CN107557482A - 一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼的分子生物学方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼的分子生物学方法，其具体技术方案为：提取南、北疆分布的新疆裸重唇鱼基因组DNA；利用PCR反应扩增新疆裸重唇鱼基因组中Tc1类转座子；构建新疆裸重唇鱼DNA电泳模式图；鉴定南、北疆分布的新疆裸重唇鱼。上述PCR反应引物序列为：5′‑TAC AGT TGA AGT CGG AAG TTT ACA TAC‑3′。有益效果为：本发明采用Tc1类转座子单引物对新疆裸重唇鱼进行扩增鉴别的方法，从基因特征上区别南、北疆不同水系分布的地理种群，为该物种的鉴定提供可靠依据，也为增殖放流亲本来源和苗种质量起到技术保障。

Description

一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼的分子生物学 方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼的分子生物学方法。

背景技术

新疆裸重唇鱼（Gymnodiptychus dybowskii），俗称裸黄瓜鱼，隶属鲤形目（Cypriniformes）、鲤科（Cyprinidae）、裂腹鱼亚科（Schizothoracinae）、裸重唇鱼属（Gymnodiptychus）。主要分布于我国伊犁河流域、天山北坡准噶尔盆地诸水域，南疆开都河，以及中亚地区锡尔河、巴尔喀什湖支流上游、伊塞克湖等。新疆裸重唇鱼作为伊犁河水系具有代表性的土著种和生态敏感种，近年来由于受到掠夺式捕捞、水利水电工程修建以及生态污染等因素的影响，野生种群资源遭到严重破坏，2004年已被新疆维吾尔自治区人民政府列为Ⅰ类水生野生保护动物。近年来，随着国家水生生物资源养护行动的实施，当地渔政部门陆续在伊犁河流域开展新疆裸重唇鱼的增殖放流活动，为了有效的防止不同水系间新疆裸重唇鱼种质混杂和性状衰退，在形态学鉴别的基础上，有必要采用分子生物学手段开展不同水系新疆裸重唇鱼野生种群的鉴别，以保证放流苗种亲本来源的可靠性。

转座子（Transposon）又称为跳跃基因、易位子，是在原核生物和真核生物基因组中广泛存在的，可自主复制和移动的一段DNA序列。是导致基因组遗传不稳定性的主要内在因素之一，也是构成生物体生长、发育和遗传的重要调节因子。Tc1-Mariner超家族是真核生物基因组中分布最广泛的DNA转座子（DNA Transposon）家族之一。Tc1-like转座子是该超家族中的一类，Tc1最初是作为引起线虫多态性的一个重复序列而被发现，也是线虫基因组中首次被鉴定的DNA转座子，与Tc1具有相似结构的转座子统称Tc1类转座子（Tc1-likeelements，TLEs），该转座子在硬骨鱼类基因组中占有较高的比例。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼的分子生物学方法，该方法采用Tc1类转座子单引物对新疆裸重唇鱼进行扩增鉴别的方法，从基因特征上区别南、北疆不同水系分布的地理种群，为该物种的鉴定提供可靠依据，也为增殖放流亲本来源和苗种质量起到技术保障。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼的分子生物学方法，其具体技术方案为：

提取南、北疆分布的新疆裸重唇鱼基因组DNA；

利用PCR反应扩增新疆裸重唇鱼基因组中Tc1类转座子；

对扩增产物用进行电泳分离，染色，构建新疆裸重唇鱼DNA电泳模式图；

鉴定南、北疆分布的新疆裸重唇鱼。

作为优选，PCR反应引物序列为：5′-TAC AGT TGA AGT CGG AAG TTT ACA TAC-3′。

作为优选，PCR反应总体系为：其中10×buffer 2.5μL，Mg²⁺终浓度为2.0mM，dNTP（2.5mM）2μL，Taq聚合酶1units，引物（10μM）各1μL，新疆裸重唇鱼基因组DNA 1μL（0.5μg），加灭菌水至终体积25μL。

作为优选，PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后是30个循环，每个循环包括94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。

作为优选，电泳分离步骤为：称量0.7g琼脂糖加入70 mL 1×TAE缓冲液的锥形瓶中，微波炉加热煮沸，使琼脂粉完全溶解，待凝胶液稍凉至50-60℃，加入7μL核酸染料Gelview，轻轻摇匀后将胶缓缓倒入胶槽内，此过程中应避免产生气泡，待琼脂糖凝胶完全凝固后竖直拔掉梳子，清除碎胶并将胶槽放入电泳槽内，将电泳缓冲液加入电泳槽中，直至没过凝胶面0.5cm，将2.5μL PCR产物与0.5μL 6×DNA loading buffer混合后依次加入点样孔，并点上6μL 100bp DNA Marker（片段大小为：2000bp，1600bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp），接通电泳槽和电泳仪的电源后开始电泳，电泳电压设定为120V，电流400mA，时间25min；电泳完毕通过凝胶成像系统照相，调节光圈和曝光时间，选择合适的滤光片，得到成像清晰、背景较低的照片。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明分子生物学方法采用Tc1类转座子单引物对新疆裸重唇鱼进行扩增鉴别的方法，从基因特征上区别南、北疆不同水系分布的地理种群，为该物种的鉴定提供可靠依据；本发明具有准确、迅速、便捷的特点，相比传统的形态特征鉴定方法，既可节省时间又可减少费用；鉴别方法对使用的仪器设备要求较低，比传统的形态学鉴别更准确可靠，同时比片段分离的多态性分析法更为准确实用；鉴别方法从根本上解决了当前南、北疆分布的新疆裸重唇鱼较难进行准确鉴定的难题，填补了行业空白，为增殖放流亲本来源和苗种质量起到技术保障，具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼的分子生物学方法，其具体技术方案为：

