一种泊沙康唑的杂质和制备方法以及泊沙康唑有关物质的检
测方法
技术领域
本发明涉及药物化学和分析领域,具体涉及一种泊沙康唑的杂质化合物、其制备方法以及泊沙康唑有关物质的检测方法。
背景技术
泊沙康唑是一种由伊曲康唑衍生而来的新型三唑类抗真菌药,具有代谢稳定、低毒、生物利用度高、抗真菌谱较广、抗菌效力强等特性,特别是其对多烯类化合物和其它三唑类耐药或侵袭性真菌感染有效,适用于深部真菌感染及艾滋病真菌感染的治疗。泊沙康唑是由美国先灵葆雅公司(Schering Corporation)研制,美国FDA于2007年批准上市。
泊沙康唑注射剂容易易氧化产生杂质,严重影响产品使用的安全性,为了保障临床用药安全,对样品中的杂质严格限制尤其重要,目前泊沙康唑杂质的杂质研究目前多集中在其异构体杂质和工艺杂质的研究,对降解杂质的研究较少。泊沙康唑或注射剂在存放过程中产生的降解杂质,同样影响注射剂的质量和安全性,需要进行深入的研究。
发明内容
本发明的目的是提供新的泊沙康唑的杂质化合物、其制备方法以及泊沙康唑有关物质的分析检测方法,为泊沙康唑原料药及制剂的生产和质量研究提供了保障。
本发明的一个方面是提供一种泊沙康唑的新的杂质化合物,即式I化合物。
本发明的第二方面是提供一种制备上述式I杂质化合物的方法。
本发明的第三方面是提供一种泊沙康唑有关物质的检测方法。
为此,本发明提供以下技术方案:
根据第一方面,提供一种泊沙康唑的杂质化合物,其结构如式(I)所示,
式(I)化合物的化学名为4-[4-[4-[4-[[(3S,5S)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]-4-氧-哌嗪-1-基]苯基-2-[(2S,3R)-2-苄氧基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮。所述杂质化合物可以作为杂质对照品使用,例如在泊沙康唑原料药或制剂的有关物质检查中作为杂质对照品。
根据第二方面,提供一种制备上述式(I)化合物的方法,包括将泊沙康唑与过氧化氢水溶液反应,加入乙酸和甲醇,配制溶液,经过高效液相色谱(HPLC)制备式(I)化合物。
在一种实施方式中,泊沙康唑与过氧化氢水溶液的比例为1g:10~100ml。
在一种实施方式中,反应在加热条件下进行,例如可以是50~70℃。反应时间可以是2~16小时。
在一种实施方式中,所述溶液中包括以v/v%计,78%的过氧化氢水溶液、2%的乙酸、20%的甲醇。
在一种实施方式中,所述过氧化氢水溶液为30wt%的过氧化氢水溶液。
在一种实施方式中,所述HPLC制备条件为:
固定相:十八烷基硅烷键合硅胶,10um粒径
流动相:A1:0.2%乙酸水溶液,B1:乙腈
检测波长:254nm
流速:200ml/min
柱温:室温
洗脱方式:梯度洗脱
收集保留时间约37min-47min处的目标峰对应的物质,即为式(I)化合物的溶液。
除特别说明的之外,本发明中室温是指10~30℃,优选的是指20~30℃。
本发明的上述方法可以将目标杂质式(I)化合物与其他组分有效地分离,得到的式(I)化合物的HPLC纯度可达到95%以上。
本发明人进一步发现,通过将上述收集的目标物溶液经HPLC方法进行富集去水处理。可以方便收集液的后处理,大大缩短浓缩的时间。
在一种实施方式中,HPLC富集制备条件为:
固定相:十八烷基硅烷键合硅胶,10um粒径,同制备用柱
流动相:A2:纯化水,B2:甲醇
检测波长:254nm
流速:200ml/min
柱温:室温
富集方式:梯度洗脱
收集保留时间位于约12-20min的目标物质。将收集液浓缩至干,得到式(I)化合物。
所得的HPLC图谱中,富集的目标峰在约16min,峰宽约8min,因此可以收集保留时间约12-20min对应的物质。该富集处理得到的收集液,含水量降至10%以下,显著地降低后处理浓缩时间,易于制备得到纯净的式(I)化合物,可用作杂质对照品。
根据第三方面,提供一种泊沙康唑有关物质的检测方法,所述方法为HPLC法,检测条件为:
色谱柱:Agilent Zorbax SB-Phenyl,3.5μm,75×4.6mm
流动相:A3:0.15%磷酸溶液;B3:水-乙腈-四氢呋喃-磷酸(250:500:250:1.5)
流速:1.5ml/min
检测波长:254nm
柱温:40℃
梯度洗脱程序:
该方法可以有效分离检测泊沙康唑的绝大多数有关物质的含量。
本发明还提供了泊沙康唑有关物质的另一种检测方法,所述方法为HPLC法,检测条件为:
色谱柱:DAICEL OZ-H 250×4.6mm,5μm
流动相:正己烷-无水乙醇-二乙胺(30:70:0.1)
检测波长:254nm
柱温:40℃
流速:1.0ml/min。
该方法尤其用于有效分离检测泊沙康唑及其3种杂质(对映异构体、非对映体)的含量。
