 증대된 안정성을 나타냈다.
실시예 S12: 상이한 말레이미드:FICOLL 몰 비율 (y)로의 [말레이미드-PEG 6 ] y -FICOLL의 제조, 및 정제된 D56-05 ([(D56-01)-PEG 6 ] x -FICOLL로도 알려짐)의 D56-01:FICOLL 몰 비율 (x)에 미치는 영향.
상이한 말레이미드:FICOLL 몰 비율 (y)을 가지는 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL 로트들을 (AECM)z-FICOLL (아민:FICOLL 몰 비율 (z) = 224)로부터 실시예 S3, 단원 E에서 기술된 과정을 사용하여 제조하였고, 단 더 작은 규모로 제조하고 상이한 양의 SM-PEG6 (아민당 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 및 2.0 당량)을 사용하였다. 말레이미드:FICOLL 몰 비율 (y)을 실시예 S4 및 S6에 기술된 과정에 의해 측정하였다. 표 S12-의 결과는 상이한 양의 SM-PEG6을 첨가하는 것이 말레이미드:FICOLL 몰 비율 (y)이 8 내지 185인 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL 로트를 초래하였음을 보여준다. [말레이미드-PEG6]y-FICOLL 로트를 다음에 D56-03 (말레이미드당 1.1 당량)과 반응시켰고, 그 결과의 D56-05 로트를 실시예 S3, 단원 G에서 기술한 대로 정제하였다. D56-05 ([(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐) 로트의 D56-01:FICOLL 몰 비율 (x)을 실시예 S4 및 S7에서 기술한 대로 측정하였고, 24 내지 154의 범위였다 (표 S12-1). 이들 결과는 D56-05 중에 F56-01 로딩이 [말레이미드-PEG6]y-FICOLL의 제조에 사용된 SM-PEG6의 양에 의해 조절될 수 있음을 보여준다. 이들 화합물의 시험관 내 효능에 대해서는 실시예 B9 참조함.
Figure pct00059
Figure pct00060
ND = 수행하지 않음.
실시예 S13: n이 각각 24, 45 및 70인 SM-PEG n 링커를 사용하는 D56-25, D56-26 및 D56-27 ([(D56-01)-PEG n ] x -FICOLL로도 알려짐)의 제조.
상이한 PEG 링커 길이를 가지는 [말레이미드-PEGn]y-FICOLL 로트를 실시예 S3, 단원 E에 기술된 과정을 사용하여 (AECM)z-FICOLL (아민:FICOLL 몰 비율 (z) = 224)로부터 제조하였고, 단 더 작은 규모로 제조하고 n이 각각 24, 45 및 70인 SM-PEGn 링커를 사용하였다 (SM-PEGn의 화학적 구조에 대해 도 5 참조). 사용한 SM-PEG24 시약을 Thermo Fisher (Rockford, IL)로부터 얻었고, 그것은 도 5a에 도시된 것과 같은 구조를 가지며, 이때 n은 24이다. 사용한 SM-PEG45 및 SM-PEG70 시약을 Nanocs Inc. (New York, NY)로부터 얻었고; 구조는 도 5-b에 도시된 것과 같다 (n은 각각 45 및 70임). 그 결과의 [말레이미드-PEGn]y-FICOLL 로트의 말레이미드:FICOLL 몰 비율 (y)은 실시예 S4 및 S6에서 기술한 대로 측정하였고 그 결과는 표 S13-1에 나타낸다. 말레이미드:FICOLL 몰 비율 (y)은 199 내지 227의 범위였고, 그것은 PEG 링커 길이가 얻어진 말레이미드:FICOLL 몰 비율에 유의미하게 영향을 주지 않았음을 나타낸다.
D56-25, D56-26 및 D56-27 ([(D56-01)-PEGn]x-FICOLL로도 알려짐, n은 각각 24, 45 및 70임)을 실시예 S3, 단원 G에서 기술한 대로 3개의 [말레이미드-PEGn]y-FICOLL 로트로부터 제조하였고, 단, 더 작은 규모로 제조하였다. [(D56-01)-PEGn]x-FICOLL 로트 (D56-05 (n=6), D56-25 (n=24), D56-26 (n=45) 및 D56-27 (n=70))의 D56-01:FICOLL 몰 비율 (x)은 실시예 S4 및 S7에서 기술한 대로 측정하였고 평균 입자 직경은 실시예 S8에서 기술한 대로 측정하였다. D56-01:FICOLL 몰 비율 (x)은 108 내지 116의 범위였고 (표 S13-1), 그것은 PEG 링커 길이가 얻어진 D56-01:FICOLL 몰 비율에 유의미하게 영향을 주지 못하였음을 나타낸다. 그러나, PEG 링커의 길이 증가와 상관된 평균 입자 직경 (55 nm 내지 91 nm)에 증가가 있었다 (표 S13-1). 이들 화합물의 시험관 내 효능에 대해서는 실시예 B10 참조.
Figure pct00061
a 평균 입자 직경을 실시예 S8에서 기술한 대로 측정하였다.
실시예 S14: [말레이미드-MC] y -FICOLL의 제조.
[말레이미드-MC]y-FICOLL을 [AECM]z-FICOLL로부터 미국 특허 제 8,597,665호에 기술된 대로 설포-SMCC 링커를 사용하여 제조하였다. [말레이미드-MC]y-FICOLL은 빠져나감 및/또는 침전으로서 관찰된, 수성 완충액에서의 용해도 문제를 보였다. 말레이미드-MC-FICOLL의 취급시 어려움은 티올-활성화된 폴리뉴클레오티드 (PN) 또는 키메라 화합물 (CC)와의 콘쥬게이션 반응을 일관성이 없게 만들었다.
실시예 S15: Alexa Fluor® 555-(D56-05) (Alexa Fluor® 555/[(D56-01)-PEG 6 ] x -FICOLL로도 알려짐)의 제조.
Alexa Fluor® 555 (Alexa Fluor® 555-NHS 에스테르)의 아민 반응성 유도체를 Life Technologies (Foster City, CA)로부터 구입하였다. 실시예 S3에서 기술한 대로 제조된 AECM-FICOLL을 Alexa Fluor® 555-NHS 에스테르와 SM-PEG6의 혼합물과의 반응에 의해 활성화하여 Alexa Fluor® 555/[말레이미드-PEG6]y-FICOLL을 형성하였고, 그것을 실시예 S3에서 기술된 D56-03 ((D56-01)-3'-SH로도 알려짐)과 반응시켜서 Alexa Fluor® 555-(D56-05) (Alexa Fluor® 555/[(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐)를 얻었다.
실시예 S16: D56-08, D56-09, D56-12 및 D56-13의 제조.
D56-08, D56-09, D56-12 및 D56-13을 미국 특허 제 8,597,665호에서 기술한 대로 제조한다.
실시예 S17: Alexa Fluor® 647-(D56-05) (Alexa Fluor® 647/[(D56-01)-PEG 6 ] x -FICOLL로도 알려짐)의 제조
Fluor 647-NHS 에스테르 (Life Technologies)를 rPA와 반응시켜서 결과적으로 rPA당 하나의 Alexa Fluor® 647의 비율을 가지는 Alexa Fluor® 647/rPA를 얻었다.
생물학적 실시예
실시예 B1: 인간 백혈구의 분리 및 자극.
폴리뉴클레오티드 (PN) 및 키메라 화합물 (CC)의 활성을 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 분리된 B 세포에 의한 사이토킨 분비의 측정, 뿐만 아니라 B 세포 증식의 측정에 의해 시험관 내에서 평가하였다. 세포 배양 배지로 분비된 사이토카인 수준을 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 측정하였다.
인간 혈액을 건강한 인간 도너로부터 서면 동의로 얻었다. PBMC를 FICOLL-Paque (GE Healthcare, UK) 밀도 구배 원심분리에 의해 분리하였다. 인간 B 세포를 항-CD19 마이크로비드 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 사용한 포지티브 선택에 의해 분리하였다. 인간 형질 세포양 수지상 세포 (pDC)를 항-BDCA-2 마이크로비드 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 사용한 포지티브 선택에 의해 분리하였다. 분리된 pDC를 총 PBMC의 푸울에 다시 첨가하여 도너에 의해 0.5 내지 2.4%로 달라지는 총 PBMC에서의 최종 pDC를 초래하였다.
세포를 10% 열-비활성화된 우태아 혈청 (FBS) (Gemini, West Sacramento, CA) 플러스 50 U/ml의 페니실린, 50 μg/ml의 스트렙토마이신, 2 mM의 L-글루타민, 10 mM의 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 (HEPES) 완충제 및 1 mM의 피루브산 나트륨 (BioWhittaker, Walkersville, MD)이 첨가된 RPMI-1640 (BioWhittaker, Walkersville, MD)에 재현탁하였다. B 세포 자극을 위해서는, 세포를 5.5 내지 0.0054 μM의 농도 범위의 PN 또는 CC와 함께 이중으로 96-웰 둥근-바닥 플레이트에서 mL당 0.75 x 106으로 90 내지 93시간 동안 배양하였다. PBMC 및 pDC-풍부화 PBMC 자극을 위해서는, 세포를 2.5 내지 0.0012 μM의 농도 범위의 PN 또는 CC와 함께 삼중으로 96-웰 평평-바닥 플레이트에서 mL당 2.5 x 106으로 21 내지 24시간 동안 배양하였다.
