JP2004534532A - Ｒｈｏｍｂｏｉｄポリペプチドのモジュレーターを同定するアッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞内の様々なシグナリング経路に関わる保存されたRhomboidファミリーのタンパク質に関する。Rhomboidタンパク質はポリペプチド基質を膜貫通ドメイン内で切断する新規のセリンプロテアーゼ活性を持つことが見出された。この活性の方法と用途を提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
アッセイ、方法および手法
本発明は進化を通じて保存されたRhomboidファミリーのタンパク質であって、ショウジョウバエにおいて上皮成長因子受容体シグナリングに関わる前記タンパク質に関する。特に本発明はこのタンパク質ファミリーのメンバーの活性および機能に関する。
【背景技術】
【０００２】
Rhomboid-1はショウジョウバエにおけるそれぞれ７個のTMDをもつ７種の関係タンパク質グループの１メンバーであって、進化を通して保存されたファミリーの原型である（Wassermanら, (2000) Genes Dev. 14, 1651-1663）。このファミリーのいずれのメンバーにも今まで活性または機能は割り付けられていないが、Rhomboid-1はショウジョウバエにおける上皮成長因子受容体（EGFR）活性化の主なトリガーであると思われる。
【０００３】
EGF受容体チロシンキナーゼは、動物成長および発生における多くの細胞の決定を調節する。ショウジョウバエは単一のEGF受容体を有し、これは哺乳類ErbB受容体の４種全てと等しく類似して恐らくそれらの進化の原型を代表すると思われる。ショウジョウバエEGF受容体は、その哺乳類対応物と同様、発生中に分化、成長および細胞生存の制御を含む複数の機能を有する（SchweitzerおよびShilo, (1997) Trends in Genetics 13, 191-196；Dominguezら,(1998) Current Biol. 8, 1039-1048）。
【０００４】
EGF受容体経路はハエおよび哺乳類の間でよく保存されていて、哺乳類ErbBシグナリングの機構および制御に関わる成分（CasciおよびFreeman, (1999) Cancer and Metastasis Rev. 18, 181-201）をショウジョウバエ遺伝学により確認することができる。これらの受容体は多くの哺乳類の細胞機能を調節するだけでなく、それらの機能亢進がヒトの癌および他の疾患とも強い関連をもつので、このEGF受容体経路は重要な研究目標である（YardenおよびSliwkowski, (2001) Nature Reviews Molecular and Cell Biology 2, 127-137）。
【０００５】
ショウジョウバエEGF受容体の主な活性化リガンドはSpitzであり、これは哺乳類TGFαと類似し、単一の膜貫通ドメイン（TMD）および１つの細胞外EGFドメインとともに合成される（Rutledgeら (1992) Genes Dev. 6, 1503-1517）。遺伝的確証は、Spitzがリガンドとして機能するためにタンパク分解的に切断されて可溶性細胞外断片になるという示唆を与えるが、これは生化学的には示されていない（Freeman, 1994 Mech. Dev. 48, 25-33；Schweitzerら, (1995) Genes Dev. 9, 1518-1529.；Golemboら(1996) Development 122, 3363-70）。
【０００６】
Spitzは最初、遺伝学的に同定されたが、既知の哺乳類リガンドとの類似性によりその分子的機構が強く示唆された。これは、ハエ遺伝学により発見されている他のEGF受容体シグナリング成分についてはそうでない。例えば、膜貫通分子Rhomboid-1およびStarは遺伝学的にショウジョウバエのEGF受容体シグナリングの主なレギュレーターとして明記されるが、それらのタンパク質配列により示唆される機能はない。
【０００７】
Rhomboid-1およびその近い同族体であるRhomboid-3はEGF受容体活性化に必要である；多くの場合においてそれらは該経路の異所的活性化をトリガーする；そして最終的に、Rhomboid-1遺伝子の発現パターンは受容体活性を予知する（Bierら, (1990) Genes Dev. 4, 190-203；Freemanら, (1992) Development 116, 335-346；Ruohola-Bakerら, (1993) Cell 73, 953-965；Sturtevantら, (1993) Genes Dev. 7, 961-973；Golemboら, (1996) Development 122, 3363-70；zuer Lageら (1997) Current Biology 7, 166-175；WassermanおよびFreeman, (1998) Cell 95, 355-364；Guichardら, (1999) Development 126, 2663-76；Wassermanら, (2000) Genes Dev. 14, 1651-1663）。
【０００８】
単一のTMDをもつ２型膜貫通タンパク質であるStarにより得られる類似の結果（Kolodkinら (1994) Development 120, 1731-1745）は、Starもほとんどの場合においてEGF受容体シグナリングを調節することを示唆する。遺伝学的分析は、Rhomboid-1とStarは両方ともシグナル放出細胞において作用することを示す（Heberleinら, (1993) Devl. Biol. 160, 51-63；Golemboら, (1996) 前掲；Guichardら, (1999) 前掲；PickupおよびBanerjee, (1999) Dev. Biol. 205, 254-259；BangおよびKintner, (2000) Genes Dev 14, 177-86；Wassermanら, 2000 前掲）。
【０００９】
かかる重要なEGF受容体活性化のレギュレーターであるにも関わらず、Rhomboid-1とStarの分子的機能については何も報じられていない。リガンドの産生または提示における役割があると思われるが、他の提案には形質膜における接着または活性シグナリング複合体の促進における役割が含まれる（WassermanおよびFreeman, (1997) Trends in Cell Biol. 7, 431-436の総説に記載）。
【００１０】
Spitz切断の確証（Freeman, (1994) Mech. Dev. 48, 25-33；Schweitzerら, (1995) Genes Dev. 9, 1518-1529）を考慮に入れて、Rhomboid-1はとにかくこのタンパク質分解を促進するという１つのモデル（Golemboら, 1996 前掲）が作られているが、識別可能なプロテアーゼドメインの欠落（Bierら, 1990 前掲）は、Rhomboid-1それ自身がプロテアーゼでありないことを示唆する。実際、Spitzの哺乳類同族体であるTGFαは、ハエ同族体を有し（まだ遺伝学的に特性決定されてないが）かつRhomboid-1と無関係であるADAMファミリーメタロプロテアーゼのTACEによりタンパク分解的に切断される（Peschonら, (1998) Science 282, 1281-4）。さらに最近の確証は、細胞表面のリガンド発現におけるStarとRhomboid-1の役割を強調する方向に移っている（Guichardら, 1999 前掲；BangおよびKintner, 2000 前掲；Klaembt, (2000) Curr Biol 10, R388-91）。最も直接的には、BangおよびKintner（2000）はアフリカツメガエル（Xenopus）外植体アッセイを用いて、Rhomboid-1とStarはSpitzのタンパク質分解に間接的に関わるだけであり、それらの直接的役割は形質膜におけるSpitzのコンフォメーションおよび／または発現を改変することであると結論した。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、Rhomboid-1とStarがEGFシグナル活性化を制御する機構の研究を通して行ったRhomboidファミリータンパク質の生物学的活性の決定に関する。
【００１２】
本発明者らは、Rhomboidファミリーが新しいクラスの膜内セリンプロテアーゼであり、このプロテアーゼはSpitzなどのEGFRリガンドを含むある範囲の生理学的基質に作用することを発見した。そのタンパク分解活性の特異性は、これらのタンパク質を抑制する分子が特異的かつ高度に有意な薬理学的効果を生じうることを示唆する。
【００１３】
ショウジョウバエにおいて、全長Spitzタンパク質はStarがそれにシャペロンとして付添って（chaperone）ゴルジ装置へ向うまで小胞体（ER）にしっかりと保持される。従来の仮定と異なり、Rhomboid-1は形質膜よりもむしろゴルジ装置に局在化し、そして直接Spitzを切断してEGFRと結合する可溶性断片を産生する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の一態様は、ポリペプチド基質をタンパク分解的に切断するRhomboidポリペプチドの断片を提供する。
【００１５】
ポリペプチド基質を膜貫通ドメイン内で切断することができる。
【００１６】
Rhomboidポリペプチドの断片は全長Rhomboidポリペプチドより少ない数の残基からなってもよい。例えば、Rhomboid-1ポリペプチドの断片は本明細書に記載のように、355個より少ないアミノ酸残基からなってもよい。
【００１７】
適当な基質は、ショウジョウバエSpitz配列の残基140-144（IASGA）のモチーフと同等のコンフォメーション、構造または三次元配置を有する５残基モチーフを含む膜貫通ドメインを含むものであってもよい。さらに好ましくは、かかる基質は、ショウジョウバエSpitz配列の残基138-144（ASIASGA）のモチーフと同等のコンフォメーション、構造または三次元配置を有する７残基モチーフを含む膜貫通ドメインを含んでいてもよい。
【００１８】
かかるポリペプチド基質は、１以上のショウジョウバエSpitz配列の残基140-144（IASGA）、さらに好ましくは138-144（ASIASGA）を含む膜貫通ドメイン（TMD）モチーフを含むものであってもよい。かかるTMDモチーフは３個以上、４個以上、５個以上、６個以上または７個全てのかかる残基を含んでもよい。好ましくは、TMDは、少なくともSpitzの残基143および144に対応するGAモチーフを含んでなる。上記のように、基質はRhomboidポリペプチドにより膜貫通ドメイン内で切断される。
【００１９】
他の適当なポリペプチド基質は、ショウジョウバエSpitz ASIASGAモチーフの残基をいずれも有しないが、その代わりにRhomboidポリペプチドにより切断されるものと同等の構造を持つモチーフ（例えば、Gurken、Keren）を有する膜貫通モチーフを含むものであってもよい。
【００２０】
例えば、適当なポリペプチド基質は、ショウジョウバエSpitzポリペプチド（残基139〜164）、Gurken、Keren、または表２に例示した他のEGFRリガンドまたはそれらの変異体、対立遺伝子、誘導体、同族体、または突然変異体の膜貫通領域からなるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２１】
変異体、対立遺伝子、誘導体、同族体、または突然変異体は、該ポリペプチドの膜貫通領域と約50％より大きい、約60％より大きい、約70％より大きい、約80％より大きい、約90％より大きい、または約95％より大きい配列同一性を有する配列からなってもよい。該配列は該ポリペプチドの膜貫通ドメインの配列と約70％より大きい類似性、約80％より大きい類似性、約90％より大きい類似性、または約95％より大きい類似性を共有してもよい。好ましくは、かかる変異体、対立遺伝子、誘導体、同族体、または突然変異体は、ショウジョウバエSpitz配列の残基141-144（IASGA）または同等の二次構造もしくはコンフォメーションをもつ残基、さらに好ましくは、ショウジョウバエSpitz配列の残基138-144（ASIASGA）または同等な二次構造もしくはコンフォメーションをもつ残基を含んでなる。
【００２２】
ポリペプチド基質は、例えば、Spitz、Gurken、KerenなどのEGFRリガンド、または表２に例示した他のEGFRリガンド、または２以上のEGFRリガンド由来のアミノ酸残基を含んでなるキメラ基質であってもよい。
【００２３】
他の適当な基質は、酵母（S. cerevidiae）ポリペプチドPET100/YDR079W、OSM1/YJR051W、MGM1/YOR211C、MCR1/YKL150WおよびCCP1/YKR066Cからなる群、特にMGM1/YOR211CおよびPET100/YDR079Wからなる群から選択することができる。
【００２４】
Rhomboidポリペプチド断片は、前記全長ポリペプチドより少ない数のアミノ酸からなる。かかる断片は少なくとも255個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも300個のアミノ酸からなってもよい。かかる断片は、325個以下のアミノ酸、300個以下のアミノ酸、または275個以下のアミノ酸からなってもよい。
【００２５】
かかる断片は好ましくは残基R152、G215、S217およびH281を、さらに好ましくは残基W151、R152、N169、G215、S217およびH281を含んでなり、これらの残基はタンパク質の触媒活性にとって重要でありかつRhomboidファミリーにおいて高度に保存される。適当なポリペプチド断片は、全長ショウジョウバエRhomboid-1配列のアミノ酸残基90〜328を含むものであってもよい。例えば、ポリペプチド断片はRhomboid-1タンパク質の残基90〜355を含みかつ全長タンパク質のＮ末端細胞質ドメインを欠くものであってもよく、または残基1〜328を含みかつ全長タンパク質のＣ末端ルーメンドメインを欠くものであってよい。
【００２６】
保存されたモチーフGXSG（Xはいずれのアミノ酸残基であってもよい）は活性部位セリン残基（S217）の周囲にしばしば見出され、Rhomboidポリペプチドは好ましくはかかるモチーフを含んでなるが位置4における変異体が存在する。特にモチーフGASGが存在しうる。
【００２７】
本特許出願においては、Rhomboidポリペプチドのアミノ酸残基をRhomboid-1配列中の位置を参照して記載する。他のRhomboidポリペプチド中の同等の残基は、それぞれのポリペプチドのアミノ酸配列に相違があるので、異なる位置と番号を有しうることは理解されるであろう。これらの相違は、例えば、Ｎ末端ドメインの長さの変化を通して起こりうる。Rhomboidポリペプチド中の同等の残基は、それらの全配列の前後関係によりおよびそれらのRhomboid TMDに対する位置により容易に認識することができる。
【００２８】
Rhomboidポリペプチドはまた、Rhomboid配列にとって異種である追加のアミノ酸残基を含むものであってもよい。例えば上記断片は融合タンパク質の部分として含まれてもよく、その部分は例えば異なるリガンドとの結合部分を含む。
【００２９】
本発明に従って使用するのに適当なRhomboidポリペプチドはRhomboidファミリーのメンバーまたはその突然変異体、同族体、変異体、誘導体または対立遺伝子であってもよい。適当なポリペプチドは、ショウジョウバエRhomboid 1、2、3または4、ヒトRHBDL-1（ヒトRhomboid-1：PascallおよびBrown (1998) FEBS Lett. 429, 337-340）、ヒトRHBDL-2（NM_017821）、ヒトRHBDL-3（図８）、ゼブラフィッシュ（Zebrafish）RHBDL2（図11）、大腸菌（E. coli）glgG、枯草菌（B. subtilis）ypqP、Ｐ・スツアルティイ菌（P. stuartii）A55862遺伝子産物、緑膿菌（P. aeruginosa）B83259遺伝子産物、酵母Ｓ・セルビジエ（S. cervisiae）YGR101wおよび酵母Ｓ・セルビジエ（S. cervisiae）YPL246C、または表１に例示した他のポリペプチドの配列を有してもよい。
【００３０】
他の適当なRhomboidポリペプチドは、例えばBlastサーチによりまたはrhomboidドメインの存在を示す注釈により、公的ドメインデータベース中に見出すことができる。
【００３１】
Rhomboidファミリーのメンバーであるかまたはそのアミノ酸配列変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは突然変異体であるポリペプチドは、ショウジョウバエRhomboid-1の配列と約18％より大きい、約25％より大きい、約35％より大きい、約40％より大きい、約45％より大きい、約55％より大きい、約65％より大きい、約70％より大きい、約80％より大きい、約90％より大きいまたは約95％より大きい配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。該配列は、ショウジョウバエRhomboid-1と約30％より大きい類似性、約40％より大きい類似性、約50％より大きい類似性、約60％より大きい類似性、約70％より大きい類似性、約80％より大きい類似性、約90％より大きい類似性を共有してもよい。好ましくは、Rhomboidファミリーのポリペプチドのアミノ酸配列変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは突然変異体は、Rhomboid活性を保持する、すなわち、EGFRリガンド膜貫通ドメイン基質をタンパク分解的に切断する。
【００３２】
配列類似性および同一性は通常、アルゴリズムGAP（Genetics Computer Group, Madison, WI）を参照して規定される。GAPはNeedlemanおよびWunschアルゴリズムを用いて２つの完全な配列を対合数を最大化しかつギャップ数を最小化するようにアラインさせる。一般的に、ギャップ作製ペナルティ＝12およびギャップ伸張ペナルティ＝4のデフォールトパラメーターを利用する。
【００３３】
GAPの利用が好ましい、しかし一般的にデフォールト・パラメーターを用いて、他のアルゴリズム、例えば、BLAST（Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:405-410の方法を用いる）、FASTA（PearsonおよびLipman (1988) PNAS USA 85:2444-2448の方法を用いる）、またはSmith-Watermanアルゴリズム（Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147:195-197）、またはTBLASTNプログラム（Altschulら (1990) 前掲）を利用してもよい。特に、プサイ（psi）-Blastアルゴリズム（Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389-3402）を利用してもよい。
【００３４】
類似性は、「保存的変異」、すなわちイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどの１つの疎水性残基と他の疎水性残基との置換、またはアスパラギンとリシンとの、グルタミン酸とアスパラギン酸との、もしくはグルタミンとアスパラギンとのなどの１つの極性残基と他の極性残基との置換を許容する。特定のアミノ酸配列変異体は、1、2、3、4、5-10、10-20、20-30、30-50、もしくは50個以上のアミノ酸の挿入、付加、置換または欠失により、本明細書に記載の公知のRhomboidポリペプチド配列から異なってもよい。
【００３５】
配列比較は、関係アミノ酸配列または場合によってはヌクレオチド配列と比較して、本明細書に記載の関係配列の全長にわたって行ってもよいし、またはさらに好ましくは約20、25、30、33、40、50、67、133、167、200、233、267、300、333個以上のアミノ酸またはヌクレオチドトリプレットの近接配列にわたって行ってもよい。
【００３６】
Rhomboidファミリーのメンバーであるポリペプチドは、好ましくは、触媒残基R152、G215、S217およびH281、さらに好ましくは、触媒残基W151、R152、N169、G215、S217およびH281を含んでなる。これらの保存された残基の存在を利用してRhomboidポリペプチドを同定することができる。
【００３７】
好ましくは、Rhomboidポリペプチドは、残基N169、S217およびH281がそれぞれ異なるTMD中にほぼ同じ脂質膜二重層のレベルで存在する少なくとも5つのTMDを有する。好ましくはRhomboidポリペプチドはまた、上記のGxSGモチーフも含んでなる。
【００３８】
Rhomboidファミリーのメンバーであるポリペプチドはまた、PFAMタンパク質構造注釈プロジェクト（PFAM protein structure annotation project）（Bateman A.ら (2000) 「Pfamタンパク質ファミリーデータベース（The Pfam Protein Families Database）」 Nucl. Acid. Res. 28 263-266）が定義したRhomboid相同性ドメインの存在により同定することもできる。Pfam rhomboid相同性ドメインは、隠れマルコフモデル（Hidden Markov Model）（HMM）から26種のrhomboid配列をシーズ（seed）として用いて構築された。Pfam「rhomboid」ドメインはpfam特異的受託番号PF01694を有する。
【００３９】
Rhomboidポリペプチドを同定するために利用する適当な他の方法は当技術分野で周知である。
【００４０】
特に価値ある方法としては、限定されるものでないがショウジョウバエRhomboids 1-4を含む、先に同定されたRhomboidタンパク質のグループから構築された隠れマルコフモデルの利用が挙げられる。かかる生物情報工学技術は当業者に周知である（Eddy S. R. Curr. Opin. Struct. Biol. 1996 6(3) 361-365）。生化学分析によりその後検証された細菌Rhomboidポリペプチドを同定する生物情報工学技術の使用例を以下に提供する。
