CN107460233A - 一种通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过检测焦磷酸电荷来提高信噪比的基因测序方法，该方法通过在反应体系中加入dNTP、聚合酶、催化剂，实现与碱基配对释放焦磷酸，焦磷酸发生水解生成磷酸氢盐离子，磷酸氢盐离子与传感器表面受体结合产生电信号，进一步翻译为对应的碱基；本发明能够检测扩增过程中产生的焦磷酸，因为焦磷酸的相对分子质量为174，扩散速率较氢离子慢很多，能够检测的电信号时间较长，能够有效地提高准确率；且焦磷酸带有4个正电荷，扩散减慢，有效表面浓度较高，转换成的电信号较强，检测的信噪比较高；高信噪比允许使用更小的传感器，更高密度及规模的传感器阵列，从而可进一步提高测序通量，降低测序成本。

Description

一种通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法
技术领域
本发明属于基因测序领域，具体涉及一种通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法。
技术背景
快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。
测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，早在1954年就已经出现了关于早期测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列；1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法(Sanger基因测序法)和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生；此后在三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，包括Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术；近几年，Helicos公司的单分子测序技术、Pacific Biosciences公司的单分子实时(SingleMolecule Real Time,SMRT)测序技术和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子测序技术被认为是第三代测序技术；同时以Illumina为代表的第二代测序技术及美国Ion Torrent公司开发的半导体基因测序技术持续取得突破，发展出新一代基因测序技术(NGS)。通过大规模传感器阵列实现高通量并行测序，极大降低了基因测序价格及测序时间，并将准确度提高到99％以上，测序技术正向着高通量、低成本、高准确率的方向发展。
但是，目前的测序方法存在诸多问题。第一代测序技术成本高，据估算，用该方法完成人类基因组计划，需花30亿美元；数据分析量大；自动化程度不高或需手工操作；一些聚合酶链式反应(PCR)产物不能被分析而需制备单克隆；且该法速度慢，测序时间长，据估算，用该法完成人类基因组的测序，至少需用时3年。第二代测序相对而言，工作量仍然比较大，费用仍然比较高，不适合用于序列已知的单基因的突变检测；关键在于读长比较短，时间还不够快，所需模板用量还比较多，故无法在单细胞、单分子水平进行检测。第三代测序技术适用于起始量少、需要高通量、自动化程度很高的全基因组测定，因此对于要求不高的单个基因位点的检测如单基因病等的基因诊断反而不适用，即性价比反而降低；此外，第三代测序技术仍需要致力于背景噪音的减少，提高准确率，及降低测序费用；另外，在DNA的固定方面如何保持DNA的延展性而不出现二聚体结构，也有待解决和完善的地方。新一代测序技术，比如Ion Torrent公司的半导体测序技术，由于采用了半导体离子敏感场效应传感器，可以借助半导体工业的摩尔定律持续减小传感器尺寸，增加阵列规模，提高测序的通量，降低费用；但是，新一代基因测序面临的主要挑战之一是如何提高随着传感器越来越小而大幅降低的信噪比并保持高准确性。
发明内容
1、发明要解决的技术问题
