CN101896624A - 对生物微粒进行测序的生物传感器装置和方法 - Google Patents

Abstract

一种对生物微粒(102)进行测序的生物传感器装置(100)，所述生物传感器(100)包括：至少一个衬底(104)；在所述至少一个衬底(104)中的每一个上提供的多个传感器活性区(106)，其中，每个传感器活性区(106)包括具有与生物微粒(102)的序列的一部分互补的序列的引物(108)，使得能够在引物(108)处产生具有与生物微粒(102)的序列的一部分相反的序列的片段；以及确定单元(114)，适于单独确定在所述多个传感器活性区(106)中的每一个的引物(108)处产生的片段的大小，在存在复制终止序列单元(116至119)时，终止片段复制。

Description

对生物微粒进行测序的生物传感器装置和方法

技术领域

本发明涉及生物传感器装置。

此外，本发明涉及对生物微粒进行测序的方法。

背景技术

生物传感器可以表示用于检测分析物的装置，该装置将生物部件与物理化学或物理检测器部件相结合。

例如，生物传感器可以基于以下现象：例如，当抗体的抗体结合片段或者DNA单链序列作为捕获分子与目标分子的相应序列或结构匹配时，固定在生物传感器表面上的捕获分子可以选择性地与流体样本中的目标分子杂交。当这样的杂交或传感器事件发生在传感器表面时，这可以改变表面电特性，这可以作为传感器事件检测到。

DNA测序是生物化学的重要应用。术语DNA测序包括用于确定DNA低(聚)核苷酸中的以下物质的顺序的生物化学方法：核苷酸碱基、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞核嘧啶以及胸腺嘧啶。DNA的序列构成了细胞核、质粒、线粒体、以及叶绿体的遗传基因信息，该遗传基因信息形成所有生物体的进化进程的基础。因此，确定DNA序列对于研究基本生物过程的基础研究以及诸如诊断或法医研究等应用领域是有用的。

桑格方法(Sanger method)是用于DNA测序的传统方法，以及用于确定DNA片段的核苷酸序列的酶方法。然而，传统上桑格方法依赖于使用标签来执行DNA测序。该桑格方法还受到在传统桑格方法的情形中执行的液胶电泳方法的限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于对生物微粒进行测序的简单系统。

为了实现上述目的，提出了根据独立权利要求所述的用于对生物微粒进行测序的生物传感器装置和方法。

根据本发明的示例实施例，提供了一种对生物微粒进行测序(即，用于确定生物微粒的序列)的生物传感器装置，该生物传感器装置包括：至少一个衬底(例如，一个衬底、四个衬底、或者任何其他数目的衬底)；在所述至少一个衬底中的每一个上提供的多个传感器活性区，其中每个传感器活性区包括具有与生物微粒序列的一部分互补(或相反)的序列的引物(primer)，使得能够在引物处(具体地，在存在生物微粒序列的序列单元时，以及在存在复制酶时)产生具有与生物微粒序列的一部分相反(或互补)的序列的片段；以及确定单元(例如，处理器)，适于单独地确定在所述多个传感器活性区中的每一个的引物处复制的片段的大小(可以指示长度、质量、质量分布、惯性矩等)，在存在复制终止序列单元时，终止(或完成)片段产生。

根据本发明的另一示例实施例，提供了一种对生物微粒进行测序的方法，该方法包括：在至少一个衬底中的每一个上提供多个传感器活性区，所述多个传感器活性区中的每一个包括具有与生物微粒序列的一部分互补的序列的引物，使得能够在引物处(具体地，在存在生物微粒序列的序列单元时，以及在存在复制酶时)产生具有与生物微粒序列的一部分相反的序列的片段；以及单独地确定在所述多个传感器活性区中的每一个的引物处复制的片段的大小，在存在复制终止序列单元时，终止(或完成)片段产生。

术语“生物传感器”具体表示可以用于检测包括诸如DNA、RNA、蛋白质、酶、细胞、细菌、病毒等生物分子的分析物的组分的任何装置。生物传感器可以将生物部件(例如，能够检测分子的传感器活性表面处的捕获分子)与物理化学或物理检测器部件(例如，具有可由传感器事件修改的电容量的电容器，或者可由传感器事件机械修改的梁)相结合。这样的传感器可以完成确定序列的任务，即，生物微粒的组分的顺序。

术语“测序”可以具体地表示确定生物微粒的序列，该序列是连续的碱基单元(basic unit)，由此构成生物微粒。这种碱基单元的示例是DNA序列的核碱基(或核苷酸碱基)或者蛋白质的氨基酸。DNA或RNA分子的序列是沿着DNA或RNA分子的核苷酸的线性顺序，获得该序列的过程可以表示为测序。基因组测序的目的在于，产生有机体的细胞核DNA中存在的所有核苷酸的线性顺序。

术语“生物传感器芯片”可以具体地表示形成为集成电路的生物传感器，即，具体地半导体技术、更具体地硅半导体技术，更具体地CMOS技术的电子芯片。由于微处理技术的使用，单片集成生物传感器芯片具有极小尺寸的特性，并因此在生物传感器芯片的尺寸，或更准确地生物传感器的部件的尺寸接近或达到生物分子的尺寸的量级的情况下，可以具有大空间分辨率，以及高信噪比。

术语“传感器活性区”可以具体地表示传感器的暴露区域，可以使其与流体样本交互，使得检测事件可以发生在传感器活性区中。换言之，传感器活性区可以是传感器装置的实际敏感区域，在该区域中进行区域处理，从而构成感测的基础。相应感测原理可以是电感测原理(即，传感器活性区的电特性的改变)、机械感测原理(即，传感器活性区的机械特性的改变)、或光感测原理(即，传感器活性区的光特性的改变)

术语“衬底”可以具体地表示诸如半导体、玻璃、塑料等之类的任何合适的材料。根据示例实施例，术语“衬底”可以用于一般地定义在感兴趣的层或部分之下或之上的层的元件。此外，衬底还可以是在其上形成例如半导体晶片(如，硅晶片或硅芯片)之类的层的任何其他基底。若干不同衬底可以是在不同衬底之间具有机械连接或不具有机械连接的分离体。

