CN107557382B - 一种植物根中多层凯氏带的诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物根中多层凯氏带的诱导方法，利用植物转录因子SHORT‑ROOT(SHR)或MYB36，结合植物源小肽CIF1和CIF2在植物根中诱导凯氏带的方法。通过组成性（利用35S启动子）或者诱导性（利用雌激素诱导表达体系）表达SHR或MYB36，可在植物根中皮层细胞和其他基本组织细胞中诱导参与凯氏带合成的多个基因。这其中包括CASP家族、PER64、ESB家族、SGN1和SGN3等。通过添加植物源小肽CIF1和CIF2，植物根中皮层细胞和其他基本组织细胞中可形成完整的功能性凯氏带，这在作物生物技术改良中具有很大潜力。

Description

一种植物根中多层凯氏带的诱导方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种植物根中凯氏带形成的诱导方法。

背景技术

凯氏带（Casparian strip）是高等植物内皮层中，细胞径向壁和横向壁的木栓化和木质化的带状结构。木栓化的凯氏带形成了水和溶质难以逾越的屏障，因此高等植物根的质外体的连续性在此被阻断。水分和矿质元素被根的表皮吸收后，可沿着两条途径向维管束横向运输：一条是细胞间隙的质外体；另一条是细胞内部的共质体途径。当水分和溶质到达内皮层时，由于木栓化的带状凯氏带的存在，水和溶质的质外体途径被阻断，必须通过内皮层细胞经共质体途径选择性吸收。这种阻隔类似于维管束的栅栏和阀门，使得植物可根据需要对水分和营养物质选择性吸收。

农业生产中一个普遍的挑战是各种环境胁迫，尤其是土壤中过多的水分和过高的各种离子。目前，我国耕地质量具有“低、费，污”的现象，现有耕地中，约1/3以上都是各种低产耕地。水涝，土壤盐碱化以及各种重金属污染严重制约我国农作物的产量和品质。

鉴于植物根中凯氏带对于水分和离子的阻挡作用，通过生物技术，实现植物根中具有凯氏带组织的扩展，从而达到抗涝和其他抗逆效果具有十分重要的意义。

高等植物拟南芥中，已有研究表明转录因子SHR可通过诱导皮层内皮层干细胞的定向分裂促进内皮层的形成。而在皮层和外皮层细胞中表达SHR，可诱导大量细胞平周分裂，在维管组织外产生多层细胞层。最新研究还表明，SHR可激活转录因子MYB36，而有报道发现MYB36调控参与凯氏带形成的多个重要基因。因此通过调控SHR或MYB36的表达在植物根中增加具有凯氏带的细胞层具有一定的可能性。然而，检测表明，表达SHR或者MYB36并不能形成完整功能性的凯氏带。最近的报道发现，植物根中维管束合成的小肽CIF1和CIF2，可参与内皮层凯氏带带状结构的形成。本发明通过在植物中组成性表达、诱导性表达、组织特异性表达或诱导性组织特异性表达植物转录因子SHR或MYB36诱导形成凯氏带的必需基因，同时结合添加合成小肽CIF1或CIF2（或内源表达CIF1或CIF2），最终诱导植物根中形成多层功能性凯氏带。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物根中多层凯氏带的诱导方法，实现植物根中具有凯氏带组织的扩展，从而达到抗涝和其他抗逆效果具有十分重要的意义。

为实现上述目的，提供以下技术方案：

一种植物根中多层凯氏带的诱导方法，通过表达植物转录因子SHR或MYB36，结合小肽CIF1或CIF2诱导植物根中形成多层功能性凯氏带。通过组成性表达、诱导性表达、组织特异性表达或诱导性组织特异性表达植物转录因子SHR或MYB36诱导形成凯氏带的必需基因；在表达SHR或MYB36的植物苗根中，添加合成小肽CIF1或CIF2，或内源表达CIF1或CIF2，最终诱导植物根中形成多层功能性凯氏带。

提供植物根中非内皮层细胞诱导形成凯氏带的组合物。组合物包括转录因子SHORT-ROOT (SHR) (AT4G37650)，或者转录因子MYB36(AT5G57620)；还包括合成的多肽CIF1或CIF2，或者内源表达合成小肽的拟南芥基因CIF1(AT2G16385)和CIF2(AT4G34600)。

