CN107496971A - 一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料及其制备方法，具有三维网状结构，乳铁蛋白经电场力的作用定向扩散分布在细菌纤维素网络内部。本发明将细菌纤维素膜浸泡在蛋白缓冲液中，将乳铁蛋白溶于蛋白缓冲液中得到不同浓度的乳铁蛋白溶液，最后将浸泡后的细菌纤维素膜和乳铁蛋白溶液置于电场发生装置中经直流电压处理，然后取出，漂洗，得到细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料。本发明的制备方法对蛋白需求量少、复合均匀高效、耗时短、绿色环保且不会对细菌纤维素的空间结构造成破坏，得到的复合材料安全性高并具有广谱抗菌性。

Description

一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料及其制备方法
技术领域
本发明属于生物复合材料技术领域，特别涉及一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料及其制备方法。
背景技术
目前，创伤已成为继心血管疾病、癌症之后的第三大致死病因，而皮肤创伤作为创伤的重要分支，其有效治愈问题日益突出。敷料是临床上广泛使用的一种用以治疗皮肤创伤的医用材料。传统使用的敷料主要包括纱布、绷带、水凝胶类敷料、泡沫类敷料等。敷料如果能为创伤部位提供一个无菌的环境将降低感染率，加快创伤的愈合。因此，具有抗菌功能的敷料受到了人们关注，并开发出了一些新型抗菌敷料，如复合银离子和天然有机抗菌剂等。但这些抗菌敷料具有一定的局限性，如重金属对人体有毒害作用，而其他抗菌剂不具广谱抗菌性等。
细菌纤维素(Bacterial cellulose,BC)是指在一定条件下，由醋酸菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属和八叠球菌属等中的某种微生物合成的纤维素的统称。与植物纤维素相比较，他们具有相同的分子结构单元，但细菌纤维素具有很多独特的性质，如纳米级三维网状结构，超强的持水性，纯度、结晶度高，弹性模量和抗张强度高，良好的生物相容性和可降解性等，已广泛应用于食品、造纸、医学材料等各个领域。作为创口敷料，BC能为创伤部位提供一个湿润的环境，促进伤口愈合，减轻疼痛且不留痂，同时不会和创口粘连，避免换药时产生二次伤害。
乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种具有多种生理功能的天然活性铁结合糖蛋白，主要来源于哺乳动物的乳汁中，它不仅参与生物体内铁的转运，促进骨细胞生长、分化，而且还具有抗微生物、抗病毒、抗氧化、抗癌等功能。在诸多生物学功能当中，其抗菌活性是最引人注目。大量研究表明，乳铁蛋白对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及一些真菌表现出良好的抑制能力，且对人体无毒副作用，被公认为是一种安全的食品防腐辅助剂，广泛地应用于食品领域。
目前，BC与蛋白的复合方法主要为物理浸渍吸附和化学交联法。中国专利CN106344954A公开了一种生物抗菌细菌纤维素敷料及其制备方法，以ε-聚赖氨酸作为抑菌剂，原花青素为交联剂，通过溶液浸渍以及交联技术，制备出一种具有抗菌效果的细菌纤维素复合材料。然而，BC致密的纤维网络结构限制了蛋白分子通过自由扩散的方式进入其内部，且浸渍吸附法对蛋白溶液的体积需求量大，过程耗时长；交联剂的使用会影响BC的性能，且大部分交联剂具有毒性，不利于创面的恢复。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料及其制备方法，本发明利用乳铁蛋白分子属于两性物质，在不同pH的缓冲溶液中带有不同电荷的特性，在乳铁蛋白溶液中施加电场，通过电场力的作用，使乳铁蛋白分子朝特定电极方向移动，主动扩散迁移均匀进入细菌纤维素内部，将大大提高细菌纤维素与蛋白的复合效率，并获得复合均匀的产品。
本发明的一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料，具有三维网状结构，乳铁蛋白经电场力的作用定向扩散分布在细菌纤维素网络内部。
本发明的一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料的制备方法，包括：
(1)将细菌纤维素膜浸泡于蛋白缓冲液中，得到蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜；
(2)将乳铁蛋白溶于蛋白缓冲液中，经滤膜过滤后，得到乳铁蛋白溶液，其中乳铁蛋白溶液的浓度为0.5～20mg/mL；
(3)将步骤(1)得到的蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜和步骤(2)得到的乳铁蛋白溶液置于电场发生装置中经直流电压处理，然后取出，漂洗，得到细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料。
所述步骤(1)和(2)中的蛋白缓冲液为Tris-HCl蛋白缓冲液。
所述Tris-HCl蛋白缓冲液的制备方法为：将0.05～0.15M Tris溶液与HCl溶液按体积比1:0.8～1混合，定容，pH值为7.3～7.5，然后在0.08～0.1MPa压力下蒸汽灭菌20～30min，经冷藏获得。
所述步骤(1)中的细菌纤维素膜的制备方法为：以木醋杆菌为菌种，经液体培养基恒温静置培养后，置于氢氧化钠溶液中，在70～90℃下处理2～4h后取出，用去离子水漂洗至中性。
所述步骤(2)中的滤膜的滤径为0.2～0.25μm。
所述步骤(3)中的电场发生装置为一中空玻璃夹板，以细菌纤维素下端截面为负极，上截面乳铁蛋白溶液为正极。
所述步骤(3)中的直流电压为70～90V。
有益效果
(1)本发明制备的细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料的主要原料为细菌纤维素和乳铁蛋白，均为绿色环保生物材料，不含对人体有害的化学物质，应用于抗菌敷料中具有良好的抗菌效果，可根据伤口的情况和特点任意剪裁成各种形状，不粘连也不刺激皮肤，安全环保，丢弃后在环境中能迅速降解，可作为一种性能良好且绿色环保的功能性抗菌敷料。