术语“流体样本”可以具体地表示物相的任何子集。这样的流体可以包括液体、气体、等离子体以及某种程度上的固体及其混合物。流体样本的示例是包含DNA的流体、血液、皮下组织、肌肉或脑组织中的间质液、尿或其他体液。例如，流体样本可以是生物物质。这样的物质可以包括蛋白质、多肽、核酸、DNA链等。

术语“生物微粒”可以具体地表示在生物学或在生物学或生物化学过程中起到重要作用的任何微粒，例如，基因、DNA、RNA、蛋白质、酶、细胞、细菌、病毒等。

术语“引物”可以具体地表示短序列的碱基单元，由此可以发起生物微粒的复制。这样的短序列可以是氨基酸或核碱基的序列。由短序列的核碱基可以发起DNA复制。

术语“互补序列”或“反向序列”可以具体地表示引物的碱基单元的相应序列，以及彼此相反的生物微粒的序列。例如，腺嘌呤是与胸腺嘧啶相反或互补，鸟嘌呤与胞核嘧啶相反或互补。

术语“序列单元”可以具体地表示生物微粒、引物或片段的基本构建块或组分，在DNA复制的情况下，表示核碱基、腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞核嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)。

术语“复制酶”可以具体地表示酶，在存在这种酶时能够促进核碱基序列的复制。这种DNA复制酶的示例是DNA聚合酶。

术语“片段”可以具体地表示从引物开始形成、并与生物微粒中与与引物互补的一部分对准(align)的基本构建块的序列。

术语“复制终止序列单元”可以具体地表示与基本构建块相比，在化学上略微修改的分子(例如，双脱氧核苷酸)。然而，当在当前片段末端在生物微粒处生长的情况下存在复制终止序列单元时，以及当这样的复制终止序列单元与当前片段末端处的生物微粒的暴露部分互补时，可以将这样的复制终止序列单元添加至片段的末端，并终止片段形成。因此，在要测序的生物微粒处对准该复制终止序列单元之后，复制过程终止，并且不向复制终止序列单元添加其他基本构建块。在DNA复制的示例中，ddT、ddC、ddG和ddA可以表示为分别与胸腺嘧啶(T)、胞核嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)有关的复制终止测序单元。

根据本发明的示例实施例，提供了一种修改的无标签的小型化桑格测序系统，用于利用结合衬底的生物传感器装置进行测序。在这样的实施例中，可以向多个传感器活性区域提供固定引物和接受分析的生物微粒，使得在添加序列单元、复制酶以及复制终止序列单元(应当针对衬底的不同部分或不同衬底而不同)时，根据生物微粒的序列以及根据特定复制终止序列单元，在特定部分开始和终止复制。换言之，对于衬底的每个部分或者对于每个衬底，可以存在指定的复制终止序列单元，使得可以在每个部分表示特性地产生特定长度的片段，其中，片段在复制终止序列单元的端部。当不同复制终止序列单元用于衬底的不同部分时，存在于衬底的不同部分处的片段集合可以允许导出与生物微粒的序列有关的信息。然后来自于衬底的不同部分的片段集合信息的组合(具体地，集合中片段长度与相应复制终止序列单元的组合)可以用于导出或重构生物微粒的完整序列。根据本发明的示例实施例，可以在不同传感器活性区处感测到这些片段的存在以及它们的长度或其他数量特性，其中，取决于长度，表示特性地调整在该特定传感器活性区处的电、机械或其他物理参数，从而允许利用传感器阵列来测量所有存在的片段，以重构生物微粒的序列。

更具体地，提供了一种DNA测序的方法，允许使用能够使用传统CMOS工艺制造的技术来执行无标签DNA测序。本发明的实施例应用修改的桑格方法，其中，通过酶(DNA聚合酶)进行DNA合成，该酶朝着引物DNA链的5’末端将核苷酸(A、T、G、C)添加至引物DNA链的3’末端。当使用双脱氧核苷酸时能够停止聚合酶(即，DNA复制)反应。双脱氧核苷酸几乎与普通核苷酸相同。将双脱氧核苷酸添加至DNA链的3’-OH末端，停止聚合酶的作用并终止链延长。双脱氧测序(也被称为链终止或桑格方法)使用酶过程来合成变化长度的DNA链，在四个基之一处停止DNA复制，并且然后确定获得的片段长度。

每个测序反应衬底(ddT衬底、ddC衬底、ddG衬底以及ddA衬底)可以包含：

-DNA模板集合(未知序列)、引物序列集合(每模板一个)、以及DNA聚合酶(每引物和模板一个)，以在将引物与模板杂交的点处发起新DAN链的合成；

-足够高浓度的四个核苷酸(A、T、C和G)，以延长与模板互补的DNA引物链；

-足够低浓度的四个双脱氧核苷酸之一(仅一个)，无论在何处包含，都终止生长链。例如，衬底部分ddA具有ddA，衬底部分ddC具有ddC、衬底部分ddG具有ddG，衬底部分ddT具有ddT。

作为示例，对在被称为ddT的衬底部分处发生了什么进行说明。聚合酶沿着引物开始添加与DNA模板互补的核苷酸，直到其包含ddT为止。然后聚合酶停止。衬底部分ddT的结果是，始终以ddT结束的、不同长度的DNA模板的片段集合。除了所有片段分别以ddA、ddG或ddC结束以外，其他三个衬底部分的结果是类似的。

通过在衬底上和/或在衬底中布置传感器活性区，并且通过由确定单元读取来自衬底的信息，本发明的实施例实现了无标签并不受(传统桑格方法所需的)电泳方法限制的DNA测序，并且还允许增加并行的程度(level of parallelism)。

