CN107460205A - 基于甲病毒复制子鸡球虫的dna疫苗及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于甲病毒复制子鸡球虫的DNA疫苗，为一种新型的鸡球虫DNA疫苗，可用于鸡球虫病的预防，基于甲病毒复制子为基础的新型DNA疫苗不仅能高效的表达目的基因，而且甲病毒复制子不进入细胞核，仅在胞浆中目的蛋白表达之后便发生凋亡而被机体清理，不会结合到宿主细胞的基因组上，其安全性好。这类新型的DNA疫苗制备简单、易于生产、成本低，保存和运输比较容易，适用于广泛的使用。

Description

基于甲病毒复制子鸡球虫的DNA疫苗及制备方法
技术领域
本发明提供了一种基于甲病毒复制子鸡球虫的DNA疫苗，为一种新型的鸡球虫DNA疫苗，可用于鸡球虫病的预防，属于基因工程技术领域。
背景技术
鸡球虫病是由艾美耳属的球虫寄生于鸡肠道引起的一种寄生性原虫病，尤以柔嫩艾美耳球虫的致病力最强，故成为本病防治的重点。由于该病严重影响鸡体的生长发育、产蛋率等，给对养鸡业的危害巨大，据相关统计每年给全世界造成的经济损失达30多亿美元。然而，目前防治该病主要依靠药物和活球虫疫苗，但长期使用药物防治球虫会导致耐药虫株以及药物残留等问题，且活疫苗存在散毒、毒力反祖等问题。故研制出一种免疫效果好、使用安全的疫苗用于预防和控制鸡球虫病是很有必要。
DNA疫苗是目前世界上研究最广泛的疫苗。它是将某种抗原基因导入真核表达载体中，通过注射的方式注入机体内，并通过宿主的转录合成抗原蛋白，从而诱导宿主产生免疫反应，达到预防疾病的目的。低剂量的接种能使机体产生持久的细胞免疫和体液免疫且免疫效果好。DNA疫苗的制备较简易，易于生产，价格低廉，便于运输。DNA疫苗相比传统的疫苗安全性好，本身不会散毒或产生毒素引发其他疾病。尽管DNA疫苗作为新型疫苗，有着许多的优势，但现在鸡球虫DNA疫苗还处于研究的初级阶段，很多技术难关还没有攻克。人们对DNA疫苗的安全性上还存在一些顾虑，如外源DNA是否能有整合到宿主基因组上的风险，有可能引起基因突变，引发宿主癌变；另外DNA长期低水平的表达外源抗原，会导致自身免疫反应和免疫耐受等，这些问题都制约着DNA疫苗广泛用于实际。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于甲病毒复制子鸡球虫的DNA疫苗，甲病毒复制子不进入细胞核，仅在胞浆中目的蛋白表达之后便发生凋亡而被机体清理，不会结合到宿主细胞的基因组上，其安全性好。
本发明的技术解决方案如下：
首先获得柔嫩艾美耳球虫保护性抗原基因，进行TA克隆，测序鉴定正确后酶切回收目的片段，再分别与同样进行酶切反应的pSMARAT2b甲病毒表达载体相连，构建的重组质粒进行菌液PCR和双酶切鉴定，并进行测序，测序正确的重组质粒转染293细胞，然后用Westernbloting进行分析。
本发明提供的重组质粒，将其命名为pSMARAT2b-Rhomboid3。
本发明以柔嫩艾美耳球虫保护性抗原Rhomboid3基因为例，进行重组质粒的构建。
、重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3的制备：
首先提取柔嫩艾美耳球虫的总RNA，提取柔嫩艾美耳球虫的总RNA并反转录为cDNA，通过PCR扩增Rhomboid3基因，然后连接pMD-18T、pSMARAT2b并在DH5α克隆，且通过测序及酶切鉴定，大小为774bp。接着将重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3通过LipofectamineTM2000转入293细胞表达，并对表达产物进行Western blot分析鉴定。
、一种基于甲病毒复制子载体为基础的鸡球虫DNA疫苗制备方法，其特征在于：
参照Rhomboid3基因DNA序列及甲病毒复制子载体pSMARAT2b物理图谱设计两对引物并引入酶切位点：上游引物QF1：5'-CCATCGATAACATTTCACTGGACAAGTCG-3'；其中5`端含有ClaI位点；下游引物QR：5'-TCCCCC GGGACACGTTACTGCGAACCCGCA-3'；5`端含有SmaI位点；将扩增克隆出的目的基因纯化后与pMD18-T载体并进行PCR、酶切及测序鉴定，凝胶回收片段与同样进行酶切的甲病毒复制子载体pSMARAT2b连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后筛选重组质粒，用SmaI、ClaⅠ进行双酶切反应，重组质粒命名为pSMARAT2b-Rhomboid3。
