CN107456477A

CN107456477A - 大豆种子萃取物、制造方法及其用途

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Publication number: CN107456477A
Application number: CN201610395805.XA
Authority: CN
Inventors: 朱益宏
Original assignee: Many Liters Of Biochemical Technology Ltd By Share Ltd
Current assignee: Many Liters Of Biochemical Technology Ltd By Share Ltd; Charsire Biotechnology Corp
Priority date: 2016-06-06
Filing date: 2016-06-06
Publication date: 2017-12-12

Abstract

本发明涉及大豆种子萃取物、制造方法及其用途。所述用途为大豆种子萃取物用于促进伤口愈合、促进神经细胞增殖和/或治疗脑部疾病和/或神经变性疾病、治疗乳癌、降低干扰DNA和/或RNA复制药物的副作用及加强干扰DNA和/或RNA复制药物疗效的用途。

Description

大豆种子萃取物、制造方法及其用途

技术领域

本发明涉及大豆种子萃取物、制造方法及大豆种子萃取物用于促进伤口愈合、促进神经细胞增殖和/或治疗脑部疾病和/或神经变性疾病、治疗乳癌、降低干扰DNA和/或RNA复制药剂的副作用及加强干扰DNA和/或RNA复制药物疗效的用途。

背景技术

大豆包含黄豆及黑豆，其为世界上最重要的油及蛋白质来源之一。举例而言，大豆可加工成可食用的油，其可用作色拉油或用于制造人造奶油及酥油。大豆油亦用于制造涂料、油毡、油布、油墨、肥皂、杀虫剂及消毒剂。此外，自油料工业的副产品中获得的卵磷脂可用作食品、化妆品、药物、皮革、涂料、塑料、肥皂及清洁剂中的湿润剂及稳定剂。大豆粉是富含蛋白质的家畜用饲料。另外，大豆蛋白可用于制造合成纤维、黏合剂、织物上浆、防水、灭火泡沫等。

在医学使用上，已报导大豆对许多疾病有作用。

大豆可用作调节肠、心脏、肾、肝及胃的功能的营养性添加物。由于大豆油含有大量不饱和脂肪酸，故其可用于对抗高胆固醇血症。从大豆获得的医用卵磷脂可作为抗脂肪肝剂。另外，人们已知可从大豆制备抗硬化因子σ-类固醇及作为某些抗高血压药中薯蓣皂苷元的替代物的谷固醇。从大豆中发现的异黄酮及植物-雌激素已表明对包含乳癌、前列腺癌及结肠癌在内的各种癌症具有预防作用(Adlercreutz,H.；Phyto-oestrogens andcancer.The Lancet Oncology，2002，Vol.3，p.364-373)；其他文献表示异黄酮欲达到预防乳癌发生的效果，服用剂量须每日至少100mg持续一个月，其表示需高剂量异黄酮持续服用才有抗癌的作用(Lu LJ,Anderson KE,Grady JJ,Nagamani M.；Effects of soyaconsumption for one month on steroid hormones in premenopausal women:implications for breastcancer risk reduction.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.1996Jan；5(1):6370)。人们还发现，食用经添加植物固醇的人造奶油可降低中老年高胆固醇血症个体中的总血浆胆固醇及LDL-胆固醇的浓度(Matvienko,O.A.,Lewis,D.S.,Swanson,M.,Aendt,B.,Rainwater,D.L.,Stewart,J.,及Alekel,D.L.；A Single daily dose of soybean phytosterols in ground beef decreasesserum total cholesterol and LDL cholesterol in young,mildly hypercholesterolemic men.Am J ClinNutr.,2002,76,p.57-64)。