因此，本发明的实施例提供了一种小型化并具有结合衬底的传感器活性区的生物传感器装置，该传感器活性区以电、光或机械方式允许检测信号，该信号指示取决于存在于不同衬底部分处的复制终止序列单元的、在生物微粒的特定部分处终止的特定片段的长度/质量/尺寸，从而允许从不同衬底部分获得与不同碱基单元有关的信息。

当根据本发明的实施例执行这种修改的桑格方法时，双脱氧核苷酸与普通核苷酸的浓度比可以是1∶100。这样，可以确保例如ddT的包含是“稀少但不太稀少”，从而可以确实获得不同长度的链。此外，通过这样的浓度调整，可以确保当聚合酶反应由于消耗了所有或大多数ddT而停止时能够有一定时间。

利用足够次数的执行(run)(或者利用单次执行中的大量电极)，可以确保能够接收包含到引物的所有组合，使得能够精确重构序列。此外，能够在电极处获得重复的组合，使得产生足够的冗余测量，以免读取中的任何错误。

例如，有可能将以下因素考虑在内：例如在第一芯片或衬底上，仅发生以ddA结束的组合(在第二芯片或衬底上发生以ddT结束的组合，在第三芯片或衬底上仅发生以ddG结束的组合，在第四芯片或衬底上仅发生以ddC结束的组合)，并且这些组合通过模板中未知的核苷酸序列指示。引物仅逐个碱基地重构模板的互补序列。

接着，将说明生物传感器装置的另一示例实施例。然而，这些实施例也可以应用到所述方法。

确定单元适于，考虑与指定类型的复制终止序列单元有关的信息，基于单独确定的片段大小，来确定生物微粒的序列。换言之，例如，可以向不同衬底或不同衬底部分指定唯一复制终止序列单元，例如，四个双脱氧核苷酸(ddA、ddT、ddG、ddC)中指定的那一个。然后，可以确保在每个衬底或衬底部分处，所产生的片段以添加至该特定衬底或衬底部分的四个双脱氧核苷酸中的仅一个结束。这允许从每个衬底或衬底部分导出与生物分子序列中四个核碱基中特定的一个有关的确定信息。然后，每个传感器活性区可以基于检测到的电、光或机械信号，来确定特定部分处的核苷酸的尺寸、长度或质量或数目。然后，不同衬底或衬底部分的组合可以允许明确确定生物微粒的序列(例如，DNA序列)。

至少一个衬底可以仅由一个衬底组成，该衬底具有分隔室，具体地具有四个分隔室，每个分隔室包括多个传感器活性区，并被指定给唯一类型的复制终止序列单元。当提供作为空间分隔区域的四个分隔室时，可以形成不同的腔，在这些腔内可以执行利用特定复制终止序列单元的相应实验。利用空间分隔室，可以确保在包括不同复制终止序列单元的不同流体样本之间不会发生混合。这可以避免不期望的干扰。

备选地，至少一个衬底可以包括多个分离的衬底，具体地，包括四个分离的衬底，每个分离衬底包括多个传感器活性区，并被指定给特定类型的复制终止序列单元。具体地，四个不同的生物传感器芯片可以用于不同的复制终止序列单元，即用于四个不同的双脱氧核苷酸(ddA、ddT、ddG、ddC)。

作为另一备选，有可能在单个衬底上进行实验，并且同时仅使该衬底与特定类型的复制终止序列单元接触。在这种部分实验之后，可以对生物传感器装置或衬底进行漂洗，以准备对另一复制终止序列单元进行测试的下个步骤或过程。该过程可以重复四次，允许逐一地导出与不同碱基单元/复制终止序列单元有关的信息。在DNA测序的情况下，必须逐一地执行四个实验。

在一个实施例中，多个传感器活性区可以包括电极。利用电极，在电极的情形下测量电信号，其中，片段的复制或产生可以表示特性地修改电特性，例如，在电极情形下的电容量。在这样的实施例中，在电极出固定引物，并且可以将生物微粒与引物杂交。然后，可以触发片段产生，并通过存在于生物微粒的暴露部分的末端处的复制终端序列单元来识别片段集合，这可以表示特性地修改电极的电特性。

可以向确定单元(可以是集成电路)提供从电极接收的电信号，电信号指示指定的片段大小，这是由于片段大小可以在电极情形下修改介电特性。具体地，确定单元可以执行允许从电信号中获取或导出片段长度的算法。结合相应复制终止序列单元的认知，可以在沿着DNA序列的特定位置处导出与特定碱基单元有关的信息。电极信号的组合然后可以允许导出生物微粒的整个序列。

备选地，多个传感器活性区可以包括悬臂，具体地，根据片段大小以表示特性的方式可弯曲的纳米悬臂。当将引物固定在悬臂处时，耦合至悬臂的片段的产生可以通过影响扭矩来改变作用在可弯曲悬臂上的机械负载。因此，可以以电方式，或者由于修改的激光束偏转而以光学方式感测机械弯曲信号。这样的悬臂可以是MEMS结构(微机电结构)，从而增加系统的精确性。可能适当的是：水平地对准悬臂，以在重力的作用下促进由于生长的片段而引起的弯曲。

仍参照悬臂实施例，确定单元可以适于，使用电磁辐射束(具体地，激光束)对悬臂的弯曲进行采样，其中，可弯曲悬臂处电磁辐射束的偏转可以指示指定的片段大小。片段越大，在片段的机械负载下悬臂弯曲的程度越大。因此，可以检测到电磁辐射束(具体地，光束)的改变的反射或偏转特性，并允许计算相应片段的大小、质量或长度。利用生物传感器装置的不同部分中的不同复制终止序列单元，可以在这些部分中的每一个中感测到不同片段。特定部分中的特定类型的复制终止序列单元的认知然后可以允许向生物微粒的相应片段指定相应的弯曲，从而获得与生物微粒的序列有关的信息。

悬臂可以是纳米悬臂。术语“纳米悬臂”可以具体地表示以下事实：悬臂至少一个维度具有至几十纳米或几百纳米的纳米量级，或者更小。例如，这样的纳米悬臂可以是碳纳米管。

当传感器活性区包括纳米电极时，电极的尺寸可以是纳米量级，例如，可以小于300nm，例如，可以小于或等于250nm，或者可以小于或等于130nm。纳米电极越小，获得的传感器区域越敏感。