提取南、北疆分布的新疆裸重唇鱼基因组DNA；利用PCR反应扩增新疆裸重唇鱼基因组中Tc1类转座子；对扩增产物用进行电泳分离，染色，构建新疆裸重唇鱼DNA电泳模式图；鉴定南、北疆分布的新疆裸重唇鱼。

上述PCR反应引物序列为：5′-TAC AGT TGA AGT CGG AAG TTT ACA TAC-3′。

上述PCR反应总体系为：其中10×buffer 2.5μL，Mg²⁺终浓度为2.0mM，dNTP（2.5mM）2μL，Taq聚合酶1units，引物（10μM）各1μL，新疆裸重唇鱼基因组DNA 1μL（0.5μg），加灭菌水至终体积25μL。

上述PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后是30个循环，每个循环包括94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。

上述琼脂糖凝胶电泳检测步骤为：称量0.7g琼脂糖加入70 mL 1×TAE缓冲液的锥形瓶中，微波炉加热煮沸，使琼脂粉完全溶解，待凝胶液稍凉至50-60℃，加入7μL核酸染料Gelview，轻轻摇匀后将胶缓缓倒入胶槽内，此过程中应避免产生气泡，待琼脂糖凝胶完全凝固后竖直拔掉梳子，清除碎胶并将胶槽放入电泳槽内，将电泳缓冲液加入电泳槽中，直至没过凝胶面0.5cm。将2.5μL PCR产物与0.5μL 6×DNA loading buffer混合后依次加入点样孔，并点上6μL 100bp DNA Marker（片段大小为：2000bp，1600bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp），接通电泳槽和电泳仪的电源后开始电泳。电泳电压设定为120V，电流400mA，时间25min；电泳完毕通过凝胶成像系统照相，调节光圈和曝光时间，选择合适的滤光片，得到成像清晰、背景较低的照片，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。

从图1中可以看出，Tc1类转座子在南疆群体中只有一条扩增主带，在北疆群体中有两条扩增主带（虚线框内）。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼分子生物学方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Saccharum)

<400> 1

tacagttgaa gtcggaagtt tacatac 27

Claims (6)

1.一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼的分子生物学方法，其特征在于：所述分子生物学方法的具体技术方案为：

1）提取南、北疆分布的新疆裸重唇鱼基因组DNA；

2）利用PCR反应扩增新疆裸重唇鱼基因组中Tc1类转座子；

3）对扩增产物用进行电泳分离，染色，构建新疆裸重唇鱼DNA电泳模式图；

4）鉴定南、北疆分布的新疆裸重唇鱼。

2.根据权利要求1所述的一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼的分子生物学方法，其特征在于：所述PCR反应引物序列为：5′-TAC AGT TGA AGT CGG AAG TTT ACA TAC-3′。

3.根据权利要求2所述的一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼的分子生物学方法，其特征在于：所述PCR反应总体系为：10×buffer 2.5μL，Mg²⁺终浓度为2.0mM，2.5mM的dNTP 2μL，Taq聚合酶1units，10μM的引物各1μL，新疆裸重唇鱼基因组DNA 1μL或0.5μg，加灭菌水至终体积25μL。

4.根据权利要求2所述的一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼的分子生物学方法，其特征在于：所述电泳分离步骤为：称量0.7g琼脂糖加入70mL 1×TAE缓冲液的锥形瓶中，微波炉加热煮沸，使琼脂粉完全溶解，待凝胶液稍凉至50-60℃，加入7μL核酸染料Gelview，轻轻摇匀后将胶缓缓倒入胶槽内，待琼脂糖凝胶完全凝固后竖直拔掉梳子，清除碎胶并将胶槽放入电泳槽内，将电泳缓冲液加入电泳槽中，直至没过凝胶面0.5cm，然后将2.5μL PCR产物与0.5μL 6×DNA loading buffer混合后依次加入点样孔，并点上6μL100bp DNA Marker，接通电泳槽和电泳仪的电源后开始电泳，电泳完毕通过凝胶成像系统照相，调节光圈和曝光时间，选择合适的滤光片，得到成像清晰、背景较低的照片。

5.根据权利要求3所述的一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼的分子生物学方法，其特征在于：所述DNA Marker片段大小为：2000bp，1600bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

6.根据权利要求3所述的一种快速鉴别南、北疆分布的新疆裸重唇鱼的分子生物学方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳检测步骤中电泳电压设定为120V，电流400mA，时间25min。