CN107475332A

CN107475332A - 一种反光素蛋白的提取方法

Info

Publication number: CN107475332A
Application number: CN201710277250.3A
Authority: CN
Inventors: 谢灿; 管哲; 蔡甜甜
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2037-04-25
Also published as: CN107475332B

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种反光素蛋白的提取方法，包括步骤：培养表达反光素蛋白的菌株，收获菌体并超声裂解；离心获得沉淀后在多种缓冲液中重悬、温育并纯化。利用本发明的方法能够获得具有活性的可溶形式的反光素蛋白，为研究反光素蛋白的性质以及更好地使用反光素蛋白提供了有利条件。

Description

一种反光素蛋白的提取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及反光素蛋白的提取。

背景技术

头足类动物(包括章鱼、墨鱼和鱿鱼)能够快速地调节自身皮肤的颜色，从而与环境融为一体进行隐蔽，或者与环境形成鲜明的对比，达到警戒猎食者保护自身不受攻击的效果。头足类动物这种动态的颜色变化主要原因之一是由细胞组织中有序排列的微观结构对光线的物理作用而产生的结构性色彩。负责这种动态的结构性色彩的微观结构是由一种特殊的蛋白质——反光素蛋白(reflectin)组成的。反光素蛋白在头足动物的细胞组织中广泛分布，并且具有多种形态和组装类型，它们的光学性质已经被广泛研究，然而关于这个蛋白的结构以及由反光素蛋白引起的结构色的内在复杂分子机制所知甚少。如果能够得到反光素蛋白的结构以及分子组装形式，对于理解头足动物动态结构色的变化具有重要的意义，而最关键的一步是得到具有活性的可溶形式的反光素蛋白。

目前获得反光素蛋白的方法主要是利用包涵体变性的方法纯化重组表达的反光素蛋白，包括：培养表达反光素蛋白的菌株、收获菌体并超声裂解，利用尿素和盐酸胍将包涵体彻底变性，然后通过镍柱亲和层析以及反相色谱柱进行纯化。蛋白所在的溶液环境始终含有变性剂盐酸胍或者其它有机溶剂(如乙腈)，所以得到的反光素蛋白是只有一级结构的线性分子，不具有生物活性。同样地，由于反光素蛋白在生理条件以及一般实验所用到的各种缓冲液中都具有极低的溶解性，其它的提取蛋白质的方法也都无法得到具有活性的可溶形式的反光素蛋白。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的上述问题，提供一种能够获得具有活性的可溶形式的反光素蛋白的方法。

本发明的反光素蛋白的提取方法包括以下步骤：

1)培养表达反光素蛋白的菌株，收获菌体并超声裂解；

优选地，所述表达反光素蛋白的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)菌株，其包含表达载体pCOLD1，所述表达载体包含编码反光素蛋白的基因；进一步优选地，所述编码反光素蛋白的基因为SoRef2基因，所述基因的序列如GenBank ID：HE687200.1所示；

优选地，当所述菌株在OD600达到0.6-0.8时，在288K的温度下利用终浓度为20μM的IPTG诱导20小时；

优选地，在诱导表达并收获菌体后，将菌体重悬于缓冲液T中，置于冰上超声裂解，所述缓冲液T包含20mM Tris、150mM NaCl，pH 8.0；优选地，超声裂解的参数为：200-220w，工作时间10s、间隙时间5s，循环100次；

2)离心步骤1)得到的裂解液，收集沉淀，将沉淀重悬于缓冲液R中，温育30min～1h，再次离心并收集沉淀，所述缓冲液R包含10～20mM Tris、150mM NaCl、0.3％～1％(体积比)Triton X-100，pH 8.0；优选地，所述缓冲液R包含20mM Tris、150mM NaCl、0.5％TritonX-100，pH 8.0；优选地，所述温育在旋转摇床中室温下进行；优选地，所述离心为15000rpm，30min；

3)将步骤2)得到的沉淀清洗三次，优选地，使用超纯水清洗；然后重悬于缓冲液S中，温育30min以上，离心，所述缓冲液S包含10～20mM Tris、150mM NaCl、0.05％～2％SDS，pH 8.0；优选地，所述缓冲液S包含20mM Tris、150mM NaCl、0.05％SDS，pH 8.0；优选地，所述温育在旋转摇床中室温下进行；优选地，所述离心为15000rpm，30min；

4)取步骤3)的离心上清液，向其中加入咪唑，利用Ni-NTA亲和层析纯化；优选地，所述咪唑的终浓度为10mM；优选地，所述亲和层析使用缓冲液W清洗柱子25～40个柱体积，优选地30个柱体积，使用洗脱缓冲液E洗脱蛋白，所述缓冲液W包含10～20mM Tris、150mMNaCl、10mM～40mM咪唑、0.05％～2％SDS，pH 8.0；优选地，所述缓冲液W包含20mM Tris、150mM NaCl、20mM咪唑、0.05％SDS，pH 8.0；所述缓冲液E包含10～20mM Tris、150mM NaCl、200mM以上的咪唑和0.05％～2％SDS，pH 8.0；优选地，所述缓冲液E包含20mM Tris、150mMNaCl、300mM咪唑、0.05％SDS，pH 8.0。

