CN107523288A - 近红外ii区高分子荧光微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了近红外II区高分子荧光微球及其制备方法，其中，制备方法包括：(1)利用与水不混溶的有机溶剂对荧光染料进行溶解，以便得到荧光染料溶液，荧光染料具有式I所示结构；(2)将高分子微球分散于十二烷基磺酸钠水溶液中，以便得到微球载体溶液；(3)将荧光染料溶液与微球载体溶液混合并进行超声处理，以便得到乳化混合液；(4)将乳化混合液进行溶胀，以便使荧光染料溶液浸入高分子微球溶胀过程中产生的纳米孔内；以及(5)对步骤(4)中所得混合物进行加热，随着二氯甲烷的挥发，荧光染料结晶析出并被包裹在纳米孔内，以便获得近红外II区高分子荧光微球。该荧光微球荧光量子效率高，且荧光检测时穿透能力强、背景干扰小，

Description

近红外II区高分子荧光微球及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及近红外II区高分子荧光微球及其制备方法。

背景技术

聚合物荧光微球作为一种特殊的功能微球，每个微球中可包裹数万甚至数十万个荧光分子，可大大提高荧光的标记效率，增强荧光分子的抗光漂白性能，极大地提高分析灵敏度；同时荧光微球表面可非常灵活地修饰多种功能基团(如羧基、氨基、醛基等)，有利于与蛋白或抗体的共价偶联和提高标记物的稳定性和标记效率。目前，荧光微球已广泛应用于标记、示踪、检测、成像、固定化酶、免疫医学、高通量药物筛选等。但是，传统荧光微球的发射均在可见光区域(发射波长小于780nm)，将其应用在生物活体、细胞或组织成像和体外诊断等领域时，容易造成荧光穿透性能差，背景荧光强。同时，由于其荧光量子效率普遍较低、激发和发射波长比较靠近(通常在20nm左右)等原因引起分析灵敏度降低，对荧光检测所需滤色片的要求很高。

因此，聚合物荧光微球有待进一步研究改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出近红外II区高分子荧光微球及其制备方法。本发明提出的近红外II区高分子荧光微球的制备过程简单、快速，荧光量子效率高，且激发(740nm)和发射(900-1400nm)的波长，荧光检测时具有穿透能力强、背景干扰小的特点，在活体成像、生物标记等方面具有良好的应用前景。

本发明主要是基于以下发现完成的：传统荧光微球荧光穿透性能差，背景荧光强，且由于荧光量子效率低、激发和发射波长比较靠近等原因，引起分析灵敏度降低、对滤色片要求很高。近红外荧光微球，尤其是近红外II区荧光微球荧光发射具有穿透力强、背景干扰小等特点，在活体成像、生物标记检测等方面具有良好的应用前景。然而，目前发现的近红外II荧光分子非常少，用其制备高分子荧光微球的报道至今未曾报道。发明人意外发现，具有式I所示结构的近红外II区的荧光染料在活体成像应用中具有穿透距离大(几毫米)，背景荧光低等优点，可以替代近红外荧光微球用于生物活体、细胞或组织成像和体外诊断等领域。然而，这种具有式I所示结构的荧光染料本身疏水性强，无法直接应用于活体成像，必须要先进行亲水性改性，这种改性过程不仅步骤繁琐，且改性后的荧光染料分散在水溶液中后，其量子效率大幅度降低，严重影响荧光检测时的灵敏度。为了解决以上问题，发明人发现可以利用溶胀法将具有式I所示结构的荧光染料包裹在高分子微球内部，效果非常理想，该微球荧光量子效率可达到20％以上，在水溶液中可良好分散，方便各种生物大分子的标记。

