CN107522605B - 倍半萜甲基环戊烯二酮，其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及倍半萜甲基环戊烯二酮，其制备方法及其应用，尤其是在抗生物污损中的应用，所述倍半萜甲基环戊烯二酮如下式(I)所示：
Figure DDA0001309668990000011
。

Description

倍半萜甲基环戊烯二酮，其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及海洋生物天然产物领域，具体地，本发明涉及从海洋真菌Penicilliumsp.F00120(2017年5月22日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCCNo：60190，保藏单位的地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所)制备倍半萜甲基环戊烯二酮及其在抗海洋生物污损中的应用。
背景技术
海洋来源的生物具有产生活性多样的新骨架化合物的巨大潜力。混源萜类一般源于自然界，结构多样，具有广泛的重要生物学活性(Fraga,B.M.Natural sesquiterpenoids.Nat.Prod.Rep.2002,19:650–672)。倍半萜醌或氢醌大多来源于海洋海绵(Gordaliza,M.Cytotoxic terpene quinones from marine sponges.Mar.Drugs2010,8,2849–2870)，少数来源于海藻(Fenical,W.；Sims,J.J.；Squatrito,D.；Wing,R.M.；Radlick,P.J.Org.Chem.1973,38,2383–2386)，也可以从海洋(Motti,C.A.；Bourguet-Kondracki,M.L.；Longeon,A.；Doyle,J.R.；Llewellyn,L.E.；Tapiolas,D.M.；Yin,P.Molecules 2007,12,1376–1388；Ying Fu,Ping Wu,Jinghua Xue,Hanxiang Li and XiaoyiWei.Myrothecols G and H,Two New Analogues of the Marine-Derived QuinoneSesquiterpene Penicilliumin A.Mar.Drugs 2015,13,3360-3367)和陆地微生物(Wijeratne,E.M.；Paranagama,P.A.；Marron,M.T.；Gunatilaka,M.K.；Arnold,A.E.；Gunatilaka,A.A.Sesquiterpene quinones and related metabolites fromPhyllosticta spinarum,a fungal strain endophytic in Platycladus orientalis ofthe Sonoran Desert.J.Nat.Prod.2008,71,218–222；Kawashima,K.；Nakanishi,K.；Tada,M.Structure of tauranin.Tetrahedron Lett.1964,5,1227–1231；Torigoe,K.；Wakasugi,N.；Sakaizumi,N.；Ikejima,T.；Suzuki,H.；Kojiri,K.；Suda,H.BE-40644,a newhuman thioredoxin system inhibitor isolated from Actinoplanessp.A40644.J.Antibiot.1996,49,314–317)中分离得到。倍半萜醌或氢醌是由补身烷或重排的补身烷骨架加上醌部分组成的混源萜类，由于具有广泛的多种多样的生物学活性而备受关注，其生物学活性包括抗肿瘤(Gordaliza,M.Cytotoxic terpene quinones frommarine sponges.Mar.Drugs2010,8,2849–2870)、抗菌(Sullivan,B.；Djura,P.；McIntyre,D.E.；Faulkner,D.J.Antimicrobial constituents of the sponge Siphonodictyoncoralliphagum.Tetrahedron 1981,37,979–982)、抗病毒(Vo,T.S.；Ngo,D.H.；van Ta,Q.；Kim,S.K.Eur.J.Phar.Sci.2011,44,11–20；Wright,A.E.；Cross,S.S.；Burres,N.S.；Koehn,F.Antiviral and antitumor terpene hydroquinones from marine sponge andmethods of use,USA.PCT WO 9112250A1,22August 1991)、抗结核(El Sayed,K.A.