ELISA 분석. IL-6 및 IFN-α 수준을 상업적으로 입수 가능한 항체 쌍 (MabTech, Inc. Cincinnati, OH)을 사용하여 평가하였다; 최소 검출 한계는 IL-6에 대해서는 31 pg/mL이었고 IFN-α에 대해서는 23 pg/mL이었다. 96-웰 Maxisorp Immuno 플레이트를 사이토카인 특이적 Ab로 코팅한 후 DPBS 중의 1% BSA로 차단하였다. 세포 배양 샘플을 첨가하고 결합된 사이토카인을 비오틴-표지된 이차 항체의 첨가, 이어서 양고추냉이 페록시다제 및 페록시다제-특이적 비색분석 기질의 첨가에 의해 검출하였다. 표준 곡선을 IL-6에 대해서는 R&D Systems (Minneapolis, MN)으로부터, 그리고 IFN-α에 대해서는 MabTech로부터 구입한 재조합 사이토카인들을 사용하여 제작하였다. 흡광도 값을 SpectraMax 190 또는 VersaMax 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)를 사용하여 450 nm에서 측정하고 650 nm에서의 바탕값을 뺐다. 반-최고 유효 농도 (EC50) 값을 각각의 개별적인 도너로부터 표로 만든 모든 도너에 대한 누적 평균으로 내삽함으로써 계산하였다. EC50을 최대 사이토카인 수준의 절반과 동등한 값을 제공하는 PN 또는 CC 농도로서 규정하였다.
실시예 B2: 마우스 비장세포의 분리 및 자극.
폴리뉴클레오티드 (PN) 및 키메라 화합물 (CC)의 활성을 마우스 비장세포에 의한 사이토카인 분비의 측정에 의해 시험관 내에서 평가하였다. 세포 배양 배지로 분비된 사이토카인 수준을 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 측정하였다.
생후 8 내지 20주의 BALB/c 마우스의 비장을 수득하고 조각조각 표준 티징 (standard teasing) 및 ACK 용해 완충액 (BioWhittaker, Inc. Walkersville, MD)으로의 처리를 사용하여 비장세포를 분리하였다. 세포를 10% 열-비활성화된 우태아 혈청 (FBS) 플러스 50 μM 2-메르캅토에탄올, 50 U/ml의 페니실린, 50 μg/ml의 스트렙토마이신, 2 mM의 L-글루타민, 10 mM의 HEPES 및 1 mM의 피루브산 나트륨이 첨가된 RPMI-1640에 재현탁하였다. 자극을 위해서, 비장 세포를 22 내지 0.0003 μM의 범위의 농도의 PN 또는 CC와 함께 삼중으로 96-웰 평평-바닥 플레이트에서 mL당 3.5 x 106 세포로 20 내지 24시간 동안 배양하였다.
ELISA 분석. IL-6 및 IL-12p40 수준을 상업적으로 입수 가능한 항체 쌍 (BD Biosciences, San Jose, CA)을 사용하여 평가하였다; 최소 검출 한계는 IL-6에 대해서는 31 pg/mL이었고 IL-12p40에 대해서는 63 pg/mL이었다. 96-웰 Maxisorp Immuno 플레이트를 사이토카인 특이적 Ab로 코팅한 후 DPBS 중의 1% BSA로 차단하였다. 배양 상층액을 첨가하고 결합된 사이토카인을 비오틴-표지된 이차 항체의 첨가, 이어서 HRP 및 페록시다제-특이적 비색분석 기질의 첨가에 의해 검출하였다. 표준 곡선을 BD Biosciences로부터 구입한 재조합 사이토카인들을 사용하여 제작하였다. 흡광도 값을 SpectraMax 190 또는 VersaMax 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)를 사용하여 450 nm에서 측정하고 650 nm에서의 바탕값을 뺐다. EC50을 최대 사이토카인 수준의 절반과 동등한 값을 제공하는 PN 또는 CC 농도로서 규정하였다. IL-6 및 IL-12p40에 대한 EC50 값을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 X-Log(X) 변형 데이터의 S자형-용량 반응 곡선 맞춤을 사용하여 측정하였다.
실시예 B3: 선형 키메라 화합물 (CC) 서열 최적화.
두 개의 별도의 실험을 수행하였다. 다음의 표에서 평균은 기하학적 평균을 나타낸다.
A. 실험 1. 선형 CC D56-14는 이전에 인간 PBMC로부터 IFN-α, 인간 B 세포로부터 IL-6을 유도하고 마우스 비장세포를 자극하는 것으로 알려져 있다 (미국 특허 제 8597665호). IFN-α 활성이 D56-14와 비교하여 개선될 수 있었는지를 측정하기 위하여 서열 최적화를 수행하였다. 7개의 새로운 선형 CC를 일차 스크리닝 분석으로, 즉 인간 PBMC IFN-α 활성 및 인간 B 세포 IL-6 활성을 시험하였다 (과정에 대해서는 실시예 B1 참조). 이 실시예에서 사용한 선형 CC, N1-S1-N2-S2-N3의 일반적 구조는 CC 내의 핵산 모티프 (N)의 배치를 기술하기 위해 사용될 수 있다. 이 연구에서 새로운 CC 중 6개가 모두 마우스 모티프, 5-AACGTTC-3'을 N3 위치에 함유하였다. D56-24는 N2 위치에 마우스 모티프를 함유하였고, 선형 CC 맥락에서 마우스 활성 모티프의 상이한 위치를 탐색하기 위한 스크리닝에 포함되었다. D56-10은 알려진 CpG-B 면역자극 서열 (ISS)이고 포지티브 대조표준으로서 패널에 포함되었다.
Figure pct00062
NC = 용량 반응 곡선으로부터 계산할 수 없음; ND = 명시된 도너에 대해 측정되지 않음
Figure pct00063
Figure pct00064
NC = 용량 반응 곡선으로부터 계산할 수 없음; ND = 명시된 도너에 대해 측정되지 않음
선형 CC D56-16, D56-18, D56-19, 및 D56-22 및 D56-24는 D56-14와 비교하여 유사하거나 개선된 PBMC IFN-α활성 (표 B3-1), 및 유사하거나 약간 감소된 인간 B 세포 활성 (표 B3-2)을 나타냈다. 선형 CC D56-24는 시험된 서열 중에서 최상의 PBMC IFN-α 및 인간 B 세포 활성을 나타냈다. 상기 주지된 것과 같이, D56-24와 다른 서열들 사이의 원리적인 차이는 N2 및 N3 인간 및 마우스 모티프가 각각, D56-24에서 스위치되어서 마우스 모티프가 다른 새로운 CC에서의 N3 위치와 비교하여 N2 위치에 위치한다는 것이다.
B. 실험 2. 실험 1로부터의 결과를 기반으로, 인간 및 마우스 활성을 증가시킬 목적으로 새로운 CC 서열의 패널을 디자인하였다. 구체적으로, D56-16, D56-18, D56-19, 및 D56-22에 관련된 4개의 새로운 서열들을 N2 위치로 이동된 마우스 모티프로 디자인하였다: D56-17, D56-01, D56-20 및 D56-23. 새로운 CC들의 초기 시험관 내 스크리닝을 마우스 비장세포에 대해 수행하였다 (표 B3-3 및 표 B3-4). N2 위치에 마우스 모티프를 가진 모든 서열은 N3 위치에 마우스 모티프를 가진 상응하는 CC와 비교하여 크게 개선된 IL-6 및 IL-12p40 효능을 나타냈다. D56-01 및 D56-23은 시험된 CC 중 최상의 IL-6 효능을 나타낸 한편, D56-01은 최상의 IL-12p40 효능을 나타냈다.
Figure pct00065
Figure pct00066
인간 PBMC IFN-α 활성 및 인간 B 세포 IL-6 활성에 대한 결과는 각각 표 B3-5 및 표 B3-6에 나타낸다. 놀랍게도, N2 위치에 마우스 모티프를 가지는 것이 또한 인간 PBMC IFN-α 활성을 유의미하게 개선시켰다. 일반적으로, 인간 IL-6 효능은 또한 N2 위치에 마우스 모티프를 가진 CC에 대해 개선되었다.
수행된 시험관 내 시험들 중에서, IFN-α 효능은 암, 항바이러스, 천식 및 알레르기 모델에서 가장 예측 가능한 양호한 생체 내 활성인 것으로 여겨진다. 이것을 기반으로, D56-01, D56-17, D56-20, D56-23, 및 D56-24가 선두 후보로 여겨졌다. 이들 서열은 또한 양호한 인간 B 세포 IL-6 및 마우스 IL-6 활성을 나타냈다. 놀랍게도, D56-01이 다른 N2 마우스 모티프 서열들과 비교하여 IL12p40 효능을 유의미하게 개선시켰다.
Figure pct00067
ND= 측정되지 않음
Figure pct00068
Figure pct00069
실시예 B4: D56-05는 D56-01보다 더 강력한 시험관 내 반응을 유도한다.
인간 및 마우스 사이토카인 둘 다에 대한 유도의 효능을 기반으로, D56-01을 나노입자 제형의 개발에 대한 선두 후보로서 선택하였다. D56-01 서열을 실시예 S3에서 기술한 대로 FICOLL에 콘쥬게이션하여 D56-05 ([(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐)를 생성하였다. 다음에 인간 PBMC IFN-α 및 인간 B 세포 IL-6의 유도에 대한 상대적인 시험관 내 효능에 대해 D56-01 및 D56-05를 비교하였다. 인간 PBMC IFN-α 활성 및 인간 B 세포 IL-6 활성에 대한 결과를 각각 표 B4-1 및 표 B4-2에 나타낸다. 서열 D56-10 및 D56-14를 이 실험에서 역사적인 포지티브 대조표준으로서 사용하였다.