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种近红外II区高分子荧光微球的制备方法，包括：

(1)利用与水不混溶的有机溶剂对荧光染料进行溶解，以便得到荧光染料溶液，所述荧光染料具有式I所示结构

(2)将高分子微球分散于十二烷基磺酸钠水溶液中，以便得到微球载体溶液；

(3)将所述荧光染料溶液与所述微球载体溶液混合并进行超声处理，以便得到乳化混合液；

(4)将所述乳化混合液进行溶胀，以便使所述荧光染料溶液浸入所述高分子微球溶胀过程中产生的纳米孔内；以及

(5)对步骤(4)中所得混合物进行加热，随着所述有机溶剂的挥发，所述荧光染料结晶析出并被包裹在所述纳米孔内，以便获得所述近红外II区高分子荧光微球。

根据本发明上述实施例的近红外II区高分子荧光微球的制备方法，首先利用有机溶剂对式I所示结构的荧光染料进行溶解并得到荧光染料溶液，然后将荧光染料溶液与微球载体溶液混合后依次进行超声处理、溶胀和加热，使荧光染料被成功地包裹在高分子荧光微球的内部，最终得到近红外II区高分子荧光微球。本发明上述实施例的近红外II区高分子荧光微球的制备方法过程简单、快速，且制备出的近红外II区高分子荧光微球在水溶液中具有较好的分散性、量子效率高达25％、激发(740nm)和发射(900-1400nm)的波长长。由此，通过采用本发明实施例的近红外II区高分子荧光微球的制备方法，不仅有效解决了具有式I所示结构的荧光染料由于疏水性强而无法直接应用于活体成像的问题，而且制备得到的近红外II区高分子荧光微球在荧光检测时还具有穿透能力强、背景干扰小的特点，能够极大地放大荧光信号，提高检测灵敏度，在活体成像、生物标记等方面具有良好的应用前景。

另外，根据本发明上述实施例的近红外II区高分子荧光微球的制备方法还可以具有如下附加的技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述荧光染料溶液中所述荧光染料的浓度为1-50mg/mL。由此，可以使高分子微球能够包裹更多的荧光染料，进而进一步提高检测的灵敏度。

在本发明的一些实施例中，所述有机溶剂为选自乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷和芳烃中的至少一种，优选二氯甲烷。

在本发明的一些实施例中，所述高分子微球为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚甲醛微球、聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球中的至少一种，这些微球可良好地分散于水溶液中，同时表面可灵活地修饰各类基团，方便后续偶联。由此，可以有效制备得到具有穿透能力强、背景干扰小，且在水溶液中分散性强的近红外II区高分子荧光微球。

在本发明的一些实施例中，所述高分子微球的粒径为20nm-1000nm。由此，可以进一步提高高分子微球包裹荧光染料的能力，进而能够进一步提高检测的灵敏度。

在本发明的一些实施例中，步骤(2)中，将所述高分子微球按照10-200mg/ml的质量体积比分散于所述十二烷基磺酸钠水溶液中。由此，不仅可以保证高分子微球稳定地分散于溶液中，还可以使高分子微球在后续的溶胀过程中充分与二氯甲烷接触，进而能够最大限度地溶胀。

在本发明的一些实施例中，所述荧光染料溶液与所述微球载体溶液的体积比为1：(5-20)。由此适量的二氯甲烷能够使得高分子微球充分溶胀，进而提高荧光染料的包封率，提高近红外II区高分子荧光微球质量。

在本发明的一些实施例中，所述荧光染料与所述高分子微球的质量比为(0.1-30):100。由此，每个微球中可包裹数十万至数千万个荧光分子，极大地提高检测灵敏度。在本发明的一些实施例中，步骤(4)，所述溶胀是在10-50摄氏度下搅拌1-10小时完成的。由此，可以使高分子荧光微球在二氯甲烷的作用下充分溶胀，从而使荧光染料能够顺利地浸入高分子微球溶胀过程中产生的纳米孔内。

在本本发明的一些实施例中，步骤(5)中，所述加热的温度为50-90摄氏度。由此，可以在较短时间内使二氯甲烷挥发完全。

根据本发明的第二个方面，本发明还提出了一种近红外II区高分子荧光微球，所述近红外II区高分子荧光微球通过本发明上述实施例的近红外II区高分子荧光微球的制备方法制备得到。

