CN107494250B - 一种银杏传粉滴的收集方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银杏传粉滴收集的方法。具体包括以下步骤：（1）在银杏胚珠未产生传粉滴时采集其着生的枝条，所述胚珠大小为2‑3 mm，胚珠珠柄长度为1.5‑2 cm；（2）将胚珠着生的银杏枝条截成15‑25 cm及30‑45 cm的长度，枝条插入吸足水的花泥或三角瓶内，并放置在20‑25℃，湿度60%‑80%的室内进行培养，光照时间为10‑11 h。（3）将胚珠培养至产生传粉滴后，使用2.5μL移液枪对银杏传粉滴进行采集，收集时间为夜间11点左右，以及早晨7点左右。采用以上方法收集银杏传粉滴，每个胚珠可收集5次左右的传粉滴，收集的量大大增加，且收集到的传粉滴内有效物质较多，传粉滴不受花粉的污染。

Description

一种银杏传粉滴的收集方法

技术领域

本发明涉及一种裸子植物传粉滴的采集方法，具体为一种银杏传粉滴的收集方法。

背景技术

裸子植物(Gymnosperms)是起源较古老的种子植物类群，由于裸子植物既保留了孢子植物的部分原始特征, 又具有种子植物的进化特性，因而在植物系统演化上处于重要的位置。裸子植物不具有真正的花，而是特殊结构的孢子叶球，且裸子植物大多为风媒传粉。因此，裸子植物为获得更高的有性生殖适应性，增加有效授粉，其大孢子叶球发育及胚珠形态结构已经演化形成各种独特的性状，如胚珠裸露、传粉滴分泌等。传粉滴是裸子植物胚珠在传粉期所产生的一种分泌物, 通过珠孔渗出, 并在珠孔处形成液滴状, 富含糖和氨基酸等营养物质。传粉滴可以增加胚珠接收花粉的面积，保持花粉活力，并负责将花粉从胚珠外部运输进胚珠内。此外，传粉滴还与花粉管萌发和受精等有性生殖过程关系密切，具有防御病菌侵染、识别花粉等方面的作用。因此,祼子植物散粉期或之前产生的传粉滴在其生殖过程中扮演着非常重要的角色。

银杏(Ginkgo biloba L.)，为银杏科银杏属的落叶乔木，是典型的风媒传粉植物，雌雄异株。银杏具有极高的药用、食用和观赏等价值。比如，银杏的种子中含有多种营养物质，包括蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、胡萝卜素等，还含有内酯、胆固醇、聚戊醇等有效成分，对于心脑血管疾病具有良好的疗效。由于银杏传粉滴中含有多糖类物质、蛋白质、纤维素、碳水化合物等物质，如果糖、葡萄糖和蔗糖等，为花粉萌发提供了营养来源，并且银杏传粉滴作为生殖细胞的载体，所以其传粉滴在有性生殖过程中起着非常重要的作用。然而，对于银杏传粉滴的研究还未能深入，主要是由于单个胚珠所分泌的传粉滴体积小，收集难度大，且生长在室外环境的胚珠所产生的传粉滴易接触花粉，随后传粉滴收缩且不再分泌。

通常收集传粉滴的方法是将带有胚珠的枝条剪下后水培一段时间，用毛细管对传粉滴收集，或在室外直接使用毛细管收集传粉滴，收集后放入-20℃或-80℃冰箱进行保存。但由于室外直接收集，胚珠及传粉滴容易沾染花粉，且毛细管收集容易导致传粉滴残留在管内，导致收集到传粉滴的含量较少，无法满足深入研究的需求。因此，因此建立配套的银杏传粉滴收集技术非常重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种可以大量收集传粉滴的银杏传粉滴的收集方法。

实现本发明的技术方案是：

一种银杏传粉滴的收集方法，具体包括以下步骤：

（1）在银杏胚珠未产生传粉滴时采集其着生的枝条，所述胚珠大小为2-3 mm，胚珠珠柄长度为1.5-2 cm；

（2）先对步骤（1）采集的银杏枝条按照长度分为两类，较短的枝条进一步截为15-25 cm，较长的枝条进一步截为30-45 cm的长度；

将截为15-25 cm的枝插入花泥中，花泥放置在托盘中，且托盘中加满水；

将截为30-45 cm的枝条，插入9 cm高的三角瓶内进行培养，且瓶内加水，水高度在8 cm左右；处于瓶内的枝条上无短枝，将枝条上去除的带有胚珠的短枝插入花泥中；