；ElSayed,P.X.；Shen,X.；Perry,T.L.；Zjawiony,J.K.；Mark,T.C.Tetrahedron 2000,56,949–953)和NF-κB抑制活性(Jiao,W.H.；Shi,G.H.；Xu,T.T.；Chen,G.D.；Gu,B.B.；Wang,Z.；Peng,S.；Wang,S.P.；Li,J.；；Han,B.N.；Zhang,W.；Lin,H.W.J.Nat.Prod.2016,79,406–411)等。有的倍半萜醌同时具有多种生物学活性，例如，分离自海绵Hyatellaintestinalis,Dactylospongia elegans,Spongia sp.和海藻Peyssonnelia sp.的倍半萜醌(hyatellaquinone)，具有强烈的抗HIV、抑制细胞生长、细胞毒、抗恶性细胞增殖及抗炎等活性。几种海绵来源的倍半萜醌或氢醌，例如avarol,avarone,illimaquinone和bolinaquinone有望成为新型抗肿瘤剂(Gordaliza,M.Cytotoxic terpene quinones frommarine sponges.Mar.Drugs2010,8,2849–2870)。倍半萜环己烯酮与倍半萜醌结构相似，在自然界中相对稀少。许多环己烯酮衍生物来源于植物共附生或海洋来源的真菌，具有体外抗肿瘤活性(Mohamed,I.E.；Gross,H.；Pontius,A.；Kehraus,S.；Krick,A.；Kelter,G.；Maier,A.；Fiebig,H.H.；
Figure GDA0001380770480000021
G.M.Org.Lett.2009,11,5014–5017；Lin,X.；Zhou,X.；Wang,F.；Liu,K.；Yang,B.；Yang,X.；Peng,Y.；Liu,J.；Ren,Z.；Liu,Y.Mar.Drugs 2012,10,106–115；Fang,S.M.；Cui,C.B.；Li,C.W.；Wu,C.J.；Zhang,Z.J.；Li,L.；Huang,X.J.；Ye.W.C.Mar.Drugs 2012,10,1266–1287)或抗菌活性(Ayer,W.A.；Altena,I.V.；Browne,L.M.Phytochemistry 1990,29,1661–1665；Schmidt,L.E.；Deyrup,S.T.；Baltrusaitis,J.；Swenson,D.C.；Wicklow,D.T.；Goler,J.B.J.Nat.Prod.2010,73,404–408)。倍半萜醌或氢醌在海绵或海藻中的含量非常低，一般在亚毫克每公斤范围，将其进一步研究或开发成为药物非常困难。药源问题成为制约其研究开发的瓶颈。微生物具有可重复培养的特点，在药源上占有巨大优势，同时可解决海洋生物资源可持续利用的问题。因此，从微生物，尤其是从海洋微生物中寻找倍半萜醌或氢醌类化合物具有重要意义。
全世界每年由生物污损造成的损失难以估算。多毛类华美盘管虫(polychaeteHydroides elegans)在中国南北内湾海域极为常见，是世界性的重要海洋污损生物，而且危害贝类养殖，可使牡蛎大量减产。研究发现表面附着的微生物藤黄微球菌(Micrococcusluteus)可显著诱导多毛类华美盘管虫的幼虫沉降，而且表面附着的微生物是多毛类华美盘管虫的幼虫沉降的前提条件。筛选得到具有明显海洋防污效果的有效成分用于改进或替代现有的海洋防污技术，已经成为近年来防除海洋污损生物研究的热点。因此，从海洋微生物中获得能够抗藤黄微球菌的化合物对于抗海洋污损生物多毛类华美盘管虫具有非常重要的意义。
发明内容
本发明涉及从海洋真菌Penicillium sp.F00120(2017年5月22日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC No：60190)提取下式(I)所示的倍半萜甲基环戊烯二酮，其类似物，其制备方法，及其在抗海洋生物污损中的应用。
第一方面，本发明提供了如下通式(A)的化合物：
Figure GDA0001380770480000031
其中，R1＝CH3或CH2OH，R2＝H或OH。
第二方面，本发明提供了下式(I)所示的化合物：
Figure GDA0001380770480000041
第三个方面，本发明提供了下式(I)所示化合物的制备方法，
Figure GDA0001380770480000042
所述方法包括如下步骤：
(1)发酵培养海洋真菌菌株Penicillium sp.F00120，其于2017年5月22日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC No：60190，保藏单位的地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所；
(2)用乙酸乙酯提取发酵培养物，并蒸馏回收，获得粗提物；
