CN107460240A - 一种利用基因表达变化快速检测海水或海洋沉积物中多环芳烃的方法 - Google Patents

一种利用基因表达变化快速检测海水或海洋沉积物中多环芳烃的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用基因表达变化快速检测海水或海洋沉积物中多环芳烃的方法。本发明检测方法是以诸氏鲻虾虎鱼为实验动物，以诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因、多耐药基因1或磷脂酸磷酸酯酶基因作为生物标志物，检测海水或海洋沉积物中的多环芳烃。本发明方法首次使用标准化的生物作为实验动物并通过筛选出三个新型的生物标志物用于快速检测多环芳烃，具有可信度高、重复性好、无本底污染风险、检测周期短、灵敏度高且成本低等优点，对当前海洋多环芳烃检测技术起到重大的提升作用，具有良好的推广应用前景。

Description

一种利用基因表达变化快速检测海水或海洋沉积物中多环芳 烃的方法
技术领域
本发明属于海洋多环芳烃生物检测技术领域，更具体地说，本发明涉及一 种应用诸氏鲻虾虎鱼及其细胞色素P4502K3基因、多耐药基因1或磷脂酸磷酸 酯酶基因快速检测海水或海洋沉积物中多环芳烃污染的方法。
背景技术
多环芳烃(PAHs)作为一种持久性有机污染物，主要来源于化石燃料的不 完全燃烧，具有高度致癌、致畸和致突变作用，多国均将其列为重点监控项目。 我国经济经过多年持续高速发展，沿海地区均已遭受不同程度的PAHs污染，渤 海辽东半岛部分地区，海水和沉积物中PAHs浓度已分别高达1717.87mg/L和 1606.89ng/L，南海部分地区沉积物中PAHs浓度也超过454.9ng/L，我国PAHs 污染程度已十分严重。苯并(a)芘是最具代表性的PAHs之一，在进入体内后 通过降解代谢产生毒性更高的中间产物，对生物生殖系统、免疫系统、神经系 统等产生严重影响，如产生的7,8-二羟基-9，10-环氧苯并(a)芘可导致基因突 变、激活原癌基因。
目前，基于传统理化的检测方法较难反映毒物对生物的综合效应，基于致 死效应的生物毒性检测方法存在周期长、灵敏度不高等问题。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有海洋多环芳烃检测中存在的周期长、灵敏度 不高等问题，提供一种海水或海洋沉积物中多环芳烃的快速检测方法，以实现 多环芳烃的快速、灵敏、准确检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种利用基因表达变化快速检测海 水或海洋沉积物中多环芳烃的方法，其中以诸氏鲻虾虎鱼为实验动物，以诸氏 鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因(CYP2K3)、多耐药基因1(MRP1)或磷脂酸 磷酸酯酶基因(PAP)为生物标志物，检测海水或海洋沉积物中的多环芳烃。
具体地，本发明利用基因表达变化快速检测海水或海洋沉积物中多环芳烃 的方法包括如下步骤：
(1)以诸氏鲻虾虎鱼成鱼作为实验动物；
(2)将诸氏鲻虾虎鱼置于待测海水或待测海洋沉积物制成的液体中6h～96h 后检测诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因、多耐药基因1和/或磷脂酸磷酸酯 酶基因的表达水平；
(3)当诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因、多耐药基因1的表达水平升 高，或当磷脂酸磷酸酯酶基因的表达水平下降，提示待测海水或待测海洋沉积 物被多环芳烃污染。
作为本发明利用基因表达变化快速检测海水或海洋沉积物中多环芳烃的方 法的一种优选技术方案，所述诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因的特异性引 物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；所述多耐药基因1的特异性引物的核 苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示；所述磷脂酸磷酸酯酶基因的特异性引物的核 苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示。