纳米电极可以包括铜材料，具体地由自组装单分子层(SAM)覆盖的铜材料。这些材料可以用作氧化保护层或者阻挡层，或者用于实现捕获分子的键合，从而允许实现相对敏感的铜材料，这种铜材料由于其高电导率而非常适合并符合过程要求。铜材料与金具有类型的化学特性，传统上在生物传感中使用金，但是金具有显著的缺点，这是由于其快速扩散到硅制造技术中使用的许多材料中，从而劣化了IC的性能，刻蚀困难，并且在清洗步骤中很难移除金残留物。然而，本发明的备选实施例也可以包括金。此外，也可以使用诸如铝等材料。

生物传感器可以包括形成生物传感器芯片的表面的一部分并具有凹口的电绝缘层，其中，提供传感器活性区的暴露表面作为凹口中的感测袋(pocket)。通过提供感测袋，可以形成其中可以发生传感器事件的屏蔽或限定区域。在凹口的底部，可以提供具有小尺寸的纳米电极，使得可以实现高灵敏度。因此，甚至可以在苛刻条件下使用生物传感器芯片。

可以采用MEMS(微机电结构)技术来制造生物传感器装置。通常，MEMS的大小从微米(一米的百万分之一)变化到毫米(一米的千分之一)。通过这样的技术，例如，能够制造对于复制片段足够敏感的悬臂梁。

可以采用CMOS技术来制造生物传感器芯片。CMOS技术(具体地，最新一代CMOS技术)允许制造尺寸非常小的结构，使得通过实现CMOS技术(具体地，前端制程)来提高装置的(空间)精度。CMOS工艺也是优选的选择。BiCMOS工艺实际上是具有添加双极晶体管的一些附加处理步骤的CMOS工艺。对于具有其他嵌入选项(如，嵌入式烧瓶(flask)、嵌入式DRAM等)的CMOS工艺也同样成立。具体地，因为选项的存在通常提供了“以零成本”使用来自选项的附加材料的机会，所以这是相关的。例如，可以“以零成本”使用来自嵌入式DRAM工艺的适当高k材料(具有高介电常数的绝缘材料，例如氧化铝)，在纳米电极的铜表面上覆盖保护介电层，随后可以在该保护介电层上沉积SAM(SAM的功能应当是“功能化”传感器表面，例如以能够附着捕获试探分子)。

生物传感器可以包括在前端制程中形成并电耦合至传感器活性区的开关晶体管结构。这样的开关晶体管可以是实现为n-MOSFET或p-MOSFET的场效应晶体管。传感器活性表面可以电耦合至这种开关晶体管结构的源极/漏极区之一，使得施加于晶体管的栅极的读出电压可以获得源极/漏极电流，该电流取决于流体样本的微粒存在还是不存在(并且还取决于流体样本的微粒的量)，因为这会对电容器的电压有影响，可以将该电压传送至源极/漏极区之一。备选地，这样的电压可以直接对MOSFET的栅极区起作用，从而改变阈值电压，或者在源极和漏极之间施加电压时改变其间流动的电流的值。

传感器活性区的暴露表面的尺寸是用于制造生物传感器芯片的COMS工艺的最小光刻特征尺寸的至多1.6倍，具体地至多1.1倍，更具体地至多0.7倍。具体地，可以假设，生物传感器具有利用铜互连在先进CMOS工艺的后端制程部分的表面处制造生物敏感部分，其中，经由相应CMOS工艺的孔，暴露铜表面的直径等于或小于最小铜最小光刻特征尺寸的1.6倍。略微小于1的制(例如，下至大约0.7)可以与通过添加少量附加加工步骤或者通过应用第一金属特征大小来制造的子特征大小的孔相对应。这将需要一些附加加工步骤，或者对更苛刻标准CMOS步骤(例如，在应用第一金属特征尺寸的情况下)的更严格的控制。原则上甚至能够实现更小的值，但是将需要更多附加加工工作。此外，这些附加加工工作将导致生物传感器单元的敏感区域部分的显著减小。同样，通过更多减小半径不会显著提高传感器的灵敏度，这是由于纳米电极传感器节点的总体电容量还是受到寄生电容量的限制。为了能够真正受益于更小纳米电极半径，还将需要减小晶体管和互连层的尺寸，即，转换至下个CMOS节点。

生物传感器装置可以单片集成在半导体衬底中，具体地包括由Ⅳ族半导体(如，硅或锗)和Ⅲ-Ⅴ族半导体(如，砷化镓)构成的组中的一种。

生物传感器芯片或微流体装置可以是传感器装置、传感器读出装置、电泳装置、样本传送装置、样本混合装置、样本洗涤装置、样本提纯装置、样本放大装置、样本提取装置或杂交分析装置或其一部分。具体地，可以以任何类型的生命科学装置来实现生物传感器或微流体装置。

对于任何方法步骤而言，可以实现从半导体技术中已知的任何传统过程。形成层或部件可以包括沉积技术，例如，CVD(化学汽相沉积)、PECVD(等离子增强化学汽相沉积)、ALD(原子层沉积)或溅射。去除层或部件可以包括诸如湿蚀刻、等离子蚀刻等蚀刻技术以及诸如光刻、UV光刻、电子束光刻等图案化技术。

本发明的实施例不限于特定材料，因此可以使用许多不同的材料。对于导电结构，能够使用金属化结构、硅化物结构或多晶硅结构。对于半导体区域或部件，可以使用晶体硅。对于绝缘部分，可以使用氧化硅或氮化硅。