根据本发明上述实施例的近红外II区高分子荧光微球在水溶液中具有较好的分散性、且量子效率高达25％、激发(740nm)和发射(900-1400nm)的波长，荧光检测时具有穿透能力强、背景干扰小的特点，能够极大地放大荧光信号，提高检测灵敏度，在活体成像、生物标记等方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1是根据本发明一个实施例的近红外II区高分子荧光微球的制备方法流程图。

图2是根据本发明一个实施例的近红外II区高分子荧光微球的制备方法流程图。

图3是用于制备本发明实施例的近红外II区高分子荧光微球的荧光染料的吸收光谱和发射的荧光光谱图。

图4是根据本发明一个实施例的近红外II区高分子荧光微球应用于免疫层析检测血清中的降钙素原(PCT)的荧光信号图。

图5是根据本发明一个实施例的制备羧基聚苯乙烯荧光微球的原料和产品图。

图6是根据本发明一个实施例的羧基聚苯乙烯颗粒和羧基聚苯乙烯荧光微球的扫描电镜图。

图7是根据本发明一个实施例的羧基聚苯乙烯荧光微球在740nm光的照射下的荧光照片和荧光光谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种近红外II区高分子荧光微球的制备方法，包括：(1)利用与水不混溶的有机溶剂对荧光染料进行溶解，以便得到荧光染料溶液，荧光染料具有式I所示结构；(2)将高分子微球分散于十二烷基磺酸钠水溶液中，以便得到微球载体溶液；(3)将荧光染料溶液与微球载体溶液混合并进行超声处理，以便得到乳化混合液；(4)将乳化混合液进行溶胀，以便使荧光染料溶液浸入高分子微球溶胀过程中产生的纳米孔内；以及(5)对步骤(4)中所得混合物进行加热，随着有机溶剂的挥发，荧光染料结晶析出并被包裹在纳米孔内，以便获得近红外II区高分子荧光微球。

根据本发明上述实施例的近红外II区高分子荧光微球的制备方法，首先利用有机溶剂对式I所示结构的荧光染料进行溶解并得到荧光染料溶液，然后将荧光染料溶液与微球载体溶液混合后依次进行超声处理、溶胀和加热，使荧光染料被成功地包裹在高分子荧光微球的内部，最终得到近红外II区高分子荧光微球。本发明上述实施例的近红外II区高分子荧光微球的制备方法过程简单、快速，且制备出的近红外II区高分子荧光微球在水溶液中具有较好的分散性、量子效率高达25％、激发(740nm)和发射(900-1400nm)的波长长。由此，不仅有效解决了具有式I所示结构的荧光染料由于疏水性强而无法直接应用于活体成像的问题，而且该近红外II区高分子荧光微球在荧光检测时还具有穿透能力强、背景干扰小的特点，能够极大地放大荧光信号，提高检测灵敏度，在活体成像、生物标记等方面具有良好的应用前景。

下面参考图1-4对本发明上述实施例的近红外II区高分子荧光微球的制备方法进行详细描述。

S100：制备荧光染料溶液

根据本发明的实施例，利用与水不混溶的有机溶剂对荧光染料进行溶解，以便得到荧光染料溶液，荧光染料具有式I所示结构：

根据本发明的实施例，本发明采用具有式I所示结构的荧光染料用于制备近红外II区高分子荧光微球。发明人发现，具有式I所示结构的荧光染料在365nm和740nm处有强烈的吸收，在此激发光下可以发射900-1400nm的荧光，其吸收光谱和发射的荧光光谱分别如图3(A)和图3(B)所示。由于其激发(740nm)和发射(900-1400nm)波长长，在活体成像应用中具有穿透距离大(几毫米)、背景荧光低等诸多优点。由此，本发明通过采用该荧光染料制备得到的近红外II区高分子荧光微球具有穿透能力强、背景干扰小的特点，在活体成像、生物标记等方面具有良好的应用前景。