【００４１】
Rhomboidポリペプチドの基質であるEGFRリガンドは、EGFRと結合するポリペプチドリガンドである。適当なリガンドは、Spitz、Gurken、Keren、または表２に例示した他のEGFRリガンドおよびそれらの同族体、変異体、突然変異体、対立遺伝子または誘導体を含んでもよい。本明細書に記載のEGFRは、例えば、ショウジョウバエEGFRまたは哺乳類EGFRであってもよい。
【００４２】
本発明者らによるRhomboidの機構および構造の分析は、Rhomboidポリペプチドをコードするヒトゲノム中の従来未知の遺伝子（RHBDL3）の発見に導いた。この遺伝子は染色体17上で注釈付き遺伝子NJMU-R1とFLJ11040（コンティグNT_010799）との間に68kbを占める。RHBDL3のタンパク質配列を図８に示しかつコードする核酸配列を図７に示す。本発明者らはまたゼブラフィッシュRHBDL2遺伝子も同定しかつクローニングした。
【００４３】
様々な態様において、本発明は図８または図11に示したアミノ酸配列からなるかまたはそれらを含むRhomboidポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。
【００４４】
コード配列は図７もしくは図10に示したものであってもよいし、または示した配列の突然変異体、変異体、誘導体または対立遺伝子であってもよい。該配列は、示した配列から、示した配列の１以上のヌクレオチドの１以上の付加、挿入、欠失および置換である変化により異なってもよい。遺伝子コードにより決定したヌクレオチド配列に対する変化は、タンパク質レベルでアミノ酸変化を生じるときもまたは生じないときもある。
【００４５】
従って、本発明による核酸は、図７または図10に示した配列と異なるが同じアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする配列を含みうる。
【００４６】
単離された核酸は、図７に示したヒトRHBDL3または図10に示したゼブラフィッシュRHBDL2配列の核酸配列と、約55％配列より大きい、約60％より大きい、約70％より大きい、約80％より大きい、約90％より大きい、または約95％より大きい同一性を共有してもよい。核酸はヒトRHBDL3またはゼブラフィッシュRHBDL2と約65％より大きい類似性、約70％より大きい類似性、約80％より大きい類似性、約90％より大きい類似性、または約95％より大きい類似性を共有してもよい。
【００４７】
本発明はまた、図７または図10に示した配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を包含する。適当な条件としては、例えば約80-90％同一である配列の検出に対する適当な条件としては、一夜、42℃にて0.25M Na₂HPO₄、pH 7.2、6.5％ SDS、10％硫酸デキストラン中のハイブリダイゼーションおよび55℃にて0.1 X SSC、0.1％ SDSにての最終洗浄が挙げられる。約90％を超えて同一である配列の検出に対する適当な条件としては、一夜、65℃にて0.25M Na₂HPO₄、pH 7.2、6.5％ SDS、10％硫酸デキストラン中のハイブリダイゼーションおよび60℃にて0.1 X SSC、0.1％ SDSにての最終洗浄が挙げられる。
【００４８】
本発明はまた、かかる配列の断片、例えば、図７または図10のヌクレオチド配列の断片も含む。適当な断片は1320個より少ない数のヌクレオチド、例えば、10、20、30、40または50個のヌクレオチドから1200、1300、1305または1310個までのヌクレオチドからなってもよい。かかる断片は本明細書に記載のRhomboidポリペプチドをコードすることができるしまたはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーとして有用である。本発明のこの態様の複数の実施形態においては、図７または図10の配列の断片は受託番号BE778475により開示されたヌクレオチド配列を含まない。
【００４９】
本発明の他の態様は、上記の核酸配列、例えば、図７または図10の核酸配列がコードする単離されたRhomboidポリペプチドを提供する。かかるRhomboidポリペプチドは図８で示したRHBDL3アミノ酸配列または図11のRHBDL2配列を含むまたはそれらからなってもよい。
【００５０】
単離されたRhomboidポリペプチドは、図８に示したヒトRHBDL3または図11のゼブラフィッシュRHBDL2配列のアミノ酸配列と約70％より大きい、80％より大きい、90％より大きい、または95％より大きい同一性を共有しうる。Rhomboidポリペプチドは、ヒトRHBDL3またはゼブラフィッシュRHBDL2配列と約70％より大きい類似性、80％より大きい類似性、90％より大きい類似性、または95％より大きい類似性を共有しうる。
【００５１】
配列類似性および同一性は本明細書の他の箇所で考察した。
【００５２】
KDEL ER保持シグナルは自然のRhomboidポリペプチド中には見出されないが、KDELは発現したRhomboidポリペプチドをゴルジ装置よりむしろER（小胞体）に保持するよう指令する。以下に説明したように、KDELなどのER保持シグナルにより標識されたRhomboidポリペプチドは、かかるポリペプチドによるタンパク分解的切断がStarポリペプチドの取引（trafficking）活性に依存しないので、本発明のアッセイ方法において特に有用である。これは分泌効率の変動に伴う潜在的問題を克服する。
【００５３】
本発明の他の態様は、従って、Ｎ末端ER保持シグナル配列を含んでなる上記の単離されたRhomboidポリペプチドを提供する。適当なシグナル配列はアミノ酸配列KDELからなる。
【００５４】
かかるRhomboidポリペプチドは、アミノ酸配列KDELからなるＮ末端シグナル配列および上記のRhomboidアミノ酸配列、例えば、ショウジョウバエRhomboid 1〜4の１つ、RHBDL-1、RHBDL-2、RHBDL-3、大腸菌（E. coli）glpG、プロビデンシア・スツアルティイ菌（Providencia stuartii）A55862、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）B83259または表１に例示したRhomboidファミリーの他のメンバーの配列を含むものであってもよい。
【００５５】
本発明の他の態様は、上記のRhomboidポリペプチドをコードする核酸を提供する。かかる核酸は本明細書に記載のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなってもよい。
【００５６】
当業者は本明細書に記載したおよび当技術分野で周知の他の技術を利用して、大量のポリペプチドおよびペプチドを例えばコードする核酸からの発現により産生することができる。
【００５７】
ペプチドはまた、全てまたは部分的に化学合成により作製することもできる。本発明の化合物は十分確立された標準の液相もしくは、好ましくは、その一般的記載が広く利用しうる固相ペプチド合成法（例えば、J.M. StewartおよびJ.D. Young, 「固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis）」, 第2版, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)；M. BodanzskyおよびA. Bodanzsky, 「ペプチド合成の実施法（The Practice of Peptide Synthesis）」, Springer Verlag, New York (1984)；およびApplied Biosystems 430A 「ユーザーズマニュアル（Users Manual）」, ABI Inc., Foster City, Californiaを参照）により容易に調製することができる、またはこれらは、溶液中において、液相法によるかもしくは固相、液相および溶液化学の組合わせにより、例えば、最初にそれぞれのペプチド部分を完成して次いで、もし所望でありかつ適当であれば、存在するいずれかの保護基を除去した後に、それぞれのカルボン酸もしくはスルホン酸もしくはそれらの反応性誘導体の反応により残基Ｘを導入することにより、調製することができる。
【００５８】
通常、アラニンスキャンを利用してポリペプチド内のペプチドモチーフを見出して精密にする。この方法はそれぞれの残基を順にアミノ酸アラニンによる体系的置換を行い、次いで生物学的活性の評価を実施することに関わる。これにより活性の原因となる残基を決定することができる。
【００５９】
ポリペプチドの「誘導体」または「変異体」は、例えばタンパク質をコードする核酸の遺伝子操作によりタンパク質のアミノ酸配列を変えることにより、またはタンパク質それ自身を改変することにより、修飾したポリペプチドを含んでもよい。自然アミノ酸配列のかかる誘導体は、野生型Rhomboidポリペプチドのタンパク分解活性の定性的性質を基本的に改変し得ない１以上のアミノ酸の１以上の挿入、付加、欠失または置換に関わるものであってもよい。
【００６０】
提供したRhomboid、StarおよびEGFRリガンドポリペプチドの活性断片の機能的模倣物（対立遺伝子、突然変異体、誘導体および変異体を含む）を本発明の方法に使用することもできる。用語「機能的模倣物（functional mimetic）」は、関連アミノ酸配列の活性部分を含有せずかつ恐らく全くペプチドでない物質であるが、定性的な意味で、自然Rhomboid、StarまたはEGFRリガンドポリペプチドの生物学的活性を保持する前記物質を意味する。候補模倣物の設計とスクリーニングは以下に詳細に記載する。
【００６１】
単離されたおよび／または精製したポリペプチド断片を、少なくとも１つの追加の成分を含有する組成物、例えば、製薬上許容される賦形剤、ビヒクルもしくは担体を含む医薬組成物の製剤に使用することができる。
【００６２】
本発明によるポリペプチドまたはポリペプチド断片を含む組成物を以下に考察した予防および／または治療処置に使用することができる。
【００６３】
本発明の様々な態様はスクリーニングおよびアッセイの方法および手段、ならびにそれにより同定される物質に関する、例えば、本発明のRhomboidポリペプチドとポリペプチド基質の間、またはStarポリペプチドとポリペプチド基質の間の相互作用を抑制する物質のアッセイが挙げられる。ポリペプチド基質はEGFRリガンドであってもよい。
【００６４】
さらなるアッセイとしては、Rhomboidポリペプチドと相互作用もしくは結合して、そのプロテアーゼ活性をモジュレートする、すなわち増加、刺激、低下、抑制または無効化する化合物または物質に対するアッセイがある。
【００６５】
Rhomboidポリペプチドのモジュレーターを同定するアッセイ方法は、本明細書に記載のRhomboidポリペプチドと試験化合物を接触させること、試験化合物のRhomboidポリペプチドとの結合を測定すること、およびRhomboidポリペプチドと結合する試験化合物の存在および不在のもとでRhomboidポリペプチドのプロテアーゼ活性を決定することを含むものであってもよい。プロテアーゼ活性は以下に説明した基質の切断を測定することにより決定することができる。Rhomboidポリペプチドは単離していてもまたはリポソームもしくは細胞内に含まれていてもよい。
【００６６】
Rhomboidポリペプチドの活性をモジュレートする物質をスクリーニングおよび／または取得する方法は、適当な反応媒質中で１以上の試験物質とRhomboidポリペプチドを接触させること、処理したポリペプチドの活性を測定すること、および比較しうる反応媒質中で試験物質により処理してないポリペプチドの活性を比較することを含むものであってもよい。Rhomboidポリペプチドは反応媒質中で単離された形態であってもよいしまたはリポソームもしくは細胞内に含まれていてもよい。
【００６７】
処理したおよび処理してないポリペプチド間の活性の差は、関係する試験物質をモジュレートする効果、例えば、抑制するもしくは増強する効果を示す。
【００６８】
Rhomboidポリペプチドの活性はタンパク分解的切断された基質の産生を測定することにより決定することができる。Rhomboidポリペプチドは、例えば、膜結合基質に作用して検出可能な可溶性産物を産生しうる。
【００６９】
本発明の他の態様によると、Rhomboidポリペプチドのモジュレーターを同定するおよび／または取得するアッセイ方法であって、
(a)Rhomboidポリペプチドと試験化合物をポリペプチド基質の存在で接触させること；および
(b)ポリペプチド基質のタンパク分解的切断を測定すること
を含んでなる前記方法を提供する。
【００７０】
アッセイ方法は、Rhomboidポリペプチドが通常ポリペプチド基質のタンパク分解的切断を触媒する条件下で実施しうる。
【００７１】
基質の切断は、試験化合物の存在および不在のもとで測定しうる。試験化合物の不在のもとと比較した試験化合物の存在のもとでの切断の差は、試験化合物がRhomboidプロテアーゼ活性のモジュレーターであることを示しうる。
【００７２】
RhomboidポリペプチドはRhomboid様ファミリーのメンバーまたはその突然変異体、変異体もしくは対立遺伝子であってもよい。適当なポリペプチドは、ショウジョウバエRhomboid 1、ショウジョウバエRhomboid 2、ショウジョウバエRhomboid 3、ショウジョウバエRhomboid 4、ヒトRHBDL-1、ヒトRHBDL-2およびヒトRHBDL-3、大腸菌（E. coli）glgG、枯草菌（B. subtilis）ypqP、Ｐ・スツアルティイ菌（P. stuartii）A55862遺伝子産物、緑膿菌（P. aeruginosa）B83259遺伝子産物、酵母Ｓ・セレビジエ（S. cervisiae）YGR101wおよび酵母Ｓ・セレビジエ（S. cervisiae）YPL246cまたは表１に例示したRhomboidファミリーの他のメンバーの配列を有してもよい。
【００７３】
Rhomboidポリペプチドによりタンパク分解的切断されるいずれのポリペプチド基質を本明細書に記載のアッセイ方法に使用してもよい。かかる基質は標準技術を用いて容易に同定される。適当なポリペプチド基質は、Spitz残基140-144（IASGA）と同じコンフォメーション、さらに好ましくはSpitz残基138-144（ASIASGA）と同じコンフォメーションをもつルーメン部分を有する膜貫通ドメインを含むものであってもよい。基質は、上記のようにSpitz膜貫通領域またはその変異体、対立遺伝子、誘導体、同族体、もしくは突然変異体を含むものであってもよい。ポリペプチド基質は表２に示したEGFRリガンドなどのEGFRリガンドであってもよい。
【００７４】
適当な基質は緑色蛍光タンパク質（GFP）、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼなどの検出可能な標識を含むものであってもよい。これは可溶性産物の好都合な検出を可能にし、自動アッセイにおいて特に有用である。
【００７５】
好ましい実施形態においては、基質はRhomboidにより切断されるためにはStarポリペプチドの存在を必要としない。
【００７６】
本発明のアッセイに利用するのに適当なEGFRリガンドは当技術分野で十分特性決定されていて、１以上の上皮成長因子（EGF）ドメインおよび単一の膜貫通ドメインを含んでなる構造を有しうる（Groenen L.ら Growth Factors 1994 11(4) 235-257）。
【００７７】
好ましくは、適当なEGFRリガンドは、表２に示した脊椎動物EGFRリガンドに対して、50％より大きい相同性、60％より大きい相同性、70％より大きい相同性、80％より大きい相同性、90％より大きい相同性、または95％より大きい相同性を有する。EGFドメインはまた、上記のpfam（「EGF様ドメイン」に対するPfam受託番号：PF00008）を用いて同定することもできる。
【００７８】
適当なリガンドは、Spitz、Gurken、Vein、Keren、およびそれらの変異体、突然変異体、対立遺伝子または誘導体を含む。他の例は表２に示した。
【００７９】
複数の好ましい実施形態においては、RhomboidポリペプチドはRHBDL-2ポリペプチドでありかつポリペプチド基質はSpitzポリペプチドである。
【００８０】
キメラリガンドは本明細書に記載の方法の特性が改良されていてもよく、例えば、それはRhomboidポリペプチドによりさらに効率的に切断され、分泌特性が改良され、またはさらに容易に検出されてもよい。
【００８１】
本発明の他の態様は、２種以上のEGFRリガンドからの配列を含んでなるキメラEGFRリガンドを提供するのであって、例えばキメラリガンドは第１のEGFRリガンドの膜貫通ドメインおよび第２のEGFRリガンドの細胞内および細胞外ドメインを含むものであってもよい。
【００８２】
適当な第１のポリペプチドはSpitzであり、適当な第２のポリペプチドはTGFαである。キメラ基質はさらにルシフェラーゼ、GFPまたはアルカリホスファターゼなどの検出可能な標識を含んでなる。
【００８３】
好ましいキメラリガンドをコードする核酸は、TGFα UTRおよびシグナル／プロペプチド配列（TGFαのATGのAは35にある）のヌクレオチド1-130、GFP標識（ヌクレオチド131-886）、および次いでSpitz15aaおよびTMDを包含する残りのTGFα配列（塩基1045-1159）を含んでなる。
【００８４】
本発明によるRhomboid活性のモジュレーターを取得するまたは同定するためのアッセイ方法または他の方法は、in vivo細胞に基づくアッセイであっても、またはin vitro非細胞に基づくアッセイであってもよい。
【００８５】
方法は10μMのバチマスタット（Batimastat）（British Biotech）の存在のもとで実施して基質の非Rhomboid依存性切断を抑制し、それによりバックグラウンドを低下させてることができる。
【００８６】
in vitroアッセイにおいて、Rhomboidポリペプチドは単離されていてもリポソーム内に含有されていてもよい。リポソームに基づくアッセイは当技術分野で周知の方法を用いて実施することができる（Brenner C.ら (2000) Meths in Enzymol. 322 243-252、Peters ら (2000) Biotechniques 28 1214-1219、Puglielli, H.およびHirschberg C. (1999) J. Biol. Chem. 274 35596-35600、Ramjeesingh, M. (1999) Meths in Enzymol. 294 227-246）。
【００８７】
in vivoアッセイ用の適当な細胞型としては、CHO、HeLaおよびCOS細胞などの哺乳類細胞が挙げられる。
【００８８】
本発明のin vitroまたはin vivo アッセイ用に、完全な全長タンパク質を使用する必要はない。全長タンパク質の活性を保持する本明細書に記載のポリペプチド断片を作製して、当業者に知られるいずれの適当な方法に用いてもよい。断片を作製する適当な方法としては、限定されるものでないが、コードするDNAの断片からの組換え発現が挙げられる。かかる断片は、コードするDNAを採取し、発現すべき部分の両側の適当な制限酵素認識部位を確認し、そしてDNAから前記部分を切り取ることにより作製することができる。次いでその部分を、標準の市販される発現系内の適当なプロモーターと機能しうる形で連結することができる。他の組換え手法はDNAの関係部分を適当なPCRプライマーを用いて増幅する方法である。小断片（例えば、約20または30個までのアミノ酸）はまた、当技術分野で周知のペプチド合成法を用いて作製することもできる。
【００８９】
本発明のアッセイの正確なフォーマットを、当業者により日常的技術と知識を用いて改変してもよい。例えば、ポリペプチド間の相互作用は、１つのポリペプチドを検出可能な標識を用いて標識し、そしてそれを固体支持体上に固定しておいた他のポリペプチドと接触させることにより、in vitroで研究することができる。適当な検出可能な標識としては、組換えにより産生されるペプチドおよびポリペプチドに組込まれた³⁵S-メチオニンが挙げられる。組換えにより産生されるペプチドおよびポリペプチドはまた、抗体を用いて標識することができるエピトープを含有する融合タンパク質として発現させることもできる。
【００９０】
融合タンパク質は、組換えタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに６個のヒスチジン残基を組込んだものを作製することができる。かかるヒスチジンタグを利用して、ニッケルまたはコバルトの金属イオンを含有する市販カラムを用いることによりタンパク質の精製を行うことができる（Clontech, Palo Alto, CA, USA）。これらのタグはまた、６個のヒスチジン残基に対する市販のモノクローナル抗体（Clontech, Palo Alto, CA, USA）を用いて、タンパク質を検出するのにも役立つ。
【００９１】
本発明によるアッセイはin vivoアッセイの形態をとることが好ましい。in vivoアッセイは酵母株、昆虫または哺乳類細胞系などの細胞系において実施してもよく、細胞中に導入した１以上のベクターから関係ポリペプチドまたはペプチドを発現させる。
【００９２】
ショウジョウバエにおいてStarはEGFRリガンドにシャペロンとして付添って小胞体からゴルジ装置まで送達し、そこでEGFRリガンドはRhomboid-1により切断される。複数の実施形態においては、Starポリペプチドをin vivoアッセイに用いてEGFRリガンドをRhomboidポリペプチドへ送達する。
【００９３】
かかる実施形態によるアッセイおよび他の方法においては、RhomboidポリペプチドをStarポリペプチドの存在のもとで試験化合物に接触させることができる。かかる方法においては、Rhomboidポリペプチド、StarポリペプチドおよびEGFRリガンドが細胞内に存在してもよい。これは、例えば、細胞中に形質転換により導入しておいた１以上の発現ベクターから該ポリペプチドを発現させることにより達成することができる。