可以在纯晶体硅晶片上或SOI晶片(绝缘体上硅)上形成生物传感器。

可以实现诸如CMOS、BIPOLAR、BICMOS等任何工艺技术。

根据以下描述的示例实施例，并参照这些示例实施例进行说明，本发明的上述方面和其他方面将变得显而易见。

附图说明

以下将参照示例实施例来更详细描述本发明，然而本发明不限于这些示例实施例。

图1说明了根据本发明示例实施例的用于对DNA进行测序的生物传感器装置。

图2至图5是示出了传统桑格方法的图示。

图6示出了根据本发明示例实施例的生物传感器装置的平面图。

图7示出了根据本发明实施例的传感器装置的单片集成部分的截面图。

图8至图10示出了根据本发明实施例的制造的生物传感器装置实验图像。

图11说明了根据本发明示例实施例的生物传感器装置的传感器活性区的延长部分。

图12说明了根据本发明示例实施例的生物传感器装置的不同衬底。

图13说明了根据本发明示例实施例的生物传感器的传感器活性区的阵列以及从中导出的相应信息。

图14至图17示意性说明了如何从图12所示的各个单独衬底中的每一个导出与DNA序列的特定核苷酸碱基有关的信息的方式。

图18示意性说明了如何从源自图14至17的信息中导出DNA序列。

图19说明了根据本发明示例实施例的悬臂类型的生物传感器装置。

图20说明了如何从图19的悬臂弯曲导出DNA序列信息。

图21示出了根据本发明示例实施例的具有多个衬底的传感器装置，其中多个衬底中的每一个承载多个悬臂。

图22示意性说明了如何从图21所示结构的悬臂中单独的悬臂导出信息。

具体实施方式

附图中的描述是示意性的。在不同的附图中，相似或相同的单元具备相同的附图标记。

在下文中，参照图1，说明根据本发明示例实施例的用于对DNA分子102进行测序的生物传感器装置100。

生物传感器装置100包括硅衬底104。在硅衬底104表面上提供多个传感器活性区106。在每个传感器活性区106上，固定引物分子108，该引物分子108是与DNA序列102的端部互补的寡聚核苷酸。引物108具有与生物微粒102的序列的末端互补的序列。因此，DNA 102的上部保持暴露于流体环境130，在该流体环境130中，存在核苷酸碱基110(A、T、C和G)以及作为复制酶的DNA聚合酶112。

可以将由图1的实施例中的多个传感器活性区106、纳米电极中的每一个检测到的电信号提供给作为硅衬底104中的单片集成电路而提供(备选地，例如作为分离电路而与衬底104分离提供)的中央处理单元114，或者具有处理能力的任何其他实体。确定单元114适于单独地确定在多个传感器区域106中的每一个的引物108处复制的片段(图1中未示出)的大小，其中，片段复制在各个单独分隔室120至123中的每一个中DNA 102的特有部分处终止，这是由于不同双脱氧核苷酸116至119存在于分隔室120至123中的每一个中。

更具体地，确定单元114适于考虑与分隔室120至123中的每一个中的指定类型的双脱氧核苷酸有关的信息，基于单独地确定的片段大小，来确定DNA 102的序列。

在图1的实施例中，仅提供具有分隔室120至123(有隔离壁132分隔)的单一硅衬底104。分隔室120至123中的每一个包括多个传感器活性区106，并被指定给特定类型的双脱氧核苷酸。具体地，分隔室120包括ddA 116，分隔室121包括ddC 117，分隔室122包括ddG 118，以及分隔室123包括ddT 119。因此，取决于DNA 102的序列，在引物108未覆盖的DNA 102的暴露部分处形成的片段取决于DNA序列和相应的双脱氧核苷酸116。由于在分隔室120至123中的每一个中形成根据DNA分子102序列的多个片段，并且可以基于从电极106向确定单元114提供的电信号来检测片段的长度，确定单元114可以将混乱的(puzzle)片放在一起，以导出与DNA 102序列有关的信息。

在下文中，参照图2至图5来说明本发明人对传统桑格方法的一些认识，并基于这些考虑，已经导出本发明的示例实施例。

双脱氧测序(也被称作链终止或桑格方法)使用酶过程来合成变化长度的DNA链，在四个碱基之一处停止DNA复制，然后确定获得的片段长度。传统桑格方法的每个测序反应管(即，ddT管、ddC管、ddG管以及ddA管)可以包含：

-DNA模板集合(未知序列)、引物序列集合(每模板一个)、以及DNA聚合酶(每引物和模板一个)，以在将引物与模板杂交的点处发起新DAN链的合成；

-足够高浓度的四个核苷酸(A、T、C和G)，以延长与模板互补的DNA引物链；

-足够低浓度的四个双脱氧核苷酸之一，无论在何处包含，都终止生长链。例如，管ddA具有ddA，管ddC具有ddC、管ddG具有ddG，管ddT具有ddT。

图2再次示出了寡聚核苷酸引物108和未知DNA序列(模板)102。DNA序列102的各个单独碱基由A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞核嘧啶)、T(胸腺嘧啶)。如图2所示，寡聚核苷酸引物108与DNA序列102的一部分互补。当添加DNA聚合酶和A、T、G、C时，将这些组分插入到四个不同的管202、204、206、208中。在管202中，添加ddA，在管204中，添加ddG，在管206中，添加ddC，以及在管208中，添加ddT。因此，准备了包含上述成分的四种溶液，并且能够激活DNA聚合酶。

然后通过酶(DNA聚合酶)进行DNA合成，即，朝着DNA 102的5’末端将核苷酸添加至引物108DNA链的3’末端。

当使用双脱氧核苷酸时能够停止聚合酶(即，DNA应用)。双脱氧核苷酸几乎与普通核苷酸相同。然而，向DNA链的3’-OH末端添加双脱氧核苷酸停止了DNA聚合酶的作用，并终止链延长。在图3中包括ddT的管208的示例情况下示出了这一点。产生了第一至第四片段300、302、304、306。

聚合酶开始沿着引物108添加与DNA模板102互补的核苷酸，直到其包含ddT为止。然后聚合酶停止。ddT管208中的结果是始终以ddT结束的、不同长度的DNA模板的片段300、302、304、306的集合。除了分别以ddA、ddG或ddC结束以外，其他三个管202、204、206的结果是类似的。