某些大豆萃取物还经报导具有医药作用。取自棕色大豆变种(Akita-Zairai)种皮的70％含水丙酮萃取物具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)游离基清除活性(Takahata.Y.,O.-Kameyama,M.,Furuta,S.,Takahashi,and M.,Suda,I.；Highly polymerizedprocyanidins in brown soybean seed coat with a high radical-scavenging activity.J.Agric.FoodChem.,2001,49,p.5843-5847)。另外，取自胚芽萃取物、大豆、米糠、tear草、芝麻、小麦、香橼、绿茶、绿叶萃取物及发芽的稻谷的萃取物，在低于60℃下经电烘炉缓慢烘烤并使用米曲霉发酵3天以上，以将每一组分转化为低分子量物质后可具有抗氧化作用(Minamiyama,Y.,Yoshikawa,T.,Tanigawa,T.,Takahashi,S.,Naito,Y.,Ichikawa,H.及Kondo,M.；Antioxidative effects of a processed grain food.J.Nutr.Sci.Vitaminol.,1994,40,p.467-477)。通过测量大鼠中血清谷胺酸-草酸-转胺酶(sGOT)及血清谷胺酸-丙酮酸-转胺酶(sGPT)的活性，黑豆的水萃取物还显示对由乙酰胺基酚引发的肝病有作用(Wu,S.-J.,Wang,J.-S.及Chang C.-H.；Evaluation of hepatoprotective activity of legumes.Phytomedicine,2001,Vol.8(3),p.213-219)。

另一方面，某些特定的大豆萃取物可用于治疗某些皮肤病的化妆品或药物。含有规定比率的鞘磷脂及磷脂的大豆萃取物经揭示可用于治疗干性皮肤的化妆品中(美国专利公开案第US2002/0009509 A1号)。该萃取物可通过单独使用脂族醇或其与水的混合物萃取成熟的完整大豆或无油大豆粉产生，且随后使用脂族烃及脂族酮处理。故，该萃取物是脂溶性的。

再者，含有一或多种植物萃取物(其为选自乳清、及黄柏萃取物，及进一步选自黄芩、西门肺草及大豆(Glycine max(L.)Merrill)的一种或多种萃取物)的化妆品组合物、粉刺药、或黑头粉刺生成抑制剂对预防或治疗皮肤病(例如粉刺或由粉刺引起的发炎皲裂皮肤)有效(日本专利第2001097842号)。

使用微生物发酵大豆的产物还可用作抗活性氧作用组合物、试剂、食品、化妆品及药品(例如日本专利第4139132号)。

大豆的许多用途虽已经报导，但大豆的萃取物的不同应用仍待开发。

发明内容

本发明涉及大豆种子萃取物、制造方法及大豆种子萃取物用于促进伤口愈合、促进神经细胞增殖和/或治疗脑部疾病和/或神经变性疾病、治疗乳癌、降低干扰DNA和/或RNA复制药物的副作用及加强干扰DNA和/或RNA复制药物疗效的用途。