(3)用硅胶柱对粗提物进行分离，用石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱(1:0,30:1,20:1,10:1,5:1,1:1,0:1)；
(4)将步骤(3)获得的级份用硅胶柱层析，并用石油醚-甲醇进行洗脱；
(5)将步骤(4)获得的级份用Sephadex LH-20柱进一步层析，用氯仿-甲醇(1:1)进行洗脱；
(6)将步骤(5)获得的级份用半制备HPLC进行纯化，用80％甲醇进行洗脱，获得式(I)所示的化合物。
优选地，海洋真菌菌株Penicillium sp.F00120的发酵培养条件如下：
(1)将平板种子接种到液体种子培养基中，于15℃，180rpm摇床培养48h；
(2)将步骤(1)获得的培养物转接到固体发酵培养基中，于15℃静置培养，40天后收获培养物进行次级代谢产物分离纯化；
所述液体种子培养基的组成为：去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,NaCl 5g,蒸馏水1000mL；所述固体发酵培养及的组成为：大米200g,NaCl 4g,蒸馏水200mL，装于1000mL三角瓶中。
第四方面，本发明提供了如下通式(A)所示化合物的制备方法，
Figure GDA0001380770480000051
其中，R1＝CH3或CH2OH，R2＝H或OH，
所述方法包括上述第三方面所述的式(I)所示化合物的制备方法，R1和R2所代表的取代基都是常规的取代基，在获得了上述式(I)所示化合物的基础上，本领域技术人员通过常规试验能够获得通式(A)所示的所有化合物。
第五方面，本发明提供了用于制备下式(I)所示化合物的海洋真菌菌株Penicillium sp.F00120，其于2017年5月22日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC No：60190，保藏单位的地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所：
Figure GDA0001380770480000061
优选地，海洋真菌菌株Penicillium sp.F00120的发酵培养条件如下：
(1)将平板种子接种到液体种子培养基，于15℃，180rpm摇床培养48h；
(2)将步骤(1)获得的培养物转接到固体发酵培养基中，于15℃静置培养，40天后收获培养物进行次级代谢产物分离纯化。
优选地，所述液体种子培养基的组成为：去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,NaCl 5g,蒸馏水1000mL；所述固体发酵培养及的组成为：大米200g,NaCl4g,蒸馏水200mL，装于1000mL三角瓶中。
第六方面，本发明提供了如下通式(A)的化合物在抗海洋污损生物中的应用：
Figure GDA0001380770480000062
其中，R1＝CH3或CH2OH，R2＝H或OH。
优选地，所述海洋污损生物为多毛类华美盘管虫(polychaete Hydroideselegans)。
优选地，所述化合物为下式(I)所示的化合物：
Figure GDA0001380770480000071
第七方面，本发明提供了如下通式(A)的化合物在抗藤黄微球菌中的应用：
Figure GDA0001380770480000072
其中，R1＝CH3或CH2OH，R2＝H或OH。
优选地，所述化合物为下式(I)所示的化合物：
Figure GDA0001380770480000081
本发明通过对于2017年5月22日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)(保藏单位的地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所)，保藏号为GDMCC No：60190的海洋真菌Penicillium sp.F00120在固体大米发酵培养基上进行大规模发酵，并对发酵培养物进行提取、分离和纯化，从中制备得到了式(I)的化合物。经过结构解析，其被确定为倍半萜环戊烯酮结构的新颖化合物，具体结构如式(I)所示。通过对其抗海洋生物污损活性评价，发现式(I)的化合物具有显著的抗海洋生物污损作用。因此本发明的第二个目的是提供式(I)所示的化合物在抗海洋生物污损中的应用。
本发明为开发新的抗海洋生物污损活性物质提供了备选化合物，对开发中国海洋微生物来源的抗生物污损活性化合物资源的利用具有重要意义。
附图说明
图1图示了式(I)化合物的主要HMBC和1H-1H COSY信息。
图2图示了式(I)化合物的X射线晶体结构。
图3图示了式(I)化合物的CD光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的保护范围。
实施例1：式(I)的化合物的制备和结构鉴定
(1)制备
1.微生物材料：