나노입자 제형 D56-05는 IFN-α (표 B4-1) 및 IL-6 활성 (표 B4-2)의 유도에서 현저하게 더 강력하였다.
Figure pct00070
Figure pct00071
NC = 용량 반응 곡선으로부터 계산할 수 없음; ND= 측정되지 않음
Figure pct00072
ND= 측정되지 않음
실시예 B5: D56-05는 D56-01보다 더 강력한 생체 내 반응을 유도한다.
D56-05 및 D56-01을 마우스 및 사이노몰구스 원숭이들에 투여한 후 선천적인 면역 반응의 유도를 평가하였다. 원숭이에서, 인터페론-경로 관련된 유전자 발현이 D56-05 및 D56-01의 투여 전 및 투여 후 24시간에 수집된 혈액 샘플에서 측정되었다. 마우스에서, 인터페론-경로 및 케모카인-관련 유전자 발현을 화합물 투여 후 18시간에 수득된 주사-부위 배수 림프절에서 측정하였다. 항원-제공 세포 집단의 D56-05 및 D56-01을 획득하는 상대적인 능력을 화합물 주사 후 24시간에 마우스로부터 수득된 주사 부위-배수 림프절에서 평가하였다. 추가로, 돌연변이 마커 발현 (CD69, CD86)을 화합물 주사 후 20시간에 수득된 림프절로부터의 형질 세포양 수지상 세포 (pDC) 상에서 측정하였다.
사이노몰구스 원숭이 (Macaca fascicularis)를 Valley Biosystems, (West Sacramento, CA) 또는 Battelle Biomedical Research Center (Columbus, OH)에서 하우징하였고, 그곳에서 모든 생전 (in life) 과정을 수행하였다. 각 연구에서 건강한 어른동물만을 사용하였다. 전혈을 PAXgene 튜브 (QIAGEN, Venlo, NL)에 면역화-전 및 -후에 수집하였고, 제조자의 설명서에 따라 RNA의 추후 추출을 위해 냉동하였다. 3 내지 6마리의 원숭이의 그룹을 PharmAthene (Annapolis, MD)으로부터의 10 μg의 탄저병 재조합 보호 항원 (rPA)으로 단독으로 또는 1 mL의 PBS 중의 1000, 250 또는 50 μg의 D56-05 또는 1000 또는 250 μg의 D56-01과 함께 근육내 경로 (사두근)에 의해 면역화하였다.
면역원성 연구를 위하여, 사이노몰구스 원숭이들의 그룹을 총 1 ml의 둘베코 PBS (DPBS) 중의 D56-01 또는 D56-05의 용량이 있거나/없이 rPA로 근육 내 (사두근) 또는 피하 경로에 의하여 면역화하고, 계속해서 채혈하여 Ab 반응에 대한 보조제들의 효과를 평가하였다.
스위스 웹스터, BALB/c 및 C57BL/6 마우스들 (생후 8 내지 12주)을 Charles River Laboratoies (Hollister, CA)로부터 구입하고 Pacific BioLabs (Hercules, CA) 또는 Murigenics (Vallejo, CA)에서 하우징하였고, 모든 생전 과정을 그곳에서 수행하였다. TLR9-/- 마우스를 Simonsen Laboratories (Gilroy, CA)DPJ 유지하고, 생후 8 내지 16주째에 사용하였다.
면역원성, 조직 분포 및 전신적 독성 연구를 위해, 마우스들을 사두근에 rPA가 있거나/없는 보조제와 함께, 또는 rPA 단독으로 주사하였다. 근육 조직 반응을 평가하는 연구를 위해, 마우스들을 보조제 단독으로 사두근에서 양방향으로 주사하였다. 유전자 발현 및 유동 세포분석 평가를 포함하여, 배수 림프절 반응에 대해서는, 마우스들을 rPA가 있거나 없는 보조제로 양 뒷발바닥에 주사하였다. D56-01- Alexa Fluor® 555는 사용할 때, 미표지 D56-01과 함께 Alexa Fluor® 555/D56-05-특이적 상대 형광을 매치하기 위한 비율로 투여하였다. 모든 면역화를 총 50 μL의 부피의 50 μL의 DPBS 또는 10 mM 인산 나트륨 완충액에서 수행하였다.
유전자 발현 분석을 위해서, 마우스들을 DPBS 또는 10 μg의 D56-05 또는 D56-01로 근육 내 또는 피하 경로 (발바닥)에 의해 주사하였다. 근육 조직 및 배수 림프절을 각각 6시간 또는 18시간째에 RNAlater (QIAGEN, Venlo, The Netherlends)에 수득하였고, 제조자의 설명서에 따라 RNA의 추후 추출을 위해 냉동하였다. 세포 유동분석에 의해 화합물의 세포 흡수를 정량하기 위해, 배수 림프절은 25 μg의 형광적으로-표지된 D56-01 또는 D56-05를 주사한 후 24시간째에 수득하였다. Alexa Fluor® 555-(D56-01) 및 Alexa Fluor® 555-(D56-05)의 제조에 대해 각각 실시예 S2 및 S15를 참조한다. 세포 유동분석을 사용하여 세포 표면 마커의 분석을 위해, 배수 림프절을 5, 2, 또는 0.2 μg의 비-형광적으로-표지된 D56-01 또는 D56-05의 주사 후 20시간에 수득하였다. 세포 유동분석 실험에 대해, 단일 세포 현탁액을 치료 그룹 모아진 림프절로부터 준비하였다.
기관들을 RNAlater (Qiagen, Venlo, The Netherlands)에서 냉동시켰다. 총 RNA를 RNeasy 섬유상 조직 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 및 전체 균등화된 오금 림프절을 RNeasy 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 개별적인 균등화된 근육당 30 mg으로부터 분리하였고, 둘 다 칼럼-상에서 DNase I으로 소화하였다.
역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR). cDNA를 재조합 RNasin 리보뉴클레아제 억제제 (Promega, Madison, WI), 올리고(dT)15 (Promega), 무작위 프라이머 (Promega), dNTP (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 SuperScript III 역전사효소 (Invitrogen)를 사용하여 총 RNA 샘플로부터 제조하였다. mRNA의 정량은 Power SYBR Green 마스터 믹스 (Life Technologies)를 사용하여 수행하였다. 순환 조건은 95℃에서 15분, 이어서 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분의 40회기였고, 분석은 Applied Biosystems (Carlsbad, CA) StepOnePlus 실시간 PCR 시스템에 의해 StepOne v2.1 소프트웨어를 사용하였다. 유비퀴틴을 기준 유전자로서 사용하였다. PCR 후에, Ct 값을 측정하였고 표준화된 데이터를 사전-면역화 또는 DPBS 대조표준을 넘는 배수 증가로서 표시하였다. 다르게는, RNA를 제조자의 지시에 따라 사이토카인 및 케모카인에 대한 RT2 프로파일러 PCR 배열 시스템 (Qiagen)과 함께 사용하기 위해 RT2 제1 가닥 키트 (Qiagen)에 의하여 역전사시켰다.
유동 세포분석. 단일-세포 현탁액을 마우스 조직으로부터 준비하여 실험 그룹별로 모았고, 단 근육은 먼저 2 mg/ml의 콜라게나제, 타입 2 (Worthington Biochemical Lakewood, NJ)로 45분 동안 37℃에서 소화시켰다. 세포를 클론 2.4G2 mAb로 FcgR을 차단한 후 30분 동안 4℃에서 2 mM EDTA가 있거나/없는 0.1% BSA를 함유하는 DPBS 중에서 유지하였다. 세포를 최소 20분 동안 1%의 포름알데하이드의 최종 농도에서 고정시킨 후, 세척하고 FACS 유동 완충액에 재현탁하였다. CD3ε (145-2C11), CD4 (GK1.5), CD8a (53-6.7), CD11b (M1/70), CD11c (HL3), CD19 (6D5), CD45R/B220 (RA3-6B2), CD49b (DX5), CD69 (H1.2F3), CD86 (GL-1), CD95 (Jo2), CD279 (J43), CD317/PDCA-1 (eBio927), CXCR5 (2G8), F4/80 (BM8), Ly-6C (AL-21), Ly-6G (1A8), MHC 부류 II (MHC II; I-A/I-E) (M5/114.15.2), 및 T 및 B 세포 활성화 Ag (GL7)에 대한 Ab들을 BD Biosciences (San Jose, CA), BioLegend (San Diego, CA) 또는 eBioscience (San Diego, CA)에서 구입하였다. 비오티닐화된 땅콩 아글루티닌 (PNA)을 Vector Laboratories (Burlingame, CA)로부터 구입하였다. 유동 세포분석 데이터를 LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA) 유동 세포분석기 상에 수집하고 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Ashland, OR)를 사용하여 분석하였다. 다색 영상 유동 세포분석 데이터를 ImageStreamX mk II (Amnis, Seattle, WA) 상에 수집하고 IDEAS v6.1 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 영상을 0.9 개구수 및 2.5-mm의 유효 피사계 심도를 가지는 360 렌즈를 사용하여 포착하였다. 공동국지화된 형광 신호를 가지는 것으로 보이는 세포를 밝은 디테일 유사성 (BDS)의 도움으로 확인하였다. BDS 채점은 영상의 비-평균-표준화된 피어슨 상관 계수를 계산하기 위하여 공간적 위치 및 중복 정도를 비교함으로써 세포들 내부의 형광 마커들 사이의 공동국지화를 수량화한다. 2의 한계 수준을 넘는 BDS 득점을 가진 사건들은 형광 공동국지화는 가지는 것으로 보였고, 그것을 육안으로 확인하였다. 림프절 세포를 항체들로 염색하여 pDCs (CD3-, CD19-, CD49b-, MHCII+, CD11c+, 및 B220+ 또는 PDCA-1+), cDCs (MHCII+, CD11b-, CD11c+), 및 mDCs (MHCII+, CD11b+, CD11c+) 및 세포 돌연변이의 모든 마커 (CD69 및 CD86)를 확인하였다. 일차 게이팅 (primary gating)은 광산란, 이중 배제 및 림프구 계통 배제 게이팅을 통하였다. pDCs, cDCs, 및 mDCs 상에서 형광-표지된 D56-05 및 D56-01 흡수의 정도, 및 별도의 실험으로, pDC 상에서의 성숙 마커 발현 (기하학적 평균 형광 세기; gMFI)을 FlowJo 소프트웨어 (TreeStar, Ashland, OR)를 사용하여 측정하였다.