将重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3通过脂质体法转染293细胞；在转染的前一天，传293细胞于6孔板中，在在37℃、5%CO2条件下继续培养，待到细胞生长密度占培养瓶的70%时进行转染实验；在转染前的1~2个小时，倒掉培养培养瓶中的完全培养基，换成无抗生素10%DMEM培养液；用50μL的Opti-MEMI低血清培养基稀释DNA，同样LipofectamineTM 2000转染试剂也要用Opti-MEMI低血清培养基稀释，在室温静置5min，LipofectamineTM 2000稀释液和DNA稀释液混合后在轻轻混匀，室温放置30min；向6孔板每个孔中加入100μL的混合液，轻轻摇晃6孔板，使其混匀，放入37℃、5%CO2条件下继续培养12~48h；在细胞转染24h后，收集6孔板中的细胞，用PBS溶液洗涤3次，然后用150μL细胞裂解液裂解细胞，裂解半个小时使其完全裂解，裂解结束后放入4℃离心机中，12000r/min离心5min，吸取上清，向其中加入30μL的6×SDS蛋白Buffer，放入100℃水中煮8~10min，然后12000rpm离心5min，吸取上清进行Western blotting 鉴定，即得。
免疫效果检测：将制备好的重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3分别以50ug/只和100ug/只的剂量通过腿部肌肉注射免疫，并同时设pSMARAT2b空载体组和红、白对照组，三次免结束后对鸡血清抗体水平、细胞因子（IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ）、T淋巴细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞活性进行检测；三免一周后进行攻虫试验，每只鸡攻104柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，对保护率、相对增重率、OPG、ACI等指标进行综合评价重组质粒的保护效果。
用柔嫩艾美耳球虫的Rhomoid3基因构建的重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3，通过三次免疫后，结果表明重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3免疫雏鸡后能诱导机体产生细胞免疫和体液免疫, 免疫剂量50µg和免疫剂量100µg的组与对照组相比，可以产生更高水平的抗体，诱导产生的细胞因子IL-2和IFN-γ水平高，同时诱导的毒性T淋巴细胞活性高，并能促进T淋巴细胞的增殖，且均差异极显著（P<0.01）。三免之后进行攻虫实验，结果表明免疫剂量50µg和免疫剂量100µg组与红对照组相比，卵囊数减少，体重增长，盲肠病变减少，各项指标均明显优于对照组（结果见表1）。经过综合评价红对照组ACI值为136.45，而免疫剂量50µg和免疫剂量100µg组重组质粒的ACI分别为181.25和184.22，显示出较好的保护性效果。
而以甲病毒载体作为表达载体，构建的新型DNA疫苗与传统的DNA疫苗相比，在RNA复制酶和转录酶的作用下，RNA能在细胞里大量复制，能更加高效的表达目的基因；而且甲病毒复制子不进入细胞核，仅在胞浆中目的蛋白表达之后便发生凋亡而被机体清理，不会结合到宿主细胞的基因组上，其安全性好。这些优势使以甲病毒复制子为表达载体构建的新型DNA疫苗是一种非常理想的基因工程苗。
本发明的积极效果在于：基于甲病毒复制子为基础的新型DNA疫苗不仅能高效的表达目的基因，而且甲病毒复制子不进入细胞核，仅在胞浆中目的蛋白表达之后便发生凋亡而被机体清理，不会结合到宿主细胞的基因组上，其安全性好。这类新型的DNA疫苗制备简单、易于生产、成本低，保存和运输比较容易，适用于广泛的使用。本发明用本课题组从柔嫩艾美耳球虫的cDNA文库中筛选的Rhomboid3基因作为候选基因。Rhomboid蛋白家族涉及EGF及EGFR信号转导，是EGFR信号转导的关键信号调节器，是一类保守的膜内丝氨蛋白酶，经过学者们的研究表明，Rhomboid蛋白是顶复器门原虫黏附和入侵细胞的重要蛋白。说明Rhomboid基因有作为疫苗候选基因的价值。