根据本发明的具体实施例，首先制备的荧光染料溶液中荧光染料的浓度可以为1-50mg/mL。由此，可以使高分子微球能够包裹更多的荧光染料，从而使制备得到的近红外II区高分子荧光微球在进行荧光检测时可以具有更高的荧光强度，进而进一步提高检测的灵敏度。

根据本发明的具体实施例，有机溶剂可以为选自乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷和芳烃中的至少一种。根据本发明的具体示例，有机溶剂优选二氯甲烷。由此通过采用二氯甲烷可以进一步促进高分子微球溶胀，进而提高荧光染料的包封率。

S200：制备微球载体溶液

根据本发明的实施例，将高分子微球分散于十二烷基磺酸钠水溶液中，以便得到微球载体溶液。

根据本发明的具体实施例，高分子微球可以为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚甲醛微球、聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球中的至少一种。由于上述高分子微球的内部均为疏水性，因此恰好可以很好地将上述疏水性荧光染料包裹在其内部而不会泄漏出来。并且一个高分子颗粒可以包裹数万甚至数十万个荧光分子，其外部由于电荷或亲水基团作用可良好地分散于水溶液中。由此，通过采用上述高分子微球可以有效制备得到具有穿透能力强、背景干扰小，且在水溶液中分散性强的近红外II区高分子荧光微球。根据本发明的具体实施例，高分子微球的粒径可以为20nm-1000nm。由此，可以进一步提高高分子微球包裹荧光染料的能力，使制备得到的近红外II区高分子荧光微球在进行荧光检测时可以具有更高的荧光强度，进而进一步提高检测的灵敏度。根据本发明的具体实施例，十二烷基磺酸钠水溶液的浓度可以为0.25％。本发明中采用十二烷基磺酸钠水溶液作为乳化剂，由此，通过选用上述浓度的十二烷基磺酸钠水溶液，不仅可以使高分子微球能够更好地分散于十二烷基磺酸钠水溶液中，而且还有利于后续超声处理中得到均匀地乳化混合液。

根据本发明的具体实施例，可以将高分子微球按照10-200mg/ml的质量体积比分散于十二烷基磺酸钠水溶液中。发明人发现，将当高分子微球按照10-200mg/ml的质量体积比分散于十二烷基磺酸钠水溶液中时，不仅可以有效提高近红外II去高分子荧光微球的产率，还可以使高分子微球在后续的溶胀过程中能够最大限度地溶胀，进一步提高高分子微球包裹荧光染料的能力，使制备得到的近红外II区高分子荧光微球在进行荧光检测时可以具有更高的荧光强度，进而能够进一步提高检测的灵敏度。

S300：超声处理得到乳化混合液

根据本发明的实施例，将荧光染料溶液与微球载体溶液混合并进行超声处理，以便得到乳化混合液。

根据本发明的具体实施例，荧光染料溶液与微球载体溶液的体积比可以为1：(5-20)。由此，荧光染料溶液适量的二氯甲烷能够使得微球载体溶液中的全部高分子微球得到充分溶胀，进而使荧光染料溶液能够充分进入高分子微球溶胀过程中产生的纳米孔内，提高高分子微球对荧光染料的包裹能力，最终制备得到品质高的近红外II去高分子荧光微球使制备得到的近红外II区高分子荧光微球在进行荧光检测时可以具有更高的荧光强度，进而能够进一步提高检测的灵敏度。

根据本发明的具体实施例，荧光染料与高分子微球的质量比为(0.1-30):100。由此，可以进一步将荧光染料与高分子微球的用量进行匹配，提高原料利用率，避免原料浪费。另外，采用上述质量比还可以使荧光染料溶液能够充分进入后续高分子微球溶胀过程中产生的纳米孔内，以便进一步提高高分子微球对荧光染料的包裹能力，使制备得到的近红外II区高分子荧光微球在进行荧光检测时可以具有更高的荧光强度，进而能够进一步提高检测的灵敏度。