【００９４】
Rhomboidプロテアーゼのモジュレーターを同定および／または取得するアッセイ方法は、従って、
(a) 試験化合物をStarポリペプチドおよびEGFRリガンドポリペプチドの存在のもとでRhomboidポリペプチドと接触させること；ならびに
(b) EGFRリガンドの切断を確認すること：
を含む。
【００９５】
アッセイ方法は、Rhomboidポリペプチドが通常、EGFRリガンドポリペプチドのタンパク分解的切断を触媒する条件下で実施しうる。
【００９６】
切断は試験化合物の存在のもとと不在のもととで決定することができる。試験化合物の不在のもとと比較した存在のもとでの切断の差は化合物がモジュレーターすなわちRhomboid活性のエンハンサーまたはインヒビターであることを示す。
【００９７】
適当なStarポリペプチドとしては、ショウジョウバエStar（データベース受託番号；SWP:P42519）またはその変異体、同族体、突然変異体、対立遺伝子または誘導体が挙げることができる。Starの変異体、対立遺伝子、誘導体、同族体、または突然変異体はショウジョウバエStarの配列と約70％より大きい、約80％より大きい、約90％より大きいまたは、約95％より大きい配列同一性を有する配列からなってもよい。該配列はショウジョウバエStarの配列と約70％より大きい類似性、約80％より大きい類似性、約90％より大きい類似性または、約95％より大きい類似性を共有してもよい。
【００９８】
本発明の他の実施形態においては、Star-非依存性EGFRリガンドおよび／またはERに保持されるRhomboidポリペプチドを細胞ベースのアッセイ方法に利用することができるのであって、かかる方法においてはStarの利用は不必要である。
【００９９】
上記のRhomboidポリペプチド、ポリペプチド基質および／またはStarポリペプチドをコードする核酸を、複製可能なベクター、特にコードしたポリペプチドを適当な条件下で発現しうる発現ベクターの部分として提供し、宿主細胞がかかるベクターまたは核酸を含有してもよい。この文脈における発現ベクターは、in vitro発現系、例えば網状赤血球においてまたはin vivo、例えばCOSまたはCHO細胞などの真核生物細胞もしくは大腸菌（E. coli）などの原核細胞において、目的のポリペプチドをコードする核酸およびポリペプチドの発現のために適当な調節配列を含む核酸分子である。これをさらに以下に考察する。
【０１００】
コンビナトリアルライブラリー技術（Schultz, JS (1996) Biotechnol. Prog. 12:729-743）は、ポリペプチドの活性をモジュレートする能力について潜在的に膨大な数の異なる物質を試験する効率的な方法を提供する。活性のモジュレーションをスクリーニングする前にまたはスクリーニングするとともに、試験物質をポリペプチドと相互作用する能力について、例えば酵母ツーハイブリッドシステムにおいて、スクリーニングすることができる（酵母においてコードする核酸から該ポリペプチドと試験物質の両方を発現させ得る必要がある）。これは、ポリペプチドの活性をモジュレートする実能力について物質を試験する前の粗いスクリーニングとして利用することができる。
【０１０１】
本発明のアッセイに添加しうる試験物質または化合物の量は、使用する化合物のタイプに依存し、通常、試行錯誤により決定しうる。典型的には、推定インヒビター化合物の約0.01〜100nM濃度、例えば0.1〜10nMを使用してもよい。細胞ベースのアッセイを用いるときは、試験物質または化合物はRhomboidポリペプチドにアクセスするために膜透過性であることが望ましい。
【０１０２】
薬物スクリーニング計画に使用する試験化合物は自然または合成化合物であってもよい。数種の特性決定済みまたは特性未決定の化合物を含有する植物の抽出物を使用することもできる。さらなるクラスの推定インヒビター化合物をSpitz TMDなどと結合するRhomboidポリペプチドおよび／またはリガンドから誘導することができる。5〜40個のアミノ酸、例えば、6〜10個のアミノ酸の膜透過性ペプチド断片を、そのかかる相互作用または活性を破壊する能力について試験してもよい。特に好ましいペプチド断片はSpitzタンパク質の残基141〜144（ASGA）、残基140-144 (IASGA)もしくは残基138-144（ASIASGA）、または他のEGFRリガンドの同等領域を含んでなる。
【０１０３】
上記のペプチド断片の抑制特性は、次のグループ：クロロメチルケトン、アルデヒドおよびボロン酸（boronic acid）の１つをＣ末端へ付加することにより増加することができる。これらのグループはセリン、システインおよびトレオニンプロテアーゼの遷移状態類似体である。ペプチド断片のＮ末端は、カルボベンジルを用いてブロックしてアミノペプチダーゼを抑制し安定性を改良することができる（「タンパク分解酵素（Proteolytic Enzymes）」 第2版, R. Beynon and J. Bond編, Oxford University Press 2001）。
【０１０４】
本特許出願はRhomboid活性を抑制することが示されている２種の化合物、TPCKおよび3,4-DCIを説明する。これらの化合物は広いスペクトルのセリンプロテアーゼインヒビターであるが、これらは具体的なRhomboidインヒビターを合理的設計するためのリード化合物の例である。
【０１０５】
他の候補インヒビター化合物は、ポリペプチドまたはペプチド断片の３次元構造のモデル化ならびに特定の形状、サイズおよび電荷特性をもつ潜在的インヒビター化合物を提供する合理的薬物設計の利用に基づいてもよい。
【０１０６】
本発明の他の態様は本明細書に記載の方法により単離および／または取得したモジュレーター、例えばRhomboidプロテアーゼ活性のインヒビター、または前記モジュレーターを含んでなる組成物を提供する。
【０１０７】
ポリペプチド活性をモジュレートするかまたは影響を与える物質を同定した後に、該物質をさらに研究することができる。さらに、該物質を製造しおよび／または薬剤、医薬組成物もしくは薬物などの組成物の調製、すなわち製造または製剤に利用することができる。これらを個体に投与してもよい。
【０１０８】
他の本発明の態様は、Rhomboidセリンプロテアーゼ活性のモジュレーター、例えばインヒビターを取得しまたは同定する方法における、本明細書に記載のRhomboidポリペプチドの利用を提供する。また、ポリペプチド基質の膜貫通ドメインのタンパク分解的切断における、Rhomboidポリペプチドの方法および利用も提供する。
【０１０９】
Rhomboidはクォーラムセンシング（quorum sensing）（細菌が実施する細胞間シグナリング）に関わる。Rhomboidインヒビターはこの活性をブロックするのに有用である。あるヒト病原体（プロビデンシア・スツアルティイ菌（Providencia stuartii））においては、クォーラムセンシング事象においてシグナルを発生するためにAarA遺伝子が必要である（Rather, P. N.ら (1999). J Bacteriol 181, 7185-7191）。AarA遺伝子はRhomboidポリペプチドをコードする（Gallio, M.,およびKylsten, P. (2000). Curr Biol 10, R693-694）。
【０１１０】
AarAはショウジョウバエRhomboidと同じ酵素学的活性を有することが示されていて、従ってクォーラムセンシングをブロックするインヒビターをスクリーニングするのに有用である。病原菌はその有毒な病原性因子を発現するときにクォーラムセンシングを利用して影響を及ぼす（例および総説として、Zhu, J.ら (2002). Proc Natl Acad Sci U S A 99, 3129-3134；Miller, M.B.,およびBassler, B.L. (2001). Annu Rev Microbiol 55, 165-199）；このシグナルをRhomboidインヒビターを用いて阻止すると、これらの病原体は病原性の発現を停止する。インヒビターは細胞を殺さないので、生物がそれに対する耐性を獲得する選択圧力を低下しうる。
【０１１１】
本明細書に記載の方法はさらに、微生物病原体の感染性または病原性を抑制する前記試験化合物の能力を確認するステップを含むものであってもよい。これは、例えば、試験化合物の存在および不在のもとで、有毒な病原性因子の発現を確認することを含むものであってもよい。
【０１１２】
モジュレーター、特にRhomboidのインヒビター活性は、例えば、酵母およびプロビデンシア・スツアルティイ菌（Providencia stuartii）、大腸菌（E. coli）0157および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）などの病原菌による病原体感染の治療に有用でありうる。
【０１１３】
従って、本発明は、本明細書の開示によりRhomboid活性のモジュレーターとして同定された物質だけではなく；かかる物質を含んでなる医薬組成物、医薬、薬物または他の組成物；前記組成物の、例えば、癌、冠状動脈アテローム硬化症、乾癬、創傷治癒、早産児の生存、末梢神経損傷／神経障害などの異常なErbBもしくはEGF受容体活性に関連する病原感染または症状を治療する（予防治療を含んでもよい）ための患者への投与を含んでなる方法；前記物質の、例えば、癌、冠状動脈アテローム硬化症、乾癬、創傷治癒、早産児の生存、末梢神経損傷／神経障害などの異常なErbBもしくはEGF受容体活性に関連する病原感染または症状を治療するために投与する組成物の製造における使用；ならびに前記物質を製薬上許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体、および場合によっては他の成分と混合することを含んでなる医薬組成物を作る方法に対する、様々な態様を包含する。
【０１１４】
上記の異常なErbBまたはEGF受容体活性に関連する症状はまた、異常なRhomboid活性にも関連しうる。
【０１１５】
本明細書に記載のアッセイを用いてポリペプチドのモジュレーターまたはプロモーター機能として同定した物質は、本性はペプチドまたは非ペプチドであってもよい。しばしば非ペプチド「小分子」が多くのin vivo医薬用途にとって好ましい。従って、前記物質（特にもしペプチドであれば）の擬薬（mimetic）または模倣薬（mimic）を医薬用に設計することができる。
【０１１６】
公知の医薬活性化合物に対する擬薬の設計は「リード」化合物に基づく医薬品開発のための公知の手法である。この手法は、活性化合物の合成が困難もしくは高価である場合に、または活性化合物が特定の投与方法には不適当である、例えばペプチドが消化管内でプロテアーゼにより速やかに消化されやすいので経口組成物用の活性薬としてあまり適当でない場合に所望されうる。TPCKおよび3,4-DCIはRhomboidを抑制することが示されている一方、これらの化合物は特異性がないので、もし治療に利用すれば望ましくない副作用を生じやすい。しかし、これらは改良された特異性をもつ擬薬を開発するための「リード」化合物を代表しうる。
【０１１７】
擬薬設計、合成および試験を利用して、標的特性に対して多数分子を無作為にスクリーニングするのを避けることができる。
【０１１８】
所与の標的特性を有するTPCK、3,4-DCI、またはSpitz膜貫通断片などの化合物から擬薬を設計する上で通常採用する複数のステップがある。最初に、標的特性を決定する上で決定的なおよび／または重要である化合物の特定部分を確認する。ペプチドの場合、これは体系的にペプチドのアミノ酸残基を変えることにより、例えばそれぞれの残基を順に置換することにより行うことができる。
【０１１９】
Rhomboidファミリーのポリペプチドの必須触媒残基は高度に保存されていて、ショウジョウバエRhomboid-1配列の残基N169、G215、S217、H281、W151およびR152に対応する。Rhomboidによる切断のために必要とされる必須残基は、Spitz配列の残基A141、S142、G143およびA144である。他の重要な残基としては、Spitz配列の残基A138、S139およびI140が挙げられる。
【０１２０】
ペプチドまたはポリペプチドの活性領域を構成する残基はその「ファルマコフォア（pharmacophore）」として知られる。
【０１２１】
本明細書で提供したRhomboidファミリーおよびその基質のファルマコフォアに関する情報は、それらの物理的特性、例えば立体化学、結合、サイズおよび／または電荷により、一連のデータソース、例えば分光学的技術、Ｘ線回折データおよびNMRからのデータを用いて、それらの構造をモデル化することを可能にする。コンピューター解析、（原子間の結合よりもむしろ、ファルマコフォアの電荷および／または容積をモデル化する）類似性マッピングおよび他の技術をこのモデル化プロセスに利用することができる。Rhomboidポリペプチドファミリーとよく研究されたセリンプロテアーゼとの間の密接な関係の発見は、Rhomboid活性部位に関するかなりの情報を提供する。
【０１２２】
この手法の変法においては、リガンドおよびその結合パートナーの三次元構造をモデル化する。これはリガンドおよび／または結合パートナーが結合時にコンフォメーションを変える場合に特に有用であり、モデルはこのコンフォメーションの変化を擬薬設計に考慮することを可能にする。
【０１２３】
次いで、テンプレート分子を選択して、その上にファルマコフォアを模倣する化学基をグラフトする。テンプレート分子およびその上にグラフトする化学基は、擬薬の合成が容易であり、製薬上許容され、そしてin vivoで分解しない一方、リード化合物の生物学的活性を保持するのに好都合なように選択する。この手法により見出される擬薬または模倣薬を次いでスクリーニングしてそれらが標的特性を有するかどうか、またはそれをどの程度表すかを見ることができる。次いで、さらなる最適化または改変を実施してin vivoまたは臨床試験用の１以上の最終的な擬薬に到達することができる。
【０１２４】
例えば、SpitzのRhomboid認識ドメイン（残基140-144：IASGA、さらに好ましくは残基138-144：ASIASGA）の三次元コンフォメーションをモデル化する擬薬を利用してRhomboidポリペプチドと結合しかつ抑制する化合物をスクリーニングすることができる。かかる擬薬としては、例えば、IASGAまたはASIASGA配列を含んでなるSpitzのRhomboid結合ドメインのペプチドクロロメチルケトン類似体を挙げることができる。
【０１２５】
本明細書に開示したスクリーニング方法を用いてRhomboidポリペプチド活性をモジュレートする能力を有すると確認された物質の擬薬は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１２６】
本発明によるポリペプチドの活性をモジュレートすることができるポリペプチド、ペプチドまたは物質を、例えばその内容物を外部環境から保護する適当な容器内にシールして、キットで提供することができる。かかるキットは使用のための指示書を含みうる。
【０１２７】
個体に与えるのが本発明によるポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子または他の製薬的に有用な化合物のいずれであっても、投与は好ましくは「予防上有効な量」または「治療上有効な量」（その場合、予防も治療と考えうるが）であり、これは個体に効果を示すのに十分である。投与する実際の量、および投与の速度と時間経過は、治療対象の性質と重篤度に依存しうる。治療の処方、例えば、投薬の決定などは一般開業医およびその他の医師の責任の範囲内にある。
【０１２８】
組成物は治療する症状に依って、単独でまたは他の治療薬と一緒に、同時にまたは逐次的に投与することができる。
【０１２９】
本発明による医薬組成物は、本発明による使用のために、活性成分に加えて、当業者に周知の製薬上許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤またはその他の物質を含んでもよい。かかる物質は無毒であって、活性成分の効能を妨害してはならない。担体または他の物質の正確な性質は投与経路に依存しうるのであって、該投与経路は経口で、または、例えば皮内、皮下もしくは静脈内注射によってもよい。
【０１３０】
経口投与用の医薬組成物は錠剤、カプセル、粉末または液剤形であってもよい。錠剤としては、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含んでもよい。液状医薬組成物は一般的に水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油などの液担体を含む。生理学的塩類溶液、デキストロースもしくは他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含んでもよい。
【０１３１】
静脈、皮内、皮下注射または患部の注射用には、活性成分は非経口投与に許容される水溶液の剤形であり、発熱物質を含まずかつ適当なpH、等張性および安定性を有しうる。関係業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、または乳酸化リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを用いて、適当な溶液を十分調製することができる。保存剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤および／または他の添加剤を必要に応じて含んでもよい。
【０１３２】
本発明によるアッセイおよび方法に使用するポリペプチドを産生する好都合な方法は、発現系の核酸を利用してそれをコードする核酸を発現させることである。従って、本発明はまた、（開示した）ポリペプチドを作る方法であって、ポリペプチドをコードする核酸（一般的に、本発明による核酸）からの発現およびRhomboidプロテアーゼ活性の試験を含む前記方法を包含する。これは、培養中のかかるベクターを含有する宿主細胞をポリペプチドの発現を生じるかまたは可能にする適当な条件下で増殖することにより都合よく達成できる。ポリペプチドはまた、網状赤血球溶解産物などのin vitro系において発現させることもできる。
【０１３３】
本発明の他の態様は、従って、Rhomboidポリペプチドを産生する方法であって、
(a) 適当な発現系においてRhomboidポリペプチドをコードする核酸を発現させてポリペプチドを組換えにより産生すること；
(b) 組換えにより産生したポリペプチドをRhomboidプロテアーゼ活性について試験すること：を含んでなる前記方法である。
【０１３４】
適当な核酸配列は、本明細書に記載したRhomboid様ファミリーのメンバーまたはその突然変異体、変異体もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列を含む。
【０１３５】
ポリペプチドは、例えばコードする核酸からの発現による産生した後に、（例えば抗体を用いて）単離および／または精製してもよい（以下参照）。従って、（もしそれが天然のポリペプチドであれば）天然で随伴する汚染物を含まないかまたは実質的に含まないポリペプチドを提供することができる。他のポリペプチドを含まないかまたは実質的に含まないペプチドを提供することができる。
【０１３６】
組換えにより産生したポリペプチドを単離し、そして／またはポリペプチドとEGFRリガンドまたは他のポリペプチド基質とのインキュベーション時のEGFRリガンドポリペプチド切断を測定することによりRhomboidプロテアーゼ活性を試験することができる。
【０１３７】
本明細書に記載の単離された核酸、例えば、Rhomboidポリペプチドをコードする核酸をベクター中に含有させてもよい。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を適当に含む適当な調節配列を含有する適当なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、適当に、プラスミド、ウイルス例えば「ファージ」、またはファージミドであってもよい。さらなる詳細は例えば、「分子クローニング：研究室マニュアル（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）」: 第2版, Sambrookら, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press、を参照すること。核酸の操作に対する、例えば、核酸構築物の調製、突然変異、配列決定、DNAの細胞中への導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における、多数の公知の技術およびプロトコルが「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, Ausubelら 編, John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。
【０１３８】
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。適当な宿主細胞としては、細菌、哺乳類動物および酵母などの真核生物細胞ならびにバキュロウイルス系が挙げられる。当技術分野で異種ポリペプチドの発現に利用しうる哺乳類細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎細胞、COS細胞および多数の他の細胞が挙げられる。通常、好ましい宿主細胞は大腸菌（E. coli）である。
【０１３９】
本発明のさらなる態様は、KDELタグを有するかまたは全長Rhomboid配列の断片であるRhomboidポリペプチドをコードする異種核酸を含有する宿主細胞、ならびにRhomboidポリペプチドおよびEGFRリガンドポリペプチドおよび、場合によっては、Starポリペプチドをコードする異種核酸を含有する宿主細胞を提供する。
【０１４０】
核酸を宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）中に組込んでもよい。組込みは標準技術によりゲノムとの組換えを促進する配列の封入により促進することができる。核酸は細胞内の染色体外ベクター上にあってもよい。