于2017年5月22日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)(保藏单位的地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所)，保藏号为GDMCC No：60190的真菌菌株F00120从采集自南海1300米深的深海沉积物中分离得到，经过形态鉴定和ITS菌株鉴定，确定该菌株属于青霉属(Penicillium sp.)，命名为Penicillium sp.F00120。
2.微生物培养条件：
培养基：
液体种子培养基：去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,NaCl 5g,蒸馏水1000mL
固体发酵培养基：大米200g,NaCl 4g,蒸馏水200mL(装于1000mL三角瓶中)
将平板种子接种到液体种子培养基中，于15℃，180rpm摇床培养48h之后，转接到固体发酵培养基中，于15℃静置培养，40天后收获培养物进行次级代谢产物分离纯化。
3.提取分离：
从上述发酵培养物中用乙酸乙酯提取并蒸馏回收，获得了128g粗提物。然后用硅胶柱进行分离，用石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱(1:0,30:1,20:1,10:1,5:1,1:1,0:1)，获得9个级份(级份A1-A9)。其中级份A3(7.2g)用硅胶柱层析，并用石油醚-甲醇(20:1)进行洗脱，获得5个级份(级份D1-D5)。级份D2(654.5mg)用Sephadex LH-20柱进一步层析，用氯仿-甲醇(1:1)进行洗脱，产生6个级份(级份F1-F6)。其中级份F4(115.4mg)最后用半制备HPLC进行纯化，用80％甲醇进行洗脱，获得式(I)的化合物(25.5mg,tR 19.5min)。
(2)结构鉴定
对式(I)的化合物进行质谱(MS)、核磁共振(NMR)、旋光(OR)和圆二色谱(CD)、单晶测试，从而确定化合物的化学结构。
式(I)的化合物：无色晶体；[α]25 D+13.8(c 0.4,MeOH)；UV(MeOH)λmax:232nm；IRνmax:3354,3258,1703,1635,667,596cm-1；CD(0.5mM,MeOH)谱图参见附图3；高分辨质谱(+)-HRESIMS m/z 353.2114[M+Na]+,计算的C21H30O3Na,353.2087；m/z 331.2267[M+H]+,计算的C21H31O3,331.2268，显示分子式有七个不饱和度。1H和13C NMR数据见下表1。HSQC,HMBC和1H-1H COSY相关也证实了式(I)的化合物具有补身烷倍半萜部分骨架(参见附图2)。H2-14(δH1.88,2.02)与C-16(δC75.5)、C-17(δC203.2)及C-20(δC201.6),H-19(δH6.92)与C-16、C-17、C-18(δC160.4)、C-20及C-21(δC11.9),H-21(δH2.07)与C-17、C-18及C-19(δC142.8)的主要HMBC相关，表明式(I)的化合物包含了一个连接着C-14(δC29.9)的4-甲基-4-环戊烯-1,3-二酮部分(参见附图2)。因此，式(I)的化合物的平面结构得到解析，其被鉴定为补身烷倍半萜甲基环戊烯二酮，是一种新型骨架化合物。式(I)化合物的主要HMBC和1H-1H COSY信息参见附图1。
通过用丙酮/甲醇系统进行重结晶，获得了式(I)的化合物的单晶。通过用单晶X射线衍射分析，证实了式(I)的化合物的结构和构型(参见附图2)。Flack参数为0.02(7)，确定了式(I)的化合物的绝对构型。式(I)的化合物的整个立体化学被确定为5S,9S,10S,16S,并且被命名为penicilliumin B。
根据以上理化数据分析可知，式(I)的化合物具体结构如下所示：
Figure GDA0001380770480000111
表1.式(I)所示化合物在CDCl3中的NMR数据a
Figure GDA0001380770480000112
Figure GDA0001380770480000121
α1H NMR：125MHz；13C NMR：500MHz
(3)式(I)的化合物的晶体学数据
式(I)的化合物的晶体学数据是在单晶衍射仪(Agilent Xcalibur Nova single-crystal diffractometer)上收集得到的，用铜靶Kα射线进行单晶衍射，用全矩阵最小二乘法进行精化。
式(I)化合物的X射线晶体学数据如下表2所示：
表2.式(I)的化合物的X射线晶体学数据：
Figure GDA0001380770480000122
Figure GDA0001380770480000131
实施例2：式(I)的化合物的抗海洋生物污损活性的实验数据