基于甲病毒复制子新型DNA疫苗不仅更能高效的表达目的蛋白发挥免疫保护作用，达到更好的预防鸡球虫病的目的，而且甲病毒复制子不进入细胞核，仅在胞浆中目的蛋白表达之后便发生凋亡而被机体清理，不会结合到宿主细胞的基因组上，其安全性好。本发明的疫苗热稳定性好，运输和保存较为容易，易于生产，产品不需纯化，可直接用于免疫保护试验，免去了蛋白质后期处理的复杂工序，从而大大降低了成本，适宜于广大农村。因此这种新型的DNA疫苗的研制具有非常广阔的前景和应用价值。
附图说明
图1为扩增克隆出的Rhomboid3基因。
图2为重组质粒pMD-18T-Rhomboid3的菌液PCR鉴定。
图3为重组质粒pMD-18T-Rhomboid3双酶切鉴定。
图4为重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3的菌液PCR鉴定。
图5为重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3双酶切鉴定。
图6为重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3的Western blotting分析。
图7为鸡血清中抗体水平的变化。
图8为鸡血清中细胞因子水平变化。
图9为脾脏T淋巴细胞增殖水平变化。
图10细胞毒性T淋巴细胞的水平变化。
表1为重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3抗E.tenella的保护效果。
表2重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3抗E.tenella的抗球虫指数。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3的制备步骤如下：
参照Rhomboid3基因DNA序列及甲病毒复制子载体pSMARAT2b物理图谱设计两对引物并引入酶切位点：
上游引物QF1：5'-CCATCGATAACATTTCACTGGACAAGTCG-3'；其中5`端含有ClaI位点；
下游引物QR：5'-TCCCCC GGGACACGTTACTGCGAACCCGCA-3'；5`端含有SmaI位点；
将扩增克隆出的目的基因（图1所示）纯化后与pMD18-T载体并进行PCR、酶切及测序鉴定（图2和图3）所示，凝胶回收片段与同样进行酶切的甲病毒复制子载体pSMARAT2b连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后筛选重组质粒，用SmaI、ClaⅠ进行双酶切反应，重组质粒命名为pSMARAT2b-Rhomboid3（如图4和图5所示所示）；
将重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3通过脂质体法转染293细胞；
在转染的前一天，传293细胞于6孔板中，在在37℃、5%CO2条件下继续培养，待到细胞生长密度占培养瓶的70%左右时，可以进行转染实验。在转染前的1~2个小时，倒掉培养培养瓶中的完全培养基，换成无抗生素10%DMEM培养液，按照LipofectamineTM 2000转染试剂说明书进行操作，方法如下：用50μL的Opti-MEMI低血清培养基稀释DNA，同样LipofectamineTM2000转染试剂也要用Opti-MEMI低血清培养基稀释，在室温静置5min，然后LipofectamineTM2000稀释液和DNA稀释液混合在一起（总体积100μL），然后在轻轻混匀，室温放置30min，然后向6孔板每个孔中加入100μL的混合液，轻轻摇晃6孔板，使其混匀，放入37℃、5%CO2条件下继续培养12~48h；
在细胞转染24h后，收集6孔板中的细胞，用PBS溶液洗涤3次，然后用150μL细胞裂解液裂解细胞（放在冰上），裂解半个小时使其完全裂解，裂解结束后放入4℃离心机中，12000rpm离心5min，吸取上清，向其中加入30μL的6×SDS蛋白Buffer，放入100℃水中煮8~10min，然后12000rpm离心5min，吸取上清进行Western blotting 鉴定（图6）。
试验例1
重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3的抗柔嫩艾美耳球虫保护效果