在Sanger基因测序基本法的框架下，在碱基延伸反应过程中，当DNA聚合酶在每一个DNA模板链上滑动，合成链每掺入一个核苷酸(dNTP)，就会释放出一个氢离子和一个焦磷酸。传统的离子流Ion Torrent半导体测序中的离子敏感场效应晶体管ISFET就会检测到释放出的氢离子引起的溶液pH值变化，并将其转化为电信号，进一步翻译为对应的碱基。但是因为氢离子的相对分子质量只有1，所以扩散速率比较快，电信号时间较短，造成检测的准确率较低；且氢离子只带有一个正电荷，离子敏感场效应管能检测到的有效氢离子数量较低，电信号较弱，所以检测的信噪比较低，对检测的准确率影响较大。本发明针对现有技术面临的低信噪比、低准确率的技术挑战，提出了一种通过检测焦磷酸电荷的高信噪比基因测序方法，该方法实现了基因测序的高通量、低成本和高准确率。
2、技术方案
为达此目的，本发明所采用的技术方案是：
一种通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法，该方法包括以下步骤：
步骤一：将一种焦磷酸PPi受体固定在电荷敏感传感器的表面，形成焦磷酸敏感传感器；
步骤二：在每一轮对一个碱基的测序反应中，在反应体系中加入一份四种脱氧核苷酸三磷酸dNTP中的一种及DNA扩增反应所需的聚合酶和催化剂，如Mg2+；如果dNTP刚好能与DNA模板的当前碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3，末端，同时释放出一份焦磷酸PPi；如果加入的dNTP不能和DNA模板的当前碱基配对，则上述反应不会发生；待本轮反应结束后，本次加入的dNTP溶液被清洗溶液冲掉，再轮流依次加入其它的dNTP，使上述反应一共重复4次；在这四次反应中，必有且仅有一种dNTP能与当前碱基成功配对，并释放焦磷酸PPi；清洗液能够将PPi受体回归原始状态，可持续在下轮配对步骤中进行与PPi的结合。清洗液可以选用盐浓度低于10μM的电解质，或加温后的去离子水。
步骤三：步骤二反应生成的焦磷酸会在溶液中发生水解反应，一份焦磷酸与水反应生成两份磷酸氢盐离子。
步骤四：水解得到的磷酸氢盐离子与固定在电荷敏感传感器表面上的受体结合，使传感器的电流，电容，或电压发生变化，起到将化学信号转换为电信号的作用。
步骤五：焦磷酸敏感传感器将碱基延伸反应释放的焦磷酸直接转换为电信号，进一步翻译为对应的碱基；
步骤六：重复步骤二至四可对DNA模版进行快速连续测序。
本发明适用于各种对表面电荷敏感的传感器，可以选用离子敏感场效应晶体管ISFET，或交错双电极传感器，或二维结构石墨烯超薄传感器，或过渡金属硫化物TMDC超薄传感器。
所述离子敏感场效应晶体管ISFET可以选用传统的金属栅极离子敏感场效应晶体管，或硅纳米线离子敏感场效应晶体管。
不论采用哪种电荷敏感的传感器，传感器暴露在溶液的表面上需要固定PPi受体，PPi受体需要与PPi有较强的结合能力，并不与dNTP、H+、焦磷酸盐、酶和Mg2+结合(或结合力较弱)，受体可以选用抗体、酶、核酸适体、肽酶或受体分子等。
本发明适用于大规模传感器阵列，对多个不同DNA模版进行并行测序，实现高通量测序及缩短测序时间。
3、有益效果：
相比较现有技术，本发明的有益效果如下
1)本发明能够检测扩增过程中产生的焦磷酸，因为焦磷酸的相对分子质量为174，扩散速率较氢离子慢很多，能够检测的电信号时间较长，能够有效地提高准确率。
2)本发明能够检测扩增过程中产生的焦磷酸，因为焦磷酸带有4个正电荷，由于扩散减慢，有效表面浓度较高，转换成的电信号较强，检测的信噪比较高。
3)高信噪比允许使用更小的传感器，更高密度及规模的传感器阵列，从而可进一步提高测序通量，降低测序成本。
附图说明
图1A、1B为本发明基因测序方法的流程图。
图2为一种基于传统的金属栅极离子敏感场效应晶体管的基因测序芯片的截面图。
图3为一种基于硅纳米线离子敏感场效应晶体管的基因测序芯片的截面图。
图4A、4B为待测DNA模版通过DNA引物及连接分子固定在传感器周围的示意图。
图5为一种基于交错双电极传感器的基因测序芯片的示意图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，便于本领域技术人员对于本发明的基因测序方法的理解，下面结合具体实施例与附图对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实例1：