S400：乳化混合液溶胀

根据本发明的实施例，将乳化混合液进行溶胀，以便使荧光染料溶液浸入高分子微球溶胀过程中产生的纳米孔内。

发明人发现，由于具有如式I所示结构的荧光染料分子本身疏水性强，无法直接应用于活体成像，必须要先进行亲水性改性。而这种改性过程步骤繁琐，且改性后的荧光染料分散在水溶液中后，其量子效率大幅度降低。而高分子微球内部疏水，疏水性荧光染料可稳定地包裹在其内部而不会泄漏出来，一个高分子颗粒可以包裹数万甚至数十万个荧光分子，而且其外部由于电荷或亲水基团作用可良好地分散于水溶液中。同时，其外部可灵活地修饰各种功能基团，方便蛋白、DNA等分子的标记。由此，发明人通过采用溶胀法将其包裹于高分子微球内部并得到近红外II区高分子荧光微球，该荧光微球荧光量子效率可达到20％以上，在水溶液中可良好分散，方便各种生物大分子的标记。

根据本发明的具体实施例，溶胀可以在10-50摄氏度下搅拌1-10小时完成的。由此，可以使高分子荧光微球在二氯甲烷的作用下充分溶胀，从而使荧光染料能够顺利地浸入高分子微球溶胀过程中产生的纳米孔内，进而使制备得到的近红外II区高分子荧光微球在进行荧光检测时可以具有更高的荧光强度。

S500：加热挥发有机溶剂

根据本发明的实施例，对溶胀得到的混合物进行加热，随着有机溶剂的挥发，荧光染料结晶析出并被包裹在纳米孔内，以便获得近红外II区高分子荧光微球。

根据本发明的具体实施例，在加热过程中，有机溶剂慢慢挥发，高分子微球表面的纳米孔伴随着收缩，同时疏水性荧光染料结晶析出，形成疏水颗粒，被包裹在微球内部。有机溶剂挥发完全后，得到近红外II区高分子荧光微球，且包裹在近红外II区高分子荧光微球中的荧光染料在水溶液中几乎不泄露。

根据本发明的具体实施例，加热的温度可以为50-90摄氏度。由此，有机溶剂优选二氯甲烷能迅速地从溶液中完全挥发，进而提高近红外II区高分子荧光微球的制备效率。

根据本发明的具体实施例，加热可以在50-90摄氏度的水浴中磁力搅拌进行。由此，可以进一步提高二氯甲烷的挥发速率，使二氯甲烷完全挥发，提高近红外II区高分子荧光微球的制备效率。

根据本发明的具体实施例，近红外II区高分子荧光微球的制备方法还可以进一步包括：依次采用乙醇和水对得到的近红外II区高分子荧光微球进行超声清洗。

根据本发明的具体实施例，将特定数量的采用本发明上述实施例的制备方法得到的近红外II区高分子荧光微球溶解于二氯甲烷中，测得其荧光强度，根据标准曲线计算出每个颗粒中包含的荧光染料分子数目约为8万个。由此，相对于小分子荧光染料，用近红外II区高分子荧光微球做标记可极大地放大荧光信号，提高检测灵敏度。

根据本发明的具体实施例，可以将本发明中将所合成的近红外II区高分子荧光微球应用于免疫层析检测血清中的降钙素原(PCT)，如图4所示，当血清中降钙素原(PCT)的浓度达到5ng/mL时，检测线上显示出很强的荧光信号，其光学照片和荧光照片分别如图4(A)上和4(A)下所示，荧光曲线如图4(B)所示，从图4可以看出，背景荧光信号极低(信号噪音比达到42)。由此，采用本发明上述实施例的制备方法合成的近红外II区高分子荧光微球可应用于高灵敏免疫层析检测。