（3）将步骤（2）所述两类枝条放置在20-25℃，湿度60%-80%的室内进行培养，光照时间为10-11 h；

（4）将胚珠培养至产生传粉滴，且在传粉滴直径达到珠孔直径2倍大小时，使用移液枪对传粉滴进行采集，当采集到的传粉滴含量到达枪头1/4-1/3处时，将液体放入离心管中低温保存。

进一步地，步骤（1）中所述胚珠江苏地区在4月上旬进行采集；（因为银杏胚珠就江苏地区来讲，一般出现于4月初）。

进一步地，步骤（1）中采集传粉滴的银杏品种选用佛指、洞庭皇和龙眼三种。

进一步地，步骤（3）中所述两类枝条放置在22℃，湿度70%的室内进行培养，光照时间为10 h。（此为最优工艺条件）。

进一步地，步骤（4）中所述传粉滴采集时间为夜间10-12点，以及早晨6-8点。（是因为传粉滴一般在夜间和凌晨旺盛分泌，因此在此时可集中采集到较多的传粉滴）。

进一步地，步骤（4）中使用2.5μL移液枪对传粉滴进行采集，当采集到的传粉滴含量到达枪头1/4处时，将液体放入200μL离心管中。

进一步地，步骤（4）中所述离心管打开盖口垂直插入干冰中。

进一步地，步骤（4）中所述液体放入离心管中-80℃保存。

需要进一步说明的是，因为银杏枝条本身长度不一致，有的非常长（70 cm左右），因此需要人工截断，实验发现长度为30-45 cm的长度的枝条在三角瓶中水培情况较好；但是太短的枝条，放入三角瓶中由于其下半部分都会淹没在水中，下半部分胚珠所产生的传粉滴无法收集，且水培效果不好，因此插入花泥中可以有效解决这一问题。

本发明与现有的技术相比，其显著的优点是：

1.本发明从银杏胚珠的品种与选择，银杏胚珠培养环境及银杏传粉滴收集工具和方法等方面作了改进；

2.本发明采用花泥和三角瓶培养组合培养银杏枝条，满足不同高度银杏枝条需求，方便传粉滴的收集，且成本低，简单易行；

3.室内培养胚珠，防止胚珠所产生的传粉滴与花粉相互作用后收缩，可以增加采集到的传粉滴含量及次数；使用加湿器控制湿度，防止室内湿度过低，传粉滴迅速蒸发；使用移液枪收集传粉滴，降低操作难度，减少传粉滴残留，增加获取的量；这种操作方法操作简单，可收集到较多的传粉滴；

4.该方法为银杏传粉滴收集提供了技术的支持，为水培银杏胚珠，大量收集传粉滴提供可行方案。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面通过具体的实施例来说明本发明的技术方案。

实施例1

1.实施方法

（1）水培材料的选择

试材取自扬州大学农学院及泰兴带有胚珠的银杏（佛指）枝条。

（2）水培材料的处理

先对步骤（1）采集的枝条截成15-25 cm及30-45 cm的长度。将截为15-25 cm的枝插入花泥中，花泥放置在托盘中，且托盘中加满水。将截为30-45 cm的枝条，插入9 cm高的三角瓶内进行培养，瓶内水高度在8 cm左右，处于瓶内的枝条上无短枝，将枝条上去除的带有胚珠的短枝插入花泥中。

（3）水培的环境条件

将其放置在22℃，使用加湿器，将湿度控制在70%的室内进行培养，光照时间为10-12 h。

（4）传粉滴收集的时间

传粉滴收集时间为夜间11点左右，以及早晨7点左右，且在收集的传粉滴直径为胚珠珠孔直径2倍大小时，进行收集。

（5）传粉滴收集的方式

使用2.5μL移液枪对传粉滴进行采集，当采集到的传粉滴含量到达枪头1/4-1/3处时，将液体放入200μL离心管中-80℃保存。其中，离心管打开盖口垂直插入干冰中。

实验发现，将银杏枝条放入在三角瓶内水培效果比花泥培养效果较好，保证水分可供应到枝条顶端，花泥培养时间较长，是因为花泥培养还需要先保证花泥吸满水再为银杏枝条供水，费时费工。