所述的小肽CIF1氨基酸序列DYGNNSPSPRLERPPFKLIPN，CIF2氨基酸序列DYGHSSPKPKLVRPPFKLIPN。

通过本发明的方法，诱导作物根中多层凯氏带形成，在培育高抗逆性作物中的应用。

本发明所述植物指代拟南芥或其他高等植物。由于SHR功能在拟南芥和其他包括水稻等高等植物中保守，因此本发明也广泛适用于非拟南芥的作物。

本发明使用拟南芥SHR和MYB36，但是SHR和MYB36在作物中的直向同源基因功能高度保守。因此使用其他高等植物来源的SHR和MYB36也涵盖在被发明中。

含有上述SHR或MYB36转录因子的植物表达载体。

含有上述SHR或MYB36转录因子基因的宿主菌。

本发明的有益效果：本发明可在植物非内皮层细胞中人工诱导形成凯氏带结构，并且分析结果表明此诱导的凯氏带结构可以阻挡外界水分自由进入根中。鉴于凯氏带为植物调节水分和离子吸收的重要结构，此发明对利用生物技术培育高抗性各种作物品种的具有重要意义。

附图说明

图1诱导性表达载体, pG1090-XVE::SHR和pG1090-XVE::MYB36在拟南芥根中所有细胞表达SHR或MYB36。野生型拟南芥根中，PER64，ESB1和SGN3等控制凯氏带的基因只在内皮层特异性表达（通过启动子连接GFP的报告体系体现，图中荧光信号部分），与此对比，表达SHR或MYb36的根中，这些基因显著上调，并在绝大多数细胞中表达。

图2 (a)表达SHR可诱导凯氏带位置骨架蛋白CASP1-GFP在皮层细胞(图中的cor)的表达，但是呈现不连续结构（图中箭头指示）。但是加入CIF1（图中c）或CIF2（图中d）可以促进CASP1-GFP形成连续带状结构（图中箭头指示）。加入小肽后，SHR表达的根可将红色碘化丙啶染料排除在皮层细胞外（如b所示），说明在这层细胞形成的凯氏带具有功能性。进一步木质素染色实验发现，正常根中(e所示)分布在内皮层的凯氏带，在SHR表达结合CIF小肽处理的根中扩展到了皮层细胞（f所示）。

具体实施方式

实施例1 SHR和MYB36表达体系构建

按照OMEGA公司的E.Z.N.A.® Plant RNA Kit试剂盒说明书提取拟南芥根部RNA。再按照TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(TRANS) 说明书将其反转录成cDNA。在TAIR网站（http://www.arabidopsis.org/）查找SHR和MYB36 的cDNA序列，设计引物SHR(+):5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGATACTCTCTTTAGA3’和SHR(-):5’ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCGTTGGCCGCCACGCACT3’;MYB36(+):5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGGAAGAGCTCCATGC3’和MYB36(-):5’GGGG ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAACACTGTGGTAGCTCATCTGA3’，PCR扩增目的片段，回收产物，通过BP反应将回收片段连接到入门克隆载体pDONR221 (质粒信息见https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12536017)。制备DH5α感受态，将连接产物转入DH5α，用含有100mg/L的卡那霉素筛选阳性菌落，并提质粒PCR验证，阳性质粒送公司测序。将验证正确的质粒和表达载体pMDC7混合，加入LR酶，利用LR反应将带有SHR cDNA的目的片段连接到表达载体上，转入DH5α，用含有100mg/L的壮‎观霉素筛选阳性菌落，提质粒PCR验证，获得表达载体pG1090-XVE:SHR和pG1090-XVE:MYB36。

实施例2：建立植物表达体系

（1）制备GV3101农杆菌感受态细胞，分别将pG1090-XVE:SHR和pG1090-XVE:MYB36质粒转入农杆菌，用含有100mg/L的壮‎观霉素加50mg/L利福平和15mg/L庆大霉素筛选阳性菌落。

（2）拟南芥种子放在4℃冰箱内低温处理3-4天，将高温灭菌的培养基质 ( 营养土：蛭石：珍珠岩=5：3 ：1)填入培养盆中，每盆均匀播种5-6粒种子，覆膜3-4天，放于生长室中培养(22-23℃，光照16h) 。待拟南芥抽苔后，用剪刀从主花序的底部将花序全部剪去，待花序重新抽出并形成大量不成熟的花簇，即可用于转化。