【０１４１】
（特にin vitro導入に対して）一般的に限定されることなく「形質転換」と呼ばれる核酸の宿主細胞中への導入は、いずれの利用可能な技術を用いてもよい。真核生物細胞に対する適当な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクションおよびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えばワクシニアもしくは、昆虫細胞に対してはバキュロウイルスを用いる形質導入が挙げられる。細菌細胞に対する適当な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを用いるトランスフェクションが挙げられる。
【０１４２】
抗生物質耐性または感受性遺伝子などのマーカー遺伝子を、当技術分野で周知のように、目的の核酸を含有するクローンを同定するために利用することができる。
【０１４３】
導入した後に、例えば宿主細胞（実際には形質転換した細胞を含んでもよいが、細胞はおそらく形質転換した細胞の子孫である可能性が大きい）を遺伝子を発現する条件下で培養することによって核酸からの発現を起こさせるかまたは可能にすることにより、コードされたポリペプチドを産生させる。もしポリペプチドが適当なリーダーペプチドとカップリングして発現すると、それは細胞から培地中に分泌されうる。発現による産生の後、ポリペプチドを、状況に応じ、宿主細胞および／または培地から単離および／または精製して、Rhomboidプロテアーゼ活性について試験し、次いで所望により、例えば、１以上の製薬上許容される賦形剤、ビヒクルもしくは担体を含む医薬組成物などの１以上の追加成分を含みうる組成物の製剤に利用することができる（例えば、以下参照）。
【０１４４】
Rhomboidポリペプチドを基質ポリペプチドとともに宿主細胞内に同時発現させ、基質ポリペプチドの切断を測定することによりRhomboidセリンプロテアーゼ活性を決定することができる。切断は培地中に分泌されうる可溶性切断産物の存在または不在を確認することにより測定することができる。
【０１４５】
Rhomboid-1による切断可能性の主な決定因子は、Spitzの膜貫通ドメイン、特に残基138-144 (ASIASGA)の間の領域である。相同的ドメインを含んでなるポリペプチドは、従って、Rhomboidポリペプチドの基質の候補である。かかるポリペプチドを、標準操作を用いてデータベースをスクリーニングすることにより同定することができる。
【０１４６】
本発明のさらなる態様は、Rhomboidポリペプチドの基質を得る方法であって、
(a) 試験ポリペプチドを提供すること、
(b) Rhomboidポリペプチドと試験ポリペプチドを、Rhomboidポリペプチドが通常、基質のタンパク分解を触媒する条件下で接触させること；および
(c) 試験ポリペプチドの切断を確認すること
を含んでなる前記方法を提供する。
【０１４７】
試験ポリペプチドの切断はポリペプチドがRhomboid基質であることを示す。
【０１４８】
試験ポリペプチドは、ショウジョウバエSpitz配列の残基141〜144または同等の三次元コンフォメーションをもつ残基、さらに好ましくは残基140〜144もしくは138〜144、または同等の三次元コンフォメーションをもつ残基を含むものであってもよい。
【０１４９】
適当な試験ポリペプチドはSpitz（残基139-164）、Gurken、Keren、もしくは表２に例示した他のEGFRリガンドの膜貫通領域またはかかる領域の変異体、対立遺伝子、誘導体、同族体、もしくは突然変異体を含むものであってもよい。
【０１５０】
Spitz膜貫通領域の変異体、対立遺伝子、誘導体、同族体、もしくは突然変異体は、ショウジョウバエSpitzの残基139〜164の配列と約50％より大きい、約60％より大きい、約70％より大きい、約80％より大きい、約90％より大きい、または約95％より大きい、配列同一性を有する配列からなってもよい。該配列はショウジョウバエSpitzの残基139〜164の配列と約70％より大きい類似性、約80％より大きい類似性、約90％より大きい類似性、または約95％より大きい類似性を共有してもよい。
【０１５１】
適当な試験ポリペプチドは上に考察したバイオインフォマティクスを用いてデータベースをスクリーニングすることにより同定することができる。
【０１５２】
本発明の他の態様は、タンパク分解活性を有せずかつ、細胞内に発現されると、前記細胞内に発現した活性Rhomboidポリペプチドのタンパク分解活性を低下させるかもしくは無効化するRhomboidポリペプチドの断片を提供する。例えば、Rhomboid-1配列の残基1〜149、Ｎ末端細胞質ドメイン、第１膜貫通領域および第１ルーメンループの部分からなる断片は、このドミナントネガティブ活性を持つ。
【０１５３】
本発明のさらなる態様はかかるRhomboidポリペプチド断片をコードする核酸である。
【０１５４】
ドミナントネガティブなポリペプチド断片を利用して本明細書に記載の内因性Rhomboidポリペプチドの活性を「ノックアウト」することができる。例えば、細胞中へもしくは該細胞の祖先への核酸の導入、および／または細胞もしくは祖先の内因性配列の遺伝的改変（かかる導入または改変はin vivoまたはex vivoで起こってもよい）の結果として、本発明による核酸を含有する宿主細胞は、例えば、細菌、古細菌、単細胞真核生物であってもよく、または真菌、植物もしくは動物である生物内に（例えば、細胞体内に）含まれてもよく、そして前記動物は脊椎動物および無脊椎動物、特に、ヒトまたは非ヒト、例えばウサギ、モルモット、ラット、マウス、ラットもしくは他のげっ歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはウマなどである哺乳類、またはニワトリなどの鳥類であってもよい。
【０１５５】
かかる細胞を含んでなる遺伝的に改変したまたはトランスジェニック生物も本発明のさらなる態様を提供する。かかる動物はRhomboid機能障害に関連する疾患の研究に有用でありうる。
【０１５６】
本発明の他の態様は、本明細書に記載したドミナントネガティブRhomboidポリペプチド断片の細胞内Rhomboidポリペプチドを不活性化するin vitroの方法における利用であって、前記細胞内に前記ポリペプチドを発現させることを含んでなる前記方法を提供する。
【０１５７】
本発明の態様をここで以下に記載の添付図面および実施例を参照して、限定でなく例示として説明する。さらなる態様および実施形態は、当業者には明らかであろう。本明細書に記載した全文書はこれによって本明細書に参照により組み入れられる。
【０１５８】
表の簡単な説明
表１ Rhomboidポリペプチドのデータベース配列の非徹底的リストを示す。
【０１５９】
表２ EGFRリガンドのデータベース配列の非徹底的リストを示す。
【０１６０】
表３ 下記の実験で使ったRhomboid欠失突然変異体を示す。
【実施例】
【０１６１】
実験
材料と方法
ショウジョウバエのストック
以下のハエ系統を標準技術により作製した：UAS-mycSpi、UAS-Rho-1HA、UAS-Rho-1N、およびUAS-Rho-1。使用した他の系統として、MS1096-Gal4（Capdevila, J.およびGuerrero, I. (1994) EMBO J. 13, 4459-4468.）、hsp70-rho-1（Freeman, M.ら (1992) Development 116, 335-346）および唾液腺特異的Gal4系統（the Bloomington Stock Centreにおける1824）を含む。他のストックは全てFlybaseに掲げられている。
【０１６２】
dsRNA 干渉
RNAiをKennerdell, J.R.およびCarthew, R.W.のプロトコル（Kennerdell, J.R.およびCarthew, R.W. (1998). Cell 95, 1017-26）の変法により実施した。
【０１６３】
目的のそれぞれの遺伝子に対応する100μgのRNAを、5μgの直鎖化プラスミドテンプレートから製造業者の説明書（Promega Ribomax system）に従ってin vitro転写により合成した。得たRNAを、RNeasyプロトコル（Qiagen）を用いて精製し、煮沸して変性し、そして1mM Tris-HCl pH7.4、1mM EDTA中で一夜アニーリングした。得たdsRNAをエタノール沈降し、そしてインジェクションバッファー（0.1 × PBS）中に、アガロースゲル電気泳動による測定で1〜2mg/mlの濃度にて再懸濁した。胚を、1時間にわたってy w成虫ハエの2〜7日齢のケージから採集し、スライドガラス上に置き、5分間脱水し、そしてボルタレフ10Sオイル（Voltalef's 10S oil）のもとでそれらの卵殻（chorion）を貫通して側面からマイクロインジェクションした。加湿チャンバー内で室温にて48時間インキュベーションした後に、致死率と表皮表現型を標準の方法により評価した。
【０１６４】
構築物
Spitzを残基123と124の間で単一mycタグを用いてタグ付けし、ハエ形質転換用のpUASTベクター中にクローニングした。EGFP ORF（Clontech）をSpitzの残基33と34の間のBsiWI部位中に挿入した。TGFαのＮ末端中にBsiWI部位をPCR突然変異誘発により導入し、TGFαＮ末端ドメインを含有するキメラにEGFP ORFを残基32と33の間に挿入することができるようにした。EGFP ORFを用いてSpitzと同じ位置にタグ付けしたSpitz/TGFαキメラ、SpiD53C、Spi-15aaおよびsSpitzは、他文献に記載されている（BangおよびKintner, 2000、前掲、Schweitzer, R.ら (1995) Genes Dev. 9, 1518-1529）。Spi:TGFα-Cは、Spitzの残基1-167およびヒトTGFαの128-160を含む。これはまた、残基33と34の間にタグ付けしたEGFPも含む。Rhomboid-1を、そのＮ末端にてトリプルHAタグを用いてタグ付けし、pUASTおよびpcDNA3.1ベクター中にクローニングした。トリプルmycタグをStarの残基3と4の間にまたは、第２の構築物においては残基83と84の間に挿入した。
【０１６５】
Rho-1NおよびRho-1ΔNはそれぞれ残基1-89および89-355（第１のTMDは残基101から始まる）を含む。Rhomboid-1のＮおよびＣ末端切断系列の正確な座標を表３に示す。StarΔ291C、Δ266CおよびΔ47Cは、終止コドンを残基310、331および551にそれぞれ挿入することにより作製された。断わりのない限り、pCS2（BangおよびKintner、2000 前掲）中に存在していたSpi-15aaおよびspi:TGFa-TMCを除き、組織培養用の全ての構築物はpcDNA3.1（Invitrogen）中に挿入された。
【０１６６】
胚における Spitz 切断
胚を、100-300 w；hs-rho1；UAS-Sの雄と交配した500-1500 w；arm-gal4 UAS-mycSpiの雌のケージから、24時間にわたり採集した。得た胚に37℃にて1.5時間にわたり熱ショックを与えて、rhomboid-1の発現を誘導し、そして25℃にて0〜2時間かけて回復させた。次いで胚を、1mlのプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche）を含有する氷冷RIPAバッファー中で脱卵殻させて溶解させた。不溶物を遠心分離により除去し、そして一夜4℃にて、アガロースビーズに直接結合した20μlの抗Myc抗体（9E10, Santa Cruz）を用いて、mycSpitzを免疫沈降させた。ビーズをRIPAバッファー中で厳密に洗浄し、20μl SDSサンプルバッファー中に再懸濁し、そして5分間煮沸した。MycSpitzを1:1000ウサギ抗myc（A14、Santa Cruz）を用いてウェスタンブロットにより検出した。
【０１６７】
胚のグリコシル化分析
胚を上記のように採集し、抽出物を様々な脱グリコシル化酵素を用いて処理した。エンドグリコシダーゼH_f（Endo-H）は、ER常在タンパク質の特徴である高マンノースN結合型グリカンを除去し；ペプチド-N-グリコシダーゼF（PNGase F）は高マンノースグリカンとまたゴルジ修飾に特徴的な複合N結合型グリカンの両方を除去し；Ｏ-グリコシダーゼはゴルジでのみ付加される多くのＯ-グリカンを除去し；最後に、ノイラミニダーゼはＯ-グリコシダーゼの効率を改良しうる広範な特異性をもつエキソグリコシダーゼである。全ての酵素は、製造業者の説明書に従って変性させたサンプルに対して使用した。
【０１６８】
細胞培養
COS細胞をDMEM培地（10％胎児ウシ血清を補充した）中で増殖させて、FuGENE 6 トランスフェクション試薬（Roche）を用いてトランスフェクトした。細胞を35mm培養ウエル中で１ウエル当たり25-250ngの各構築物および1μgまでの全DNAを担持すべき空プラスミドを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの24〜30時間後に、培地を無血清培地と置換えた。これを24時間後に回収し、そして細胞をSDSサンプルバッファー中に溶解した。ならし培地および細胞溶解物中のGFPをウェスタンブロットによりウサギポリクローナル抗体を用いて検出した。いくつかの実験については、無血清培地に、メタロプロテアーゼインヒビターであるバチマスタット（batimastat）（British Biotech）またはイロモスタット（ilomostat）（Calbiochem）を補充した。
【０１６９】
酵母株
YGR101wおよびYPL246cには、二倍体株K842（Nasmythら (1990) Cell 62, 631-647）のゲノムのＣ末端に、PCRにより直接、GFPをタグ付けした（Wigge, P. A.ら (1998). J Cell Biol 141, 967-977）。生細胞を放射輝度共焦点顕微鏡（BioRAD）上でイメージングした。
【０１７０】
免疫組織化学
播種しトランスフェクトした細胞を、カバースリップ上で20分間、4％パラホルムアルデヒドを含有するPBS中で固定し、そして10分間、0.1％ TritonX-100を含有するPBS中で透過化処理した。細胞を一夜、1％ BSAを用いてブロックし、次いで一次および二次抗体を用いて室温にてそれぞれ1.5時間および1時間インキュベートした。GFP蛍光は固定後しばしば大きく低減したので、可視化のために抗GFP（1:5000）を用いて染色する必要があった。次の一次抗体を使用した：マウス抗Myc 9E10（Santa Cruz Biotechnology）を1:250にて、ラット抗HA（Roche）を1:500にて、ウサギ抗PDI（Calbiochem）を1:250にて、ウサギ抗Giantin（Seeligら, (1994) J. Autoimmun. 7, 67-91）を1:500にて、マウス抗p115（Transduction Labs；第２の哺乳類細胞ゴルジマーカー）を1:250にて。Molecular Probes社から入手したAlexa Fluor 568（赤色）およびAlexa Fluor 488（緑色）-コンジュゲート二次抗体を1:500にて使用した。唾液腺は、MunroおよびFreeman (2000)に従い1:400マウス抗ショウジョウバエゴルジ（Calbiochem）および1:400ウサギ抗HA（Y11, Santa Cruz）を用いて染色した。蛍光イメージは全て、MRC放射輝度共焦点顕微鏡（Biorad）上で取得した。
【０１７１】
プロテアーゼインヒビターアッセイ
細胞を、標準として1ngのRhomboid-1 DNA（1μgの全DNA中）を用いてトランスフェクトし、次いで無血清培地中で24時間インキュベートした。次に培地を示した濃度のプロテアーゼインヒビターを含有する0.5ml無血清培地を用いて置換えて、そして1時間インキュベートした。1時間後、培地を回収し、遠心分離により清澄化し、一夜、数回交換しながら水に対して透析しそして凍結乾燥した。得たペレットをSDSサンプルバッファー中に再懸濁し、煮沸しそしてウェスタンブロットにより分析した。分泌型のSpitzを用いたトランスフェクションを用いて、プロテアーゼインヒビターの非特異的毒性または分泌経路の全体的抑制に対する対照実験を、並行して実施した。
【０１７２】
ヒト Rhomboid （ RHBDL2 ）のインヒビターに対するアッセイ
HeLa細胞を、
(a) ベクターpcDNA 3.1＋（Invitrogen）中に挿入された、トリプルＮ末端HAタグとともにRHBDL2コード配列を含んでなるRHBDL2構築物（「HAn RHBDL」）、および
(b) pcDNA 3.1＋（Invitrogen）中に挿入された、好適／最適化基質（「GFP-TGF-Spi-TGF」）を含有する基質構築物
を用いて、同時トランスフェクトした。
【０１７３】
Ｎ末端GFPタグ（Ｃ末端HAタグ有りまたは無し）をもつTGF-αを含有する対照ベクターを、培地中へのタンパク質分泌のポジティブ対照として使用することができ、該対照ベクターはHeLa細胞中に独立してトランスフェクトされる。
【０１７４】
構築物(a)の不在のもとでの構築物(b)のHeLa細胞中へのトランスフェクションは基質の内因的切断に対する対照となる。場合によっては、バチマスタットなどのメタロプロテアーゼインヒビターを用いてHTSアッセイにおける内因的基質切断を最小限にしてもよい。
【０１７５】
トランスフェクトした細胞を次いで試験化合物とともに、例えば、96ウエルマイクロプレートフォーマットでインキュベートする。
【０１７６】
次いで上清をウエルから回収し、培地中のGFPの存在について従来の技術を用いてアッセイする。
【０１７７】
例えば、GFPをポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を用いて捕捉し、洗浄し、そして次いで捕捉したGFPを、酵素にコンジュゲートしたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を用いて（捕捉ELISA）または蛍光標識を用いて検出することができる。
【０１７８】
ELISAについては、西洋わさびペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼとコンジュゲートした適当なポリクローナル抗GFPが市販されている。かかるコンジュゲートは、インキュベーションの所要数が減少するので好ましい。あるいは、アビジンもしくはストレプトアビジン酵素コンジュゲートと組合わせたビオチン化抗GFP抗体を用いてもよい。
【０１７９】
蛍光アッセイについては、ユーロピウムもしくはテルビウム標識した抗体またはストレプトアビジンが適当である（例えば、デルフィア（Delphia）またはランス（Lance）試薬、Perkin Elmer）。これらは長い蛍光寿命をもつ標識であり、シグナル：ノイズ比を改善することができる。
【０１８０】
上記の変法としては、GFP-TGF-Spi-TGF構築物中のGFPをＮ末端の酵素標識により置換して（または構築物にそれを加えて）培地中の切断された基質を直接アッセイするものである。適当な酵素としては、Renillaルシフェラーゼ（Lui,J.,およびEscher, A. (1999) Gene 237, 153-159）および分泌可能なアルカリホスファターゼ配列（SEAP）（Clontech）が挙げられる。
【０１８１】
細菌 Rhomboid のクローニング
細菌Rhomboid遺伝子をPCRによりゲノムDNAからクローニングし、pcDNA3.1（Invitrogen）中に挿入した。活性は上記の標準COS細胞アッセイによりアッセイしたが、典型的には100ngのrhomboid DNAをCOS細胞の35mmディッシュ中にトランスフェクトした。
【０１８２】
酵母ノックアウト
サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）rhomboid遺伝子のノックアウトを標準方法により実施した（Rothstein RJ. 1983. Methods Enzymol 101, 202-11）。レスキュー実験は、rhomboidの野生型または突然変異型を、酵母細胞中に単一コピーとして維持される2ミクロンプラスミド中にクローニングすることにより実施した。該プラスミドを当該rhomboidノックアウト細胞中に形質転換し、特定のノックアウト表現型をレスキューするその能力を評価した。
【０１８３】
ゼブラフィッシュノックアウト
ゼブラフィッシュRHBDL2のノックアウトを標準方法により実施した（McClintock JM, Kheirbek MA, Prince VE. 2002. Development. 129, 2339-2354）。翻訳開始点の周囲のcDNA領域と相補的なモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（TCTTGCTCTTCGGTGTCATTATCGC）を、1〜4個の細胞胚中に2〜4μMにてインジェクションした。24および48時間後に表現型を評価し、同等の段階の野生型胚と比較した。RHBDL2に対するin situハイブリダイゼーションを標準技術により実施した。
【０１８４】
結果
Spitz は Rhomboid および Star に依存する機構により切断される
ショウジョウバエ胚を、RhomboidおよびStarに応答するSpitzの切断について研究した。UASにより駆動される、Ｎ末端近くにmycタグ付けしたSpitzは、アルマジロ-Gal4の制御下で、遍在性Starおよび／または熱ショック誘導性Rhomboid-1の存在または不在のもとで、胚中で遍在的に発現した。次いでタグ付きSpitzを胚抽出物から免疫沈降させた（これらの胚は内因性StarおよびRhomboidならびに異所的に発現されるトランスジーンも含有することに注意）。
【０１８５】
Spitzの切断はRhomboid-1単独では誘導されなかった。Star単独の存在下では検出された切断のレベルは非常に低かったが、より遅く移動する新しいSpitz種が、少量の低分子量産物とともに認められた。
【０１８６】