优选地，所述方法还包括：

5)将步骤4)获得的蛋白溶液利用凝胶过滤层析进一步分离；优选地，所述凝胶过滤层析使用柱Superdex 200 10/300 GL(GE Healthcare,Sweden)，流动相缓冲液包含10～20mM Tris、0.05％～2％SDS，pH 8.0；优选地，所述流动相缓冲液包含20mM Tris、0.1％SDS，pH 8.0。

利用本发明的方法获得的反光素蛋白在室温下稳定，具有高比例的二级结构，即，利用本发明的方法能够获得具有活性的可溶形式的反光素蛋白，为研究反光素蛋白的性质以及更好地使用反光素蛋白提供了有利条件。

附图说明

图1：实施例2所得的反光素蛋白的亲和层析结果；

图2：实施例3所得的反光素蛋白的凝胶过滤层析结果；

图3：反光素蛋白的透射电子显微镜结果；

图4：反光素蛋白SoRef2的颗粒的形态，其中，A为单个颗粒的不同面的结构，B为模拟的颗粒形态，C和D为2～4个颗粒的聚集形态；

图5：不同浓度SDS下获得的反光素蛋白的圆二色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来说明本发明，但本发明的内容不限于此。

以下实施例中，如无明确说明，所使用的仪器、试剂都是本领域常规仪器和试剂，可以从商购途径获得；所使用的方法都是本领域常规技术方法，本领域技术人员根据实验目的可以毫无疑义地知晓如何进行所述实验并实现发明目的。

本申请文件中，涉及描述SDS含量时，表示每100ml水中含有的SDS克数，例如，0.05％SDS表示每100ml水中含有0.05克SDS。

本发明中使用的反光素蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列如GenBank ID：HE687200.1所示。

实施例1：反光素蛋白的表达

全长的SoRef2基因(来自于墨鱼Sepia officinalis，GenBank ID：HE687200.1)由北京博迈德基因技术有限公司合成，并且克隆到表达载体pCOLD1(Takara)中，其N端带有His融合标签，启动子为冷诱导启动子cspA，操纵子为lacZ，表达系统为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。当细菌的OD600达到0.6-0.8时，在288K的温度下利用终浓度为20μM的IPTG诱导20小时，然后收获菌体。

实施例2：反光素蛋白的纯化

将收获的菌体重悬于缓冲液T(20mM Tris、150mM NaCl，pH 8.0)中，置于冰上超声裂解，超声裂解的参数为：200-220w，工作时间10s、间隙时间5s，循环100次。

将裂解液在15000rpm、30min离心后，保留沉淀，将沉淀重悬于缓冲液R(20mMTris、150mM NaCl、0.5％Triton X-100，pH 8.0)中，在旋转摇床中室温孵育30min，再次离心，收集沉淀。得到的沉淀用超纯水清洗三次，然后重悬于缓冲液S(20mM Tris、150mMNaCl、0.05％SDS，pH 8.0)中，在旋转摇床中室温孵育30min，溶解反光素蛋白。

15000rpm，30min离心后，取含有反光素蛋白的上清，向其中加入咪唑至终浓度为10mM，然后利用Ni-NTA亲和层析柱进行进一步的纯化。柱子使用缓冲液W(20mM Tris、150mMNaCl、20mM咪唑、0.05％SDS，pH 8.0)清洗30个柱体积，蛋白使用洗脱缓冲液E(20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑、0.05％SDS，pH 8.0)进行洗脱。

如图1所示，获得了反光素蛋白SoRef2。经测序验证，该反光素蛋白与预期蛋白一致。

实施例3：反光素蛋白的进一步纯化和验证

为进一步获得颗粒均一的蛋白质，利用凝胶过滤层析柱Superdex 200 10/300 GL(GE Healthcare,Sweden)进行反光素蛋白的颗粒分布分析及分离，所使用的流动相缓冲液为20mM Tris、0.1％SDS，pH 8.0。

如图2所示，所得到的反光素蛋白呈现出两个峰，代表蛋白颗粒大小有两个分布，其中第一个峰比较窄且对称，说明分布在此处的蛋白颗粒相对更加均一。利用凝胶过滤层析柱分析将大小不同的颗粒分离开，同时达到进一步提纯的效果，去除杂蛋白。对比图1和图2的电泳胶图来看，经过本步骤，图2中的蛋白条带更纯，说明本步骤起到了纯化效果，去除了杂蛋白。对得到的蛋白质颗粒进行透射电子显微镜观察，具体步骤为：收集凝胶过滤层析柱的第一个峰组分，然后取其中10微升，吸附在铜网(中镜科仪公司，铜网上具有超薄碳支持膜，厚度为3-5nm)表面，利用负染法制备电镜样品，通过透射电子显微镜(FEI(捷克)，Tecnai G2 20 Twin)进行观察。如图3所示，反光素蛋白形成颗粒，分散较均匀，并且能够进行二维平面颗粒图的分类，如图4所示，对这些颗粒进行分类和计算，得到平均颗粒结构，如图4的A所示，单个颗粒的三个不同面的结构。单个颗粒具有较高的对称性，为六棱柱或者五棱柱的结构，结构示意图如图4的B所示。单个的颗粒也会偶尔两个、三个甚至是四个聚集在一起，如图4的C和D所示。说明本发明提取的蛋白具有较好的三维结构。蛋白颗粒的平均直径为11nm，这个大小远大于一个32kD大小的蛋白，这与凝胶过滤层析的第一个出峰位置相一致。