采用三角瓶内水培或花泥培养每个胚珠可收集传粉滴5次左右，收集到的传粉滴大大增加。此外，收集到的传粉滴内有效物质较多，传粉滴不受花粉的污染。

实施例2

1.实施方法

（1）水培材料的选择

试材取自扬州大学农学院及泰兴带有胚珠的银杏（洞庭皇）枝条。

（2）水培材料的处理

先对步骤（1）采集的枝条截成15-25 cm及30-45 cm的长度。将截为15-25 cm的枝插入花泥中，花泥放置在托盘中，且托盘中加满水。将截为30-45 cm的枝条，插入9 cm高的三角瓶内进行培养，瓶内水高度在8 cm左右，处于瓶内的枝条上无短枝，将枝条上去除的带有胚珠的短枝插入花泥中。

（3）水培的环境条件

将其放置在20℃，使用加湿器，将湿度控制在80%的室内进行培养，光照时间为10-12 h。

（4）传粉滴收集的时间

传粉滴收集时间为夜间10点左右，以及早晨6点左右，且在收集的传粉滴直径为胚珠珠孔直径2倍大小时，进行收集。

（5）传粉滴收集的方式

使用2.5μL移液枪对传粉滴进行采集，当采集到的传粉滴含量到达枪头1/4-1/3处时，将液体放入200μL离心管中-80℃保存。其中，离心管打开盖口垂直插入干冰中。

实施例3

1.实施方法

（1）水培材料的选择

试材取自扬州大学农学院及泰兴带有胚珠的银杏（龙眼）枝条。

（2）水培材料的处理

先对步骤（1）采集的枝条截成15-25 cm及30-45 cm的长度。将截为15-25 cm的枝插入花泥中，花泥放置在托盘中，且托盘中加满水。将截为30-45 cm的枝条，插入9 cm高的三角瓶内进行培养，瓶内水高度在8 cm左右，处于瓶内的枝条上无短枝，将枝条上去除的带有胚珠的短枝插入花泥中。

（3）水培的环境条件

将其放置在25℃，使用加湿器，将湿度控制在60%的室内进行培养，光照时间为10-12 h。

（4）传粉滴收集的时间

传粉滴收集时间为夜间10点左右，以及早晨6点左右，且在收集的传粉滴直径为胚珠珠孔直径2倍大小时，进行收集。

（5）传粉滴收集的方式

使用2.5μL移液枪对传粉滴进行采集，当采集到的传粉滴含量到达枪头1/4-1/3处时，将液体放入200μL离心管中-80℃保存。其中，离心管打开盖口垂直插入干冰中。

尽管本发明已通过上述实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应该被认为是本发明的限制，在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (7)

1.一种银杏传粉滴的收集方法，具体包括以下步骤：

(1)在银杏胚珠未产生传粉滴时采集其着生的枝条，所述胚珠大小为2-3mm，胚珠珠柄长度为1.5-2cm；

(2)先对步骤(1)采集的银杏枝条按照长度分为两类，较短的枝条进一步截为15-25cm，较长的枝条进一步截为30-45cm的长度；

将截为15-25cm的枝条插入花泥中，花泥放置在托盘中，且托盘中加满水；

将截为30-45cm的枝条，插入9cm高的三角瓶内进行培养，且瓶内加水，水高度在8cm；处于瓶内的枝条上无短枝，将枝条上去除的带有胚珠的短枝插入花泥中；

(3)将步骤(2)所述两类枝条放置在22℃，湿度70％的室内进行培养，光照时间为10h；

(4)将胚珠培养至产生传粉滴，且在传粉滴直径达到珠孔直径2倍大小时，使用移液枪对传粉滴进行采集，当采集到的传粉滴含量到达枪头1/4-1/3处时，将液体放入离心管中低温保存。

2.根据权利要求1所述的银杏传粉滴的收集方法，其特征在于，步骤(1)中所述着生胚珠的枝条是江苏地区在4月上旬进行采集。

3.根据权利要求1所述的银杏传粉滴的收集方法，其特征在于，步骤(1)中采集传粉滴的银杏品种选用佛指、洞庭皇和龙眼三种。

4.根据权利要求1所述的银杏传粉滴的收集方法，其特征在于，步骤(4)中所述传粉滴采集时间为夜间10-12点，以及早晨6-8点。

5.根据权利要求1所述的银杏传粉滴的收集方法，其特征在于，步骤(4)中使用2.5μL移液枪对传粉滴进行采集，当采集到的传粉滴含量到达枪头1/4处时，将液体放入200μL离心管中。

6.根据权利要求1所述的银杏传粉滴的收集方法，其特征在于，步骤(4)中所述离心管打开盖口垂直插入干冰中。

7.根据权利要求1所述的银杏传粉滴的收集方法，其特征在于，步骤(4)中所述液体放入离心管中-80℃保存。