Starおよび誘導性Rhomboid-1とともにSpitzを発現する胚においては、Rhomboid-1発現の誘導に応答してSpitzの末端切断型が出現した。これはハエにおけるSpitz切断に対する第１の直接的確証であり、これはタンパク分解がRhomboid発現に応答して起こることを実証する。
【０１８７】
このSpitz活性化の生化学アッセイは、StarとRhomboidの両方がEGF受容体活性化に必要であり、それらは相乗的に作用することを示す従来の遺伝学的確証と良く相関する。
【０１８８】
経時変化は、切断されたSpitzが不安定であり、実質的に熱ショックの60分間後までに減少することを示す。この不安定性にはエンドサイトーシスが関与する。というのも、ショウジョウバエ・ダイナミンが不活性化されているshibire^ts突然変異体バックグラウンドにおいてエンドサイトーシスをブロックしたところ、切断されたSpitzが高レベルに蓄積したためである（van der BliekおよびMeyerowitz (1991) Nature 351, 411-4）。
【０１８９】
この結果はまた、エンドサイトーシスがSpitzのRhomboid-1およびStar誘導性切断に必要でないことも示す。
【０１９０】
哺乳類細胞における Spitz 切断
タンパク分解切断アッセイを哺乳類組織培養系において繰返した。Spitzを、GFPを用いてそのＮ末端近くでタグ付けし、Starおよび／もしくはRhomboid-1の存在のもとでまたは不在のもとで、COS細胞中にて一過性発現させた。次いで細胞培地中のGFP-Spitzの可溶性細胞外断片の蓄積をウェスタンブロットにより測定した。
【０１９１】
胚の場合と非常に類似した結果を得た。すなわちStarおよびRhomboid-1の不在のもとでもまたはRhomboid-1単独の存在のもとでも、切断されたSpitzは検出されなかった。Starは低レベルの切断されたSpitzならびに高分子量の新たな全長Spitzバンドを細胞溶解物中に生じさせた。Spitzと、StarおよびRhomboid-1との同時発現は、膜と結合したSpitzの可溶型への効率的な切断をもたらした。この場合も、StarとRhomboid-1の両方が効率的切断に必要であり、かつそれらは相乗的に作用した。遊離したGFP-Spitz断片のサイズは、当該タンパク質をEGFドメインとTMDの間で末端切断したGFP-Spitzの人工分泌形態のサイズと区別できなかった。
【０１９２】
Rhomboid-1とStarに依存するSpitzの切断はCOS細胞特異的でなかった。同一の切断が、HeLa、NIH3T3およびCHOを含む広範囲の哺乳類細胞系において生じた。
【０１９３】
全ての細胞を、COS細胞と同じアッセイ、すなわち、Rhomboid、Starおよび基質の同時トランスフェクションと、試験培地および溶解物を用いて、切断された基質について試験した。
【０１９４】
哺乳類細胞はまた、Rhomboid-1の過剰発現によって影響を受けることも見出した。最高レベルにおいては、高レベルのRhomboidが発現されると、Spitz分泌はゴルジ装置の断片化による影響を受けて低下する。
【０１９５】
Spitz は TACE 様メタロプロテアーゼにより切断されない
Spitz、StarおよびRhomboid-1は、形質転換した哺乳類細胞中に存在するもっぱらショウジョウバエのタンパク質である。可能性のある仮説はこれらのタンパク質がプロセシング複合体に哺乳類プロテアーゼを召集することができるというものである。もしそうであれば、推定上の哺乳類プロテアーゼに対する主な候補はメタロプロテアーゼのADAMファミリーのメンバーであろう。これらのプロテアーゼは広範囲の特異性を有し、Spitz相同体であるTGFαを含む様々な哺乳類成長因子の遊離を引き起こす。これらのプロテアーゼの関与の可能性を、強力なメタロプロテアーゼインヒビターであるバチマスタット(batimastat)（British Biotechnology）を用いて1μMおよび10μMにて試験した。予想通り、バチマスタットはこのアッセイで10μM濃度にてTGFαの遊離を抑制したが、RhomboidとStarによるSpitzの切断には影響を与えなかった。
【０１９６】
他の広範囲なスペクトルをもつメタロプロテアーゼインヒビターであるイロモスタット(ilomostat)（Calbiochem）を用いても同じ結果を得た。従って、Rhomboidが引き起こすSpitz切断は、メタロプロテアーゼに依存するものでない。興味深いことに、Star単独により引き起こされるSpitzの低レベル分泌は1μMバチマスタットにより完全に抑制され、このことは、これがRhomboidが引き起こす切断とは別の機構により起こることを示唆している。
【０１９７】
従って、StarとRhomboid-1はそれら自身でSpitzの切断を十分に触媒するのである。
【０１９８】
RNA干渉を利用して、TGFα切断に必要な特異的メタロプロテアーゼであるショウジョウバエ相同体のTACE（CG7908）（これに対する突然変異体はショウジョウバエでまだ存在しない）を不活性化した。もしTACEがSpitz切断に必要であるとすれば、RNAiによるその発現のブロッキングはspitz様表現型を生じるに違いない。実際にはこれを注射した胚は野生型と区別することができず、このことは、ショウジョウバエTACEはSpitz活性化の必須成分でないことをさらに示唆した。
【０１９９】
Spitz 、 Star および Rhomboid の細胞内局在
Spitz、StarおよびRhomboid-1の組合わせを発現するCOS細胞を試験して、タンパク質の局在を発見した。GFP-Spitzに加えて、切断アッセイに有効なHA-タグ付けRhomboid-1およびmyc-タグ付けStarを用いた。Spitzは小胞体（ER）にのみ局在したが、そのことはその特徴的な核周囲染色および網状染色により、およびそのERマーカータンパク質であるジスルフィドイソメラーゼ（PDI）との共局在により示された。Starはさらに複雑なパターンを示した。すなわちそれはER内に存在したが、そのことはPDIとの共局在より確認された。Starはまた、80〜90％の細胞においてゴルジ装置内にも存在し、かつこれらのほぼ半分の細胞においては同様に形質膜にも存在した。StarがER内に存在したという本発明者らの知見は、そのショウジョウバエ卵母細胞内への局在の報告（PickupおよびBanerjee、1999 前掲）と一致する。Rhomboid-1はゴルジ装置内に存在していたが、そのことはGolgiタンパク質ジアンチン（giantin）（Seeligら、1994 前掲）との共局在により確認された。重要なこととして、Rhomboid-1をER内に検出することはできなかった。Rhomboid-1が高レベルに発現すると、ゴルジ装置の断片化が引き起こされる。これらの細胞において、Rhomboid-1はなおゴルジ断片中のジアンチンと共局在していたが、約10％の細胞においては形質膜にも見られた。このゴルジ断片化は恐らく、高レベルのRhomboidがSpitz分泌を低下させるという本発明者らの観察の説明となろう。
【０２００】
Star は Spitz を細胞内で再局在化する
SpitzとStarの同時発現はSpitzの著しい再局在化を起こした。Spitzは、ER内に存在する代わりに、ゴルジ装置および形質膜内に位置した。ゴルジ装置内では、Spitzは常にStarと共局在したが、この共局在は分泌経路の後期においてはより不均一になった。一部の細胞においては、SpitzとStarは形質膜内に一緒に残った。他の細胞においては、Spitzは形質膜内に存在したがStarはERとゴルジ体に限られた。これらの染色パターンは、SpitzがERからゴルジ体中へ移動するためにはStarとSpitzが結合する必要があること、しかしその後のSpitzの分泌経路を通じた移動はStarに依存しないにも関わらず、両タンパク質は時には共局在したままで存在することを示唆する。
【０２０１】
SpitzとRhomboid-1の同時発現はそのいずれのタンパク質の局在にも影響を与えなかった。SpitzはER内にそしてRhomboid-1はゴルジ装置内に留まった。Spitz、StarおよびRhomboid-1が同時発現されると、Spitzはゴルジ装置内に見られたが、このことは、切断および／またはその後の分泌は律速的であるが、ERからゴルジ体へのSpitzの移動は律速的でないことを示す。
【０２０２】
これらの結果は、Starが、通常ERに留まっているSpitzを、ゴルジ装置中に移動させてそこでRhomboid-1により促進されるタンパク分解作用を受けさせることによって、EGF受容体シグナリングを調節することを示す。SpitzとStarがRhomboid-1の不在のもとで同時発現する状況においては、Spitzの非切断型がゴルジ体を経て形質膜へ移動する。しかしこれらの３種のタンパク質が同時発現すると、Spitzは効率的に切断されかつ分泌されるので、形質膜に到達しない。
【０２０３】
ショウジョウバエおよび酵母細胞における局在
HAタグ付きRhomboidを幼虫の唾液腺内においてGal4/UAS系の制御下で発現させた。幼虫の唾液腺はショウジョウバエのほとんどの細胞よりはるかに大きい細胞を有するので、タンパク質の細胞内局在に関して好都合である。全ての検出可能なHA-Rhomboidはこれらの細胞内の点状ゴルジ様構造中に位置し、既知のゴルジマーカーと正確に共局在した。これは、Rhomboid-1が実際に、ショウジョウバエのゴルジ装置内に局在し、かつ形質膜内には通常存在しないことを示す。サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）Rhomboid相同体YPL246cのタグ付きバージョンもゴルジ様細胞内コンパートメント内に局在しかつ形質膜とは関連しなかったように、その局在は進化的に保存されている。サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）Rhomboid相同体YGR101wはミトコンドリア内に局在するのがみとめられた。
【０２０４】
生化学的手法を用いてショウジョウバエ細胞におけるSpitzの所在を分析し、それがStarにより再局在化されるかどうかを確認した。Spitzタンパク質は予測されるよりも大きな分子量にてウェスタンブロット上を移動し、バンドは拡散した外観を有した。これは、予想通り、そしてTGFαと同様に（Teixidoら, (1990) J Biol Chem 265, 6410-5；Rutledgeら, (1992) Genes Dev. 6, 1503-1517；Schweitzerら, 1995 前掲）、当該分子の細胞外部分がグリコシル化されていることを示す。
【０２０５】
このことは様々な脱グリコシル化酵素を用いて確認され、本発明者らはこれらの酵素の特異性によってSpitzの細胞内局在を推測することができた。Endo-Hは、Starの不在のもとで生じる全長Spitzの型からグリコシル化の全ての形跡を除去した。Endo-Hは、ER修飾に特徴的な単純な高マンノースＮ結合型グリコシル化だけを除去する酵素であるので、このことはこの型のSpitzがER内にだけ存在することを示す。
【０２０６】
先に記載したように、SpitzをStarと同時発現させたとき、増加した分子量のバンドが現れた。Endo-Hはこの型のSpitzを脱グリコシル化することはできなかった。その代わりに、これはゴルジ装置内でだけ付加されるＯ-結合型糖類を除去する酵素（Ｏ-グリコシダーゼおよびノイラミニダーゼ）に対して感受性があった。Spitzの切断型はStar依存型と同じパターンの感受性を有した。これらの結果は、ショウジョウバエ胚において、Ｏ-グリコシル化を受けるゴルジ装置へとSpitzをStarが輸送するまでは、Spitzは単独でER内に位置していることを示す。RhomboidはSpitzのグリコシル化に影響を与えなかった。哺乳類細胞の場合と同様、胚におけるRhomboidの唯一の機能は切断を促進することであると思われる。
【０２０７】
Spitz の必須ドメイン
SpitzとヒトTGFαの間の一連のGFPタグ付きキメラならびにそれらに基づくBangおよびKintnerの欠失体（BangおよびKintner (2000)、前掲）を、COSアッセイで試験した（図１）。TGFαはCOS細胞から、メタロプロテアーゼインヒビターに感受性の機構により効率的に構成的に分泌された。Starおよび／またはRhomboidの付加は、分泌経路全体を通しておよび形質膜におけるその分泌またはその局在のいずれにも検出可能な影響を与えなかった。
【０２０８】
Star に依存する再局在化のための要件
TGFα TMDのSpitz TMFによる置換は、その広範な分布に影響を与えなかった。対照的に、Spitz細胞質ドメインを含有するTGFαキメラはER内にしっかりと保持されたが、このことは、このドメインが、SpitzのER滞留に必要な情報を含有することを示唆している。しかし、Spitzの53個のＣ末端アミノ酸の欠失（細胞質ドメインの13個の膜近位アミノ酸だけを残して）はER滞留を損なわなかった。
【０２０９】
Starにより再局在化される特性は、Spitzの単一のドメインにマッピングされなかった。EGFドメインとTMDの間にある15個の残基の欠失は再局在化の効率を実質的に減少された。一部はStarによってゴルジ装置へ再局在化されたが多数はER内に残った。Spi-Δ15のわずかな再局在を、細胞溶解物におけるシフトしたＯ-グリコシル化全長バンドの不在により確認した。対照的に、８個の膜近傍残基だけの除去はStar依存性再局在を減少させなかった。その細胞質Ｃ末端の53個の残基の除去もStar再局在を野生型より低い効率とした。この場合も同様に、若干のSpitzがER内に保持された。この場合、弱いＯ-グリコシル化バンドが細胞溶解物中にみとめられるが、このことは、Spi-Δ53CはSpi-Δ15より多くゴルジ体に到達することを示す。
【０２１０】
総合すると、これらの結果は、Spitzの内腔ドメインおよび細胞質ドメインの両方が再局在化に関わることを示す。
【０２１１】
しかし、他のキメラは、Spitzの内腔ドメインがStar依存性再局在にとって十分なものであることを実証した。かくして、TGFαのTMDおよび細胞質ドメインと連結したSpitzの細胞外ドメインを含んでなる構築物は、TGFαと区別し得ない分布（ER、ゴルジ体、一部の形質膜）を示したが、Starが同時発現すると、それはもはやER中に検出できず、細胞表面染色がより顕著になった。従って、SpitzのER滞留シグナルの不在にも関わらず、このキメラはStarにより再局在化された。対照的に、Spitz細胞質ドメインを含有するTGFαキメラはStarにより再局在化されなかったが、このことは、このドメインがStar再局在化に十分でないことを示す。
【０２１２】
Rhomboid 依存性切断の要件
顕著なことに、TGFαTMD（膜貫通ドメイン）のSpitz-TMDによる置換は、効率は様々であるが、キメラ（TGFα:SpiTM）をRhomboid-1が促進する切断に対して感受性であるようにするために十分であった。この切断は細胞溶解物において新しいRhomboid-1依存性バンドとしてみとめられた。これは培地中では検出できなかったが、それは切断産物の分泌が乏しいことによるかまたはこのキメラの高いレベルの構成的分泌によりゲル上で単に覆い隠されたかであろう。TMDがRhomboid-1依存性切断の主な決定因子であることと一致して、Spitz細胞外ドメインとTGFα TMDおよび細胞質ドメインを含有するキメラは、Rhomboid-1により切断されなかった。また、Starの存在のもとでは全長タンパク質のＯ-グリコシル化型が細胞内に蓄積した。また逆のTGFα:Spi-TMCキメラは、Rhomboidにより検出可能なようには切断されなかった。
【０２１３】
この結果は、Spitz TMDがRhomboid感受性を与えるのに十分であることと一致しないように思えるが、TGFα:SpiTMキメラとTGFα:Spi-TMCキメラの局在は全く異なるものであった。前者は分泌経路全体に分布したが、後者はSpitz細胞質ドメインのおかげでしっかりとERに局在化された。従って、TGFα:Spi-TMCはゴルジ装置内でRhomboid-1に曝されなかったが、これは、切断が検出されない理由の説明となる。
【０２１４】
SpitzのTMDがRhomboid-1感受性を与えるという考えと一致して、Spi:TGFαTMCはRhomboid-1により切断されないがSpi-Δ53Cは切断される。しかし、膜の細胞外面とEGFドメインの間の15個のアミノ酸の欠失（Spi-Δ15）はSpitz切断の明らかな失敗を引き起こすという発表済の観察（BangおよびKintner、2000 前掲）により、TMDの意義に異議が申し立てられる。この構築物はアフリカツメガエル（Xenopus）外植体アッセイにおいてRhomboidとStarに依存する方法でEGF受容体シグナリングを活性化した。この論文では、Spitzの切断はRhomboidとStarの主たる機能でないと結論された。
【０２１５】
しかし、本発明者らのアッセイにおいては、効率は低下するが、Spi-Δ15はRhomboid-1およびStarに依存する方法で切断され、このことは、膜とEGFドメインの間の15個の残基はRhomboid誘導性切断に必須でないことを示唆する。実際、この構築物の切断効率の低下は、もっぱらStarにより再局在化される能力の減少によるものでありうる。この結果は、本発明者らの結果と先に示された結果（BangおよびKintner (2000） 前掲）との間の矛盾を説明する。
【０２１６】
総括すると、これらの結果は全て、SpitzのTMDがRhomboid-1依存性切断にとって必要かつ十分であることと一致する。
【０２１７】
Rhomboid-1 活性は Star を必要とない
本発明者らのモデルの予測では、ER内に留まらなかったSpitzの型はStarの不在のもとでRhomboid-1により切断されたのであろう。この予測を調べるために、今度は細胞質ドメインだけをTGFα細胞質ドメインにより置換えてSpitzを含む他のSpitz:TGFαキメラ（Spi:TGFα-C）を作った。この構築物の局在はTGFαに似ていたが、そのより多くがER内に保持された。約20％の細胞においては、ゴルジ装置内でおよび時には細胞表面で、みとめられた。これは、常にERに局在化されるSpitzでは決して見られないことであった。Spi:TGFα-CはSpitz内腔ドメインを有するために、StarによりそれがERの外へ移動した。重要なこととして、これはStar不在のもとでさえRhomboid-1により効率的に切断された。Starの添加はRhomboid-1依存性切断を増強し、このことは、ERの外へのSpi:TGFα-Cのシャペロンとして機能するStarの能力と一致した。
【０２１８】
この結果は、Starの機能がSpitzを再局在化することであることを実証する。それは、またRhomboid-1依存性切断はStarを補因子として必要としないことも実証する。Spi:TGFα-CはRhomboidにより切断されるがSpi:TGFα-TMCは切断されず、そしてそれらの間の唯一の相違はそれらのTMDにある。この結果は、Spitz TMDがRhomboid-1感受性を与えることを示す。これらの結果を、以下に説明するように、ER内に局在するKDELタグ付けRhomboidを用いて確認した。
【０２１９】
Star の内腔ドメインがその機能に必要である
Spitzの内腔ドメインが、Star依存性再局在化に対する感受性を与える上で十分なものである。そこで本発明者らはStarの内腔ドメインがその再局在機能に必須であるかどうかを試験した。291、266および47内腔アミノ酸をそれぞれ除去した３つのＣ末端切断体を試験し（Starは２型タンパク質である）、その結果、全てがSpitzをERからゴルジ装置へ有意に再局在化するStarの能力を無効にした。
【０２２０】
これと一致して、これらの末端切断体は、SpitzのStar依存性グリコシル化を媒介することができず、またはRhomboid-1依存性切断を誘導することができなかった。全ての３つの末端切断体は通常レベルでかつ野生型Starと同じ細胞内局在で発現した。従って、Starの内腔ドメインはSpitzを再局在化するStarの能力に必要であり、このことは、SpitzとStarとの間の主な相互作用は内腔で行われるという考えと一致する。
【０２２１】
TMD は Rhomboid-1 のコア機能を有する
Rhomboidファミリーの全てのメンバーはＮ末端親水性ドメインとそれに続くTMDを含有する領域を有する。Rhomboid-1の場合、本発明者らはＮ末端ドメインが細胞質にあることを確認した。他のRhomboidにおけるシグナルペプチドの欠損は、このトポロジーが保存されていることを示す。これらのＮ末端ドメインの偏在性にも関わらず、これらは検出可能な配列保存性を示さず、従ってそれらの機能は不明確である。
【０２２２】
Ｎ末端単独（Rhomboid-1N）またはＮ末端をもたない膜貫通ドメイン（Rhomboid-1ΔN）についてのSpitz切断を促進する能力を、COS細胞内で基質（GFP-Spitz）およびStarの存在のもとでRhomboid-1NおよびRhomboid-1ΔNを発現させて基質の切断を測定することにより試験した。可溶性細胞質性Ｎ末端は活性を有しなかったが、Rhomboid-1ΔNは低い活性であるがSpitzを切断した。
【０２２３】
重要なこととして、Rhomboid-1ΔN切断は1μMおよび10μMバチマスタットにより影響を受けなかったことから、その切断はメタロプロテアーゼ依存性の細胞表面剥離（shedding）により生じた人為的なものでないことが証明された。
【０２２４】
これらの構築物をGAL4/UAS系（BrandおよびPerrimon (1993) Development 118 401-415）を用いて羽で発現させると、同一の結果がin vivoで得られた。Rhomboid-1ΔNは全長Rhomboid-1と類似した活性を示したがRhomboid-1Nは活性を示さなかった。これをさらに試験するために、本発明者らはHAタグ付きRhomboid-1のＮおよびＣ末端切断物の多数からなる系列を作って、標準COS細胞アッセイにおいてSpitz切断を促進する能力についてそれらを試験した。いくらかの（低い）活性を保持しているこの系列のうちの唯一のものは、Rhomboid-1のＣ末端内腔ドメインを欠失したN8であった。少なくとも１つのTMDを除去したその他のものは全て、活性全てを失った（表３および図４を参照）。