将215只13日龄健康的雏鸡随机分成6组，每组35只。免疫组为肌注50μg（免疫A组）和100μg（免疫B组）pSAMRT2b-Rhomboid3重组质粒，设置肌注50μg（空载体A组）和100μg（空载体B组）pSAMRT2b空载体、红对照组和白对照组。共免疫三次，分别在14日龄、21日龄、28日龄进行免疫，在免疫之前和攻虫前每组随机选取5只鸡进行颈静脉采血和收集脾脏淋巴细胞，测定血清中抗体水平，IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ表达水平，鸡脾脏淋巴细胞增殖情况和脾脏毒性T淋巴细胞活性；三免疫一周后口服接种柔嫩艾美耳球虫卵囊1×104个/只进行攻虫试验，进行以下各项指标判定，包括存活率、相对增重率、盲肠病变、OPG、ACI等。
鸡体的免疫应答：在三次免疫之前和攻虫前每组随机选取5只鸡进行颈静脉采血和取脾脏淋巴细胞。用于检测血清中的抗体水平和细胞因子（IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ）鸡脾脏淋巴细胞增殖情况和脾脏毒性T淋巴细胞活性。
抗体水平检测：通过间接ELISA方法检测一免前、二免前、三免前和攻虫前每组血清中抗体水平的变化，以感染柔嫩艾美耳球虫的鸡的血清作为阳性对照，以健康鸡的血清作为阴性对照。结果表明，在一免后，免疫剂量50µg和免疫剂量100µg组血清中的抗体水平变化不大，但随着免疫次数的增加，抗体水平明显增加，三免过后，与对照组相比，差异极显著（P<0.01），且免疫剂量100µg组比免疫剂量50µg产生的抗体水平略高。而对照组在这三次免疫中，抗体水平基本没有变化（图7所示）。
细胞因子检测：用鸡细胞因子ELISA检测试剂盒对一免前、二免前、三面前和攻虫前鸡血清中的IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平进行检测。结果表明鸡血清中的细胞因子IL-2和IFN-γ随着免疫次数增加，免疫剂量50µg和免疫剂量100µg组的IL-2和IFN-γ呈现逐渐上升的趋势，且随免疫剂量的增加两种细胞因子水平增加，而对照组在这三次免疫中变化不明显；免疫剂量50µg和免疫剂量100µg组在三免之后与对照组相比差异极显著（P<0.01）。而鸡血清中的细胞因子IL-4和IL-10在这三次免疫过程中，所有组的这两种细胞因子水平都没明显的变化，免疫剂量50µg和免疫剂量100µg组与对照组的差异都不显著（P>0.05）（图8所示）。
T淋巴细胞增殖试验：分别在一免、二免、三免以及攻虫前取脾脏淋巴细胞，用MTT法检测各组T淋巴细胞增殖情况。结果表明免疫剂量50µg和免疫剂量100µg组的T淋巴细胞在一免前、二免前和三免前都没有明显的增长，但在三免之后，开始明显增加，且与对照组相比差异极显著（P<0.01），且免疫剂量100µg比免疫剂量组50µg增殖水平高。在这三免期间，对照组没有明显的变化（图9所示）。
细胞毒性T淋巴细胞分析：三免后的T淋巴细胞用Colorimetric CellCytotoxicity Assay Kit进行分析，结果表明免疫剂量50µg和免疫剂量100µg组的毒性T淋巴细胞的活性明显的高于对照组，差异极显著（P<0.01），且免疫剂量100µg比免疫剂量组50µg毒性T淋巴细胞活性稍高（图10所示）。
保护效果观察：三次免疫一周后口服接种柔嫩艾美耳球虫卵囊1×104个/只进行攻虫试验，进行以下各项指标判定，包括存活率、相对增重率、盲肠病变、OPG、ACI等。结果表明免疫剂量50µg和免疫剂量100µg组与红对照组相比，卵囊数减少，体重增长，盲肠病变减少，且差异显著（P<0.05）（见表1）。经过综合评价免疫剂量50µg和免疫剂量100µg组的ACI分别为181.25和184.22（见表2），显示出较好的保护作用。
表1 重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3抗E. tenella的保护效果
表2 重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3抗E. tenella的抗球虫指数
<110> 吉林大学
<120>
<140>
<160> 4
<210> 1
<211>774
<212> DNA
<213>柔嫩艾美尔球虫(Eimeriatenella)
<400> 1
1 ATGTCGGACATCGAATCCCAGAGAGTCCTCGGGGCTGGGATCCCGCGGACTGGCAGACTG
61 ATTGATGTTGCCTTCCCTAACATTTCACTGGACAAGTCGATTGTTGTGATAACGTTGGCC
121 CAGATCGCGGTCTACATTATGTCATGTGCGATGTCGTCGGCTTTTGAGCCTACGGAGCGC