图4示出了如何利用传统桑格方法导出DNA序列。

图4示出了针对ddA、ddG、ddC和ddT的片段的凝胶电泳分析的结果400。此外，示出了合成的DNA序列402，该序列402与模板DNA序列102互补。通过附图标记404示意性指示的反向转换或互补操作，可以明确地从合成的DNA序列402中导出模板DNA序列102。

当聚合酶反应停止时，将所有溶液注入电泳凝胶中。电场根据所有片段的长度拖曳(drag)这些片段。由于已知链终止(ddA、ddG、ddC和ddT)，有可能通过读取凝胶来重构模板序列。模板序列与已在凝胶中读出的一个序列互补。

图5再次示出了20bp的引物的情况下的结果。

根据图5的实施例，当不同荧光标签用于每个dd核苷酸时，可以在单次执行中进行与图2至图4相同的操作。在过程步骤500中，合成继续，直到包含双脱氧核苷酸(ddG、ddA、ddT或ddC)为止。在过程步骤502中，沿向下方向执行产物的电泳。结果示出为片段504的长度以及双脱氧506的终止。如箭头508所示，序列与DNA模板链102互补。不同荧光标签510、512、514、516用于每个核碱基。

图6示出了根据本发明示例实施例的生物传感器装置600的平面图。

在单个衬底104上，以类似矩阵方式(即，以行和列的方式)布置了多个纳米电极106。在不期望受限于特定理论的情况下，目前相信，每个纳米电极106足够敏感，以通过电容量变化来检测包含到引物108中的单个核苷酸。当将单个、两个或若干核苷酸添加至DNA引物108时，预先以能够区分的方式来校准从每个纳米电极106接收的每个信号。

图7示出了根据本发明示例实施例的生物传感器装置700的截面图。

图7是能够使用并实现电子桑格方法的装置700的示例。

生物传感器芯片700适于检测生物微粒12，并包括传感器活性区701，传感器活性区701对生物微粒102敏感，并被布置在生物传感器芯片700的后端制程部分702的顶端。更具体地，将传感器活性区701布置在生物传感器芯片700的BEOL区域702的上表面703处。

在BEOL部分702中提供多个中间金属化结构704至706，使得传感器活性区701经由多个中间金属化结构704至706电耦合至生物传感器芯片700的前端制程(FEOL)部分707。

更具体地，形成传感器活性区701的一部分的纳米电极708经由多个中间金属化结构704至706电耦合至集成在FEOL区域707中的场效应晶体管713。

在后端制程部分702中部分地形成电容器结构，布置该电容器结构，使得电容器的电容值受传感器活性区701处的检测事件(即，对于固定在传感器活性区701的表面703上的生物分子-引物复合体(complexes)的片段的产生，未示出)的影响，这是由于这种检测事件对传感器凹口717中的介电常数有影响。更具体地，铜层708形成这种电容器的第一电极，该电容器的第二电极由电解液750形成，并由相对电极(counter electrode)709连接，在本实施例中，与单片集成层序列700分离地提供相对电极709。备选地，有可能将形成电容器的第二电极的导电结构集成到层堆叠中。

更具体地，根据本发明的示例实施例的生物传感器700中的实际电容器是电解电容器。在测量期间传感器700浸入在电解液750中。电解液750可以是分析物本身，或者在实验之后代替分析物的其他导电流体。铜纳米电极708是一个电容器极板，导电流体750是另一个电容器“极板”。两个极板708、750由SAM715分开，SAM715可以对电容器的电介质做贡献。当生物分子-引物复合体712附着至SAM 715时，电容器的电介质的介电特性改变，并因此电容器的电容量也改变。电解液750与相对电极709相连接。

如图7示意性所示，晶体管结构713在前端制程部分707中形成，并经由多个金属化结构704至706、708电耦合至传感器活性区701。示出了这种晶体管713的栅极区710以及沟道区711。源极/漏极区分别位于附图的平面的前面和后面，因此在图7中没有明显地示出。如本领域技术人员所知的，源极/漏极区可以形成为电耦合至沟道区711的两侧的掺杂区域。

如图7可知，可以将单个生物分子-引物复合体712固定在传感器活性区701的表面703上，并且该复合体712适于与生物微粒相互作用。

铜金属化结构708在表面703处的尺寸可以为250nm，并从而形成可以发生检测事件的纳米电极。纳米电极708由以氮化钽层714为衬里的铜材料形成。如图7进一步可知，SAM层715(自组装单分子层)与铜结构708和生物分子-引物复合体712桥接。

在最后CMP步骤之后残留的裸铜表面可以在空气或水中氧化。因此，通常在该CMP步骤期间(或者在后续清洗步骤期间)沉积BTA(腐蚀阻抑剂)以抑制这种氧化。这样，在沉积SAM 175之前，可以将晶片存储若干时间(若干天，或者可能甚至若干星期)。

就在SAM沉积之前，必须从铜表面移除BTA。用实验方法发现，一些湿化学SAM沉积制法实际移除了BTA本身。在这种情况下，在SAM沉积之前，不必严格移除BTA，这是由于BAT移除会自动进行。在SAM沉积之后，由于BTA将污染SAM表面，因此不再可能沉积BTA。取而代之，适当的SAM 715应当自己起到腐蚀阻抑剂的作用。或者在SAM沉积之后，必须将传感器芯片存储在无氧化性气氛中。

除此之外，生物传感器芯片700包括形成生物传感器芯片700表面的一部分并具有凹口717的绝缘层716，其中，提供传感器活性区701的暴露表面703作为凹口717中感测袋体积。