根据本发明的第二个方面，本发明还提出了一种近红外II区高分子荧光微球，近红外II区高分子荧光微球通过本发明上述实施例的近红外II区高分子荧光微球的制备方法制备得到。

根据本发明上述实施例的近红外II区高分子荧光微球在水溶液中具有较好的分散性、且量子效率高达25％、激发(740nm)和发射(900-1400nm)的波长长，荧光检测时具有穿透能力强、背景干扰小的特点，能够极大地放大荧光信号，提高检测灵敏度，在活体成像、生物标记等方面具有良好的应用前景。

实施例1

(1)羧基聚苯乙烯微球的合成

将190ml水加入至500mL毫升圆底烧瓶中，70度水浴中350rpm搅拌半小时。然后加入16mg SDS作为乳化剂，0.05g碳酸氢钠作为缓冲试剂。继续搅拌10分钟后往烧瓶中加入8ml苯乙烯和0.8mL丙烯酸。一小时后加入0.2g过硫酸钾，氮气保护下聚合反应18小时。反应结束后用2：1(v/v)乙醇和水溶液离心洗涤3次，得到羧基聚苯乙烯微球，其扫描电镜图如图6(A)所示。然后将羧基聚苯乙烯微球分散在浓度为0.25％(w/v)的SDS水溶液中，配置成为30mg/ml的羧基聚苯乙烯微球分散液，如图5(A)所示，并于4度冰箱中保存。

(2)近红外II区羧基聚苯乙烯荧光微球的合成

取近红外II区荧光染料40mg溶解于2mL二氯甲烷中，以便得到浓度为20mg/mL的染料溶液，如图5(B)所示；取步骤(1)制备的羧基聚苯乙烯微球分散液20mL于50mL平底锥口烧瓶中，超声5min混匀；将上述2mL的染料溶液加入平底锥口烧瓶中与20mL的羧基聚苯乙烯微球分散液超声混合，并于40摄氏度下磁力搅拌6h，以使羧基聚苯乙烯微球充分溶胀，染料溶液进入羧基聚苯乙烯微球溶胀后产生的微孔内；将混合物溶液于50摄氏度水浴中磁力搅拌过夜，使混合物溶液中的二氯甲烷完全挥发；所得产物离心分离后用乙醇超声清洗3次，再用水超声清洗数次，直至离心后上清溶液中几乎不含荧光染料，得到近红外II区羧基聚苯乙烯荧光微球产品。将近红外II区羧基聚苯乙烯荧光微球产品分散在水中(5％w/v)，4度冰箱中保存，如图5(C)所示。

(3)对制备得到的羧基聚苯乙烯荧光微球产品的评价

1)、图5(A)显示了分散在SDS水溶液中的羧基聚苯乙烯颗粒图呈白色；图5(B)显示了溶解在二氯甲烷中的荧光染料呈青色；而图5(C)显示了包裹荧光染料的羧基聚苯乙烯荧光微球产品呈青色。由此，从颜色的变化可以说明荧光染料已被成功地包裹在微球内部，同时颗粒表面的性质未发生大的改变。并且从图5(C)中可以看出合成的近红外II区羧基聚苯乙烯荧光微球可稳定地分散在水溶液中。

2)、对羧基聚苯乙烯荧光微球产品进行电镜扫描，扫描电镜图如图6(B)所示。从图6中可以看出，羧基聚苯乙烯颗粒包裹荧光染料前后颗粒形貌未发生明显改变，且合成后的荧光微球大小均一，无任何聚集现象。

3)、采用740nm激发光照射羧基聚苯乙烯荧光微球产品得到的荧光照片和荧光光谱图分别如图7(A)、图7(B)所示。图中显示该荧光微球在800-1400nm处发出强烈的荧光，通过测量，其量子效率高达25％。