(2)本发明细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料的制备方法简单易行，对蛋白需求量少，复合均匀高效，耗时短，与浸渍法比较优势明显，且不会对细菌纤维素的空间结构造成破坏；复合方法不使用化学交联剂，绿色环保，成本低廉，可工业化生产。
附图说明
图1是本发明细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料制备方法示意图和产品效果图。其中1为电极；2为乳铁蛋白溶液；3为双层夹板；4为细菌纤维素；5为1mL实施例1制备得到的细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料经考马斯亮蓝染色的效果图；6为30mL实施例1制备得到的细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料经考马斯亮蓝染色的效果图；7为对比例6制备得到的纯细菌纤维素经考马斯亮蓝染色的效果图。
图2是实施例1～5与对比例1～5制备的细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料经考马斯亮蓝染色的效果对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将50mL 0.1M Tris溶液与42mL 0.1M HCl溶液混合，定容至100mL(pH 7.4)，然后在0.08～0.1MPa压力下蒸汽灭菌20～30min，经冷藏得到蛋白缓冲液；
(2)以木醋杆菌为菌种，经液体培养基恒温静置培养后，置于氢氧化钠溶液中，在80℃下处理3h后取出，用去离子水漂洗至中性，得到的细菌纤维素膜；浸泡于步骤(1)的蛋白缓冲液中，得到蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜；
(3)称取5mg乳铁蛋白溶于10mL步骤(1)的蛋白缓冲溶液中，充分溶解后经0.22μm滤膜过滤后冷藏，得到浓度为0.5mg/mL的乳铁蛋白溶液；
(4)将步骤(2)中的蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜和步骤(3)中的乳铁蛋白溶液置于电场发生装置中，以细菌纤维素下截面铁蛋白溶液为负极，上截面乳铁蛋白溶液为正极，经80V直流电压处理后使乳铁蛋白从细菌纤维素截面主动定向扩散入细菌纤维素内部，将复合膜从电场发生装置中取出，用去离子水漂洗干净，得到细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料，经考马斯亮蓝染色后其效果如图2a所示。
取1mL本实施例制备得到的细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料，经考马斯亮蓝染色后其效果如图1所示。取30mL本实施例制备得到的细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料，经考马斯亮蓝染色后其效果如图1所示。
实施例2
采用实施例1步骤(1)制备得到的蛋白缓冲液和步骤(2)制备得到的蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜进行反应。
(1)称取10mg乳铁蛋白溶于10mL蛋白缓冲溶液中，充分溶解后经0.22μm滤膜过滤后冷藏，得到浓度为1mg/mL的乳铁蛋白溶液；
(2)将蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜和步骤(1)中的乳铁蛋白溶液置于电场发生装置中，以细菌纤维素下截面铁蛋白溶液为负极，上截面乳铁蛋白溶液为正极，经80V直流电压处理后使乳铁蛋白从细菌纤维素截面主动定向扩散入细菌纤维素内部，将复合膜从电场发生装置中取出，用去离子水漂洗干净，得到细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料，经考马斯亮蓝染色后其效果如图2c所示。
实施例3
采用实施例1步骤(1)制备得到的蛋白缓冲液和步骤(2)制备得到的蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜进行反应。
(1)称取50mg乳铁蛋白溶于10mL蛋白缓冲溶液中，充分溶解后经0.22μm滤膜过滤后冷藏，得到浓度为5mg/mL的乳铁蛋白溶液；
(2)将蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜和步骤(1)中的乳铁蛋白溶液置于电场发生装置中，以细菌纤维素下截面铁蛋白溶液为负极，上截面乳铁蛋白溶液为正极，经80V直流电压处理后使乳铁蛋白从细菌纤维素截面主动定向扩散入细菌纤维素内部，将复合膜从电场发生装置中取出，用去离子水漂洗干净，得到细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料，经考马斯亮蓝染色后其效果如图2e所示。
实施例4
采用实施例1步骤(1)制备得到的蛋白缓冲液和步骤(2)制备得到的蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜进行反应。
(1)称取100mg乳铁蛋白溶于10mL蛋白缓冲溶液中，充分溶解后经0.22μm滤膜过滤后冷藏，得到浓度为10mg/mL的乳铁蛋白溶液；
(2)将蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜和步骤(1)中的乳铁蛋白溶液置于电场发生装置中，以细菌纤维素下截面铁蛋白溶液为负极，上截面乳铁蛋白溶液为正极，经80V直流电压处理后使乳铁蛋白从细菌纤维素截面主动定向扩散入细菌纤维素内部，将复合膜从电场发生装置中取出，用去离子水漂洗干净，得到细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料，经考马斯亮蓝染色后其效果如图2g所示。