本发明提供一种萃取组合物，其包含大豆种子萃取物，该大豆种子萃取物为由包含下述步骤的方法制备：

(a)提供大豆种子与萃取溶液，其中该萃取溶液为水或包含浓度低于约90wt％的醇；

(b)在大气压力低于约1atm且温度低于约60℃以该萃取溶液萃取该大豆种子，以获得粗萃物；及

(c)去除步骤(b)该粗萃物中的固体，以获得液体部分。

本发明另提供一种制备如前述萃取组合物的方法，其包含制备该大豆种子萃取物的方法，且该制备该大豆种子萃取物的方法包含下述步骤：

(a)提供大豆种子与萃取溶液，其中该萃取溶液为水或包含有浓度低于约90wt％的醇；

(c)去除步骤(b)该粗萃物中的固体，以获得液体部分。

本发明还提供一种如前述萃取组合物的用途，其为用于制备促进伤口愈合的药物。

本发明还提供一种如前述萃取组合物的用途，其为用于制备促进神经细胞增殖和/或治疗脑部疾病和/或神经变性疾病的药物。

本发明还提供一种如前述萃取组合物的用途，其为用于制备治疗乳癌的药物。

本发明还提供一种如前述萃取组合物的用途，其为用于制备降低干扰DNA和/或RNA复制药物的副作用和/或加强干扰DNA和/或RNA复制药物疗效的药物。

附图说明

图1至3显示根据本发明的大豆种子萃取物(GMA1)的离子层析分析图谱(ICS)。

图4至6显示根据本发明的大豆种子蒸气分馏物(GMC1)的离子层析分析图谱(ICS)。

图7显示异黄酮标准品的HPLC分析图谱。

图8显示大豆种子蒸气分馏物(GMC1)的HPLC分析图谱。

图9显示0.3重量份大豆种子萃取物(GMA1)与1重量份大豆种子蒸气分馏物(GMC1)的萃取组合物的HPLC分析图谱。

图10显示GMA1及GMC1于糖尿病伤口愈合的效果。为检视GMC1及GMA1是否对增进伤口愈合具有疗效，使用STZ诱导的糖尿病大鼠模式，并同时比较乳膏赋形剂及CGS-21680治疗组。结果显示0.3％GMA1及GMC1与乳膏赋形剂相比皆对伤口愈合有效，0.3％GMA1治疗组比GMC1组具有稍佳的伤口愈合效果。

图11显示不同剂量GMA1及GMC1于糖尿病伤口愈合的效果。研究糖尿病伤口愈合的GMA1及GMC1最佳组合。如图所示，将GMC1分别以不同浓度的GMA1组合：0.009％、0.045％及0.09％。为比较，乳膏赋形剂及CGS-21680治疗组亦进行。结果显示，GMC1及0.009％、0.045％及0.09％不同浓度的GMA1组合治疗的伤口愈合效果比单独使用GMC1的效果为佳，最有效的组合为GMA1的最高剂量(0.09％)。

图12显示大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物合并用药对HaCaT细胞迁移的作用。

图13显示以GMA1处理的IMR-32细胞存活率。数据为7组的平均±标准偏差。以25mg/ml GMA1及阳性控制组处理的IMR-32细胞存活率具有非常显著及显著的增加(GMA1p＝0.0008，阳性控制组p＝0.0246)。结果显示GMA1可增进细胞生长(***p<0.001)。

图14显示以GMC1处理的IMR-32细胞存活率。数据为7组的平均±标准偏差。以25mg/ml GMC1及阳性控制组处理的IMR-32细胞存活率具有显著的增加(GMC1p＝0.0255，阳性控制组p＝0.0246)。结果显示GMC1可增进细胞生长(*p<0.05)。

图15显示显示以GMA1与GMC1(GM)处理的IMR-32细胞存活率。数据为7组的平均±标准偏差。以25mg/ml GM及阳性控制组处理的IMR-32细胞存活率具有显著的增加(GMp＝0.0059，阳性控制组p＝0.0246)。结果显示GM可增进细胞生长(**p<0.01)。

图16显示旋臂迷宫的示意图。

图17显示失智大鼠的旋臂迷宫轨迹图，第4日大鼠迷宫轨迹图显示失智诱发+包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物(AlCl₃+N2)组经治疗后可依记忆快速寻找出食物位置，而失智诱发(AlCl₃)及失智诱发+乳膏赋形剂(AlCl₃+乳膏赋形剂)组则不能。

图18显示失智大鼠经旋臂迷宫检测的总体记忆失误(TME)分析图，其显示失智诱发(AlCl₃)组TME值与失智诱发+乳膏赋形剂(AlCl₃+乳膏赋形剂)组并无显著差异(p>0.05)，而经包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物治疗(AlCl₃+N2)第4日之后，TME值皆显著小于AlCl₃组(AlCl₃+N2p＝0.0128)，代表包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物具有治疗失智大鼠的疗效。数据以平均值±标准偏差表示，并以未配对Student’s t-检验进行统计分析。当AlCl₃组和AlCl₃+N2组相比较，p<0.05以*标示；p<0.001以**标示，代表具有统计学的显著差异。