本发明提供了一种新的泊沙康唑的杂质化合物及其制备方法,可以作为杂质对照品,用于泊沙康唑原料药及其制剂的质量研究,此外还提供了泊沙康唑有关物质的检测方法,可以有效分离检测泊沙康唑及其众多杂质的含量,为泊沙康唑原料药及制剂的质量研究提供了更方便、准确和适用的分析方法。
附图说明
图1:式(I)化合物的1H-NMR谱图;
图2:式(I)化合物的13C-NMR谱图;
图3:式(I)化合物的1H-1H COSY谱图;
图4:式(I)化合物的13C-1H HSQC谱图;
图5:式(I)化合物的13C-1H HMBC谱图;
图6:式(I)化合物的HPLC检测图;
图7:根据一种实施方式的泊沙康唑有关物质的分析检测图;
图8:根据另一种实施方式的泊沙康唑有关物质的分析检测图;
图9:根据另一种实施方式的泊沙康唑有关物质的分析检测图;
图10:根据另一种实施方式的泊沙康唑有关物质的分析检测图;
图11:根据另一种实施方式的泊沙康唑有关物质的分析检测图。
具体实施方式
以下实施例仅是举例说明的作用,以便技术人员更好地理解本发明的优点,而不以任何方式限制本发明所揭示的内容。所采用的仪器和试剂均为本领域普通市售产品。未特别说明的步骤均是本领域技术人员知晓的常规操作,例如进样前平衡柱子,样品溶液的制备,流动相的配制、洗脱液的分段收集、合并浓缩,泊沙康唑及相关物质的HPLC图谱定位等。
实施例1:4-[4-[4-[4-[[(3S,5S)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]-4-氧-哌嗪-1-基]苯基-2-[(2S,3R)-2-苄氧基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮(式I化合物)的制备
将10g泊沙康唑和500ml的30wt%的过氧化氢水溶液混合,升温至50℃搅拌2h,再升温至70℃搅拌6h,加入乙酸和甲醇配制得到样品溶液(78%的过氧化氢水溶液+2%的乙酸+20%的甲醇,以v/v%计)。用流动相A1稀释至2倍体积进样,进行HPLC制备。
HPLC制备条件:
仪器:北京创新通恒LC6000,DAC-100制备柱,1.5kg装料量
固定相:十八烷基硅烷键合硅胶,10um粒径
流动相:A1:0.2%(v/v)乙酸水溶液,B1:乙腈
检测波长:254nm
流速:200ml/min
柱温:室温
进样量:以泊沙康唑计,10g
洗脱方式:梯度洗脱
收集保留时间约37min-47min处的目标峰对应的物质。
上述HPLC制备图中,目标峰位于保留时间约44.5min处,峰宽约37min-47min处。在实际操作中,根据载样量的变化,梯度洗脱中的A/B相的比例可能有5%左右的波动,实际目标峰的保留时间也会有少许位移,因此,最好收集保留时间约37min-47min的目标峰对应的物质。本发明的上述方法可以将目标杂质式(I)化合物与其他组分有效地分离,得到的式(I)化合物的HPLC纯度可达到95%以上。本发明人进一步发现,通过将上述收集液经HPLC方法进行富集去水处理,可以方便上述收集液的后处理,大大缩短浓缩的时间。
富集去水方法为:
对上述达到95%纯度的目标组分用流动相A1稀释至2倍体积进样,进行富集处理。
HPLC富集制备条件:
固定相:十八烷基硅烷键合硅胶,10um粒径,同制备用柱
流动相:A2:纯化水,B2:甲醇
检测波长:254nm
流速:200ml/min
柱温:室温
进样量:控制载样量在50g以内即可
富集方式:梯度洗脱
收集保留时间位于约12-20min的目标物质。将收集液浓缩至干,得到式(I)化合物约75mg。
此HPLC图谱中,富集的杂质峰在约16min,峰宽约8min,因此可以收集保留时间约12-20min对应的物质。该富集处理得到的收集液,含水量降至10%以下,显著地降低后处理浓缩时间,易于制备得到式(I)化合物。
结构确证:
1)质谱
仪器:Agilent 6540B Q-TOF质谱仪,离子源:电喷雾,质量分析器:飞行时间质谱
测得供试品的质谱中,一个离子峰[M+H]+的m/z为717.33,是式(I)化合物(C37H42F2N8O5,MW=716.78)加一质子得到,另一个离子峰[M+2H]2+的m/z为359.17,是式(I)化合物加两个质子得到,质谱数据是与式(I)化合物的分子量相符。
2)核磁共振波谱
a)1H-NMR谱
仪器:Bruker DRX500,溶剂:DMSO-d6,内标:TMS,温度:303K
1H-NMR谱图如图1所示。数据和解析见表1。
表1.样品1H-NMR测定数据及解析
注:带*数据为远程13C-1H HSQC谱对应碳原子的化学位移值
b)13C-NMR谱图
仪器:Bruker DRX500,溶剂:DMSO-d6,内标:TMS,温度:303K
13C-NMR谱图如图2所示。数据和解析见表2。
表2.样品13C-NMR谱图数据及解析
注:带*数据为远程13C-1H HSQC谱对应质子的化学位移值