实施例4：不同浓度的SDS实验

为考察不同浓度SDS对反光素蛋白的活性影响，进行此实验以验证。

将上述得到的反光素蛋白SoRef2对含有不同浓度SDS的磷酸缓冲液(19mMNa₂HPO₄、1mM NaH₂PO₄、0.05％/0.10％/2.00％SDS，pH8.0)进行透析，调节蛋白终浓度为0.2mg/ml。使用Bio-Logic圆二色谱仪(法国，MOS-500)在室温下进行测量，得到的数据利用在线服务器BESTSEL(http://bestsel.elte.hu/)进行二级结构分析。

如图5及表1所示，在SDS存在的情况下，利用本发明方法获得的反光素蛋白依然具有高比例的二级结构，即使在高达2％SDS存在的情况下，β折叠的比例依然很高。有文献显示，当蛋白质的结构比较对称且紧密，β折叠含量较高，抵抗变性剂和降解的能力相对较高。这与反光素蛋白具有重复的序列以及高比例的β折叠相符合。由此可见，本发明方法获得的反光素蛋白在溶液中室温放置十分稳定，不容易降解，具有高级结构，能够抵抗SDS的变性作用。

表1：不同浓度SDS对反光素蛋白结构的影响(来自圆二色谱的实验结果)

SDS(％)	α-螺旋(％)	β-片层(％)	β-转角(％)	其它(％)
					0.05	12.3	33.6	12.0	42.1
0.10	18.5	28.6	9.5	43.4
					2.00	7.5	28.0	12.6	51.8

Claims

1.一种反光素蛋白的提取方法，包括：

1)培养表达反光素蛋白的菌株，收获菌体并超声裂解；

2)离心步骤1)得到的裂解液，收集沉淀，将沉淀重悬于缓冲液R中，温育30min～1h，再次离心并收集沉淀，所述缓冲液R包含10～20mM Tris、150mM NaCl、0.3％～1％Triton X-100，pH 8.0；

3)将步骤2)得到的沉淀清洗三次，然后重悬于缓冲液S中，温育30min以上，离心，所述缓冲液S包含10～20mM Tris、150mM NaCl、0.05％～2％SDS，pH 8.0；

4)取步骤3)的离心上清液，向其中加入咪唑，利用Ni-NTA亲和层析纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括：

5)将步骤4)获得的蛋白溶液利用凝胶过滤层析进一步分离；优选地，所述凝胶过滤层析使用柱Superdex 200 10/300GL(GE Healthcare,Sweden)，流动相缓冲液包含10～20mMTris、0.05％～2％SDS，pH 8.0；优选地，所述流动相缓冲液包含20mM Tris、0.1％SDS，pH8.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2)中，所述缓冲液R包含20mM Tris、150mMNaCl、0.5％Triton X-100，pH 8.0；步骤3)中，所述缓冲液S包含20mM Tris、150mM NaCl、0.05％SDS，pH 8.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤4)中，所述亲和层析使用缓冲液W清洗柱子25～40个柱体积，优选地30个柱体积，使用洗脱缓冲液E洗脱蛋白，所述缓冲液W包含10～20mMTris、150mM NaCl、10mM～40mM咪唑、0.05％～2％SDS，pH 8.0，所述缓冲液E包含10～20mMTris、150mM NaCl、200mM以上的咪唑和0.05％～2％SDS，pH 8.0。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述缓冲液W包含20mM Tris、150mM NaCl、20mM咪唑、0.05％SDS，pH 8.0；所述缓冲液E包含20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑、0.05％SDS，pH 8.0。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤4)中，所述咪唑的终浓度为10mM。

7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其中，步骤2)和3)中，所述温育在旋转摇床中室温下进行，所述离心为15000rpm，30min。

8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其中，步骤1)中，所述表达反光素蛋白的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)菌株，其包含表达载体pCOLD1，所述表达载体包含编码反光素蛋白的基因；优选地，所述编码反光素蛋白的基因为SoRef2基因，所述基因的序列如GenBank ID：HE687200.1所示。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，当所述菌株在OD600达到0.6-0.8时，在288K的温度下利用终浓度为20μM的IPTG诱导20小时。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，在诱导表达并收获菌体后，将菌体重悬于缓冲液T中，置于冰上超声裂解，所述缓冲液T包含20mM Tris、150mM NaCl，pH 8.0；优选地，超声裂解的参数为：200-220w，工作时间10s、间隙时间5s，循环100次。