【０２２５】
総合すると、これらの結果は、Rhomboid-1のコア機能（すなわち、Spitz切断を促進するその能力）が細胞質性Ｎ末端にも内腔性Ｃ末端にも存在しない複数のTMDをもつタンパク質部分に存在することを示している。
【０２２６】
Rhomboid はタンパク分解酵素である
酵素の重要な特徴は、それらが反応において触媒として、半化学量論的レベルで作用することである。逆に、反応基質、および反応において触媒的役割をもたないタンパク質は、化学量論的に挙動し、すなわちかかるタンパク質の量を減少させると反応産物が比例的に減少すると予測される。Rhomboid-1を、Spitzの切断を促進する上での酵素的挙動について、この原理に従って試験した。
【０２２７】
切断反応の３成分のそれぞれの濃度を、COS細胞中にトランスフェクトするDNAの量を減少させることにより滴定した。全DNAをトランスフェクション当たり1μgに維持してトランスフェクション効率が確実に一定になるようにした。培地中の切断されたGFP-Spitzの量を24-30時間後にウェスタンブロットにより測定した。
【０２２８】
反応物中のSpitzの量を減少させると、生成物の量に線形的な影響を与えることが観察された。Spitzがこの反応の基質と仮定すると、これは予測通りであった。
【０２２９】
Starの減少はSpitz切断反応の効率全体に強い影響を与えることが観察された。Starの存在する量が少ないほど、再局在化されるSpitzは少なくなりうる。これは、シャペロンタンパク質としてはたらくStarがSpitzと相互作用してそれをゴルジ装置へ移動させることによって機能する機構と、一致する。
【０２３０】
対照的に、rhomboid-1 DNAを10倍および100倍に減じると、実際にその切断能力が増加した（Rhomboid-1のゴルジ破壊効果を低下させることによる）。10,000倍希釈（すなわち、トランスフェクション当たり0.025ngのrhomboid-1 DNA）でも、Rhomboid-1はなおSpitz切断を促進するのに有効である。
【０２３１】
この実験に対する重要な対照実験は、細胞中にトランスフェクトしたDNA量が、発現したタンパク質レベルに正比例すること（すなわちHA-タグ付きRhomboid-1タンパク質レベルが入力DNAに比例して減少すること）を実証したものであった。これは、抗HA抗体を用いて細胞溶解物のウェスタンブロットに対してプローブしてHA-Rhomboid-1タンパク質レベルを直接測定することにより試験した。連続希釈における第１希釈（10倍）においてすら、Rhomboid-1レベルは検出可能値以下に低下した。これはRhomboid-1が極度に低レベルにおいて効率的にタンパク分解活性を促進することを立証する。Rhomboid-1のこの特性とStarおよびSpitzのそれらのレベルの低下に対する感受性の間の対比は、Rhomboidが半化学量論的に機能すること、すなわち酵素の特質を、実証するものである。
【０２３２】
類似の滴定実験を他の細胞系（CHO、NIH3T3およびHeLa）において実施して同じ結果を得た。このことは、Rhomboid-1の半化学量論的機能がこのタンパク質の一般的特性であることを示唆する。
【０２３３】
もしRhomboid-1が酵素として作用したのであれば、Rhomboid-1配列内のある特定の残基が触媒部位を形成すると予想された。酵素の活性はこの触媒部位における残基の突然変異誘発に特に感受性があったであろう。実際、それらの改変は、もしそれが本当に触媒機能の部分であれば、酵素活性を完全に無効にするはずである。
【０２３４】
対照的に、Rhomboid-1機能の他の側面（例えば他のタンパク質との結合、タンパク質コンフォメーション）に関わる残基は改変に対してほとんど影響を受けていない。
【０２３５】
Rhomboidファミリー内で高度に保存されている全ての残基（触媒機能を有していないだろうと予測されるいくつかのグリシンを除いて）を個別にRhomboid-1において突然変異させた。次いでRhomboid-1のこれらの突然変異型がSpitz切断を促進する能力を、COS細胞アッセイにおいて培地中の切断されたGFP-Spitzのウェスタンブロット分析により試験した。
【０２３６】
突然変異型（全てHAタグ付きであった）の発現を抗HA抗体を用いて細胞溶解物についてプローブすることにより確認した。全て同程度のレベルで発現された。13個の高度に保存された残基のうち、6個だけがRhomboid-1機能に必須であった。これらの6個（W151、R152、N169、G215、S217、H281）のいずれか１つをアラニンに改変するとRhomboid-1活性は完全に無効化された。このアッセイの感度（通常の入力量のrhomboid-1-HA DNAの1:1000希釈ですら検出可能な活性を有した）からすれば、これらの単一突然変異のそれぞれが少なくとも1000倍だけタンパク分解機能を低下させたと結論することができる。
【０２３７】
他の保存された残基の突然変異は、Rhomboid-1機能を検出しうるが不完全に低減させるか（R188、G218）または野生型機能と区別できない活性をもたらした（S155、H160、H165、E181、Y193）。本アッセイはRhomboid機能に対する感度が高いので、これら後者の場合、培地中の切断されたSpitzの検出可能な低下をもたらすことなく、活性を有意に低下させるかもしれないことに注意すべきである。従って、このアッセイにおけるそれらの活性にも関わらず、Rhomboid-1機能の何らかの側面に対してこれらの残基は重要でありうるが、それらは触媒作用それ自身に対して必須ではあり得ない。
【０２３８】
Rhomboid-1 はセリンプロテアーゼである
Rhomboid-1がSpitzを切断するプロテアーゼの特性を持つことが示された。しかし、Rhomboidタンパク質中によく保存されたシステインまたはアスパラギン酸残基は存在しないので、Rhomboid-1はシステインまたはアスパラギン酸プロテアーゼではありそうにない。他の２クラスの既知プロテアーゼはメタロプロテアーゼおよびセリン／トレオニンプロテアーゼである。
【０２３９】
Rhomboid-1は、金属イオンを配位するように働き得る複数の保存ヒスチジン残基を有しており、このことはそれがメタロプロテアーゼであることを示唆するであろう。しかし上記の突然変異誘発分析は、これらの残基のほとんどが触媒機構の一部分でないことを示す。さらに、SpitzのRhomboid-1依存性切断は、メタロプロテアーゼの強力なインヒビター、バチマスタットおよびイロモスタットに対して非感受性であることが見出されている。バチマスタットアッセイを、ある範囲のRhomboid-1濃度（1μMおよび10μMバチマスタット中のトランスフェクトしたCOS細胞が入った35mmウエル当たり2.5、0.25および0.025ng Rhomboid DNA）に対して実施して、Rhomboid-1が限界に達する濃度のバチマスタット感受性を調べた。
【０２４０】
試験した全ての条件のもとで、1μMおよび10μMのバチマスタットはRhomboid-1依存性切断に影響を与えなかったが、このことから、Spitzの切断はメタロプロテアーゼにより触媒されないという結論が確認された。
【０２４１】
上記の位置指定突然変異誘発は、本発明者らの注意をRhomboid-1のTMD4中の残基のクラスターに向けさせた。GASGGモチーフにおいて、第１のグリシン（G215）およびセリン（S217）は両方とも触媒活性にとって必須である。この配列は、配列データベース中に存在するほとんど全てのRhomboid相同体において保存されている。顕著なことに、この配列は、セリンが加水分解反応そのものにおいて活性残基となるキモトリプシンおよびトリプシンを含む多くのセリンプロテアーゼ中のGXSGG配列に、類似する。これらのセリンプロテアーゼにおいて、このモチーフ中の第１グリシンはまた、重要な機能（それは触媒性トライアド（triad）の一成分ではないが）、すなわち基質のペプチド主鎖との水素結合も有する。セリンプロテアーゼ触媒性トライアドはまた、ヒスチジンも含む。Rhomboid-1においてTMD6のヒスチジン281は他の必須残基の１つであり、これは脂質二重層において推定上の触媒性セリンと類似した位置にあると予測される。従って、これらはセリンプロテアーゼ活性部位の部分を形成している可能性があった。脂質二重層内に存在するかかるセリンプロテアーゼ活性部位は全く新規でありうる。
【０２４２】
セリンプロテアーゼ触媒性トライアドの第３残基はアスパラギン酸である。Rhomboid-1には保存された必須アスパラギン酸は存在しない。
【０２４３】
興味深いことに、Rhomboid-1のTMD2中のアスパラギン-169は必須である。それは二重層中にセリン-217およびヒスチジン-281と同程度のレベルで存在すると予測され、従ってそれはRhomboid-1が触媒するタンパク分解に参加する候補である。触媒性トライアドのアスパラギン酸がアスパラギンにより置換えられている疎水性システインプロテアーゼは、公知である（Vernet ら (1995) J. Biol. Chem. 270 16645-16652）。システインプロテアーゼはセリンプロテアーゼと非常に類似した触媒機構を有するので、これはN-169がRhomboid触媒性トライアドのアスパラギン酸と置換わることを示す。
【０２４４】
最後の２つの必須残基（W151およびR152）の機能は確立されていない。これらはTMD1とTMD2の間の内腔ループに存在すると予測される。
【０２４５】
本明細書に記載の実験は、Rhomboid-1が、基質をその膜貫通ドメイン内で切断する新規のセリンプロテアーゼであること、ならびにR152、G215、S217およびH281が重要な触媒残基であり、それらが、同様に重要性をもつW151およびN169とともに、触媒中心および／または必須ドッキング部位を形成することを、実証する。
【０２４６】
これは、本発明者らの観察、すなわちSpitzのRhomboid-1-依存性切断がメタロプロテアーゼの特異的インヒビターにより阻害されないが、セリンプロテアーゼインヒビターには感受性であったという観察により強く支持される。本発明者らは一群のインヒビターの存在のもとで標準切断アッセイを実施した。
【０２４７】
Rhomboid活性の阻害が観察されなかったのは次のインヒビターを用いた場合である：システインプロテアーゼインヒビターE64d（50μM）およびロイペプチン（100μM）（Salvesen, G.S.,およびNagase, H. (2001), 「タンパク分解酵素の阻害（Inhibition of proteolytic enzymes）」, Proteolytic Enzymes 収載, R. Beynon,およびJ.S. Bond, 編 (Oxford, Oxford University Press）、カルパインインヒビターPD150606（Wang, K.K.ら (1996), Proc Natl Acad Sci U S A 93,6687-6692）、アスパルチルプロテアーゼインヒビターペプスタチンＡ（50μM）（Salvesen, G.S.,およびNagase, H. (2001), 「タンパク分解酵素の抑制（Inhibition of proteolytic enzymes）」 Proteolytic Enzymes 収載, R. Beynon,およびJ. S. Bond, 編 (Oxford, Oxford University Press）、γセクレターゼインヒビターＩ（25μM）（Hartmann, T.ら (1997). Nat Med 3, 1016-1020）、およびメタロプロテアーゼインヒビター・バチマスタット（British Biotech）およびイロモスタット（Calbiochem）。
【０２４８】
しかし、２つのセリンプロテアーゼインヒビター（TPCKおよび3,4-DCI）は反応を強く阻害するのが観察された（10-100μM）。重要なこととして、このDCIおよびTPCKの濃度はSpitzの人為的末端切断型（膜貫通および細胞質ドメインを喪失した細胞外ドメイン）の発現または分泌に影響を与えなかった。これは、DCIおよびTPCKがSpitz切断それ自体には影響を与えるが、その発現または分泌に影響を与えないことを示す。これはRhomboid-1が新規のセリンプロテアーゼである直接の確証を提供する。従って、これは触媒部位が膜の脂質二重層内に存在するセリンプロテアーゼについての初めての記載である。
【０２４９】
ヒト Rhomboid 同族体
プログラムtblastnおよびblastpを用いてRhomboid遺伝子の公的配列データベースをサーチした。ショウジョウバエrhomboidと40％より大きい類似性を有する次の３種のヒト配列を同定した（GenBank受託番号を用いて）；
1) XM_007948、NM_003961、AJ272344（異なる番号は同じ遺伝子の異なる論文提出を表す）；これはPascallおよびBrown（FEBS Lett. 429, 337-340, 1998）が同定しかつ開示したRHBDL遺伝子に対応する。
【０２５０】
2) NM_017821；この遺伝子はヒトゲノムプロジェクトにおいて予想遺伝子として同定されかつ全長cDNAが単離されている。これはショウジョウバエrhomboidと類似性を有すると注釈されたが、それだけで命名または特性決定されてない。名称RHBDL2がヒト遺伝子命名法委員会により公的に容認されている。
【０２５１】
3) BE778475；これは不完全なcDNAでしかない；ヒトゲノムプロジェクトで遺伝子は同定または注釈されていなかった。あるいは、該配列がrhomboid類似性を有するとも注釈されていなかった。Genemarkプログラム（Borodovsky M.およびMcIninch J. Computers and Chemistry (1993) 17 19 123-133）を用いて、本発明者らは周囲のゲノムDNA配列をサーチして全長配列を同定した。この全長配列を図７に示す。
【０２５２】
全長遺伝子配列は、RHBDL-1およびRHBDL2とその全長にわたって有意な類似性（RHBDL1に対して52.6％同一性、60.2％類似性；RHBDL2に対して35.0％同一性、47.7％類似性；ショウジョウバエ rhomboid-1に対して34.7％同一性、45.7％類似性）を示す。この遺伝子に対する名称RHBDL-3は公的に容認されている。重要なこととして、RHBDL3遺伝子産物はRhomboidプロテアーゼ機能に触媒として必須であると示した全ての保存残基を含有する。従って、該遺伝子はタンパク分解活性をもつ真のRhomboidをコードする。
【０２５３】
ショウジョウバエ Rhomboids の基質特異性
３種の他のショウジョウバエRhomboidの、Spitzおよび２種の他のショウジョウバエTGFα様リガンド、KerenおよびGurkenを切断する能力を評価した。
【０２５４】
ショウジョウバエRhomboid-1、-2、-3または-4をCOS細胞に発現し、それらのリガンドを切断する能力をRhomboid発現レベルの範囲にわたって（トランスフェクション当たり25ng〜0.05ng）比較した。切断を、24時間ならし培地のウェスタンブロットにより可溶性GFP-Spitzの存在についてアッセイした。全ての４種のRhomboidは、GAL4/UAS系（Brand & Perrimon 前掲）を用いてSpitzを効率的に切断した。本発明者らはこの結果をin vivoで確認した：全ての４種のRhomboidの異所的発現は、粗眼（rough eye）および外羽静脈物質（extra wing vein material）などのEGF受容体超活性(hyperactivity)に典型的な類似の表現型に導く。従って、Rhomboid-1のタンパク分解活性は試験した全ての４種のショウジョウバエRhomboidに保存されていると結論することができる。全事例において本明細書で必須と同定した残基はタンパク質の全体の予測構造として保存されているが、別な見方ではかなり広い配列相同性の発散が、特にRhomboid1と4の間で、存在することに注意されたい。
【０２５５】
ショウジョウバエRhomboids1〜4の、２種の他のTGFα様ショウジョウバエリガンド、GurkenおよびKerenの切断を促進する能力もCOS細胞切断アッセイにおいておよびショウジョウバエS2組織培養細胞で実施した類似のアッセイにおいて分析した。Gurkenは試験した全ての４種のRhomboidによって効率的に切断されたがSpitzと異なり、切断効率はStarに依存しなかった。全４種のRhomboidは完全にGurkenの全長型を切断したが、Rhomboid-1は一貫して２つの細胞内切断産物を産生するのに対して、Rhomboid-2〜4は１つの細胞内バンドしか産生しなかった。全４種のRhomboidがGurkenを切断する事実は、これらが全て同じコアタンパク分解活性を有するという初期の結論を支持するが、Rhomboid-1が切断の異なるパターンを引起すという観察はそれらの作用が同一でないことを示す。
【０２５６】
この特異性をKeren切断の事例についてさらに詳しく研究する。再び、全４種のRhomboidは切断を促進したが、この事例においてはその相違がさらに顕著であった。
【０２５７】
Starが不在であると、Rhomboid1と2のKerenの切断は非効率的になった；切断のレベルは低かったので細胞溶解物中のわずかな新規のバンドとして検出し得ただけであって（Gurkenと異なり、検出可能なKerenのほとんどは未切断で残った）、培地に検出可能なレベルまで蓄積しなかった。
【０２５８】
対照的に、Rhomboids3と4は、より効率的なKerenのStar非依存性切断および分泌を触媒した；切断産物は細胞溶解物中で可視性でありかつまた培地に実質的に蓄積した。
【０２５９】
Starの存在のもとで、Kerenの切断および分泌の全効率は増強されたが、細胞溶解物中の切断バンドの強度によりアッセイして、一方のRhomboid1と2と他方のRhomboid3と4との間の相違は維持された。
【０２６０】
興味深いことに、Gurkenと同様、Rhomboid-1切断は細胞溶解物中に２つの産物を生じるが、Rhomboid2〜4は単一のバンドを生じた。これらの結果に基づいて、本発明者らは、Kerenの切断においてRhomboid3および4はRhomboid1および2よりはるかに効率的であり；かつRhomboid-1は明らかにKerenを２つの部位で切断する異なる切断作用を有すると結論する。再び、これらの結果は、異なるRhomboid間に若干の基質特異性が存在することを示す。
【０２６１】
プロテアーゼはしばしばその基質に対する特異性を示して生物学的プロセスを調節するために必要とされる精度を達成する（Perona, J.J.,およびCraik, C.S. (1997) J Bioi Chem, 272:29987-90に総説されている）。Rhomboid-1は、Spitz、GurkenおよびKerenを切断するにも関わらず、ショウジョウバエEGF受容体、ショウジョウバエδ、ヒトTGN38（Luzio, J.P., Brake, B., Banting, G., Howell, K.E., Braghetta, P.,およびStanley, K.K. (1990) Biochem J, 270: 97-102）およびヒトTGFαを含む他のＩ型膜タンパク質を切断することができなかった。
【０２６２】
さらに、Rhomboid-1-KDELによるERにおけるSpitz切断の分析は、Rhomboid-1だけがこの特異性に関わることを示す。KDELは、KDEL-タグ付きRhomboid-1ポリペプチドをERに滞留させるER滞留シグナルである。Rhomboid-1-KDELによる切断はStarによるSpitzの受渡しに頼らないので、Rhomboid-1への基質提示にStarが二次的役割を有するかどうかの直接的試験を可能にする。
【０２６３】
StarはSpitz基質およびRhomboid-1プロテアーゼの両方と物理的に結合すると報じられているが（Hsiung, F., Griffis, E.R., Pickup, A., Powers, M.A.,およびMoses, K. (2001) Mech Dev, 107:13-23；Tsruya, R., Schlesinger, A., Reich, A., Gab ay, L., Sapir, A.,およびShilo, B.Z. (2002), Genes Dev,16:222-34）、Rhomboid1-KDELにより触媒される細胞内切断の量は、Starを様々な型のSpitzと同時発現させたときに増強されないことが観察された。従って、Rhomboid-1の特異性とタンパク分解活性はStarに全く依存しない。
【０２６４】
これらの観察は、Rhomboid-1がその基質の選択に高度に選択的であることを示しかつSpitz切断における特異性はRhomboid-1により単独に決定されることを実証する。
【０２６５】
ヒト RHBDL2 による Spitz の切断
ヒトRHBDL2に対する全長cDNAは日本NEDOのヒトcDNA配列決定プロジェクトにおいてリストされた（クローン番号FLJ20435）。
【０２６６】
ヒトRHBDL2 cDNAをCOS細胞に発現し、Starの存在のもとでSpitz切断を誘導するその能力を分析した。GFP-Spitz、StarおよびHuman RHBDL2をCOS細胞内に発現した。培地中のGFP-Spitzの蓄積を10μMバチマスタットの存在のもとで（バックグラウンドのメタロプロテアーゼ活性を抑制するため）アッセイした。これらの条件下では、ヒトRHBDL2は効率的にGFP-Spitz切断を触媒した。
【０２６７】
これは、さらに重要な触媒残基の保存により立証されたように、Rhomboidのコアタンパク分解機能がショウジョウバエとヒトの間で保存されていることのさらなる実証を与える。ショウジョウバエRhomboid-1とRHBDL2の間のこの配列の保存（全ての重要な触媒残基が同一である）はさらに、これらのプロテアーゼが同じ機構により作動することを示す。
【０２６８】
Rhomboid-1活性にとって重要であることが見出された６個の残基を、ヒトRHBDL2において突然変異させた。R111、G174、S176またはH239（ヒトRHBDL2配列による番号）のアラニンへの突然変異はヒトRHBDL2によるSpitzのタンパク分解を完全に無効化した。W110およびN128の突然変異はタンパク分解活性を低下させたが無効化しなかった。RHBDL2の重要な残基の保存は、RHBDL2によるSpitzのタンパク分解的切断がRhomboid-1によるタンパク分解的切断と同じ機構を通して起こることを実証する。