图19显示失智大鼠经旋臂迷宫检测的参考(长期)记忆失误(RME)次数分析图，其显示失智诱发(AlCl₃)组RME值与失智诱发+乳膏赋形剂(AlCl₃+乳膏赋形剂)组并无显著差异(p>0.05)，而经包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物(AlCl₃+N2)治疗后于检测第4日的RME值显著小于AlCl₃组(p＝0.0046)，代表包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物具有恢复大鼠长期记忆力的疗效。数据以平均值±标准偏差表示，并以未配对Student’s t-检验进行统计分析。p<0.05以*标示；p<0.001以**标示，代表具有统计学的显著差异。

图20显示以乳膏赋形剂(M)、GMC1(M1)及GMC1+0.5％GMA1(M3)治疗血管性失智大鼠经旋臂迷宫检测的总体记忆失误(TME)次数分析图，其显示双侧颈总动脉结扎(2VO)组TME值与假手术(sham)组相比显著较高(第8天，p＝0.0013)，显示双侧颈总动脉结扎成功诱发血管性失智。而经M1及M3治疗后，与2VO组相比TME值显著改善(第8天，M1p＝0.0019；M3p＝0.0355)，代表M1及M3具有治疗大鼠血管性失智的疗效。数据以平均值±标准偏差表示，并以未配对Student’s t-检验进行统计分析。p<0.05以*标示；p<0.001以**标示，代表具有统计学的显著差异。

图21显示以乳膏赋形剂(M)、GMC1(M1)及GMC1+0.5％GMA1(M3)治疗血管性失智大鼠经旋臂迷宫检测的参考(长期)记忆失误(RME)次数分析图，其显示双侧颈总动脉结扎(2VO)组TME值与假手术sham组相比显著较高(第8天，p＝0.0016)，显示双侧颈总动脉结扎成功诱发血管性失智。而经M1及M3治疗后，与2VO组相比RME值显著改善(第8天，M1p＝0.0029；M3p＝0.0171)，代表M1及M3具有治疗大鼠血管性失智RME的疗效。数据以平均值±标准偏差及ANOVA表示，并以未配对Student’s t-检验进行统计分析。p<0.05以*标示；p<0.001以**标示，代表具有统计学的显著差异。

图22显示以乳膏赋形剂(M)、GMC1(M1)及GMC1+0.5％GMA1(M3)治疗血管性失智大鼠经旋臂迷宫检测的工作记忆失误(WME)次数分析图，其显示双侧颈总动脉结扎(2VO)组TME值与假手术sham组相比显著较高(第8天，p＝0.0111)，显示双侧颈总动脉结扎成功诱发血管性失智。而经M1及M3治疗后，与2VO组相比WME值显著改善(第8天，M1p＝0.0111；第6天，M3p＝0.0139)，代表M1及M3具有治疗大鼠血管性失智WME的疗效。数据以平均值±标准偏差表示，并以未配对Student’s t-检验进行统计分析。p<0.05以*标示；p<0.001以**标示，代表具有统计学的显著差异。

图23显示血管性失智大鼠的旋臂迷宫轨迹图，第8日大鼠迷宫轨迹图显示假手术(sham)、GMC1(M1)及GMC1+0.5％GMA1(M3)组经治疗后可依记忆快速寻找出食物位置，而乳膏赋形剂(M)AlCl₃及2VO组则不能。

图24显示计算机断层扫描血管性失智大鼠脑损伤程度分析，脑损伤的程度分为0至4级，其结果显示双侧颈总动脉结扎(2VO组)的严重脑损伤(p＝0.0000)经由GMC1(M1)及GMC1+0.5％GMA1(M3)治疗后显著降低(M1p＝0.0030；M3p＝0.0238)，数据以平均值±标准偏差表示，并以未配对Student’s t-检验进行统计分析。p<0.05以*标示；p<0.001以**标示，代表具有统计学的显著差异。

脑损伤的计算机断层分级：

0：于计算机断层扫描无显著异常

1：脑组织有小区域的不正常密度区

2：单侧脑组织的不正常密度区占超过25％，或于双侧脑组织有小区域的不正常密度区

3：单侧脑组织的不正常密度区占超过50％，中线位移或于双侧脑组织不正常密度区占超过25％

4：双侧脑组织的不正常密度区占超过50％或明显中线位移/扭曲

图25为裸鼠诱发肿瘤并待生长到一定体积后，裸鼠进行分组并给予背部皮肤和肿瘤生长区域皮肤0.1g/天萃取组合物进行治疗，观察测量裸鼠肿瘤大小的生长速度。由图中结果显示，与肿瘤诱发控制组相较之下，给予萃取组合物可以延缓肿瘤生长速度。