(4)羧基聚苯乙烯荧光微球产品的应用

1)、近红外II区羧基聚苯乙烯荧光微球偶联抗体

将上述制备得到的近红外II区羧基聚苯乙烯荧光微球用分散剂MES(10mM pH＝6.2)，配置成1％(w/v)的均匀分散液。向分散液中加入EDC(5mg/mL)和sulfo-NHS(5mg/mL)，活化15min。离心丢弃上清液，重新分散于MES(10mM pH＝6.5)中，往溶液中加入0.2mg/mL的anti-PCT1鼠源单抗，搅拌反应2h。离心分离，弃上清，将颗粒分散于超声分散在20mM PBS(0.5％酪蛋白、2.5％BSA、1％蔗糖、2％PEG-2000和0.03wt％NaN₃，pH＝8.0)中，配置成1％(w/v)固含量的抗体结合荧光微球分散液，于4度冰箱中保存备用。

2)、免疫荧光层析试纸条制作

将抗体结合荧光微球分散液通过免疫层析专用喷头喷散在结合垫上，然后冷冻干燥10h备用。anti-PCT2(1.0mg/mL,75uL)和羊抗鼠IgG(1.2mg/mL,75uL)溶液通过免疫层析专用划线仪均匀地喷散在硝酸纤维素膜上，分别形成检测线(T线)和控制线(C线)，37度烘箱中过夜处理。然后，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸附垫整齐地沿轴固定到硬质粘贴纸板上。最后，将组装好的层析板通过免疫层析试纸切割机切割成3mm宽的试纸条，铝质包装袋中保存。

3)、免疫荧光试纸定量检测

将75uL人血清加至样品垫上，在毛细管力的作用下，标准样品和控制样品朝着吸附垫的方向运动。15min后，将试剂卡放入近红外荧光成像仪中成像检测。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种近红外II区高分子荧光微球的制备方法，其特征在于，包括：

(1)利用与水不混溶的有机溶剂对荧光染料进行溶解，以便得到荧光染料溶液，所述荧光染料具有式I所示结构

(2)将高分子微球分散于十二烷基磺酸钠水溶液中，以便得到微球载体溶液；

(3)将所述荧光染料溶液与所述微球载体溶液混合并进行超声处理，以便得到乳化混合液；

(4)将所述乳化混合液进行溶胀，以便使所述荧光染料溶液浸入所述高分子微球溶胀过程中产生的纳米孔内；以及

(5)对步骤(4)中所得混合物进行加热，随着所述有机溶剂的挥发，所述荧光染料结晶析出并被包裹在所述纳米孔内，以便获得所述近红外II区高分子荧光微球。

2.根据权利要求1所述近红外II区高分子荧光微球的制备方法，其特征在于，所述荧光染料溶液中所述荧光染料的浓度为1-50mg/mL。

3.根据权利要求1所述近红外II区高分子荧光微球的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为选自乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷和芳烃中的至少一种，优选二氯甲烷。

4.根据权利要求3所述近红外II区高分子荧光微球的制备方法，其特征在于，所述高分子微球为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚甲醛微球、聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球中的至少一种。

5.根据权利要求4所述近红外II区高分子荧光微球的制备方法，其特征在于，所述高分子微球的粒径为20nm-1000nm。

6.根据权利要求5所述近红外II区高分子荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将所述高分子微球按照10-200mg/ml的质量体积比分散于所述十二烷基磺酸钠水溶液中。

7.根据权利要求6所述近红外II区高分子荧光微球的制备方法，其特征在于，所述荧光染料溶液与所述微球载体溶液的体积比为1：(5-20)。

8.根据权利要求7所述近红外II区高分子荧光微球的制备方法，其特征在于，所述荧光染料与所述高分子微球的质量比为(0.1-30):100。

9.根据权利要求1所述近红外II区高分子荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(4)，所述溶胀是在10-50摄氏度下搅拌1-10小时完成的，

任选地，步骤(5)中，所述加热的温度为50-90摄氏度。

10.一种近红外II区高分子荧光微球，其特征在于，所述近红外II区高分子荧光微球通过权利要求1-9任一项所述近红外II区高分子荧光微球的制备方法制备得到。