통계학적 분석. 도면의 간단한 설명에서 명시된 것과 같이, Dunn 사후시험이 포함된 Mann-Whitney 또는 Kruskal-Wallis 시험을 사용하여 통계학적 유의미성을 측정하였다. 0.05 이하의 p 값을 유의미한 것으로 간주하였다.
결과. 표 B5-1은 원숭이 혈액에서 IFN 경로-관련 유전자 발현을 나타낸다 (사전-면역화를 넘는 배수 증가). 이들 데이터는 D56-01이 IFN-관련 유전자 발현을 유도한 한편, D56-05는 영장류에서 rPA로 면역화한 후에 더 강력한 IFN-관련 유전자 발현을 유도하였음을 나타낸다.
단량체 D56-01과 비교하여 개선된 보조제 활성과 관련될 수 있는 국소 조직에서의 초기 D56-05를 평가하기 위하여, 전사적 변화를 주사 후 6시간 후에 주사 부위에서 분석하였다. 마우스들에게 보보제를 rPA 없이, 동등한 CpG-기반 용량으로 주사하였고, PBS-주사된 동물을 대조표준으로서 사용하였다. D56-05는 단량체 D56-01의 효과와 비교하여, 다중 IFN-조절된 유전자 (IRG) (도 11a) 및 케모카인 (도 11b) 둘 다에 대해, 유도된 많은 유전자 및 유전자 유도의 수준 둘 다에 대해 더 강력한 효과를 나타냈다. 마찬가지로, D56-05는 IL-1 및 TNF 슈퍼패밀리의 사이토카인의 더 높은 수준을 유도하였다 (도 11c). 접착 분자, 인티그린 및 매트릭스 메탈로프로테이나제가 또한 D56-05 처리 후에 주사 부위 근육에서 훨신 더 큰 정도로 유도되었다 (도 11d). 그러므로, 나노입자-유사 제형의 D56-01은 단량체 D56-01과 비교하여 주사 부위에서 면역 활성화의 초기 마커들을 유도하는 데 더 효과적이다. 나노미립자 및 단량체 D56-01이 주사 부위 근육에 대한 세포 충원에 상이하게 영향을 미쳤는지를 측정하기 위하여, 면역 세포 집단의 상대적인 비율을 유동 세포분석에 의하여 분석하였다. 24시간 째에, 총 CD45+ 세포는 D56-01-주사된 조직과 비교하여 D56-05-주사된 근육에서 3-배 풍부하였다 (약 212,000 대 약 67,000 세포/g 근육). D56-05 주사는 단량체 D56-01이 투여된 마우스와 비교하여 주사된 근육에서 상대적으로 높은 비율의 종래의 DCs (cDCs), 골수성 DCs (mDCs), 골수 세포, 대식세포, 단핵 세포 및 호중구를 유도하였다 (도 11e).
D56-05-유도된 염증성 유전자 발현 및 rPA-유도된 Ab 반응에 대한 보조성 (adjuvanticity)이 TLR9-무관한 경로를 포함하였는지를 시험하기 위하여, TLR9-/- 마우스에서의 반응을 시험하였다. D56-05로의 근육 내 주사 후에, IRG 및 케모카인 및 사이토카인 유전자의 유도가 야생형 C57BL/6 마우스에서 관찰되었지만, TLR9-/- 마우스에서는 관찰되지 않았다 (도 12a). 따라서, D56-05 보조제 활성은 TLR9-/- 마우스에서는 관찰되지 않았다 (도 12b). 주사 부위에서 유도된 두 염증성 반응의 결핍 및 TLR9-/- 마우스에서의 보조제 효과는 D56-05의 활성이 TLR9 신호화에 의존적임을 증명하였다.
피하 주사 후 18시간 후에, D56-05는 D56-05와 비교하여 림프절에서 인터페론-조절된 유전자 (도 13a), 케모카인 (도 13b) 및 사이토카인 (도 13c)의 전사의 더 큰 증가를 유발하였다. 다중 케모카인의 더 강력한 유도의 결과인 것처럼, D56-05 주사는 D56-01-주사된 마우스와 비교하여 배수 림프절에서 더 큰 수의 다양한 항원 제공 세포 (APC)를 초래하였다. MHC II+ pDC가 특히 영향을 받았는데, D56-05 치료 후에 5-배 더 큰 수로 존재하였다 (평균적으로, 940 대 187 세포/림프절) (도 14). 이것들을 함께 고려하면, 이들 데이터는 D56-05가 주사 부위에서 및 배수 림프절에서 면역 반응을 개시하는 데 있어서는 단량체 D56-01보다 더 강력한 것을 증명한다.
D56-05 치료 후에 세포 트래피킹 (cell trafficking)의 상대적인 증가가 보조제의 세포 흡수에 대한 차등 효과에 의해 이루어졌는지를 측정하였다. 적응성 면역 반응의 개시에 포함된, MHC II+ pDC 및 mDC, 골수 세포, 대식 세포 및 단핵 세포뿐 아니라 호중구를 포함하여 광범위한 세포 집단은 모두 D56-05로의 주사 후에 더 큰 형광을 증명하였다. D56-05 주사된 마우스에서는 고수준의 Alexa Fluor® 555 형광을 가지는 실질적인 비율의 mDC, 골수 세포, 대식 세포 및 단핵 세포가 있었던 반면, mDC 내부화된 D56-01만이 유사한 정도로 있었다. Alexa Fluor® 555-표지된 D56-01-Ficoll 또는 D56-01의 림프구 흡수는 무시할 정도였다. 표 B5-2는 세포에서 A555-표지된 D56-05 또는 D56-01의 기하학적 평균 형광 세기 (gMFI)에 의해 측정된 형광-표지된 D56-05 또는 D56-01의 흡수를 나타낸다. 이들 데이터는 배수 림프절 pDC, cDC 및 mDC가 마우스에서 생체 내 주사 후에 D56-05 또는 D56-01을 흡수하는 것을 나타낸다. 일반적으로, 더 높은 gMFI 값에 의해 나타나는 바와 같이 상이한 세포 집단에서 D56-05의 흡수가 D56-01의 흡수보다 컸다.
D56-05는 또한 배수 림프절 내에서 단량체 D56-01이그런 것보다 더 크게 APC 및 림프구의 활성화에 영향을 나타냈다. D56-05 주사 후에, pDC, CD8+ DC, cDC, mDC 및 골수 세포는 모두 CD86의 더 큰 발현을 나타낸 반면, B 및 NK 세포는 단량체 D56-01로 주사된 마우스로부터 수득된 림프절 세포와 비교하여 CD69의 더 큰 발현을 나타냈다. 표 B5-3은 마우스 림프절로부터의 pDC 상에서의 CD69 및 CD86 발현의 수준을 나타낸다. 이들 데이터는 D56-05 및 D56-01 둘 다 pDC상에서 CD69 및 CD86 발현을 유도하지만 D56-05는 D56-01과 비교하여 생체 내에서 pDC의 성숙을 유도하는데 더 강력하다. 그러므로, Ficoll 상의 D56-01의 나노미립자 제형은 핵심 APC 집단에 의해 그것의 흡수 및 활성화를 개선하고, 적응성 면역력의 효과적인 유도에 기여한다.
Ficoll 콘쥬게이션이 CpG-ODN의 효율 및 동일한 세포로의 Ag 흡수를 증가시켰는지를 측정하기 위하여, 마우스들의 발바닥에 형광 표지된 보조제 (상기에서 기술된 것과 같음) 플러스 Alexa Fluor® 647로 표지된 rPA를 주사하였다. 오금의 림프절 세포를 유동 세포분석 분석을 위해 주사 후 24 또는 48시간 후에 수득하였다. 조사한 각각의 APC 유형에 대해, 많은 세포가 단지 Ag 또는 보조제를 통합하였다; 그러나, rPA 및 D56-05 또는 D56-01 둘 다를 획득한 세포의 집단도 있었다. D56-05 및 rPA로 면역된 마우스들은 보조제만을 흡수한 세포들뿐 아니라 일관된 Ag 및 보조제 흡수를 포함하여 최고 빈도의 APC를 증명하였다. 다색 영상 유동 세포분석 및 후속되는 두 개의 독립적인 실험에서 BDS 채점의 계산을 사용하여 Alexa Fluor® 555-표지된 D56-05 및 Alexa Fluor® 647-표지된 rPA가 동일한 세포 내에서 특이적으로 공동국지화되었는지를 측정하였다. D56-05 및 rPA의 연합 흡수를 가진 대략 11%의 pDC, 7%의 mDC, 5%의 골수 세포 및 <1%의 cDC가 2보다 큰 BDS 점수를 보였고, 그것은 측정 시점에 세포 내에서 Ag와 보조제의 공동국지화를 나타내는 것으로 보인다.