图26为裸鼠诱发肿瘤并待生长到一定体积后，裸鼠进行分组并给予背部皮肤和肿瘤生长区域皮肤0.1g/天GMC1及GMA1进行治疗，观察测量裸鼠肿瘤大小的生长速度。由图中结果显示，与肿瘤诱发控制组相较之下，给予萃取组合物可以延缓肿瘤生长速度。

图27为裸鼠诱发肿瘤并待生长到一定体积后，裸鼠进行分组并给予CTX药物注射以及背部皮肤和肿瘤生长区域皮肤0.1g/日萃取组合物进行治疗，观察测量裸鼠肿瘤大小的生长速度。由图中结果显示，与CTX控制组相较之下，给予萃取组合物可以进一步延缓肿瘤生长速度。

具体实施方式

(c)去除步骤(b)该粗萃物中的固体，以获得液体部分。

参考以下对本发明的各态样、实例、及伴随相关描述的化学图式及表格的详细描述，可更容易地了解本发明。在揭示及描述本发明的萃取物、组合物和/或方法之前，应了解，除非由申请专利范围另外特别地指出，否则本发明不受限于特定制备方法、载剂或调配物、或将本发明萃取物调配成用于局部、经口或非经肠施用的产物或组合物的特定模式，此为由于本领域技术人员非常清楚此等事情是可以加以变化的。亦应了解，本文所用的术语仅用于描述特定态样的目的而不意欲用于限制性本发明的范围。

除非另外指出，否则如本发明所用的以下术语应解释为具有以下含义。

范围在本文中通常表述为“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表述此类范围时，态样为包括一个特定值和/或至另一个特定值的范围。类似地，当值通过使用字“约”表述为近似值时，应了解特定值可形成另一态样。另外应了解，每一范围的各端点皆有显著性，一端点与另一端点既有相关性，亦彼此独立。

“视情况”或“视情况地”是指随后所述的事件或状况可能发生或可能不发生，且该描述包括该事件或状况发生的情况及其未发生的情况。举例而言，“视情况包含药剂”是指该药剂可能存在或可能不存在。

必须指出，除非上下文另外清楚规定，否则如本说明书及随附权利要求中所用的单数形式“一”及“该”包括多个所指标的物。因此，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。

如本文所用的术语“个体”表示任何动物，优选为哺乳动物，且更优选为人类。个体的实例包括人类、非人类灵长类动物、啮齿动物、天竺鼠、兔、绵羊、猪、山羊、母牛、马、狗及猫。

术语如本文所提供的化合物的“有效量”是指该萃取物的量足以提供对所需功能的所需调节。如下文所指出，确实的需要量将在个体之间有变化，此视个体的疾病病况、身体状况、年龄、性别、物种及体重、组合物的特性及配方等而定。给药方案可经调整以诱导最佳治疗反应。举例而言，可每日施用若干分次剂量，或可依治疗情形的紧急程度按比例减少剂量。因此，很难指定确实的“有效量”。然而，本领域技术人员使用常规实验即可确定适当的有效量。