本发明利用基因表达变化快速检测海水或海洋沉积物中多环芳烃的方法特 别适合苯并(a)芘的快速检测。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一类多环芳烃检测标志物，具体 为诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因、多耐药基因1或磷脂酸磷酸酯酶基因； 其中，所述诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因和多耐药基因1的表达水平与 多环芳烃的浓度呈正相关；所述磷脂酸磷酸酯酶基因的表达水平与多环芳烃的 浓度呈负相关。
本发明多环芳烃检测标志物——诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因、多 耐药基因1或磷脂酸磷酸酯酶基因可用于检测海水或海洋沉积物中是否存在多 环芳烃污染。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明方法使用的诸氏鲻虾虎鱼为我国本土海水鱼类，现已完成实验 动物化研究，标准化的诸氏鲻虾虎鱼具有遗传背景清晰、质量稳定可靠的优点， 用于多环芳烃毒性测试时的实验结果可信度高、重复性好，且无本底污染的风 险，便于大规模推广应用；
(2)本发明首次筛选出对海洋多环芳烃污染敏感的三个新型生物标志物， 分别为诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因(CYP2K3)、多耐药基因1(MRP1) 和磷脂酸磷酸酯酶基因(PAP)；当超微量污染物进入鱼体内后，虽短期不会导 致鱼死亡，但可在6h内迅速诱导鱼体内解毒、免疫和代谢等相关基因的表达； 本发明筛选的诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因(CYP2K3)、多耐药基因1 (MRP1)和磷脂酸磷酸酯酶基因(PAP)均为相关信号通路上的关键基因，利 用基于基因表达层面的生物标志物，可大大缩短检测周期(6h内)、增加检测灵 敏度(超微量)并降低检测成本，对当前海洋多环芳烃检测技术起到重大的提 升和补充作用。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施 例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例 仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地 制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
1、实验生物
采用诸氏鲻虾虎鱼成鱼作为实验生物，为120日龄个体。实验鱼于循环水 养殖系统中养殖，水温26℃，盐度20，每天投喂卤虫无节幼体和配合饲料各1 次，每周换水1/2。实验开始前24h挑选实验鱼于静水中暂养，暂养期间温度控 制在26±0.5℃，盐度20±1，溶解氧在60％饱和度以上。
2、样品制备
试验用水为无染天然海水，用曝气自来水稀释盐度至20。按照表1，利用 纯度为99.9％的苯并(a)芘配制1个对照组和3浓度组，每组各设3个重复。
3、毒性试验
试验容器为2L玻璃烧杯，试验液1L，每杯放置实验鱼3尾。试验时间为6h， 期间不投喂，不换水。试验期间环境因子同暂养条件。
表1毒性试验各组苯并(a)芘浓度
组别 对照组 浓度1 浓度2 浓度3
浓度 0 0.02μg/L 0.2μg/L 2μg/L
4、总RNA提取
试验期间实验鱼无死亡。试验结束后分别取每组实验鱼新鲜肝脏适量，每 个平行组3尾鱼的肝脏样本混合，合计12个样本。按照常规方法提取总RNA， 检测浓度和纯度，用RNA free水将各组RNA浓度调为一致。
5、反转录
利用反转录试剂对12个样本总RNA分别进行反转录。
6、荧光定量PCR
以actin为内参基因，首链cDNA为模板，利用SYBR荧光定量PCR法检 测CYP2K3、MRP1和PAP基因在对照组和试验组中表达量。
其中，内参actin、CYP2K3、MRP1和PAP基因的特异性引物为：
CYP2K3上游引物：SEQ ID NO:1；
CYP2K3下游引物：SEQ ID NO:2；
MRP1上游引物：SEQ ID NO:3；
MRP1下游引物：SEQ ID NO:4；
PAP上游引物：SEQ ID NO:5；
PAP下游引物：SEQ ID NO:6；
内参actin上游引物：SEQ ID NO:7；
内参actin下游引物：SEQ ID NO:8。
(1)PCR扩增
采用含有SYBR green染色的PCR试剂，在ABI 7500荧光定量仪进行PCR 扩增，PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃34s；40个循环。
7、相对表达量计算
采用2-△△Ct法计算CYP2K3、MRP1和PAP基因在各浓度组的相对表达量， 数据见表2。