주사 부위 배수 림프절 내에서 GC B 및 T 소포성 헬퍼 (TFH) 세포 반응에 대한 D56-05의 영향을 평가하였다. 이것을 유동 세포분석에 의해 직접 평가하였고, GC B 세포를 B220+/GL7+/PNA+/CD95+ 세포로서 및 TFH 세포를 CD4+/CXCR5+/PD1+ 세포로서 확인하였다. 마우스를 D56-05 또는 D56-01 또는 비히클 대조표준이 있거나/없는 rPA로 발바닥에 1회 면역시켰고, 2주 동안 많은 GC B 또는 TFH 세포를 모니터링하였다. 고비율의 GC B 및 TFH 세포를 5일째에 rPA/ D56-05 면역된 마우스의 배수 림프절에서 검출하였고 14일째에도 상승된 채로 유지되었다. GC B 및 TFH 반응은 비히클-주사된 마우스와 비교하여 rPA로만 면역된 마우스에서 최소였다. 이것들을 함께 고려하면, 이들 데이터는 선천적인 면역력의 유도에 대해 D56-01을 능가하는 D56-05의 증가된 효능이 초기 GC B 및 T 세포 반응에서 반영되는 것을 시사한다.
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
실시예 B6: D56-05는 rPA에 대한 신속하고, 고역가의 독소 중화 항체 반응을 보조하고 생 탄저균 포자로의 치명적인 도전에 대해 원숭이를 보호한다.
포유류 대상체에서 보호성 항원-특이적 항체 반응을 유도하는 D56-05의 능력 (즉 면역원성)을 D56-05 + rPA로 면역된 원숭이들에서 평가하였다. 비교를 위해, 추가의 원숭이 그룹을 D56-01 + rPA 또는 rPA 단독으로 면역화하였다. D56-05로의 1회 또는 2회 면역화 후에 보호를 시험하기 위하여, 원숭이들을 치사량의 탄저병 포자로 도전시키고 생존을 모니터링하였다.
원숭이 면역원성 연구에 대한 생전 과정은 실시예 B5에서 기술하였다. 탄저병 에어로졸 도전 연구를 위해, 원숭이 (Macaca fascicularis)를 Battelle Biomedical Research Center (Columbus, OH)에서 하우징하고, 모든 생전 과정을 그곳에서 수행하였다. 이전에 탄저병에 노출된 적이 없는 25마리의 수컷 및 25마리의 암컷 건강한 원숭이들을 중량에 의해 무작위로 8마리 (4마리 수컷, 4마리 암컷) 또는 6마리 (3마리 수컷, 3마리 암컷)의 그룹으로 나누었다. 동물들을 근육 내 경로에 의해 사두근에 0일 및/또는 29일에 총 1 mL의 DPBS로 10 μg의 rPA를 1000 또는 250 μg의 D56-05와 함께 면역시켰다. 6마리의 비-면역 동물들로 구성된 그룹을 또한 포함시켰다. 혈청 샘플을 연구 중에 수집하여 항체 반응의 발생을 확인하였다. 원숭이들을 69, 70 또는 71일에 에어로졸화된 탄저균 에임즈 (B. anthracis Ames) 포자의 200 x 50% 치사량 (LD50) 동등물의 목적 용량에 노출시켰다. 원숭이들을 3개의 도전일 중 하나로 무작위로 나누었고, 각 그룹으로부터 적어도 두 마리의 원숭이를 각 날에 배정하였다. 동물들을 도전 후 28일 동안 1일에 2회 생존 및 병의 임산 신호에 대해 모니터링하였다. 빈사상태인 것으로 판단된 임의의 동물은 즉시 안락사시켰다. 정성적 균혈증을 62일 이후부터 30 내지 40 ml의 EDTA 전혈을 혈액 아가 플레이트 위에 스트리킹하고 37℃에서 적어도 48시간 동안 인큐베이션함으로써 평가하였다. 탄저균 형태 (g-용혈성, 백색 콜로니, 직경이 4 내지 10 mm이고 거친 외관 및 불규칙한 가장자리를 가짐)와 일치한 임의의 콜로니들을 유발한 샘플을 포지티브로 기록하였다.
독소 중화 분석 (TNA). rPA에 대한 항체 역가의 발달을 시험관 내 독소 중화 분석 (TNA)에 의해 평가하였다. 이 분석은 탄저균 치사 독소 세포독성에 대해 J774.1 세포를 특이적으로 보호하는 rPA에 대한 혈청 항체의 능력을 측정한다. J774.1 쥐과 대식 세포 (아메리칸 타입 컬춰 콜렉션, Manassas, VA)를 연속적으로 희석된 혈청 샘플의 존재 또는 부재하에 PA 및 치사 인자 (LF; List Biological Laboratories, Campbell, CA)에 노출시켰다. 생존력을 MTT (3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸리움 브로마이드)의 첨가에 의해 평가하였다. 역가를 중화 곡선의 4-매개변수 로지스틱 로그 핏의 변곡점에 상응하는, 독소-중재된 세포독성의 50% 중화 (ED50)를 초래하는 혈청 샘플의 희석률의 역수로서 계산하였다. TNA 결과를 시험 샘플의 ED50 및 기준 표준의 ED50의 지수 (quotient)로서 기록한다 (NF50). 분석 종점을 SoftMaxPro 버전 4.7.1(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)을 사용하여 계산하였다. TNA 분석을 Battelle에서 수행하였던 도전에 비해 -1, +1, +3, +5, +7, +14, +21 및 +28일로부터 발생한 혈청에 대한 것을 제외하고 다이나박스 테크놀로지스에 의해 수행하였고, NF50 값은 인간 기준 표준 AVR801을 사용하여 계산하였다. 분석 종점을 SAS (JMP, Cary, NC)를 사용하여 계산하였다. 데이터 획득 및 분석을 SoftMaxPro 버전 5.0.1을 사용하는 SpectraMax 190 또는 Versa-Max (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 또는 SAS (SAS Institute, Cary, NC)에 의해 수행하였다. 정량의 하한선 (LLOQ)은 100이었다. 검출할 수 없는 값을 초래하는 샘플을 LLOQ의 절반과 동등한 값으로 배정하였다.
항-rPA IgG 정량. 플레이트 (96 웰)를 rPA로 코팅하고 밤새 인큐베이션하였다. 적절하게 연속적으로 희석된 표준 및 시험 혈청을 이중으로 분석하였다. HRP-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG (SouthernBiotech, Birmingham, AL)를 검출에 사용하였고, 색을 3,3',3,3'-테트라메틸벤지딘 마이크로웰 페록시다제 기질 시스템 (KPL, Gaithersburg, MD)으로 현상시켰다. 역가를 4-매개변수 로지스틱 로그 핏 곡선의 변곡점에 상응하는, 희석률의 역수로서 계산하였다 (ED50). 그 결과를 시험 샘플의 ED50 및 기준 표준의 ED50의 지수로서 기록한다 (NF50). 데이터 획득 및 분석을 SoftMaxPro v5.0.1 소프트웨어를 사용하는 SpectraMax 190 또는 VersaMax (Molecular Devices)에 의해 수행하였다.
결과. 표 B6-1 및 도 15a는 면역원성 연구 데이터, 구체적으로 rPA 단독, rPA+D56-05, 또는 rPA+D56-01의 1회 주사 후 2주 후의 원숭이 혈청에서 유도된 TNA 역가를 보여준다 (개별적인 역가, 기하학적 평균 및 95% 신뢰도 간격). 두 개의 최고 용량의 D56-05가, D56-01 첨가에 의한 유의미하지 않은 증가와 비교하여, rPA가 단독으로 제공된 동물에서보다 유의미하게 더 높은 평균 TNA 역가를 유도하였다. 최고 용량의 D56-05에서, rPA 단독과 비교한 TNA 역가의 계산된 31-배 증가는, rPA 단독 동물에서의 역가가 모두 TNA 분석에 대한 검출 수준보다 아래에 있었기 때문에, 보조제 효능의 과소평가인 것으로 보인다. 추가로, 250 내지 1000 mg의 D56-05를 받은 모든 동물 (11마리 중 11마리)은 혈청검사 양성이었던 반면, 250 내지 1000 mg의 D56-01로 면역화된 11마리 동물 중 5마리는 LLOQ보다 아래였다. 이들 데이터는 rPA + D56-05 및 rPA + D56-01이 둘 다 rPA 단독으로의 면역화에 비교하여 신속하고 강력한 독소 중화 항체의 역가를 유도하였지만, TNA 역가는 D56-05의 동등한 CC 양으로 면역화된 원숭이들에서 가장 높았음을 나타낸다.
마찬가지로, 14일째의 총 항-rPA IgG의 역가는 rPA/D56-05로의 면역화 후에 유의미하게 증가하였고 (도 15b) TNA 결과와 유의미하게 상관돠었다 (도 15c). 28일째에 제2 면역화 후에, TNA 반응의 >15-배 추가증가가 모든 그룹에서 분명하였고 역가는 적어도 18주 동안 상승된 채로 유지되었다. 제2 면역화 후 약 5 개월 후 항원성 도전에 대한 기억 반응을 또한 이들 동물에서 평가하였다. 적어도 15-배의 TNA 역가의 추가의 증가 (도 15d)는 신속하고, 왕성한 반응을 증명하였고, 그것은 강력하게 보호적인 면역력을 나타낸다.