如图2所示，使用一种传统的金属栅极离子敏感场效应晶体管来实现本发明的基因测序方法；晶体管设置在底座上，包括传感器栅极平板，传感器栅极平板通过金属层与栅极介电材料相连，栅极介电材料下面是硅沟道，硅沟道的两端分别与源极、漏极相连，传感器栅极平板上也设有感应介电层；感应介电层上固定有PPi受体，介电层上方设有溶液腔体，介电层及其上的PPi受体暴露在腔体内的溶液中；腔体内的溶液中有待测DNA模板。
其中底座可为硅晶圆，晶体管设置在底座的上层。
进一步地，介电材料可以为二氧化硅，氧化铝，二氧化铪，二氧化钛，氧化钽的一种或多种，也可以为其他类似的无机或有机介电材料，比如自组装单分子膜(SAMS)。
待测DNA模板的准备可采用类似于Ion Torrent半导体测序技术的样品准备流程，即将待测的核酸序列分别切割成核酸片段，再在核酸片段的一端通过其中一段序列与DNA引物杂交，使其形成模板，再将DNA模版或引物的末端固定在磁珠上，并通过油包水流程PCR扩增，提高待测DNA模板的数量(提高测序信号)。然后将装有大量待测DNA模板的磁珠送到传感器上方的溶液腔体内。DNA模板上已经设有引物，可进行碱基延伸反应。
测序过程主要分为三步。第一步的作用主要为焦磷酸的生成，第二步进行焦磷酸的水解，第三步将磷酸转化为电信号，进一步翻译为对应的碱基。
如图1A、1B所示，第一步，在每一轮对一个碱基的测序反应中，反应体系中加入四种脱氧核苷酸三磷酸dNTP中的一种及DNA扩增反应所需的聚合酶和催化剂(比如Mg2+)，如果此dNTP刚好能与DNA模板的当前碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3，末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。如果加入的dNTP不能和DNA模板的当前碱基配对，则上述反应不会发生。待本轮反应一定时间结束后，加入的dNTP溶液被清洗溶液冲掉，再轮流依次加入其它的dNTP，使上述反应一共重复4次。在这四次反应中，必有且仅有一种dNTP能与当前碱基成功配对，并释放焦磷酸(PPi)。清洗液能够将PPi受体回归原始状态，可持续在下轮配对步骤中进行与PPi的结合。
第二步，第一步反应中，若发生碱基配对，反应生成的焦磷酸会在溶液中发生水解反应，一份焦磷酸与水反应生成两份磷酸氢盐离子。
第三步，第二步水解得到的磷酸氢盐离子与固定在离子敏感场效应晶体管的金属栅极表面的受体结合，使传感器的电流或电压发生变化，起到将化学信号转换为电信号的作用。
依次检测第一步中提到的四次重复反应时的电信号即可准确判别是哪种dNTP与当前碱基成功配对，并释放焦磷酸(PPi)，从而引起了传感器表面电荷、电压、或电容的变化，从而测定本轮碱基的类别。
重复以上三步可对DNA模版进行快速连续测序。
进一步地，如图4A所示，除了使用类似于Ion Torrent半导体测序技术的磁珠样品准备流程之外，待测DNA模板也可通过DNA引物及连接分子被固定在溶液腔体材料比如SiO2材料的表面及传感器表面，使其释放的PPi位于传感器周围，能被传感器检测到。也可以如图4B所示，在传感器上方的溶液腔体内装载水凝胶，DNA模板通过连接分子固定在水凝胶内，在芯片上再实现PCR扩增提高DNA模板的数量(提高信号)。
实例2：
如图3所示，使用一种硅纳米线离子敏感场效应晶体管来实现本发明的基因测序方法；晶体管设置在底座上，包括硅纳米线，纳米线的表面是介电层，纳米线的两端与源极和漏极相连；介电层上固定有PPi受体，纳米尺度沟道上方设有溶液腔体，沟道及其上的PPi受体暴露在腔体内的溶液中。腔体内的溶液中有待测DNA模板。
底座可包括上层和下层，上层为二氧化硅，下层为硅晶圆，晶体管设置在底座的上层。
进一步地，一个选项为纳米尺度沟道的介电层上可设有一层金膜，可以降低纳米传感器对于pH的灵敏度，起到钝化表面的作用，提高信噪比；金膜层上再固定有PPi受体。
进一步地，纳米线呈直线或非直线，作为优选，呈蜿蜒线形或螺旋线形。
其测序流程及DNA模板样品的制备与实例1相同。不同的是硅纳米线离子敏感场效应晶体管比传统的金属栅极离子敏感场效应晶体管具有更高的电荷感应灵敏度，更好的信噪比。
实例3：
如图5所示，使用一种交错双电极传感器来实现本发明的基因测序方法。DNA模板样品的制备及测序步骤与实例1相同。不同的是电信号的传感方式不同。芯片上的两个电极形成交错式结构，实现最大化电极间的电容。电容表面可直接固定有PPi受体。