181 GTCTTGTACCAATTGGGCGCTACCTACGGACCTGGGATACGGCACCTCCAAGCATGGAGG
241 CTTATCATGCCTGTTTTCCTTCATGTCGGCATTGTCCATTTGCTGTTCAATGTTCTCTTC
301 ATTTTGCACATGGGACTTGACAAGGAAATAAAGTATGGGAGGACGAATTTCCTCATACTA
361 TACTTCTCCTCTGCTCTTATCGGGAACATGTTCACTGTCTTGATGCGGCCGTGCTCCTTG
421 GCTGTTGGTGCGAGTACAGCAGGGTTCGGTCTCGTGGGTTCCATCCTTGCCGAGATCTTG
481 ATTGTCTGGCACAAGCTTGACGAACGCACAAGGAACATGTACACACTCGACATGACTGTA
541 TTTGGTGCTTTGATGATTCTTCTCTCCTACGGACAAACTGTCGACATCTGGGGCCATTTG
601 GGAGGTTTCGTCTGCGGGTTCGCAGTAACGTGTGAATTCAACAAGAACATAAGGGACCTT
661 CCTCATTGGTTTGACCTGGCCAAGAATGGGACAAGAACTATTTGCTTTGGTGTTGTCGCT
721 CTTACACTTGCACGTGTATTCCTTGGCCTTCCTTTGCCCATGGGATGCGCATAA

Claims (3)

1.一种重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3的制备方法，包括以下步骤：
提取柔嫩艾美耳球虫的总RNA，提取柔嫩艾美耳球虫的总RNA并反转录为cDNA，通过PCR扩增Rhomboid3基因，然后连接pMD-18T、pSMARAT2b并在DH5α克隆，且通过测序及酶切鉴定，大小为774bp；接着将重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3通过LipofectamineTM2000转入293细胞表达，并对表达产物进行Western blot分析鉴定。
2. 重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3 DNA疫苗在抗鸡球虫中用途。
3.一种基于甲病毒复制子载体为基础的鸡球虫DNA疫苗制备方法，其特征在于：
参照Rhomboid3基因DNA序列及甲病毒复制子载体pSMARAT2b物理图谱设计两对引物并引入酶切位点：上游引物QF1：5'-CCATCGATAACATTTCACTGGACAAGTCG-3'；其中5`端含有ClaI位点；下游引物QR：5'-TCCCCC GGGACACGTTACTGCGAACCCGCA-3'；5`端含有SmaI位点；将扩增克隆出的目的基因纯化后与pMD18-T载体并进行PCR、酶切及测序鉴定，凝胶回收片段与同样进行酶切的甲病毒复制子载体pSMARAT2b连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后筛选重组质粒，用SmaI、ClaⅠ进行双酶切反应，重组质粒命名为pSMARAT2b-Rhomboid3；
将重组质粒pSMARAT2b-Rhomboid3通过脂质体法转染293细胞；在转染的前一天，传293细胞于6孔板中，在在37℃、5%CO2条件下继续培养，待到细胞生长密度占培养瓶的70%时进行转染实验；在转染前的1~2个小时，倒掉培养培养瓶中的完全培养基，换成无抗生素10%DMEM培养液；用50μL的Opti-MEMI低血清培养基稀释DNA，同样LipofectamineTM 2000转染试剂也要用Opti-MEMI低血清培养基稀释，在室温静置5min，LipofectamineTM 2000稀释液和DNA稀释液混合后在轻轻混匀，室温放置30min；向6孔板每个孔中加入100μL的混合液，轻轻摇晃6孔板，使其混匀，放入37℃、5%CO2条件下继续培养12~48h；在细胞转染24h后，收集6孔板中的细胞，用PBS溶液洗涤3次，然后用150μL细胞裂解液裂解细胞，裂解半个小时使其完全裂解，裂解结束后放入4℃离心机中，12000r/min离心5min，吸取上清，向其中加入30μL的6×SDS蛋白Buffer，放入100℃水中煮8~10min，然后12000rpm离心5min，吸取上清进行Western blotting 鉴定，即得。
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