采用藤黄微球菌菌株Micrococcus luteus UST950701-006作为待测菌株，测试式(I)的化合物的抗菌活性。Micrococcus luteus UST950701-006是一种可以诱导多毛类华美盘管虫(polychaete Hydroides elegans)的幼虫沉降从而引起海洋生物污损的细菌。以抗细菌药物青霉素为阳性对照，试验方法为测试最小抑制浓度(MIC)通用的微量肉汤稀释法。式(I)的化合物对Micrococcus luteus UST950701-006的MIC为4.0μg/ml，而阳性对照青霉素对该菌株的MIC为0.25μg/mL。因此，从MIC值看，可以认为式(I)的化合物对Micrococcus luteus UST950701-00具有显著的抗菌活性。因此，本发明提供了一种具有新型骨架的抗生物污损活性化合物，对于引起世界范围内海洋污损的污损生物多毛类华美盘管虫(polychaete Hydroides elegans)的抗生物污损活性物质的开发具有重要意义。

Claims (11)

1.通式(A)所示的化合物：
Figure FDA0002767436270000011
其中，R1＝CH3或CH2OH，R2＝H或OH。
2.式(I)所示的化合物：
Figure FDA0002767436270000012
3.式(I)所示化合物的制备方法，
Figure FDA0002767436270000013
所述方法包括如下步骤：
(1)发酵培养海洋真菌菌株Penicillium sp.F00120，其于2017年5月17日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC No：60190；
(2)用乙酸乙酯提取发酵培养物，并蒸馏回收，获得粗提物；
(3)用硅胶柱对粗提物进行分离，用石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱(1:0,30:1,20:1,10:1,5:1,1:1,0:1)；
(4)将步骤(3)获得的级份用硅胶柱层析，并用石油醚-甲醇进行洗脱；
(5)将步骤(4)获得的级份用Sephadex LH-20柱进一步层析，用氯仿-甲醇(1:1)进行洗脱；
(6)将步骤(5)获得的级份用半制备HPLC进行纯化，用80％甲醇进行洗脱，获得式(I)所示的化合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中海洋真菌菌株Penicillium sp.F00120的发酵培养条件如下：
(1)将平板种子接种到液体种子培养基中，于15℃， 180rpm摇床培养48h；
(2)将步骤(1)获得的培养物转接到固体发酵培养基中，于15℃静置培养，40天后收获培养物进行次级代谢产物分离纯化；
所述液体种子培养基的组成为：去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,NaCl 5g,蒸馏水1000mL；所述固体发酵培养及的组成为：大米200g,NaCl 4g,蒸馏水200mL，装于1000mL三角瓶中。
5.通式(A)所示化合物的制备方法，
Figure FDA0002767436270000021
其中，R1＝CH3或CH2OH，R2＝H或OH，
所述方法包括权利要求3的方法的步骤和权利要求4的方法的步骤。
6.海洋真菌菌株Penicillium sp.F00120，其于2017年5月17日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC No：60190。
7.权利要求6的海洋真菌菌株Penicillium sp.F00120的发酵培养方法，其中所述方法包括如下步骤：
(1)将平板种子接种到液体种子培养基中，于15℃， 180rpm摇床培养48h；
(2)将步骤(1)获得的培养物转接到固体发酵培养基中，于15℃静置培养，40天后收获培养物进行次级代谢产物分离纯化，
其中所述液体种子培养基的组成为：去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,NaCl 5g,蒸馏水1000mL；所述固体发酵培养及的组成为：大米200g,NaCl 4g,蒸馏水200mL，装于1000mL三角瓶中。
8.通式(A)的化合物在抗海洋污损生物中的应用，所述海洋污损生物为多毛类华美盘管虫：
Figure FDA0002767436270000031
其中，R1＝CH3或CH2OH，R2＝H或OH。
9.根据权利要求8所述的应用，所述化合物为下式(I)所示的化合物：
Figure FDA0002767436270000032
10.如下通式(A)的化合物在抗藤黄微球菌中的应用：
Figure FDA0002767436270000041
其中，R1＝CH3或CH2OH，R2＝H或OH。
11.根据权利要求10所述的应用，所述化合物为下式(I)所示的化合物：
Figure FDA0002767436270000042
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