【０２６９】
触媒性セリン（典型的にはGASGであるが、位置２および４において変異体が存在する）モチーフは、進化において良く分離されたファミリーのメンバー（Rhomboid-1、ヒトRHBDL2、細菌および酵母RHBDL）において、膜内プロテアーゼの触媒センターとして保存されていることを本明細書において示す。これは、同じ酵素活性が、保存されたRhomboid様タンパク質の全ファミリーにわたって保存されることを示し、このファミリーが関係のある膜内プロテアーゼであることがわかる。
【０２７０】
Rhomboid-1 の末端切断型はドミナントネガティブとして作用する
Rhomboid-1の残基1〜149、Ｎ末端細胞質ドメインに加えて第１TMDおよび第１細胞外ループ部分を含んでなる、Rhomboid-1の末端切断型（Rho-1-NTM1）を作製した。
【０２７１】
COS細胞Spitz切断アッセイにおいてStarおよび全長Rhomboid-1と共に同時発現させると、末端切断したRhomboid-1はGFP-Spitz切断を促進する野生型タンパク質の能力を抑制した。この結果に対して２つの明らかな説明がある：末端切断Rhomboidがドミナントネガティブ構築物として作用する（すなわち、特異的に、Rhomboid-1切断事象を妨害する）かまたは非特異的に、細胞の生存もしくはタンパク質分泌能力を破壊しうるというものである。
【０２７２】
Rho-1-NTM1はTGFα合成もしくは分泌を妨害せず、対照と区別できなかった。従って、このRhomboid-1のＮ末端断片はRhomboid-1依存性Spitz切断を全く特異的に抑制する能力を有し、すなわち、まさにタンパク質のドミナントネガティブであることを示す。
【０２７３】
このRhomboid-1断片のドミナントネガティブ活性を、Ｐ-エレメントを媒介する形質転換を用いてこれをショウジョウバエにおいて発現させることによりin vivoで確認した。Gal4/UAS系（BrandおよびPerrimon）を用いて発生眼内に発現させると、これはRhomboid-1およびRhomboid-3機能の消失に関連する表現型である細胞死を引き起した。
【０２７４】
Rhomboidファミリーのタンパク質の全構造およびトポロジーはよく保存され、かつ触媒機構は保存されている（４種の異なるショウジョウバエRhomboidは同じコア触媒活性を有しかつ本発明者らが同定した潜在的触媒残基がファミリーのほとんどを通して保存される）と思われるので、他のRhomboidの類似のＮ末端断片のドミナントネガティブ活性を使用しうるということになる。これは、遺伝子に突然変異が存在するかどうかに関係なくいずれかの種由来のRhomboidの役割を決定するための、およびRhomboid活性を実用目的のために操作するための技術を提供しうる。
【０２７５】
遺伝分析は、StarおよびRhomboid-1がショウジョウバエEGF受容体活性化の主なレギュレーターであることを示唆しているが、その機構は今まで解明されてない（SchweitzerおよびShilo, (1997) Trends in Genetics 13, 191-196；WassermanおよびFreeman, (1997) Cell 95, 355-364；Klambt, (2000) Curr Biol 10, R388-91に総説）。本発明者らは、今回、これらの分子のそれぞれの機構を決定した：Starは活性化リガンドSpitzのERからゴルジ装置への搬出に必要である。ゴルジ装置で、Spitzは膜貫通セリンプロテアーゼであるRhomboid-1と遭遇し、Rhomboid-1はリガンドを切断する。
【０２７６】
切断それ自身は調節された膜内タンパク分解（Brownら (2000) Cell 100, 391-8）の新しい変法であり、SpitzTMD内に起こる。切断されると、可溶性内腔リガンド断片は細胞から分泌され、EGF受容体の活性化を引き起こす。かくして、ショウジョウバエEGF受容体シグナリング経路の律速ステップは主にリガンド転位とタンパク分解的切断のレベルにて起こる。
【０２７７】
Spitz 認識と切断
Spitz切断の位置を確認するために、Rhomboid-1による切断産物のサイズを人工的に末端切断したオープンリーディングフレームから発現したSpitz断片のサイズと比較した。切断産物は、直接Ｎ末端〜TMD（残基139）で末端切断したSpitzの型より検出可能なだけ大きかったが、TMD中へ2/3（内腔表面から）にある残基149における末端切断物より小さかった。従って、Spitzは残基139と149の間で切断される。このアッセイの分解度は近似的に５個の残基であるので、これは切断部位を近似的にTMDの内腔側半分内の残基144に配置する。これは、報じたRhomboid-1活性部位とTMD内で同じ「高さ」である。TMDをその内腔／細胞外側でカットする他の膜内プロテアーゼは未だ知られていない。
【０２７８】
SpitzTMDをTGFαのそれと、細胞質末端から開始する４つのネスト化セグメントで逐次的に置換えた（図６参照）。これは、Star非依存性ゴルジ局在化を与えるTGFαＣ末端を有するキメラSpitz分子で行った。SpitzTMDのボトム1/4（Spitz残基155-160）、2/4（残基150-160）、または3/4（残基145-160）をTGFαのそれと置換えても、Rhomboid-1による切断に影響を与えなかった。しかし、残りの5個の残基（残基140-160）を置換えると切断を無効化した。これらのアッセイにおいてStarは使用せず、そしてこれらはバチマスタットの存在のもとで実施して細胞表面メタロプロテアーゼによるバックグラウンド切断を除去した。
【０２７９】
全Spitz TMDをTGFαのそれによる置換えることが、認識部位の消失によるよりもむしろTGFα特異的結合タンパク質によるRhomboid-1認識部位のマスキングをもたらす可能性を排除するために、様々なTMDを用いて類似の分析を実施した：このとき、SpitzTMDを無関係なTMD、哺乳類タンパク質TGN38由来のセグメントを用いて逐次的に置換えた。これは同一の結果を与えて、内腔表面に最も近い５個のSpitzのTMD残基がRhomboid-1が認識する部位を含有することを確証した。
【０２８０】
この分析は、Spitz残基140-144（IASGA）が主なRhomboid-1認識部位を含有することを正確に指摘した；TGFα由来の同等の配列（ITALV）により置換えると、これはRhomboidによる切断を無効化した。一次分析において、野生型Spitz中のこれらをそれぞれ個別に突然変異させた。A141T、G143L、およびA144V突然変異だけがRhomboid-1切断を低下させ、それぞれほぼ3〜5倍低下させた。G143L突然変異が最も強い影響を与えた一方、S142A突然変異はSpitz切断に検出可能な影響を与えなかった。
【０２８１】
Spitz TMDのコンピューター予測（例えば、プログラムTMHMM（Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G.およびSonnhammer, E.L. (2001), J Mol Bioi, 305, 567-580）を用いて）は、TMDが実際には上記Spitz/TGFαキメラシリーズに置換えられた配列のＮ末端で２残基だけ伸びることを示す。そこでTGFαキメラの結果を考え合わせて、残基ASIASGA（残基138-144）をSpitz切断決定における役割について分析した。
【０２８２】
第１に、Spitzの重要な領域中のどの残基がRhomboid-1による認識に関わったのかを試験するために、Spitz中に見出された残基のそれぞれを個々に、切断不可能なSpitz-TGFαキメラ（すなわち、TGFαからの同等の残基により置換えられた残基140-160をもつSpitz）のTGFα TMD中に導入した。注目すべきこととして、Spitz残基G143だけの置換によりこのキメラ基質の切断が回復する一方、G143およびA144の両方の置換はさらに効率的な切断が起こった。従って、Rhomboid-1はSpitz内のこのGAモチーフを標的とすると思われる。興味深いことに、基質TMD内のこのGAモチーフの正確な位置は絶対的に拘束されるものでなく、TMD中へさらに１残基および３残基だけ変位したGAモチーフをもつRhomboid-1はSpitzを切断することができた。
【０２８３】
第２に、上記の一次分析に類似した補足研究において、野生型Spitzにおいて重要領域の全ての残基を単独に突然変異させた。これらのSpitz突然変異型のRhomboid-1基質として作用する能力を、Rhomboid-1-KDELを用いて評価した（これは、ERにおける切断をアッセイすることを可能にしかつ誤らせる結果を生じる分泌効率の変動を回避する）。これは、Spitzの突然変異型の多くは分泌される能力が異なるので意味がある。これらの条件のもとで、切断量は、細胞内のRhomboid-1-KDEL量に依存し、そして、近似的に50％切断をもたらすRhomboid-1-KDELの濃度を用いて、切断を増強および抑制した両方の突然変異を同定することが可能であった。結果を図９に総括したが、ここで、野生型配列を表のトップに沿って示し、試験した突然変異体をそれらの各野生型残基の下に示す。星印の突然変異体はSpitz切断を無効にし；無標識突然変異体は少ししかまたは全く影響を与えず；そして下線を引いたものは切断を増強した。垂直線は実験的に決定した重要領域の境界を示す。
【０２８４】
Spitz突然変異体のこの分析は、重要領域の２つのさらなる特徴を明らかにした。第１に、最初の３つの位置はフェニルアラニンなどの大きな分裂的残基と適応できなかったが、重要領域の後半部ではかかる残基の存在はそれほど重要でなかった。回復分析と一致して、G143Fはフェニルアラニン突然変異誘発に感受性のある重要領域後半部の唯一の残基であった。これらの結果は、G143に加えて、重要領域前半部の残基がRhomboid-1による認識にある役割を果たしうることを示唆する。興味深いことに、A138F突然変異の破壊的性質は恐らくこの部位におけるサイズよりもむしろ疎水性の増加によるようであった。なぜならば、チロシン置換は効率的に切断されたからである。従って、SpitzTMDの最初の数塩基は、恐らく水をRhomboid活性部位中に通過させるために疎水性を制限する必要がありうる。第２に、Rhomboid-1による切断を増強した４種の突然変異体を単離したが、これらは一般的にヘリックスを不安定化すると考えられる残基であった。これらの残基のうちの２つは非常に小さかった；GAモチーフのA144のより小さい残基グリシンへの突然変異およびS139のより小さいアラニン残基への突然変異は両方とも切断を増強した。残基141および143のβ-分枝残基トレオニンおよびイソロイシンへの突然変異もそれぞれ切断を増強した。従って、ある特定の小さいおよびβ分枝残基はRhomboid-1による切断を増強するのに有効であった。
【０２８５】
まとめると、これらの結果は、Rhomboid-1は特定の配列を認識しないで、むしろ構造的決定因子、外見上共通した無秩序なコンフォメーションを認識することを示す。GAモチーフの残基のような小さい残基はそのコンフォメーションがより大きい残基のように制限されず、従ってヘリックスなどの剛直な構造を不安定化することが知られる（Chou, P.Y.,およびFasman, G.D. (1978), Annu Rev Biochem, 47:251-76、Parker, M.H.,およびHefford, M.A. (1997), Protein Eng, 10:487-96、Liu, L.P.,およびDeber, C.M. (1998) Biopolymers, 47:41-62、Butcher, D.J., Luo, Z.,およびHuang, Z. (1999), Biochem Biophys Res Commun, 265:350-5）。さらに、β分枝残基もらせん構造により低い性向を有する。従って、Spitz TMDの重要領域は、多数のTMDとは対照的に非らせんコンフォメーションを採用しうるのであろう。
【０２８６】
ショウジョウバエRhomboids2、3、4およびヒトRHBDL-2のプロテアーゼ活性を、Spitzの切断不能型（残基140-160がTGFα TMDにより置換えられた）、および回復したG143をもつTGFα TMDに対して試験した。Rhomboids2、3、およびRHBDLは正確にRhomboid-1と同じ挙動を示した：それらはTGFα TMDを切断できなかったが、G143だけを加え戻したときには切断できた。これは、これらのRhomboidが全て同じ機構を利用してポリペプチド基質を認識することを示す。
【０２８７】
Rhomboid-4 の特異性
ショウジョウバエ Rhomboid-4は、試験してきた他のRhomboidポリペプチド（例えば、ショウジョウバエRhomboids1、2、3およびヒトRHBDL2）と区別される。多くのRhomboidポリペプチドは基質認識について規定されかつ制限された特異性を有するのに対して、Rhomboid-4は試験した限りの全てのポリペプチド基質を切断し、それらの基質としてはSpitz、Gurken、Keren、ヒトTGFα、「非切断性」Spitz/TGFaキメラ、および完全に無関係のショウジョウバエEGF受容体が挙げられる。
【０２８８】
従って、他のRhomboidポリペプチドと異なり、Rhomboid-4は広範囲の膜内プロテアーゼであって、広範囲のタンパク質のTMDを切断することができる。
【０２８９】
細菌 Rhomboid
Rhomboidファミリーは高い全体相同性を持たないが、本明細書に記載のPFAMおよびpsi-Blastなどの生物情報工学ツール（bioinformatic tools）を利用して進化の全分枝のファミリーメンバーを同定することができる。
【０２９０】
表１はこの方法で同定したRhomboidファミリーのメンバーの例を提供する。ショウジョウバエおよびヒトRhomboidポリペプチドのそれと類似した膜内プロテアーゼ活性が、Rhomboidファミリーの他のメンバーについても観察された。
【０２９１】
Rhomboidポリペプチドを次の細菌からクローニングした：大腸菌（Escherichia coli）（遺伝子：glpG、BVECGG）、プロビデンシア・スツアルティイ菌（Providencia stuartii）（遺伝子：A55862）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（遺伝子：B83259）、テルモトガ・マリチマ菌（Thermotoga maritima）（遺伝子：AAD36164およびAAD35669）、枯草菌（Bacillus subtilis）（遺伝子：ydcA、G69772およびyqgP、BAA12519）、バシラス・ハロデュランス菌（Bacillus halodurans）（遺伝子：BABO5140）、ピロコッカス・ホリコシイ菌（Pyrococcus horikoshii）（遺伝子：E71025）、およびアキフェキス・アエオリクス菌（Aquifex aeolicus）（遺伝子：AACO7308）。
【０２９２】
標準COS細胞切断アッセイ（しかし35mmウエル当たり100ngのRhomboid DNAをトランスフェクトして）を用いて、大腸菌（E. coli）、プロビデンシア菌（Providencia）およびシュードモナス菌（Pseudomonas）（全てヒト病原菌）および枯草菌（B. subtilis）yqgP（グラム陽性）由来のrhomboidが、ショウジョウバエ基質のSpitz、GurkenおよびKerenを切断することを観察した。
【０２９３】
このように、機能性Rhomboidポリペプチドを生物情報工学技術により同定することができる。ヒトおよびハエから十億年以上分枝した細菌のrhomboidですら同じコア触媒活性を有し；それらは膜内プロテアーゼである。これは、Rhomboidが同じ膜内セリンプロテアーゼのコア活性を共有する機能性酵素ファミリーであることを実証する。さらに、基質特異性はショウジョウバエRhomboids1-4、ヒトRHBDL2および複数の細菌rhomboidの間で保存されている。
【０２９４】
酵母 Rhomboid ポリペプチド
サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）RhomboidポリペプチドYGR101wおよびYPL246cをクローニングしてそれらの機能を研究した。YGR101wはミトコンドリアの機能を調節する一方、YPL246cはエンドサイトーシスに関わるようである。
【０２９５】
酵母 Rhomboid-l （ YGR101w ）
GFPタグ付き酵母Rhomboid-lの発現およびミトコンドリアマーカーを用いた同時染色は、該タンパク質はゴルジ装置でなくミトコンドリアにおいて発現されることを示す。これはまた、酵母Rhomboid-l配列からMITOPROTを用いて予測されていた（Claros & Vincens, 1996, Eur J. Biochem. 241,779-786）。
【０２９６】
ygr101wの欠失は緩慢な増殖およびミトコンドリアの形態学的破壊をもたらし、これはEM分析およびミトコンドリアマーカーを用いた蛍光染色により示される。さらに、欠失突然変異体は、グリセロールが単独の炭素源である条件のもとで増殖しない。これは呼吸代謝破損の古典的徴候である。
【０２９７】
本発明者らの結果は、これらの表現型がYGR101wセリンプロテアーゼ活性の不在により生じたことを示す。何故なら触媒として不活性な型（活性セリン周りのGASGの代わりにGAGG）をもつ野生型遺伝子の置換は細胞をレスキューできないが、野生型を用いて置換えると成功裏に細胞をレスキューするからである。
【０２９８】
酵母Rhomboid-1の基質は、全て単一TMDをもち、可溶性の切断されたタンパク質として作用する単一TMDミトコンドリアタンパク質である次のタンパク質：
i) PET100/YDR079W−cyt cオキシダーゼのアセンブリーに関わるタンパク質、
ii) OSM1/YJR051W−浸透圧調節に関わるオキシドレダクターゼタンパク質、
iii) MGM1/YOR211C−膜融合に関わるダイナミン（dynamin）関連タンパク質、
iv) MCR1/YKL150W−酸化ストレス耐性に関わるオキシドレダクターゼタンパク質、
v) CCP1/YKR066C−細胞ストレスに関わるオキシドレダクターゼタンパク質
の１以上であってもよい。
【０２９９】
意味ありげなのは、MGMlおよびPET100突然変異体はYGR101W表現型を共有し、これらをYGR101w基質の有力な候補にすることである。
【０３００】
酵母 Rhomboid-2 （ YPL246c ）
酵母Rhomboid-2（YPL246c）は分泌経路に発現され、その欠失は膜および小胞動力学を損傷する。電子顕微鏡は、YPL246cノックアウトはその細胞質中に外来性膜断片を有することを示す。さらに、野生型ではSNARE SNC1はゴルジ装置と形質膜との間をエンドソームを経由してリサイクルするが（Lewis M.ら (2000） Mol. Cell. Biol. 11 23-28)、ノックアウトではこのリサイクルが破壊される。
【０３０１】
蛍光色素FM4-64の取込み（VidaおよびEmr (1995） J. Cell Biol. 128 779-792)もノックアウトでは損なわれる。
【０３０２】
この確証はエンドサイトーシスの欠陥を示すが、分泌／エンドサイトーシス経路の他の態様も破壊されている可能性がある。突然変異表現型は、野生型YPL246c遺伝子のノックインによりレスキューできるが、触媒として不活性な型（GASGからGAGGへ）のノックインによってレスキューできない。これは、この機能がRhomboid様膜内セリンプロテアーゼ活性に依存することを実証する。
【０３０３】
ゼブラフィッシュ（ Danio rerio ） RHBDL2
脊椎動物Rhomboidの役割を研究するために、ヒトRHBDL2のゼブラフィッシュ同族体（cDNAクローン2652120、GenBank受託番号AW422344から配列決定した）を、遺伝子機能の迅速除去が可能であるアンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチドの標準技術（Heasman J. Dev Biol. 2002 Mar 15;243(2):209-14に総説)を用いてノックアウトした。胚発生が容易に観察されるので、ゼブラフィッシュ胚を共通のモデル系とする。
【０３０４】
RHBDL2が胚形成中に動的かつ特異的発現パターンで発現されることを観察した。アンチセンスモルフォリノオリゴTCTTGCTCTTCGGTGTCATTATCGCを用いたノックアウトは、脳、耳原基および尾に特異的な欠陥を生じる。これらの領域はRHBDL2遺伝子発現の部位と対応する。
【０３０５】
これらの結果は脊椎動物rhomboidの有意で非重複的な機能を初めて示し、他の脊椎動物rhomboid、特に哺乳類rhomboidも生理学的に有意なプロセスに参加しうることを示す。
【０３０６】
Rhomboid-1 の活性型
全ての公知の膜内プロテアーゼを、エンドタンパク分解的切断により活性化される不活性酵素前駆体として合成する。
【０３０７】
タグ付きRhomboid-1の分析は、細胞内の優性型は見かけ分子量により評価して全長であるが、しかし切断型もCOSおよびS2の両方の細胞内に見られることを示した。
【０３０８】
全長型が優性型であるという事実は、ＮおよびＣ末端タグ付き型の抗HA（エピトープタグ）を用いたウェスタンブロットが同じ全長産物を示したこと、すなわちこれらのタグ付き型が共通で有しうる唯一のバンドは全長タンパク質であることを実証することにより確立した。
【０３０９】
タンパク分解断片のサイズを１セットのRhomboid-1の末端切断バージョンと比較すると、これは切断がTMD1と2との間の内腔ループ内に起こったことを示した。
【０３１０】
TMD2および3の細胞質領域の保存アミノ酸の突然変異はこの切断を無効化したが、しかしこれらの非切断性タンパク質は全Spitzタンパク分解活性を有していてそのRhomboid-1の全長型は活性があることを実証した。
【０３１１】