보호를 직접적으로 평가하기 위하여, 사이노몰구스 마카크 원숭이들을 rPA 플러스 D56-05로 근육 내로 1회 (29일) 또는 2회 (0일 및 29일) 면역화하였고 70 ±1일에 에어로졸화된 탄저균 포자의 200 LD50 동등물의 목적 용량으로 도전하였다. 생존, 균혈증 및 임상적 질환의 증상을 도전 후 28일 동안 모니터링하고 TNAS 역가의 측정을 위해 도전 전과 후에 혈청 샘플을 수집하였다. 도 16a는 rPA + D56-05로 1회 또는 2회 면역화된 후 에어로졸화된 생 탄저병 포자로 도전된 원숭이들에 대한 Kaplan-Meier 생존 분석 결과를 나타낸다. 탄저병 도전으로부터의 완전한 보호는 1000 mg의 D56-05와 함께 rPA의 1회 백신접종 또는 250 또는 1000 mg의 D56-05로의 2회 백신접종을 받은 모든 원숭이에서 이루어졌던 반면, 백신접종되지 않은 모든 동물은 도전 후 9일 이내에 질환으로 쓰러졌다. 이들 데이터는 분명하게 rPA+D56-05로의 1회 면역화가 치사 도전으로부터 원숭이를 100% 보호하는 것을 나타낸다. 2회 면역화된 동물들 또한 보호되었다.
나아가, rPA/D56-05로 백신접종된은 동물들은 어느 것도 도전 후 임의의 시점에서 균혈증 또는 임상적 증상을 보이지 않았다. 도전 후에, 모든 동물은 TNA 역가의 신속한 증가를 유발하였는데, 그것은 강력한 기억 반응을 나타낸다. 기억 반응은 1회의 rPA/D56-05 면역화를 받은 원숭이들에서 현저하였고, 감염성 도전 후 7일 이내에 2회-면역화된 동물들에 비교할만한 수준으로 빠르게 상승하였다 (도 16b). 이것들을 함께 고려하면, 이들 데이터는 rPA 플러스 1000 mg의 D56-05의 1회 면역화가 현저한 기억 반응에 대해 동물을 대비시키고 에어로졸화된 탄저균 포자로의 치사 도전에 대해 보호를 제공하는 것을 증명한다.
비록 탄저병 노출에 대하여 신속한, 1회-주사 보호가 충족되지 않은 요구를 나타내긴 하지만, D56-05의 강력한 보조제 활성은 2회-주사 예방 양생법이 실행 가능한 상황에서 실질적으로 감소된 용량이 효과적일 수 있음을 시사하였다. 그러므로, 별도의 실험으로, 0 및 28일에 1000, 50, 20 또는 5 mg의 rPA 및 D56-05로 면역화된 원숭이들에서 TNA 반응을 모니터링하였다. 시험한 최저 용량인 5 mg의 D56-05로도 1000보다 큰 TNA 역가가 2회-면역화 양생법에서 유도되었고, 추가로 Ag 단독 주사 (박테리아 포자 노출에 대한 대용물로서 사용됨)에 의해 10,000보다 크게 부스팅되었다 (도 16c). 그러므로, 2회 면역화 양생법의 맥락에서, 데이터는 원숭이에서 1회-면역화 양생법으로 보호적인 것으로 증명된 D56-05 용량의 1/200을 사용한 보호 능력을 시사한다.
D56-05 나노입자 제형에 의한 개선된 보조제 활성을 또한 마우스에서 평가하였다. 실제로, rPA/D56-05는 마우스에서 제1 및 제2 면역화 후에 모두 유의미하게 더 높은 TNA 역가를 유도하였고, 그것은 D56-05 작용 메커니즘을 연구조사하는 연구에 대해 종의 관련성을 증명한다 (도 17a-b).
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Figure pct00078
실시예 B7: 동등한 용량에서, 나노입자 제형 D56-05는 유리 선형 키메라 화합물 D56-01과 비교하여 마우스에서 안전성 장점을 증명한다.
생체 내에서 CC 서열의 안전성/내성에 대한 나노입자 제형의 효과를 시험하기 위하여, 마우스들에 근육 내 경로에 의해 반복된 고용량의 D56-05 및 D56-01 주사를 투여하였다. 독성을 평가하기 위한 종으로서, 마우스는 마우스에서의 TLR9 발현의 보다 광범위한 세포 분포로 인해, 영장류에 비교하여 CpG ODN-함유 뉴클레오티드에 대하여 과장된 약물학적 반응을 보인다. 본 발명자들은 100 μg (D56-01 무게를 기준으로)의 D56-05 또는 D56-01을 받은 마우스에서 총 4회 주사에 대해 매 2주마다 혈청 사이토카인 반응을 측정하고 체중의 변화를 모니터링하여 CC의 유리 및 나노입자 버전의 상대적인 안전성을 평가하였다.
암컷 BALB/c 마우스들 (생후 6 내지 10주)을 Charles River로부터 구입하고 Murigenics (Vallejo, CA)에서 하우징하였고, 그곳에서 모든 생전 과정을 수행하였다. 5마리씩의 그룹에 100 μg의 D56-05 또는 D56-01을 1회, 2주 간격으로 2회, 3회 또는 4회 투여하였다. 선택 그룹을 각 주사 후 2시간 후에 희생시켰다. 대조를 위해, 주사를 받지 않은 한 그룹과 다른 그룹에 비히클 (식염수, 50 μL) 주사를 투여하였다. 이들 두 그룹을 4회 주사 후 18시간 후에 희생시켰다. 혈청을 희생시 심장 천공에 의해 수득하였다. 희생시 비장, 간 및 신장을 수득하고 무게를 측정하였다. 마우스들을 연구기간 내내 주 2회 체중을 측정하였다.
ELISA. 혈청 샘플 중의 사이토카인 수준을 실시예 B1에서 기술한 바와 같이 상업적으로 입수 가능한 항체 쌍을 사용하여 측정하였다. 마우스 IL-6 및 IL-12p40의 검출을 위한 항체 쌍은 BD Biosciences (San Jose, CA)로부터 공급되었다. 마우스 IP-10, MCP-1 및 TNF-α의 검출을 위한 시약은 R&D Systems (Minneapolis, MN)로부터 공급되었다. 이들 분석에 대한 검출 한계는 약 20 pg/mL 내지 약 150 pg/mL의 범위였다. 데이터 획득 및 분석을 SoftMaxPro v5.0.1 소프트웨어를 사용하는 SpectraMax 190 또는 VersaMax (Molecular Devices)에 의해 수행하였다.
효소-결합 혼성화 분석 또는 혼성화 분석에 의한 D56-05 또는 D56-01 조직 정량. 개별적인 동물의 조직당 비장, 간, 신장 또는 주사 부위 근육, 25 내지 50 mg, 및 개별적인 동물당 모아진 배수 림프절을 20 mM Tris (pH 8), 20 mM EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 100 mM 염화 나트륨, 0.2% SDS (Teknova, Hollister, CA)에서 TissueLyser II (Qiagen)를 사용하여 균등화하고, 그것에 대해 프로테이나제 K (New England BioLabs, Ipswitch, MA) 소화를 50℃에서 6 내지 20시간 동안 1.2 U/mg 조직에서 수행하였다. Nunc 고정화기 아미노 플레이트를 밤새 4℃에서 30 ng/ml의 포착 프로브 (D56-01 정량을 위해 SEQ ID NO:18로서 제시한 5'-GCGCCGAGAA CGTTGCGCCG A-3'; 및 D56-05 정량을 위해 SEQ ID NO:19로서 제시한 5'-AGCCGCGTTG CAAGAGAAGC GATGCGCGGC TCG-3')로 0.1 M 인산 나트륨 (Teknova) 중에서 코팅하였다. D56-05의 정량을 위해, 0.6 mg/ml 검출 프로브 (SEQ ID NO:18로서 제시된 5'-GCGCCGAGAA CGTTGCGCCG A-3')와 동일 부피로 혼합된 균등화된 샘플을 75분 동안 52℃에서 인큐베이션하였다. D56-01의 정량을 위해, SSC 플러스 2% N-라우로일사르코신 나트륨 염 완충액과 동일 부피로 혼합된 균등화된 샘플을 2시간 동안 45℃에서 인큐베이션하고 30분 동안 실온으로 냉각되도록 허용하였다. 포획된 D56-01의 상보하는 39개 단부의 합성은 1.25 U의 클레노우 단편 (New England BioLabs)에 의해 0.5 mM의 비오티닐화된 dUTP 및 50 mM의 dNTP (New England BioLabs)의 존재하에 촉매되었다. HRP-콘쥬게이트된 스트렙트아비딘 (Thermo Scientific, Waltham, MA)을 보조제 검출을 위해 사용하였고, 색을 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 마이크로웰 페록시다제 기질 시스템 (KPL)로 현상시켰다. 보조제는 표준으로서 작용하였다. LLOQ는 D56-05 및 D56-01에 대해 각각 6.24 및 7.62 ng/g 조직이었다. 모든 데이터 획득 및 분석을 SoftMaxPro v5.0.1 소프트웨어를 사용하는 SpectraMax 190 또는 VersaMax (Molecular Devices)에 의해 수행하였다.
결과. D56-05 및 단량체 D56-01이 근육 내 주사 후 차등적인 조직 분포 동역학을 나타냈는지를 시험하기 위하여, 마우스들을 D56-05 또는 D56-01로 주사하고 주사 부위에서 및 배수 림프절뿐만 아니라 원위 부위 (비장, 간 및 신장)에서의 보조제의 수준을 측정하였다. 마우스들은 회수를 용이하게 하기 위하여 고용량 (100 μg)의 어느 하나의 보조제를 받았고, 조직을 주사후 1일 후에 수득하였다. D56-05 및 D56-01을 상기 기술한 것과 같이 혼성화 분석에 의해 정량하였다. D56-05는 주사 부위 근육 및 림프절 (오금, 서혜부, 좌골, 요추 및 천골)에 농축된 반면, D56-01은 빠르게 전신적으로 분포되었다 (도 18). D56-01을 주사 부위 및 림프절에서 최소 수준으로 검출하였고, 대신 비장, 간 및 신장에서 농축되었다. 이들 데이터는 나노입자 및 단량체 D56-01이 주사 후 24시간 이내에 상이하게 분포하는 것을 가리키며, 그것은 D56-05의 우선적인 국지적 보유가 그것의 보조제로서의 증가된 효능에 기여할 수 있음을 시사한다.