实施例5
采用实施例1步骤(1)制备得到的蛋白缓冲液和步骤(2)制备得到的蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜进行反应。
(1)称取200mg乳铁蛋白溶于10mL蛋白缓冲溶液中，充分溶解后经0.22μm滤膜过滤后冷藏，得到浓度为20mg/mL的乳铁蛋白溶液；
(2)将蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜和步骤(1)中的乳铁蛋白溶液置于电场发生装置中，以细菌纤维素下截面铁蛋白溶液为负极，上截面乳铁蛋白溶液为正极，经80V直流电压处理后使乳铁蛋白从细菌纤维素截面主动定向扩散入细菌纤维素内部，将复合膜从电场发生装置中取出，用去离子水漂洗干净，得到细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料，经考马斯亮蓝染色后其效果如图2i所示。
对比例1
将实施例1步骤(2)中的蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜利用浸渍法与实施例1步骤(3)中的乳铁蛋白溶液进行复合，用去离子水漂洗干净，经考马斯亮蓝染色，其效果如图2b所示。
对比例2
将实施例1步骤(2)中的蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜利用浸渍法与实施例2步骤(1)中的乳铁蛋白溶液进行复合，用去离子水漂洗干净，经考马斯亮蓝染色，其效果如图2d所示。
对比例3
将实施例1步骤(2)中的蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜利用浸渍法与实施例3步骤(1)中的乳铁蛋白溶液进行复合，用去离子水漂洗干净，经考马斯亮蓝染色，其效果如图2f所示。
对比例4
将实施例1步骤(2)中的蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜利用浸渍法与实施例4步骤(1)中的乳铁蛋白溶液进行复合，用去离子水漂洗干净，经考马斯亮蓝染色，其效果如图2h所示。
对比例5
将实施例1步骤(2)中的蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜利用浸渍法与实施例5步骤(1)中的乳铁蛋白溶液进行复合，用去离子水漂洗干净，经考马斯亮蓝染色，其效果如图2j所示。
分别对实施例1-5和对比例1-5制得的细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料进行抗菌效果测试，其测试结果如下表所示：
由上表可知：本发明制备方法得到的细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料对不同种类的细菌都具有明显的抑菌效果，且其抑菌强度与乳铁蛋白的浓度呈正相关。
对比例6
以木醋杆菌为菌种，经液体培养基恒温静置培养后，置于氢氧化钠溶液中，在80℃下处理3h后取出，用去离子水漂洗至中性，得到纯细菌纤维素膜，经考马斯亮蓝染色，其效果如图1所示。

Claims (8)

1.一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料，其特征在于：具有三维网状结构，乳铁蛋白经电场力的作用定向扩散分布在细菌纤维素网络内部。
2.一种如权利要求1所述的细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料的制备方法，包括：
(1)将细菌纤维素膜浸泡于蛋白缓冲液中，得到蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜；
(2)将乳铁蛋白溶于蛋白缓冲液中，经滤膜过滤后，得到乳铁蛋白溶液，其中乳铁蛋白溶液的浓度为0.5～20mg/mL；
(3)将步骤(1)得到的蛋白缓冲液浸泡后的细菌纤维素膜和步骤(2)得到的乳铁蛋白溶液置于电场发生装置中经直流电压处理，然后取出，漂洗，得到细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料。
3.根据权利要求2所述的一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中的蛋白缓冲液为Tris-HCl蛋白缓冲液。
4.根据权利要求3所述的一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料的制备方法，其特征在于：所述Tris-HCl蛋白缓冲液是通过将0.05～0.15M Tris溶液与HCl溶液按体积比1:0.8～1混合，定容，pH值为7.3～7.5，然后在0.08～0.1MPa压力下蒸汽灭菌20～30min，经冷藏获得。
5.根据权利要求2所述的一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的细菌纤维素膜是通过以木醋杆菌为菌种，经液体培养基恒温静置培养后，置于氢氧化钠溶液中，在70～90℃下处理2～4h后取出，用去离子水漂洗至中性后获得。
6.根据权利要求2所述的一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的滤膜的滤径为0.2～0.25μm。
7.根据权利要求2所述的一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的电场发生装置为一中空玻璃夹板，以细菌纤维素下端截面为负极，上截面乳铁蛋白溶液为正极。
8.根据权利要求2所述的一种细菌纤维素/乳铁蛋白抗菌敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的直流电压为70～90V。
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