进一步地，电极表面可设有一层介电层，介电层表面再设有PPi受体。
当受体结合DNA延伸时释放的PPi转化为磷酸氢盐离子时，电极间电容发生变化，从而被检测。
以上的实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内。本发明未涉及的技术均可通过现有的技术加以实现。

Claims (10)

1.一种通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤一：将一种焦磷酸PPi受体固定在电荷敏感传感器的表面，形成焦磷酸敏感传感器；
步骤二：在每一轮测序反应体系中加入四种脱氧核苷酸三磷酸dNTP中的一种，以及DNA扩增反应所需的聚合酶和催化剂；如果加入的dNTP刚好能与当前DNA模板的碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一份焦磷酸PPi；如果加入的dNTP不能和当前DNA模板的碱基配对，则上述反应不会发生；重复上述步骤直至找到可以与当前DNA模板的碱基成功配对的dNTP，并释放出焦磷酸PPi；
步骤三：步骤二反应生成的焦磷酸PPi在溶液中发生水解反应，一份焦磷酸PPi与水反应生成两份磷酸氢盐离子；
步骤四：水解得到的磷酸氢盐离子与步骤一中固定在电荷敏感传感器表面上的受体结合，使传感器的电流，电容，或电压发生变化，从而将化学信号转换为电信号；
步骤五：焦磷酸敏感传感器将碱基延伸反应释放的焦磷酸PPi直接转换为电信号，进一步翻译为对应的碱基；
步骤六：重复步骤二至四对DNA模版进行快速连续测序。
2.根据权利要求1所述的通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法，其特征在于，所述方法步骤一中的电荷敏感传感器选用离子敏感场效应晶体管ISFET，交错双电极传感器，二维结构石墨烯超薄传感器，或过渡金属硫化物TMDC超薄传感器中的一种。
3.根据权利要求1所述的通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法，其特征在于，所述方法步骤一中的焦磷酸PPi受体选用与焦磷酸PPi有较强的结合能力，并不与dNTP、H+、焦磷酸盐、酶和Mg2+结合或结合力较弱的受体材料。
4.根据权利要求1所述的通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法，其特征在于，所述方法步骤一中的焦磷酸PPi受体选用抗体、酶、核酸适体、肽酶或受体分子中的一种。
5.根据权利要求1所述的通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法，其特征在于，所述方法步骤二中，每轮反应结束后需加入清洗液将dNTP溶液冲洗掉，清洗液将焦磷酸PPi受体回归原始状态，可持续在下轮配对步骤中与焦磷酸PPi进行结合。
6.根据权利要求1所述的通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法，其特征在于，所述方法步骤二中催化剂为Mg2+。
7.根据权利要求1所述的通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法，其特征在于，所述方法适用于大规模传感器阵列，对多个不同DNA模版进行并行测序。
8.根据权利要求2所述的通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法，其特征在于，所述离子敏感场效应晶体管为传统的金属栅极离子敏感场效应晶体管。
9.根据权利要求2所述的通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法，其特征在于，所述离子敏感场效应晶体管为硅纳米线离子敏感场效应晶体管。
10.根据权利要求5所述的通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法，其特征在于，所述清洗液为盐浓度低于10μM的电解质，或加温后的去离子水。
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