CpG-ODN 투여 후에 마우스에서 통상적으로 관찰된 모든 전신성 독성은 D56-01과 비교하여 D56-05로 주사된 동물에서 크게 감소하였다. 표 B7-1은 D56-05 또는 D56-01의 제1 용량의 투여 후 2시간 후 마우스들에서의 혈청 사이토카인 수준을 나타낸다. 염증성 사이토카인 IL-6, IL-12p40, IP-10, MCP-1 및 TNF-α가 모두 D56-01 주사 후 2시한 후에 혈액에서 고수준으로 유도되었지만 D56-05에 대한 반응에서는 그렇지 않았다.
추가로, D56-05-주사된 마우스에서 지연된 전신성 효과의 증거는 거의 없었다. D56-05의 격주로 4회 주사 후 희생된 마우스들은 샴-주사된 마우스들과 유사한 비장 및 간 무게를 보였다. D56-05가 아닌, D56-01이 투여된 마우스들은 2회 주사 후 뚜렷한 비장 비대증 및 간 비대증을 나타냈고, 그것은 3회 및 4회 주사 후 더 현저해졌다. 이 데이터는 표 B7-2에서 요약한다. 신장 무게에는 영향이 없었다. D56-05-주사된 마우스들에서 조직병리학적 변화는 최소한이었던 반면, 반복된 D56-01 주사는 시누소이드의 세포의 침윤, 간세포 변경 및 미약한/중간의 간 괴사를 포함하여, 증가된 비장의 골수외 조혈 활성 및 간세포 변화를 초래하였다.
도 19는 D56-05 및 D56-01을 받은 마우스들에 대해 연구 동안의 그룹-평균화된 체중을 보여준다. 격주로 D56-01 주사가 격주로 투여된 동물들에서 발생한, TNF-알파-의존적이고, 설치류에 특이적인 CpG-유도된 독물학적 사건인 체중 손실이 표시되었다. 대조적으로, 체중은 고용량의 D56-05의 주사가 격주로 투여된 마우스들에 대해서 대조표준의 체중보다 단지 약간 더 낮았다. 이 데이터는 D56-01이 투여된 마우스들에서 비장 비대증 및 간 비대증으로 인한 추가의 체중 효과를 제거하기 위하여 조정되었고 전체 체중이 연속적인 고용량의 D56-01의 투여로 감소하지만 D56-05로는 그렇지 않다는 것을 증명한다. 함께, 이들 데이터는 유리 CC D56-01을 넘는 나노입자-제형된 D56-05의 뚜렷한 안전성 장점을 보여준다. 유리 CC와는 달리, 나노입자 제형은 반복된 고용량 주사 후에도 염증성 혈청 사이토카인 반응, 인지할만한 기관비대증 또는 극적인 체중 감소를 유도하지 않는다. 그러므로, 단량체 D56-01을 뛰어넘는 D56-05 나노입자의 개선된 보조제 활성은 감소된 전신성 독성 신호가 수반된다.
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실시예 B8: D56-05의 종양-내 투여는 림프종 세포주 EG7-OVA 종양을 가진 마우스에서 종양 성장을 억제한다.
암 면역요법의 모델 (Moore et al., Cell, 54:777, 1998)에서 D56-05의 적용을 시험하기 위하여, 림프종 세포주 EG7 1 OVA를 사용하여 수립된 종양의 성장에 미치는 D56-05 또는 대조 비-CpG-함유 올리고 뉴클레오티드 (D56-30)의 종양 내 주사의 효과를 평가하였다.
암컷 C57BL/6 마우스들 (생후 6 내지 10주)을 Harlan으로부터 구입하고 Murigenics (Vallejo, CA)에서 하우징하였으며 그곳에서 생전 과정을 수행하였다. 1x10*6 EG-7 세포 (아메리칸 타입 컬춰 콜렉션, Manassas, VA)를 C57BL/6 마우스의 양 옆구리에 피하로 주사하였다. 0일 (세포 이식 후 4일)에 연구를 시작하여 마우스들 (N=5/그룹)에게 150 μL의 부피의 PBS에 넣은 50 μg의 D56-05 또는 대조 비-CpG-함유 올리고 뉴클레오티드 (D56-30)를 수립된 종양 덩어리 안으로 주사로 투여하였다. 주사를 0, 3 및 7일에 투여하였다. 동물을 관찰하였고 종양 크기 (부피)를 측정하였다.
종양 부피 데이터를 도 20에 나타낸다. 데이터는 종양 내 경로에 의해 투여된 D56-05가 이 쥐과 종양 모델에서 종양 부피 증가를 억제하였음을 증명한다.
실시예 B9: 상이한 D56-01:FICOLL 몰 비율 (x)을 가지는 D56-05 ([(D56-01)-PEG 6 ] x -FICOLL로도 알려짐) 콘쥬게이트의 시험관 내 효능 평가.
D56-05 ([(D56-01)-PEG6]x-FICOLL로도 알려짐) 콘쥬게이트의 D56-01:FICOLL 몰 비율 (x)을 다르게 했을 때 생물학적 반응의 효능에 미치는 효과를 시험관 내 분석에 의해 평가하였다. 인간 B 세포에서의 시험관 내 효능을 실시예 B1에서 상이한 D56-01:FICOLL 몰 비율 (x)을 가지는 D56-05 콘쥬게이트에 대해 기술한 것과 같이 측정하였다: D56-05 x = 24, D56-05 x = 53, D56-05 x = 82, D56-05 x = 124 및 D56-05 x = 154. 인간 B 세포 IL-6 분석에 대한 결과를 표 B9-1에 나타낸다. 상이한 56-01:FICOLL 몰 비율 (x)을 가지는 D56-05의 합성에 대해서는 실시예 S12를 참조한다.
이들 데이터는 더 높은 D56-01: FICOLL 몰 비율 (x)을 가지는 D56-05 콘쥬게이트가 D56-05와 비교하여 인간 IL-6 분석에서 유사한 효능을 나타냈음을 보여준다.
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Figure pct00082
ND = 측정되지 않음; x가 140인 D56-05는 파일럿 로트 2이고 이 실험에서 포지티브 대조표주으로서 사용되었다.
실시예 B10: n이 6, 24, 45 및 70인 SM-PEG n 을 사용하여 제조된 D56-05, D56-25, D56-26 및 D56-27 ([(D56-01)-PEG n ] x -FICOLL로도 알려짐)의 시험관 내 효능 평가.
[(D56-01)-PEGn]x-FICOLL에서 링커 분자의 길이 (n)를 다르게 했을 때의 효과를 시험관 내 생물학적 반응의 효능을 측정함으로써 시험하였다. 인간 pDC-풍부화 PBMC 및 B 세포의 시험관 내 효능을, 실시예 S3 및 실시예 S13에서 기술한 것과 같이, n이 각각 6, 24, 45 및 70인 SM-PEGn을 사용하여 제조된 [(D56-01)-PEGn]x-FICOLL 콘쥬게이트, D56-05, D56-25, D56-26 및 D56-27에 대해 실시예 B1에서 기술한 것과 같이 측정하였다. 인간 pDC-풍부화 PBMC IFN-α 분석 및 인간 B 세포 IL-6 분석에 대한 결과를 표 B10-1 및 표 B10-2에 각각 나타낸다. 더 긴 PEG 링커를 가진 [(D56-01)-PEGn]x-FICOLL 콘쥬게이트가 IFN-α 분석에서 약간 증가된 효능 및 IL-6 분석에서 약간 감소된 효능을 나타냈다.
Figure pct00083
a 파일럿 로트 4.
Figure pct00084
a 파일럿 로트 4.
SEQUENCE LISTING <110> OTT, Gary S. MILLEY, Robert J. COFFMAN, Robert L. KIWAN, Radwan KANZLER, Holger <120> BRANCHED AND LINEAR CHIMERIC COMPOUNDS, POLYNUCLEOTIDES, USES AND METHODS FOR PREPARATION THEREOF <130> 377882005640 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/107,291 <151> 2015-01-23 <160> 19 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 tcggcgcaac gttctcggcg c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <221> misc_feature <222> (7)...(8) <223> positions 7 and 8 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <221> misc_feature <222> (14)...(15) <223> positions 14 and 15 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <400> 2 tcggcgcaac gttctcggcg c 21 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 tcggcgcaac gttc 14 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <221> misc_feature <222> (7)...(8) <223> positions 7 and 8 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <400> 4 tcggcgcaac gttc 14 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 tgactgtgaa ccttagagat ga 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 tgactgtgaa cgttcgagat ga 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <221> misc_feature <222> (7)...(8) <223> positions 7 and 8 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <221> misc_feature <222> (14)...(15) <223> positions 14 and 15 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <400> 7 tcgtcgaacg ttcgagatga t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <221> misc_feature <222> (7)...(8) <223> positions 7 and 8 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <221> misc_feature <222> (14)...(15) <223> positions 14 and 15 are linked by a hexa-(ethylene glycol) moiety <400> 8 tcgacgttcg acgtaacgtt c 21 <210> 9 <211> 21 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Claims (43)

  1. 식 (I)의 분지형 키메라 화합물:
    [D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I)
    식에서:
    D는 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물이고;
    L1은 알킬티오기를 포함하는 제1 링커이며;
    L2는 석신이미드기를 포함하는 제2 링커이고;
    L3은 아미드기를 포함하는 제3 링커이며;
    PEG는 식 -(OCH2CH2)n-의 것으로, n은 2 내지 80의 정수이고;
    x는 3 내지 300의 정수이며;
    F는 약 100,000 내지 약 700,000 달톤의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이고 에테르기를 통해 L3에 연결되며,
    D의 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열: 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하고, 이때 폴리뉴클레오티드는 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드들 사이 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이고; 및
    D의 선형 키메라 화합물은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)와 같이 세 개의 핵산 모이어티와 두 개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하며, 선형 키메라 화합물은 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유하고, 뉴클레오티드들 사이, 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이다.