采用CMOS技术，从硅衬底718开始，制造生物传感器芯片700，在图7中示出了硅衬底718的表面，并且硅衬底718可以具有P阱或N阱。

可以提供用于电接触生物传感器芯片700的键合焊盘(bong pad)，但是图7中未示出。

更具体地，在半导体衬底718上/中提供电绝缘浅沟绝缘结构719。栅极710包括多晶硅材料和CoSi硅化物结构。此外，在浅沟绝缘层719和栅极堆叠710上提供碳化硅层720。氧化硅层721具有其中形成钨触点706的接触孔。在该结构的顶部，提供了另一碳化硅层741。在碳化硅层741的顶部，氮化钽衬里722被预见为，给填充铜材料的沟加衬，以形成铜金属结构705。这可以嵌入在另一氧化硅层723中。在该结构顶部，形成另一碳化硅层724，随后在另一氧化硅层726中形成的过孔中形成氮化钽衬里725。在有衬里的过孔中填充铜材料，从而形成铜通道704。接着，可以沉积碳化硅层727，随后设置另一氧化硅层728，在另一氧化硅层728中，可以刻蚀另一沟，该另一沟可以以另一氮化钽结构729为衬里。该有衬里的沟道可以填充铜材料，从而形成铜金属层708。

可以执行CMP(化学机械抛光)过程来在生物传感器芯片700中产生实质上平坦表面。

图8示出了说明纳米电极的示例的图像800。

图9给出了晶体管900的示例。

图10示出了说明装置700的顶视图的图像1000，示出了多个纳米电极。示出了划线保护访问区(scratch protection access area)1002以及电极阵列1004。

图11示出了传感器活性区106的放大图1100。在感测袋1102内，可以在电极106处固定引物108，该感测袋1102可以是沟等，并有电绝缘侧壁1104分隔。还示出了未知的DNA链(模板)102。此外，示出了DNA聚合酶112。有可能在每个纳米电极106中包含引物108和未知DNA链102。A、T、G、C以及ddA、ddG、ddT和ddC可以浮在溶液(图11中未示出)中。

图12示出了生物传感器装置700，该生物传感器装置700具有第一衬底1202、分离的第二衬底1204、分离的第三衬底1206以及分离的第四衬底1208。在衬底1202、1204、1206、1208中的每一个的表面上示出了多个类似矩阵布置的纳米电极106。

在第一芯片1202上，提供了A、T、G、C和ddA，以及聚合酶、引物和未知的DNA序列。向第二芯片1206，添加A、T、G、C、ddT、聚合酶、引物以及未知的DNA序列。向第三芯片1204，添加A、T、G、C、ddG、聚合酶、引物以及未知的DNA序列。向第四芯片1208，添加A、T、G、C、ddC、聚合酶、引物以及未知的DNA序列.

如图12可知，每个纳米电极106暴露于所示溶液。聚合酶的作用类似于桑格方法中。

图13是再次示出了第一芯片1202的图像1300。

图13是通过读取第一芯片1202而获得的这种类型的信息的示例。如附图标记1302所示，在电极(1，1)上不包含核苷酸并以ddA结束。如附图标记1304所示，在电极(2，2)上包含2个核苷酸并以ddA结束。如附图标记1306所示，在电极(3，3)上包含7个核苷酸并以ddA结束。因此，每个电极106接收与包含的核苷酸的数目成比例的不同的电容信号。图13中所示的序列仅是示例性的。任何其他组合是可能的，例如，电极(1，1)上0个核苷酸，电极(1，2)上2个核苷酸，电极(1，3)上7个核苷酸。

图14示意性说明了通过读取第一芯片1202而获得这种类型的信息的示例。在该示例中，将ddA视作核苷酸。如箭头1402所指，聚合酶始终沿该方向在引物中包含核苷酸。如附图标记1404所示，电极(3，3)包含7个核苷酸，并以ddA结束。如附图标记1406所示，电极(2，2)包含2个的核苷酸，并以ddA结束。如附图标记1408所示，电极(1，1)没有包含核苷酸，并以ddA结束。

因此，可以从第一芯片1202中导出序列中所有的“A”位置。

图15示出了在读取第二芯片1206之后如何获得信息。如附图标记1500所示，根据片段，可以导出“T”位置。

图16示出了在读取第三芯片1204之后可以导出哪些信息。如附图标记1600所示，可以导出“G”位置。

图17示出了在读取第四芯片1208之后可以导出哪些信息。如附图标记1700所示，可以导出与“C”有关的信息。

如图18所示，在已经读出4个芯片1202、1204、1206、1208之后，可以重构未知DNA链102。用附图标记402表示由引物构建的DNA链，而先前未知的DNA链102与引物链402互补。

图19示出了根据本发明另一实施例的生物传感器装置1950。

与图11相比，纳米悬臂1952被示为感测元件而不是纳米电极。纳米悬臂1952在所附着的分子108、102的机械力下可弯曲(参见箭头1954)。如图11所示，核苷酸和双脱氧核苷酸浮在溶液中。每个纳米悬臂1952可以附着有聚合酶112、引物108和模板102。

如图20示意性所示，当达到ddA，聚合酶反应停止。悬臂1952经历与已经添加的质量成比例的偏转。因此，以可弯曲方式安装悬臂1952，有可能从弯曲程度中导出指示添加的片段的长度的信息。

图21说明了根据本发明示例实施例的电子桑格生物传感器装置1900。

在图21中，示出了4个纳米悬臂的阵列，纳米悬臂分别具有衬底1202、1204、1206、1208以及附着的悬臂1902。向连接至衬底1202的纳米悬臂阵列提供A、T、G、C、ddA、聚合酶、引物以及未知DNA序列。向指定给衬底1204的纳米悬臂提供A、T、G、C以及ddT、聚合酶、引物以及未知DNA序列。向与衬底1206连接的纳米悬臂阵列提供A、T、G、C、ddG、聚合酶、引物以及未知DNA序列。向指定给衬底1208的纳米悬臂提供A、T、G、C、ddC、聚合酶、引物以及未知DNA序列。如图21所示，确定单元114这里还起到控制单元的作用。控制单元114控制受激激光器1920，该受激激光器1920将光束1906指向悬臂1902中特定的一个。如箭头1922所示，激光器1920可以扫描整个装置1900。光电二极管或CCD探测器1924检测反射光，以导出反射特性，并因此计算悬臂1902的偏转。