如本文所用的术语“治疗”表示逆转、减轻或改善此术语所适用的病症或病状、或该病症或病状的一或多种症状，或抑制其进展。

如本文所用的术语“载剂”或“赋形剂”是指自身并不为治疗剂，而是用作用于将治疗剂传递至个体的载剂和/或稀释剂和/或佐剂或媒剂，或添加至调配物中以改善调配物的处理或储存性质或允许或有助于组合物的剂量单位形成适于施用的剂量单位的任何物质。适合的载剂或赋形剂为本领域技术人员所熟知。载剂或赋形剂可包括(举例而言但不限于)缓冲剂、稀释剂、崩解剂、黏合剂、黏着剂、湿润剂、聚合物、润滑剂、滑动剂、为遮蔽或抵消不良味道或气味而添加的物质、调味剂、染料、芳香剂及为改善组合物的外观而添加的物质。可接受的载剂或赋形剂包括柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸及硫酸之钠盐及钙盐、碳酸镁、滑石、明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、果胶、糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、淀粉、明胶、纤维素物质(例如烷酸的纤维素酯及纤维素烷基酯)、低熔点蜡、可可脂、胺基酸、尿素、醇类、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如血清白蛋白)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲亚砜(DMSO)、氯化钠或其他盐、脂质体、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油或粉末、聚合物(例如聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇及聚乙二醇)、及其他医药学上可接受的物质。载剂不应破坏治疗剂的药理学活性，且在以足以传递治疗量的药物的剂量施用时应无毒性。

根据本发明的萃取组合物为包含大豆种子萃取物。根据本发明的大豆因种皮颜色的不同，可称为黄豆、毛豆、白豆、青皮豆、乌豆、青豆、黑豆；较优选为黄豆或黑豆。根据本发明的大豆系属于豆科(Fabaceae)大豆属(Glycine)，优选地，该大豆为Glycine max(L.)Merrill、Glycine formosana Hosokawa或Glycine soja auct.non Sieb.&Zucc.。

根据本发明的大豆种子优选为指去除荚果外壳的种子。一般而言，大豆的果实为有毛的荚果，由荚果外壳包覆种子，荚果外壳非常坚硬并且防水，可以保护其内的种子。自大豆果实中获得大豆种子，亦即去除荚果外壳的方式为本领域技术人员所熟知。优选地，根据本发明的大豆种子包含种皮、子叶及胚轴。

根据本发明的大豆种子萃取物为由包含下述步骤的方法制备：

(c)去除步骤(b)该粗萃物中的固体，以获得液体部分。

根据本发明用以萃取大豆种子的该萃取溶液为水或包含浓度低于约90wt％的醇。优选地，该醇为具有1至7碳数的醇。本文中所言之“具有1至7碳数的醇”是指直链或支链、具取代或不具取代、单元或多元、饱和或不饱和的醇，优选为不具取代、单元及饱和醇。另一方面，该具有1至7碳数的醇优选为1至4碳数的醇。在本发明的一个具体实施方案中，该具有1至7碳数的醇为甲醇、乙醇、正丙醇(n-propanol)、异丙醇(isopropanol)、正丁醇、异丁醇(iso-butanol)、仲丁醇(sec-butanol)、叔丁醇(tert-butanol)、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-己醇、2,4-己二烯-1-醇、2-甲基-环戊醇、环己醇、1-庚醇、2-庚醇或环庚醇；更优选地，该醇为甲醇或乙醇；最优选地，该醇为乙醇。该醇可单独使用或混合多种使用。

本文中所言的醇优选为水溶液，其浓度为低于约90wt％的醇溶液；优选为约5wt％至约90wt％的醇溶液；更优选为约30wt％至约85wt％的醇溶液；最优选为约50wt％至约75wt％的醇溶液。

根据本发明的方法，其包含(b)在大气压力低于约1atm且温度低于约60℃以该萃取溶液萃取该大豆种子，以获得粗萃物。以溶液萃取种子部位的方式为本发明所属技术领域中通常用来自植物种子获得粗萃物的任何方法。举例而言，该粗萃物可通过任何方法，例如研磨、搅拌、扰动、切割或切碎方法将种子分成碎块并将其浸没在该萃取溶液中来获得，本发明所属技术领域中通常用来分割种子的任何方式均可用于实施本发明。在本发明的一个具体实施方案中，该大豆种子为搅碎为粉末。在本发明的一个具体实施方案中，该大豆种子为浸于该萃取溶液中以供萃取，更优选地，该大豆种子为浸于该萃取溶液中，并经超音波震荡以供萃取。