c)1H-1H COSY谱图
仪器:Bruker DRX500,溶剂:DMSO-d6,内标:TMS,温度:303K
谱图如图3所示。
d)13C-1H HSQC谱图
仪器:Bruker DRX500,溶剂:DMSO-d6,内标:TMS,温度:303K
谱图如图4所示。
e)13C-1H HMBC谱
仪器:Bruker DRX500,溶剂:DMSO-d6,内标:TMS,温度:303K
谱图如图5所示。
3)构型确证
泊沙康唑的该杂质化合物是由泊沙康唑经氧化反应得到,反应没有涉及手性中心,因此该泊沙康唑杂质化合物的构型与泊沙康唑是一致的,都为3R,5R,2S,3S构型。
由上述质谱、氢谱、碳谱、1H-1H COSY谱、13C-1H HSQC谱及13C-1H HMBC谱,确认该化合物为如式(I)所示的化合物。
实施例2:式(I)化合物的HPLC检测方法
制备供试品溶液:取泊沙康唑注射液(规格16.7ml:300mg)1.0ml,置20ml量瓶中,加30wt%过氧化氢水溶液溶液1ml,室温放置4h,用稀释液(水-乙腈-磷酸(75:25:1))溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
HPLC检测条件为:
色谱柱:Agilent Zorbax SB-Phenyl(75mm×4.6mm,3.5μm)
流动相:A3:0.15%(v/v)磷酸溶液;B3:水-乙腈-四氢呋喃-磷酸(250:500:250:1.5)
检测波长:254nm
流速:1.5ml/min
柱温:40℃
进样量:10μl
梯度洗脱:
HPLC图谱如图6所示。式(I)化合物在约24min出峰,泊沙康唑在约32min出峰。
实施例3:泊沙康唑有关物质的HPLC检测
有关物质名称:
IMP1:4-[4-[4-[4-[[(3R,5R)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基-2-[(2S,3S)-2-羟基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮
IMP2:4-[4-[4-[4-[[(3R,5R)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基-2-[(2S,3R)-2-羟基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮
IMP3:4-[4-[4-[4-[[(3R,5R)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基-2-[(2R,3R)-2-羟基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮
IMP4:4-[4-[4-[4-[[(3R,5R)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基-2-[(2R,3S)-2-羟基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮
IMP5:4-[4-[4-[4-[[(3R,5S)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基-2-[(2R,3R)-2-羟基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮
IMP6:4-[4-[4-[4-[[(3R,5S)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基-2-[(2S,3R)-2-羟基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮
IMP7:4-[4-[4-[4-[[(3R,5S)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基-2-[(2S,3S)-2-羟基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮
IMP8:4-[4-[4-[4-[[(3R,5S)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基-2-[(2R,3S)-2-羟基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮
IMP9:4-[4-[4-[4-[[(3S,5S)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基-2-[(2S,3S)-2-羟基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮
IMP10:4-[4-[4-[4-[[(3S,5S)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基-2-[(2R,3S)-2-羟基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮
IMP11:4-[4-[4-[4-[[(3S,5S)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基-2-[(2S,3R)-2-羟基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮
IMP12:4-[4-[4-[4-[[(3S,5S)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基-2-[(2S,3R)-2-苄氧基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮
IMP13:2-[(2S,3S)-2-(羟基)戊-3-基]-4-[4-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]苯基]-2H-1,2,4-三氮唑-3(5H)-酮
IMP14:4-[4-[4-[4-[[(3R,5R)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]哌嗪-1-基]苯基-2-(戊-3-基)-1,2,4-三唑-3-酮
IMP15:4-[4-[4-[4-[[(3S,5S)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]-1-苄基-4-[4-[1-[(2S,3R)-2-羟基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮-4基]苯基]哌嗪氯季铵盐
IMP16:苄氯
IMP17:对甲苯磺酸钠
IMP18:对甲苯磺酸甲酯
IMP19(式I化合物):4-[4-[4-[4-[[(3S,5S)-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1,2,4-三唑-1-基甲基)氧杂戊环-3-基]甲氧基]苯基]-4-氧-哌嗪-1-基]苯基-2-[(2S,3R)-2-苄氧基戊-3-基]-1,2,4-三唑-3-酮
SM1(起始原料1):N’-[(2S,3S)-2-苄氧基戊-3-基]甲酰肼草酸盐
SM2(起始原料2):(5R-顺)-甲苯-4-磺酸-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1H-1,2,4-三氮唑-1-基)甲基四氢呋喃-3-基甲基酯
SM3(起始原料3):4-[4-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]苯基]氨基甲酸苯酯
INT2(中间体2):2-[(2S,3S)-2-(苄氧基)戊-3-基]-4-[4-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]苯基]-1H-1,2,4-三氮唑-5(4H)-酮
对照品溶液的制备和HPLC定位:取泊沙康唑、IMP1、IMP2、IMP3、IMP4、IMP6、IMP7、IMP8、IMP9、IMP10、IMP11、IMP12、IMP13、IMP14、IMP15、SM1、SM2、SM3、INT2各适量,分别加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液;取IMP5适量,加四氢呋喃溶解后加甲醇稀释制成每1ml中约含1mg的溶液;取IMP16适量,加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含5mg的溶液。取上述对照品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,进行定位。定位图略。
系统适用性试验溶液的制备和HPLC检测:取泊沙康唑约15mg,另取IMP1、IMP2、IMP3、IMP4、IMP5、IMP6、IMP7、IMP8、IMP9、IMP10、IMP11、IMP12、IMP13、IMP14、IMP15、IMP16(即IMP1~IMP16)、SM1、SM2、SM3、INT2对照品溶液各20μl,用稀释液(水-乙腈-磷酸(75:25:1))溶解并稀释至刻度,作为系统适用性试验溶液。取该溶液10μl,注入液相色谱仪,进行检测。图谱如图7所示。
HPLC检测条件:
色谱柱:Agilent Zorbax SB-Phenyl,3.5μm,75×4.6mm