  2. 제1 항에 있어서, L2는
    Figure pct00085
    인 것을 특징으로 하는 분지형 키메라 화합물.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, L3은
    Figure pct00086
    인 것을 특징으로 하는 분지형 키메라 화합물.
  4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 식 -(OCH2CH2)n-의 n이 6, 24, 45 또는 70인 것을 특징으로 하는 분지형 키메라 화합물.
  5. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, F는 약 300,000 내지 약 500,000 달톤의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 분지형 키메라 화합물.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, D는 뉴클레오티드 서열 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)로 구성되는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 분지형 키메라 화합물.
  7. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, D는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)로 구성되는 선형 키메라 화합물인 것을 특징으로 하는 분지형 키메라 화합물.
  8. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, L1은 -(CH2)m-S-이고, m은 2 내지 9의 정수인 것을 특징으로 하는 분지형 키메라 화합물.
  9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, x는 20 내지 200인 것을 특징으로 하는 분지형 키메라 화합물.
  10. 제9 항에 있어서, x는 90 내지 150이고, n은 6이며 m은 3 또는 6인 것을 특징으로 하는 분지형 키메라 화합물.
  11. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드들 사이의 모든 결합, 존재하는 경우 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 결합들 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합인 것을 특징으로 하는 분지형 키메라 화합물.
  12. 뉴클레오티드 서열 5'-TCGGCGC AACGTTC-3' (SEQ ID NO:3)을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 폴리뉴클레오티드는 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합인 폴리뉴클레오티드.
  13. 뉴클레오티드 서열 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 폴리뉴클레오티드는 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드들 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합인 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  15. 제12 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  16. 제12 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 제12 항 내지 제16 항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3' (SEQ ID NO:4)와 같이 두 개의 핵산 모이어티 및 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하는 선형 키메라 화합물로서, 선형 키메라 화합물은 50개보다 적은 뉴클레오티드를 함유하고, 뉴클레오티드들 사이 및 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합인 선형 키메라 화합물.
  19. 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)와 같이 세 개의 핵산 모이어티 및 두 개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하는 선형 키메라 화합물로서, 선형 키메라 화합물은 50개보다 적은 뉴클레오티드를 함유하고, 뉴클레오티드들 사이 및 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합인 선형 키메라 화합물.
  20. 제19 항에 있어서, 선형 키메라 화합물은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)로 구성되는 것을 특징으로 하는 선형 키메라 화합물.
  21. 제18 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 모이어티는 2'-데옥시리보폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 선형 키메라 화합물.
  22. 제18 항 내지 제21 항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합인 것을 특징으로 하는 선형 키메라 화합물.
  23. (i) 제약학적으로 허용되는 부형제, 및 (ii) 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항의 분지형 키메라 화합물, 제12 항 내지 제17 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 및 제18 항 내지 제22 항 중 어느 한 항의 선형 키메라 화합물로 구성되는 군의 하나를 포함하는 제약학적 조성물.
  24. 제23 항에 있어서, 분지형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드 및 선형 키메라 화합물은 각각:
    인간 말초혈 단핵 세포에 의해 IFN-알파의 생성을 자극하기;
    인간 B 림프구에 의해 IL-6의 생성을 자극하기;
    마우스 비장 세포에 의해 IL-12p40 및 IL-6 중 하나 또는 둘 다의 생성을 자극하기로 구성되는 군 중 하나 이상을 포함하는, 포유류 백혈구에 의한 사이토킨 생성을 자극할 수 있는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  25. 제23 항 또는 제24 항에 있어서, 분지형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드 및 선형 키메라 화합물은 각각 포유류 B 림프구의 증식을 자극할 수 있는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  26. 제23 항 내지 제25 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 멸균 용액인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  27. 제23 항 내지 제26 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 분지형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드 및 선형 키메라 화합물에 공유적으로 결합되지 않은 항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  28. 제27 항에 있어서, 항원은 미생물 항원, 알레르기 유발 항원 또는 종양 항원인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  29. 제23 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 본질적으로 내독소가 없는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  30. 제23 항 내지 제29 항 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 면역 반응을 자극하기에 충분한 양으로 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  31. 제30 항에 있어서, 면역 반응을 자극하는 것은
    IFN-알파 생성을 자극하기;
    IL-6 생성을 자극하기;
    B 림프구 증식을 자극하기;
    인터페론 경로-관련 유전자 발현을 자극하기;
    화학유인물질-관련 유전자 발현을 자극하기; 및
    형질 세포양 수지상 세포 (pDC) 성숙을 자극하기
    로 구성되는 군 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제30 항 또는 제31 항에 있어서, 제약학적 조성물은 항원을 더 포함하고, 면역 반응을 자극하는 것은 항원-특이적 항체 반응을 유도하는 것을 포함하며, 항원-특이적 항체 반응의 역가는 항원이 분지형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물없이 투여될 때보다 항원이 분지형 키메라 화합물, 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물과 함께 투여될 때 더 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제27 항 내지 제29 항 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 항원-특이적 항체 반응을 유도하기에 충분한 양으로 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 항원-특이적 항체 반응을 유도하는 방법.
  34. 제23 항 내지 제29 항 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 감염성 질환을 예방하기에 충분한 양으로 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 감염성 질환을 예방하는 방법.
  35. 제23 항 내지 제29 항 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 감염성 질환의 증상을 개선하기에 충분한 양으로 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 감염성 질환의 증상을 개선하는 방법.
  36. 제23 항 내지 제29 항 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 IgE-관련 장애의 증상을 개선하기에 충분한 양으로 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 IgE-관련 장애의 증상을 개선하는 방법.
  37. 제23 항 내지 제29 항 중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 포유류 대상체에서 암을 치료하기에 충분한 양으로 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  38. 제37 항에 있어서, 암을 치료하는 것은 고체 종양의 크기를 수축시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 식 (I)의 분지형 키메라 화합물의 제조 방법으로서:
    [D-L1-L2-(PEG)-L3]x-F (I),
    식에서:
    D는 폴리뉴클레오티드 또는 선형 키메라 화합물이고;
    L1은 알킬티오기를 포함하는 제1 링커이며;
    L2는 석신이미드기를 포함하는 제2 링커이고;
    L3은 아미드기를 포함하는 제3 링커이며;
    PEG는 폴리에틸렌 글리콜이고;
    x는 3 내지 300의 정수이며;
    F는 약 100,000 내지 약 700,000 달톤의 분자량을 가지는 수크로오스와 에피클로로히드린의 분지형 공중합체이고 에테르기를 통해 L3에 연결되며,
    폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열: 5'-TCGGCGC AACGTTC TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:1)을 포함하고, 이때 폴리뉴클레오티드는 길이가 50개 미만의 뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드들 사이 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이고, 및
    선형 키메라 화합물은 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)와 같이 세 개의 핵산 모이어티와 두 개의 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 스페이서를 포함하며, 선형 키메라 화합물은 50개 미만의 뉴클레오티드를 함유하고, 뉴클레오티드들 사이, 뉴클레오티드와 HEG 스페이서 사이 및 3'-말단 뉴클레오티드와 L1 사이의 하나 이상의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르 결합이며,
    방법은
    식 D-L1a-SH의 화합물 (식에서 D는 식 (I)에 대해 정의된 것과 같고 L1a는 (CH2)m이며, 여기서 m은 2 내지 9의 정수임)을 식 (II)의 화합물:
    [L2a-(PEG)-L3]y-F (II)
    (식에서
    L3, PEG 및 F는 식 (I)에 대해 정의된 것과 같고;
    L2a는
    Figure pct00087
    이며; 및
    y는 3 내지 350의 정수이다)과 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
  40. 제39 항에 있어서, 식 D-L1a-SS-L1a-OH의 화합물을 환원제와 반응시켜서 식 D-L1a-SH의 화합물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제39 항 또는 제40 항에 있어서, 식 (III)의 화합물:
    [NH2CH2CH2NHC(O)CH2]z-F (III) (식에서 F는 식 (I)에 대해 정의된 것과 같고 z는 3 내지 400의 정수임)을 식 L2a-(PEG)-L3a-Lv의 화합물 (식에서 L2a 및 PEG는 식 (II)에 대해 정의된 것과 같고; L3a는 NHC(O)CH2CH2C(O)- 또는 -C(O)-이며; Lv는 이탈기임)과 반응시켜서 식 (II)의 화합물을 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제41 항에 있어서, Lv는 (2,5-다이옥소피롤리딘-1-일)옥시인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제39 항 내지 제42 항 중 어느 한 항에 있어서, D는 5'-TCGGCGC-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGGCGC-3' (SEQ ID NO:2)인 것을 특징으로 하는 방법.
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