表2基因相对表达量
8、结果判定
CYP2K3和MRP1基因相对表达量与苯并(a)芘浓度呈正相关，PAP基因 相对表达量与苯并(a)芘浓度呈负相关。受苯并(a)芘污染的海水或沉积物会 显著促进CYP2K3和MRP1基因上调表达，抑制PAP基因出现下调表达。
实施例2
1、实验生物
采用诸氏鲻虾虎鱼成鱼作为实验生物，为90日龄个体。实验鱼于循环水养 殖系统中养殖，水温26℃，盐度30，每天投喂卤虫无节幼体和配合饲料各1次， 每周换水1/2。实验开始前24h挑选实验鱼于静水中暂养，暂养期间温度控制在 26±0.5℃，盐度30±1，溶解氧在60％饱和度以上。
2、样品制备
试验样品为南海某已知受PAHs污染的海水，对照组为无污染的天然海水。 配制1个对照组和1浓度组，每组各设3个重复。
3、毒性试验
试验容器为2L玻璃烧杯，试验液1L，每杯放置实验鱼3尾。试验时间为96h， 期间每24h换液1次，每天投喂1次，每次投喂100只卤虫/尾鱼。试验期间环 境因子同暂养条件。
4、总RNA提取
试验期间实验鱼无死亡。试验结束后分别取每组实验鱼新鲜肝脏适量，每 个平行组3尾鱼的肝脏样本混合，合计6个样本。按照常规方法提取总RNA， 检测浓度和纯度，用RNAfree水将各组RNA浓度调为一致。
5、反转录
利用反转录试剂对6个样本总RNA分别进行反转录。
6、荧光定量PCR
以actin为内参基因，首链cDNA为模板，利用SYBR荧光定量PCR法检 测CYP2K3、MRP1和PAP基因在对照组和试验组中表达量。
其中，内参actin、CYP2K3、MRP1和PAP基因的特异性引物为：
CYP2K3上游引物：SEQ ID NO:1；
CYP2K3下游引物：SEQ ID NO:2；
MRP1上游引物：SEQ ID NO:3；
MRP1下游引物：SEQ ID NO:4；
PAP上游引物：SEQ ID NO:5；
PAP下游引物：SEQ ID NO:6；
内参actin上游引物：SEQ ID NO:7；
内参actin下游引物：SEQ ID NO:8。
(1)PCR扩增
采用含有SYBR green染色的PCR试剂，在ABI 7500荧光定量仪进行PCR 扩增，PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃34s；40个循环。
7、相对表达量计算
采用2-△△Ct法计算CYP2K3、MRP1和PAP基因在各浓度组的相对表达量， 数据见表3。
表3 基因相对表达量
8、结果判定
CYP2K3和MRP1基因相对表达量与苯并(a)芘浓度呈正相关，PAP基因 相对表达量与苯并(a)芘浓度呈负相关。受苯并(a)芘污染的海水或沉积物会 显著促进CYP2K3和MRP1基因上调表达，抑制PAP基因出现下调表达。
实施例3
1、实验生物
采用诸氏鲻虾虎鱼成鱼作为实验生物，为90日龄个体。实验鱼于循环水养 殖系统中养殖，水温26℃，盐度30，每天投喂卤虫无节幼体和配合饲料各1次， 每周换水1/2。实验开始前24h挑选实验鱼于静水中暂养，暂养期间温度控制在 26±0.5℃，盐度30±1，溶解氧在60％饱和度以上。
2、样品制备
样品为南海某港口已知受PAHs污染的沉积物，稀释水为盐度为30的无染 天然海水。取沉积物与稀释水，按体积1：4比例混合，2000r/min搅拌30分钟， 静置1小时，取上清液用于毒性试验。配制1个对照组和1浓度组，对照组为 天然海水，每组各设3个重复。
3、毒性试验
试验容器为2L玻璃烧杯，试验液1L，每杯放置实验鱼3尾。试验时间为6h， 期间每24h换液1次，每天投喂1次，每次投喂100只卤虫/尾鱼。试验期间环 境因子同暂养条件。
4、总RNA提取
试验期间实验鱼无死亡。试验结束后分别取每组实验鱼新鲜肝脏适量，每 个平行组3尾鱼的肝脏样本混合，合计6个样本。按照常规方法提取总RNA， 检测浓度和纯度，用RNAfree水将各组RNA浓度调为一致。
5、反转录
利用反转录试剂对6个样本总RNA分别进行反转录。
6、荧光定量PCR
以actin为内参基因，首链cDNA为模板，利用SYBR荧光定量PCR法检 测CYP2K3、MRP1和PAP基因在对照组和试验组中表达量。
其中，内参actin、CYP2K3、MRP1和PAP基因的特异性引物为：
CYP2K3上游引物：SEQ ID NO:1；
CYP2K3下游引物：SEQ ID NO:2；
MRP1上游引物：SEQ ID NO:3；
MRP1下游引物：SEQ ID NO:4；
PAP上游引物：SEQ ID NO:5；
PAP下游引物：SEQ ID NO:6；
内参actin上游引物：SEQ ID NO:7；
内参actin下游引物：SEQ ID NO:8。
(1)PCR扩增