图22示意性说明了针对指定给衬底1202的纳米悬臂阵列如何导出信息。如附图标记2000所示，纳米悬臂(1，1)没有包含核苷酸，并以ddA结束。纳米悬臂2002(2，2)包含2个核苷酸，并以ddA结束。如附图标记2004所示，悬臂(3，3)包含7个核苷酸，并以ddA结束。

可以向图21所示的阵列中的每一个悬臂1902引导激光，并且读取偏转值，该偏转值代表包含到引物中的核苷酸的数目。因此，采用与图14至图18所示方式相同的方式，可以从悬臂弯曲中导出DNA序列。可以给出偏转值与包含的核苷酸的数目之间的比例关系。

最终，应注意，上述实施例示出而非限制本发明，在不脱离如所附权利要求所限定的本发明的范围的前提下，本领域技术人员将能够设计出许多备选实施例。在权利要求中，置于圆括号中的任何附图标记不应被解释为限制权利要求。词语“包括”和“包含”等并不排除除了任何权利要求或说明书全文中所列的元件或步骤以外的其他元件或步骤的存在。元件的单数引用并不排除对这种元件的复数引用，反之亦然。在列举了若干装置的设备权利要求中，可以由同一软件或硬件来实现这些装置中的若干装置。重要的是，在互不相同的从属权利要求中阐述特定措施并不表示不能有利地使用这些措施的组合。

Claims (18)

1.一种对生物微粒(102)进行测序的生物传感器装置(100)，所述生物传感器装置(100)包括：

至少一个衬底(104)；

在所述至少一个衬底(104)中的每一个上提供的多个传感器活性区(106)，其中，每个传感器活性区(106)包括具有与生物微粒(102)的序列的一部分互补的序列的引物(108)，使得能够在引物(108)处产生具有与生物微粒(102)的序列的一部分相反的序列的片段；以及

确定单元(114)，适于单独地确定在所述多个传感器活性区(106)中的每一个的引物(108)处复制的片段的大小，在存在复制终止序列单元(116至119)时，终止片段产生。

2.根据权利要求1所述的生物传感器装置(100)，其中，确定单元(114)适于考虑与指定类型的复制终止序列单元(116至119)有关的信息，基于单独地确定的片段大小，来确定生物微粒(102)的序列。

3.根据权利要求1所述的生物传感器装置(100)，其中，所述至少一个衬底仅由一个衬底(104)组成，所述衬底(104)具有分隔室(120至123)，具体地具有四个分隔室(120至123)，每个分隔室(120至123)包括多个传感器活性区(106)，并被指定给一种类型的复制终止序列单元(116至119)。

4.根据权利要求1所述的生物传感器装置(1200)，其中，所述至少一个衬底包括多个分离的衬底(1202、1204、1206、1208)，具体地，包括四个分离的衬底(1202、1204、1206、1208)，每个分离衬底(1202、1204、1206、1208)包括多个传感器活性区(106)，并被指定给一种类型的复制终止序列单元(116至119)。

5.根据权利要求1所述的生物传感器装置(100)，其中，多个传感器活性区包括电极(106)，具体地，纳米电极。

6.根据权利要求5所述的生物传感器装置(100)，其中，电极(106)的暴露表面具有小于300nm的尺寸。

7.根据权利要求5所述的生物传感器装置(100)，其中，电极(106)包括铜材料，具体地，由自组装单分子层覆盖的铜材料。

8.根据权利要求5所述的生物传感器装置(100)，其中，电极(106)形成电容器结构，所述电容器结构被布置为使得电容器的电容值受相应传感器活性区(106)中的检测事件的影响。

9.根据权利要求5所述的生物传感器装置(100)，其中，确定单元(114)适于对在电极(106)处接收到的电信号进行评估，所述电信号指示指定的片段大小。

10.根据权利要求1所述的生物传感器装置(1900)，其中，多个传感器活性区包括悬臂梁(1902)，具体地，纳米悬臂梁，所述悬臂梁(1902)可基于片段大小以表示特性的方式弯曲。

11.根据权利要求10所述的生物传感器装置(1900)，其中，确定单元(1904)适于使用电磁辐射束(1906)，具体地激光束，对悬臂梁(1902)的弯曲进行采样，其中，可弯曲悬臂梁(1902)处的电磁辐射束(1906)的偏转指示指定的片段大小。

12.根据权利要求1所述的生物传感器装置(100)，其中，传感器活性区(106)的暴露表面的尺寸是用于制造生物传感器装置(100)的COMS工艺的最小光刻特征尺寸的至多1.6倍，具体地至多1.1倍，更具体地至多0.7倍。

13.根据权利要求1所述的生物传感器装置(700)，包括电耦合至传感器活性区(717)的开关晶体管结构(713)。

14.根据权利要求1所述的生物传感器装置(100)，采用CMOS技术或MEMS技术进行制造。

15.根据权利要求1所述的生物传感器装置(100)，单片集成在半导体衬底(104)中，具体地包括由Ⅳ族半导体和Ⅲ-Ⅴ族半导体构成的组中的一种。

16.根据权利要求1所述的生物传感器装置(100)，其中，引物(108)适于在存在生物微粒(102)的序列的序列单元(110)时以及在存在复制酶(112)时，使得能够在引物(108)处产生具有与生物微粒(102)的序列的一部分相反的序列的片段。

17.一种对生物微粒(102)进行测序的方法，所述方法包括：

在至少一个衬底(104)中的每一个上提供多个传感器活性区(106)，所述多个传感器活性区(106)中的每一个包括具有与生物微粒(102)的序列的一部分互补的序列的引物(108)，使得能够在引物处(108)产生具有与生物微粒(102)的序列的一部分相反的序列的片段；以及

单独地确定在所述多个传感器活性区(106)中的每一个的引物(108)处产生的片段的大小，在存在复制终止序列单元(116至119)时，终止片段复制。

18.根据权利要求17所述的方法，包括考虑与指定类型的复制终止序列单元(116至119)有关的信息，基于单独地确定的片段大小，来确定生物微粒(102)的序列。

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