Rhomboid-1活性部位残基の突然変異はそのプロテアーゼ活性を無効化したが、しかしRhoそれ自身のエンドタンパク分解に影響を与えず、この切断は自己触媒的でない（すなわち、Rhomboid-1活性はそれ自身の切断に関わらない）ことを示した。
【０３１２】
これらの結果は、全長Rhomboid-1タンパク質は活性があり、他の膜内プロテアーゼと異なって、それ自身の活性によるかまたは他のプロテアーゼによるタンパク分解活性化を必要としないことを示す。これは、タンパク質の単純な発現が活性に十分であるので、in vitroで活性酵素を作るときに実用上の利点となる。
【０３１３】
Star の機能
Starが不在であると、SpitzはERに滞留される。これは、EGF受容体活性化のドメインがSpitzの発現パターンよりはるかに狭いこと（Rutledgeら, (1992) Genes Dev. 6, 1503-1517；Gabayら, (1997) Science 277, 1103-1106）の理由、および全長Spitzの異所的発現が受容体を活性化しないこと（Schweitzerら, 1995 前掲）の理由を説明する。単一のTMDをもつタンパク質であるStar（Kolodkinら, (1994) Development 120, 1731-1745）は、Spitzをゴルジ装置中に転位するために必要である。SpitzとStarの間の主な相互作用は、両タンパク質の内腔ドメイン間で起こり、この相互作用が細胞質SpitzのER滞留作用と対向作用する。
【０３１４】
Starは、Spitz細胞質ドメイン中に存在するER滞留シグナルを特異的にブロックすることにより作用するのではない。ヒトTGFαＣ末端ドメインとともにSpitz内腔ドメインを含有する２つのキメラはCOS細胞においてERに滞留しないが、それにも関わらずStarにより再局在化される。これはStarが能動的にSpitzをERから搬出することを示す。
【０３１５】
ショウジョウバエ遺伝学は、StarとRhomboid-1は両方ともEGF受容体活性の最良のレギュレーターであり：それらは両方とも必要でありかつそれらはお互いと置換わることはできないことを示す（Guichardら,(1999) Development 126, 2663-76）。今まで、それらの機能を分離することはできなかった。本発明者らの結果は、それらの共依存性と相乗性を説明し、そしてまたStarとRhomboid-1との間の機構上の明確な区別も与える。
【０３１６】
Starは、Rhomboid-1依存性タンパク分解それ自身にとって酵素の補因子として必要でない。Spi:TGFα-ＣキメラはStarに依存せずにERを離れ、かつStarの不在のもとでRhomboid-1により切断されうる。従って、Spitzの活性化におけるStarの唯一の機能は、ERからゴルジ装置へ付添って（chaperone）、それをRhomboid-1に送達することである。
【０３１７】
最適化基質の設計
Rhomboidポリペプチドを用いるアッセイを単純化しかつ最適化するために、キメラ基質を、いずれの自然の基質よりも効率よく切断されかつショウジョウバエSpitzを切断するある範囲のrhomboid（例えば、全てのショウジョウバエrhomboid、ヒトRHBDL2、大腸菌（E. coli）、プロビデンシア菌、およびシュードモナス菌Rhomboid）に対する広い特異性を有するように設計した。
【０３１８】
TGFα-GFP-Spi-TGFα「理想的基質」構築物（本明細書ではSTと呼ぶ）を、標準技術を用いて次の（ヌクレオチド座標）から構築した：1-34はTGFαUTR、35-130（35はATGの最初のA）はTGFαシグナル／BsiWI部位までプロペプチド配列（本発明者らが配列中に操作したもので、この中にいずれかのタグもクローニングできる）次いでGFP、そして残りはSpitz 15aaおよびTMDを伴うTGFα（1045-1159）。このインサートをpcDNA3.1（＋）ベクター中にHindIII（5'）およびXbal（3'）を用いてクローニングした。
【０３１９】
ST基質は哺乳類細胞において非常に効率よく切断されかつ非常に効率的に分泌された。これは重要なことである。何故なら、複数の既知の基質は切断されうるが次いで培地中に効率よく遊離されず、そして分泌はハイスループットアッセイにとって重要な要件であることによる。ST基質はStar非依存性であって（その細胞質ドメインはヒトTGFαに由来するので）、より単純でかつより直接的なアッセイを提供し、そしてアッセイ自動化のためのタグが付いている。
【０３２０】
好都合な制限酵素切断部位（BsiWI）が、本実験に用いた構築物のＮ末端ドメインに操作されていて、その中にGFP、ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼなどのタグを標準技術により容易に導入することができる。この位置におけるタグの存在は基質切断の障害にならない。
【０３２１】
STコード配列を含んでなるベクターを、スクリーニングするRhomboidをコードするDNAの適当な量とともに哺乳類細胞（例えば、COSまたはHeLa）中に同時トランスフェクトする。次いで細胞の上清中の可溶型タグ付きＮ末端ドメインの蓄積を測定することができる。
【０３２２】
この切断断片はタグ付きであるので（例えば、GFP、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼを用いて）、その検出は容易に自動化される。また他の検出法（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ他）を利用してもよい。
【０３２３】
本アッセイを試験化合物の存在および不在のもとで実施して、その切断効率を比較する。
【０３２４】
アッセイは、いくつかのまたは全ての成分（すなわちrhomboidおよび基質）を発現する安定な細胞系統を用いて実施してもよい。
【０３２５】
本発明者らが本明細書に示したように、rhomboidは非常に高い活性を有し；その濃度を10倍以上低下させると実際にその切断能力を増加することができ（細胞に対する毒性がより低くなるので）、そして（35mmウエル中の）トランスフェクション当たり0.025ngの低いDNAが検出可能な活性を与えることが観察されている。
【０３２６】
典型的な量の入力DNA（例えば、35mmウエル当たり250ng）を使用するアッセイ方法は細胞中のRhomboidの量を大過剰に入れて、＞90％の抑制の誤ちをすら起こしかねない。適当な濃度のRhomboidは、インヒビター（またはアクチベーター）の効果を検出しうるように律速している。
【０３２７】
これはいずれの特定のアッセイに対しても日常の方法論を用いて個別に容易に決定できるが、本実験のデータは、最適化の適当な出発点は35mmウエルで用いる細胞数中にトランスフェクトするRhomboid DNAが0.25ng程度であろうことを示す。
【０３２８】
このレベルを変えうる因子としては、試験する特定のrhomboidの活性、使用するプロモーターにより駆動される、使用する細胞中の前記rhomboidの発現レベル；検出系の感度；ならびにトランスフェクション効率が挙げられる。
【０３２９】
Rhomboid の機能
Rhomboid-1は、Spitzのタンパク分解的切断に関わるゴルジ局在化タンパク質である。さらに、StarおよびRhomboid-1の存在のもとで、Spitzはゴルジ装置内に蓄積するので、Rhomboid依存性切断が、活性Spitzの産生およびそれによるEGF受容体活性化における律速段階である。
【０３３０】
StarおよびRhomboid-1は試験した全ての哺乳類細胞系列において効率的なSpitz切断を起こすのに十分であり、それらがSpitz切断に必要とされる唯一の成分であることを示す。本発明者らの分析は、Spitzプロセシングにおけるメタロプロテアーゼの関わりを排除するので、これはさらに、Rhomboid-1それ自身がプロテアーゼでありうることを示す。多くの遺伝的スクリーニングにも関わらず、遺伝的に同定されたRhomboid-1以外の候補プロテアーゼが存在しないこともこの知見と一致する。
【０３３１】
Rhomboid-1のプロテアーゼ活性の確認を、保存残基の突然変異誘発分析により示す。これは、Rhomboidが新規の膜内セリンプロテアーゼのファミリーであり、かつそれがSpitzのRhomboid-1依存性切断がセリンプロテアーゼインヒビターに感受性であるという観察により強く支持されることを実証する。試験した４種のショウジョウバエRhomboidは全て、３種のショウジョウバエEGFRリガンド：Spitz、GurkenおよびKeren（表２参照）に対して明確な切断活性を示し、それらのセリンプロテアーゼの特異性を示す。
【０３３２】
SpitzTMD（すなわち残基141-144）がTGFαにRhomboid-1感受性を与えるのに十分であり、そして切断および／または認識の実部位はこのSpitz膜のまたがるドメイン内にある。
【０３３３】
Rhomboidは多くの種において高度に保存されているので、本明細書に記載したEGFRリガンドシグナリング機構の解明は、生物学および医学の多くの分野で重要な応用を見出す。
【表１】

【０３３４】

【０３３５】
【表２】

【０３３６】
【表３】

【図面の簡単な説明】
【０３３７】
【図１】COS細胞に発現させかつ免疫蛍光を用いて局在化を確認した一連のSpitz/TGFαキメラおよびSpitz欠失体のGFPタグ付き誘導体を示す。
【図２】本特許出願に記載したStarおよびRhomboid-1の機構モデルを示す。SpitzはERに保持されていて（a）、その後、StarがSpitzのゴルジ装置への再局在化を促進する（b）。そこでSpitzはその切断を誘導するRhomboid-1と遭遇し（c）、可溶性ルーメン断片を遊離する。次いでこの断片は細胞から分泌され(d)、そしてEGF受容体を活性化することができる。
【図３】Spitz、StarおよびRhomboid-1の間の相互作用の総括を示す。Starのシャペロン機能は主にStarとSpitzのルーメンドメインを通して媒介する一方、細胞質ドメインの寄与の程度は低い（矢印により示した）。Spitzは、さもないと、細胞質ドメインを経由してERに保持される。ゴルジ装置において、Rhomboid-1のTMD領域はSpitzのSpitzTMD内切断を誘導する。
【図４】Rhomboid-1末端切断のＮおよびＣ系列を示す。Ｎ系列はＮ末端にトリプルHAをタグ付けし、線上方の矢印によりマークしたように末端切断した；Ｃ系列はＣ末端にトリプルHAをタグ付けし、線下方の矢印によりマークしたように末端切断した。正確な座標は表３に示す。
【図５】ショウジョウバエrhomboid-1に最も密接な３種のヒトRhomboid同族体：RHBDL-1（RHBDLとしても知られる）、RHBDL-2およびRHBDL-3のアラインメントを示す。特にRHBDL-3のアミノ酸配列を示す。
RHBDL3のcDNA配列と予測配列の間の境界を示した。活性セリンを囲む保存セリンプロテアーゼモチーフ（GASGG）を配列の上方に示した。；本発明者らが同定したその他の触媒残基を矢印で示した。同一の残基に黒色の影を付けた；保存配列に灰色の影を付けた。このアラインメントはGCGプログラム「パイルアップ（pileup）」を用いて作製した。
【図６】どれがRhomboid-1により切断される能力を保持するかを示すSpitz/TGFαキメラの模式図である。TMD内の番号付き座標は、対応TGFα残基により置換えられたSpitzのTMD残基を示す。Rhomboid-1切断の認識ドメインはTMDのルーメンの４分の１、すなわち残基140-145にマッピングする。
【図７】RHBL3の核酸コード配列を示す。該配列はGenemarkにより予想した（そして配列の下線により示した部分EST［受託番号BE778475］により支持される）。
未翻訳領域は示してない；配列は第１メチオニンをコードすると予想されるATGコドンで開始する。矢印はイントロンの位置を表す。交互する大文字／小文字は隣接エキソンを区別するために使った。このORFは、ヒト染色体17上のゲノム配列の55152ヌクレオチドにまたがる（コンティグ受託番号NT_010799から）。
【図８】RHBDL3のアミノ酸配列を示す。
【図９】SpitzTMD内の残基突然変異の切断効率に与える影響を示す。
【図１０−１】ゼブラフィッシュRHBDL2のヌクレオチド配列を示す。
【図１０−２】ゼブラフィッシュRHBDL2のヌクレオチド配列を示す（図１０−１の続き）。
【図１１】ゼブラフィッシュRHBDL2のアミノ酸配列配列を示す。

Claims (44)

1. Rhomboidポリペプチドのモジュレーターを同定するアッセイ方法であって、
   (a) 試験化合物の存在のもとでRhomboidポリペプチドとポリペプチド基質を接触させること；および
   (b) ポリペプチド基質のタンパク分解的切断を確認すること
   を含んでなる前記方法。
2. Rhomboidポリペプチドが表１に示した配列を有する、請求項１に記載のアッセイ方法。
3. RhomboidポリペプチドがショウジョウバエRhomboid 1、ショウジョウバエRhomboid 2、ショウジョウバエRhomboid 3、ショウジョウバエRhomboid 4、ヒトRHBDL-1、ヒトRHBDL-2およびヒトRHBDL-3、大腸菌（E. coli）glgG、枯草菌（B. subtilis）ypqP、Ｐ・スツアルティイ菌（P. stuartii）A55862遺伝子産物、緑膿菌（P. aeruginosa）B83259遺伝子産物、酵母Ｓ・セレビジエ（S. cervisiae）YGR101wおよび酵母Ｓ・セレビジエ（S. cervisiae）YPL246cからなる群から選択される、請求項２に記載のアッセイ方法。
4. RhomboidポリペプチドがER（小胞体）保持シグナルを含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアッセイ方法。
5. ポリペプチド基質がEGFRリガンドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアッセイ方法。
6. ポリペプチド基質が表２に示した配列を有する、請求項５に記載のアッセイ方法。
7. ポリペプチド基質が検出可能な標識を含んでなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアッセイ方法。
8. 前記試験化合物をRhomboidプロテアーゼ活性のモジュレーターとして同定することを含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアッセイ方法。
9. 微生物病原体の感染性を抑制する前記試験化合物の能力を決定することをさらに含んでなる、請求項８に記載のアッセイ方法。
10. 前記試験化合物を単離することを含んでなる、請求項８または請求項９に記載のアッセイ方法。
11. 前記試験化合物を製薬上許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体とともに医薬組成物に製剤することを含んでなる、請求項１０に記載のアッセイ方法。
12. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法により得られる、Rhomboidプロテアーゼ活性のモジュレーター。
13. Rhomboidポリペプチドのペプチド断片を含んでなる、請求項１２に記載のモジュレーター。
14. Rhomboidポリペプチドによりタンパク分解的に切断されるEGFRリガンドポリペプチドであって、第１EGFRリガンドの膜貫通ドメインならびに第２EGFRリガンドの細胞内および細胞外ドメインを含んでなる前記EGFRリガンドポリペプチド。
15. 第１ポリペプチドがSpitzでありかつ第２ポリペプチドがTGFαである、請求項１４に記載のEGFRリガンドポリペプチド。
16. 細胞外ドメインがさらに検出可能な標識を含んでなる、請求項１４または請求項１５に記載のEGFRリガンドポリペプチド。
17. 図８、図１０に示したアミノ酸配列を含んでなるRhomboidポリペプチドまたはそれらの断片をコードする、単離された核酸。
18. 図７、図１１に示した核酸配列またはその断片を含んでなる、請求項１７に記載の単離された核酸。
19. 図７に示したヒトRHBDL3または図１０に示したゼブラフィッシュRHBDLの核酸配列と約55％より大きい配列同一性を有する、単離された核酸。
20. 図７または図１０に示した核酸配列とストリンジェントな条件のもとでハイブリダイズする、単離された核酸。
21. 請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の核酸配列によりコードされた、単離されたRhomboidポリペプチド。
22. 図８に示したヒトRHBDL3または図１１に示したゼブラフィッシュRHBDL2のアミノ酸配列と約70％より大きい配列同一性を有する、単離されたRhomboidポリペプチド。
23. ポリペプチド基質をタンパク分解的に切断する、325個以下のアミノ酸を含んでなるRhomboidポリペプチド断片。
24. ポリペプチド基質が表２に示したEGFRリガンドである、請求項２３に記載のRhomboidポリペプチド断片。
25. ショウジョウバエRhomboid-1配列のアミノ酸残基R152、G215、S217およびH281を含んでなる、請求項２３または請求項２４に記載のRhomboidポリペプチド断片。
26. RhomboidポリペプチドがショウジョウバエRhomboid 1、ショウジョウバエRhomboid 2、ショウジョウバエRhomboid 3、ショウジョウバエRhomboid 4、ヒトRHBDL-1、ヒトRHBDL-2およびヒトRHBDL-3、大腸菌（E. coli）glgG、枯草菌（B. subtilis）ypqP、Ｐ・スツアルティイ菌（P. stuartii）A55862遺伝子産物、緑膿菌（P. aeruginosa）B83259遺伝子産物、酵母Ｓ・セレビジエ（S. cervisiae）YGR101wおよび酵母Ｓ・セレビジエ（S. cervisiae）YPL246cからなる群から選択される、請求項２５に記載のRhomboidポリペプチド断片。
27. ポリペプチド基質をタンパク分解的に切断するRhomboidポリペプチドであって、異種小胞体保持シグナルを含んでなる前記Rhomboidポリペプチド。
28. 小胞体保持シグナルがKDELである、請求項２７に記載のRhomboidポリペプチド。
29. ポリペプチド基質が表２に示したEGFRリガンドである、請求項２７または請求項２８に記載のRhomboidポリペプチド。
30. ショウジョウバエRhomboid-1配列のアミノ酸残基R152、G215、S217およびH281を含んでなる、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のRhomboidポリペプチド。
31. RhomboidポリペプチドがショウジョウバエRhomboid 1、ショウジョウバエRhomboid 2、ショウジョウバエRhomboid 3、ショウジョウバエRhomboid 4、ヒトRHBDL-1、ヒトRHBDL-2およびヒトRHBDL-3、大腸菌（E. coli）glgG、枯草菌（B. subtilis）ypqP、Ｐ・スツアルティイ菌（P. stuartii）A55862遺伝子産物、緑膿菌（P. aeruginosa）B83259遺伝子産物、酵母Ｓ・セレビジエ（S. cervisiae）YGR101wおよび酵母Ｓ・セレビジエ（S. cervisiae）YPL246cからなる群から選択される、請求項３０に記載のRhomboidポリペプチド。
32. 請求項２３〜２６のいずれか１項に記載のRhomboidポリペプチド断片または請求項２７〜３１のいずれか１項に記載のRhomboidポリペプチドをコードする、単離された核酸。
33. 請求項１７〜２０および請求項３２のいずれか１項に記載の核酸を含んでなる組換えベクター。
34. 請求項３３に記載の組換えベクターを含んでなる宿主細胞。
35. Rhomboidポリペプチドを産生する方法であって：
    (a) 適当な発現系においてRhomboidポリペプチドをコードする核酸から発現させてポリペプチドを組換えにより産生すること；
    (b) 組換えにより産生したポリペプチドのRhomboidプロテアーゼ活性を試験すること
    を含んでなる前記方法。
36. Rhomboidポリペプチドの基質を得る方法であって、
    (a) 試験ポリペプチドを提供すること、
    (b) Rhomboidポリペプチドが通常、基質のタンパク質分解切断を触媒する条件のもとでRhomboidポリペプチドと試験ポリペプチドを接触させること；および
    (c) 試験ポリペプチドの切断を確認すること
    を含んでなる前記方法。
37. 試験ポリペプチドがアミノ酸配列IASGAを含んでなる請求項３６に記載の方法。
38. 試験ポリペプチドがアミノ酸配列ASIASGAを含んでなる請求項３７に記載の方法。
39. ポリペプチドの膜貫通ドメインをタンパク分解的に切断する方法であって、前記ポリペプチドをRhomboidポリペプチドと接触させることを含んでなる前記方法。
40. ポリペプチド基質の膜貫通ドメインをタンパク分解的に切断するためのRhomboidポリペプチドの使用。
41. 請求項２１もしくは請求項２２に記載のポリペプチド、請求項２３〜２６に記載のポリペプチド断片、または請求項１２に記載のモジュレーターおよび製薬上許容される賦形剤、ビヒクルもしくは担体を含んでなる、医薬組成物。
42. 異常なErbBまたはEGF受容体活性または病原体感染に関連する症状を治療するための組成物の製造における、請求項２１もしくは請求項２２に記載のポリペプチド、請求項２３〜２６に記載のポリペプチド断片、または請求項１２に記載のモジュレーターの使用。
43. 請求項４１に記載の組成物を異常なErbBもしくはEGF受容体活性または病原体感染に関連する症状を治療するために患者に投与することを含んでなる方法。
44. 異常なErbBまたはEGF受容体活性または病原体感染に関連する症状が癌、冠状動脈アテローム性硬化症、乾癬、創傷治癒、幼児性未熟または末梢神経傷害／神経障害である、請求項４３に記載の方法。

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