采用含有SYBR green染色的PCR试剂，在ABI 7500荧光定量仪进行PCR 扩增，PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃34s；40个循环。
7、相对表达量计算
采用2-△△Ct法计算CYP2K3、MRP1和PAP基因在各浓度组的相对表达量， 数据见表4。
表4 基因相对表达量
8、结果判定
CYP2K3和MRP1基因相对表达量与苯并(a)芘浓度呈正相关，PAP基因 相对表达量与苯并(a)芘浓度呈负相关。受苯并(a)芘污染的海水或沉积物会 显著促进CYP2K3和MRP1基因上调表达，抑制PAP基因出现下调表达。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上 述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述 的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的 保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是 为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
SEQ ID NO:1 CYP2K3上游引物
GTGGT GGTGC TGGCT GGTTA C
SEQ ID NO:2 CYP2K3下游引物
ATGTC CTTCC AAGGC TCGTC AT
SEQ ID NO:3 MRP1上游引物
AAAGA CTCAC CTCCG TTCCT GA
SEQ ID NO:4 MRP1下游引物
TCCCA CTCGT CCTCT CCATC TC
SEQ ID NO:5 PAP上游引物
ACACA TTACC CACAA GACGA GGCAC
SEQ ID NO:6 PAP下游引物
CTGGT GAGTG ATGTT TTGAG AAGTT G
SEQ ID NO:7 内参actin上游引物
GGAAG GTGGA CAGAG AAGCC
SEQ ID NO:8 内参actin下游引物
TGCTG ACAGG ATGCA GAAGG

Claims (6)

1.一种利用基因表达变化快速检测海水或海洋沉积物中多环芳烃的方法，其特征在于，所述方法是以诸氏鲻虾虎鱼为实验动物，以诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因、多耐药基因1或磷脂酸磷酸酯酶基因为生物标志物，检测海水或海洋沉积物中的多环芳烃。
2.根据权利要求1所述利用基因表达变化快速检测海水或海洋沉积物中多环芳烃的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以诸氏鲻虾虎鱼成鱼作为实验动物；
(2)将诸氏鲻虾虎鱼置于待测海水或待测海洋沉积物制成的液体中6h～96h后检测诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因、多耐药基因1和/或磷脂酸磷酸酯酶基因的表达水平；
(3)当诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因、多耐药基因1的表达水平升高，或当磷脂酸磷酸酯酶基因的表达水平下降，提示待测海水或待测海洋沉积物被多环芳烃污染。
3.根据权利要求2所述利用基因表达变化快速检测海水或海洋沉积物中多环芳烃的方法，其特征在于，所述诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；所述多耐药基因1的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示；所述磷脂酸磷酸酯酶基因的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示。
4.根据权利要求2所述利用基因表达变化快速检测海水或海洋沉积物中多环芳烃的方法，其特征在于，所述多环芳烃为苯并(a)芘。
5.一类多环芳烃检测标志物，其特征在于，所述检测标志物为诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因、多耐药基因1或磷脂酸磷酸酯酶基因；其中，所述诸氏鲻虾虎鱼细胞色素P4502K3基因和多耐药基因1的表达水平与多环芳烃的浓度呈正相关；所述磷脂酸磷酸酯酶基因的表达水平与多环芳烃的浓度呈负相关。
6.权利要求5所述多环芳烃检测标志物在海水或海洋沉积物中多环芳烃检测或监控中的应用。
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