流动相:A4:水-四氢呋喃-磷酸(760:240:1.5),B4:水-乙腈-四氢呋喃-磷酸(250:500:250:1.5)
流速:1.5ml/min
检测波长:254nm
柱温:40℃
梯度洗脱程序:
从图7可以看出,泊沙康唑主峰与相邻已知杂质峰之间分离度较差,且拖尾因子较大。
实施例4:泊沙康唑有关物质的HPLC检测
对照品溶液的制备:同实施例3。
系统适用性试验溶液的制备:同实施例3。
HPLC检测条件:
色谱柱:Agilent Zorbax SB-Phenyl,3.5μm,75×4.6mm
流动相:A3:0.15%(v/v)磷酸溶液,B3:水-乙腈-四氢呋喃-磷酸(250:500:250:1.5)
流速:1.5ml/min
检测波长:254nm
柱温:40℃
进样量:10μl
梯度洗脱程序:
结果如图8所示。
从图8可以看出,泊沙康唑与大多数杂质的分离度良好,但IMP6、IMP8峰与泊沙康唑峰的分离度较差。
实施例5:泊沙康唑有关物质的HPLC检测
对照品溶液的制备:同实施例3。
系统适用性试验溶液的制备:取泊沙康唑约10mg,另取IMP1~IMP16、SM1、SM2、SM3、INT2对照品溶液各50μl,用稀释液(水-乙腈-磷酸(75:25:1))溶解并稀释至刻度,作为系统适用性试验溶液。
HPLC检测色谱条件:
色谱柱:Agilent Zorbax SB-Phenyl,3.5μm,75×4.6mm
流动相:A3:0.15%(v/v)磷酸溶液,B3:水-乙腈-四氢呋喃-磷酸(250:500:250:1.5)
流速:1.5ml/min
检测波长:254nm
柱温:40℃
进样量:10μl
梯度洗脱程序:
结果如图9所示。
从图9可以看出,本实施例是一种更优选的检测方法。泊沙康唑与已知杂质峰、各已知杂质峰之间的分离度都较好,泊沙康唑峰拖尾因子小。
实施例6:泊沙康唑有关物质的HPLC检测
对照品溶液的制备:类似实施例3。增加了IMP19的对照品溶液,将IMP19用甲醇溶解并稀释制成1mg/1ml的溶液即得。
系统适用性试验溶液的制备:取泊沙康唑约10mg,另取IMP1~IMP16、IMP19、SM1、SM2、SM3、INT2对照品溶液各适量,用稀释液(水-乙腈-磷酸(75:25:1))定量稀释制成每1ml中分别约含泊沙康唑1mg、IMP2(IMP4/IMP10/IMP11)、IMP5(IMP7)、IMP6(IMP8)、IMP12、IMP13、IMP14、IMP15、IMP16、SM2、SM3、INT2各约2μg、IMP19约1μg的溶液,作为系统适用性试验溶液。
HPLC检测色谱条件:
色谱柱:Agilent Zorbax SB-Phenyl,3.5μm,75×4.6mm
流动相:A3:0.15%(v/v)磷酸溶液,B3:水-乙腈-四氢呋喃-磷酸(250:500:250:1.5)
流速:1.5ml/min
检测波长:254nm
柱温:40℃
进样量:10μl
梯度洗脱程序:
结果如图10所示。
从图10可以看出,杂质化合物IMP19色谱峰与泊沙康唑峰分离度良好,与其他杂质的分离度良好,该方法可以作为泊沙康唑有关物质的检测方法。
实施例7:泊沙康唑有关物质的HPLC检测
本发明上述检测方法,尤其是实施例5~6的方法可以分离检测泊沙康唑绝大多数的有关物质,但由于泊沙康唑结构复杂,手性中心较多,仍有极少数杂质,如IMP1、IMP3、IMP9与泊沙康唑分离度较差。为此,本实施例进一步提供一种分离检测泊沙康唑有关杂质IMP1、IMP3、IMP9的方法。
对照品溶液的制备:取泊沙康唑及IMP1、IMP3、IMP9对照品各适量,分别加无水乙醇制成每1ml中约含泊沙康唑100μg的溶液。
系统适用性试验溶液的制备:取泊沙康唑及IMP1、IMP3、IMP9对照品各适量,加无水乙醇制成每1ml中约含泊沙康唑0.5mg、IMP1、IMP3、IMP9各0.5μg的溶液,作为系统适用性试验溶液。
HPLC检测色谱条件:
色谱柱:DAICEL OZ-H 250×4.6mm,5μm
流动相:正己烷-无水乙醇-二乙胺(30:70:0.1)
检测波长:254nm
柱温:40℃
流速:1.0ml/min
进样量:10μl
结果如图11所示。
从图11可以看出,此色谱条件下,泊沙康唑峰与IMP1、IMP3、IMP9峰分离度良好,可准确检测相关杂质。
从上述实施例可以看出,本发明的检测方法,能够有效分离检测泊沙康唑有关物质的含量,为泊沙康唑的原料和制剂的质量研究与控制提供了有利保障。
以上实施例仅是解释说明的目的,本领域普通技术人员可以在本发明描述的基础上进行改变和修饰,适应性地调整HPLC检测条件,例如样品溶液的配制方法、浓度、调整进样量和样品浓度、柱温、流动相比例,保留时间等等均属于本发明的构思,只要在不违背本发明的精神前提下做出的改变,均属于本发明所揭示和保护的范围。