（3）准备携带目的基因的农杆菌，用含有100mg/L的壮‎观霉素加50mg/L利福平和15mg/L庆大霉素的液体LB培养基在 28℃下大批量摇菌，摇至OD600=1.2-1.6。将农杆菌在大离心机2000r/min下离心10min，用5%的蔗糖溶液重悬农杆菌(DD600=0.8)。

（4）侵染前加入Silwet L-77至终浓度0.05%，混合均匀。将拟南芥的花序浸入农杆菌溶液中30s-60s。侵染完后，用黑色塑料袋将整盆苗套袋遮盖，放在生长室遮光16-24h，之后正常培养即可。

（5）将收获的拟南芥种子倒入50mL离心管，加入40 mL 70％的乙醇，震荡10s，静置移除上清；加40 mL无菌去离子水，震荡后吸除，重复2次；加40 mL的5%次氯酸钠(含0.1％Triton100)，摇10 分钟，吸除上清；加40 mL无菌去离子水，震荡后吸除，重复3次以上；加入无菌的含0.1%琼脂的液体MS培养基，摇匀，种子悬浮在培养基中，将其倒在1/2MS平板(Hyg50mg/L) 上，轻轻旋转平板，使种子混匀整个平板。

（6）将封好的平板放在4℃冰箱，3d后，放在组织培养箱22℃下光照培养。10d左右，将阳性苗移栽到花盆中培养，收种并进行纯合筛选。

实施例3：小肽处理

（1）TAIR网站查找小肽氨基酸序列，CIF1：DYGNNSPSPRLERPPFKLIPN，CIF2：DYGHSSPKPKLVRPPFKLIPN，公司合成小肽。

（2）取少量筛选出的纯合转基因种子，倒在塑料离心管中，盖子打开，置于玻璃密封缸中，向灭菌缸里的小烧杯里加入45mL次氯酸钠和5mL浓盐酸，快速将密封缸密封，灭菌2.5-3 h。以上操作均在通风橱中完成。灭菌完成后，将种子放到超净台吹半小时，用牙签将种子点在1/2 MS平板上。4℃冰箱内低温处理3-4d，放在培养箱22℃下光照培养5d。将小苗移到含10 μM小肽（CIF1或CIF2）和10 μM雌激素的1/2 MS培养基上，正常光下处理2天。激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM880)下观察根(图1和图2)。

实施例4：功能性凯氏带验证

碘化丙啶(PI)是一种荧光染料，不能透过活细胞的细胞膜，只能通过细胞间隙进入根内部，PI溶液进入的地方会在显微镜下发出荧光，由于根成熟区的内皮层上有凯氏带，能阻止PI溶液向维管束进入，从而确定拟南芥的根在哪层细胞可以形成功能性凯氏带。在载玻片上滴一滴配好的PI溶液（1-10µg/ml），用镊子夹取拟南芥幼苗，使根浸在PI溶液中，平放在载玻片上，轻轻盖上盖玻片，显微镜下观察（图2）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种植物根中多层凯氏带的诱导方法

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> CIF1

<400> 1

Asp Tyr Gly Asn Asn Ser Pro Ser Pro Arg Leu Glu Arg Pro Pro Phe

1 5 10 15

Lys Leu Ile Pro Asn

20

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> CIF2

<400> 2

Asp Tyr Gly His Ser Ser Pro Lys Pro Lys Leu Val Arg Pro Pro Phe

1 5 10 15

Lys Leu Ile Pro Asn

20

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggatact ctctttaga 49

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cgttggccgc cacgcact 48

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catgggaaga gctccatgc 49

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt aacactgtgg tagctcatct ga 52

Claims (1)

1.一种植物根中多层凯氏带的诱导方法，其特征在于：通过表达植物转录因子SHR或MYB36，在表达SHR或MYB36的植物苗根中，添加合成小肽CIF1或CIF2，最终诱导植物根中形成多层功能性凯氏带；所述凯氏带位于非内层细胞中；

所述的小肽CIF1氨基酸序列为DYGNNSPSPRLERPPFKLIPN，CIF2氨基酸序列为DYGHSSPKPKLVRPPFKLIPN。

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