另一方面，根据本发明的制备方法，在步骤(b)前该大豆种子优选为经干燥。

根据本发明，大豆种子与萃取溶液的比例并无限制，在本发明的具体实施方案中，大豆种子与萃取溶液的比例为约1：1至约1：30；优选地，约1：5至约1：20；更优选地；约1：10。

根据本发明的步骤(b)中萃取温度为低于约60℃，优选为约25℃至约55℃；更优选为约30℃至约50℃；最优选为约45℃。

在本发明的一个具体实施方案中，该萃取步骤(b)可重复实施，并收集合并该萃取物。

根据本发明的方法包含(c)去除步骤(b)该粗萃物中的固体，以获得液体部分。去除固体部份以获得该液体部分的方法为本领域技术人员所熟知，例如但不限于使用过滤、离心、沉淀等方式。

优选地，根据本发明的方法进一步包含步骤(d)浓缩步骤(c)中所获得的液体部分，以获得浓缩固体部分。浓缩的方法为本领域技术人员所熟知，例如使用减压浓缩机进行。

优选地，根据本发明的方法进一步另包含步骤(e)烘干步骤(d)所得的浓缩固体部分。烘干的方法为本领域技术人员所熟知，例如使用自然风干或冷冻干燥机进行。

在本发明的一个具体实施方案中，该大豆种子萃取物为使用分析管柱CarboPac PA1Analytical(4x250mm)进行离子层析分析，其条件为移动相为87％水与13％的500mMNaOH，并以麦芽糖单水合物(maltose monohydrate)作为内部标准品进行等位冲提(isocraticelution)，流速为1.0ml/min，以0.5秒为一周期，每一周期中于0.00秒至0.2秒以相对电位0.1伏特进行、于0.2秒至0.4秒以0.1伏特进行、0.41秒至0.42秒以相对电位-2.0伏特进行、0.43秒以相对电位0.6伏特进行、0.44秒至0.5秒以相对电位-0.1进行，总分析时间为55分钟。

所得的图谱示于图1至图3。各图中波峰的出峰时间如下表1所示：

表1：

优选地，根据本发明的萃取组合物，视情况地进一步包含大豆种子蒸气分馏物，该大豆种子蒸气分馏物为由包含下述步骤的方法制备：

(i)提供大豆种子与第二萃取溶液，其中该第二萃取溶液为水或包含浓度低于约15wt％的醇；及

(ii)在大气压力低于约1atm且温度低于约110℃下以该第二萃取溶液萃取该大豆种子，并收集该蒸气分馏物。

根据本发明用以制备大豆种子蒸气分馏物的该第二萃取溶液为水或包含浓度低于约15wt％的醇，优选为水。该醇的种类可与制备大豆种子萃取物的萃取溶液的种类相同，不再于此赘述。

本文中所言的第二萃取溶液中醇为低于约15wt％的醇溶液；优选为低于约10wt％的醇溶液；更优选为低于约5wt％的醇溶液。

根据本发明的制备大豆种子蒸气分馏物方法，其包含(ii)在大气压力低于约1atm且温度低于约110℃下以该第二萃取溶液萃取该大豆种子，并收集该蒸气分馏物。该萃取可与制备大豆种子萃取物的萃取方法相同，惟该大豆种子蒸气分馏物为在大气压力低于约1atm且温度低于约110℃下受到蒸发。该蒸气分馏物可通过冷却该蒸气以液体形式收集。

在本发明的一个具体实施方案中，在给定大气压力及温度下蒸发该大豆种子且通过冷却蒸气收集该蒸气分馏物的方法可在旋转蒸发器中实施，其中蒸气被蒸发至供有冷水之冷凝管中，并随后使该蒸气通过该冷凝管冷却且以液体形式收集该蒸气分馏物。该作业简单且成本低廉。

根据本发明，大豆种子与第二萃取溶液的比例并无限制，在本发明的优选具体实施方案中，大豆种子与萃取溶液的比例可为约1：1至约1：30；优选地，约1：5至约1：20；更优选地，约1：10。

根据本发明的步骤(ii)中萃取温度为低于约110℃，优选介于约60℃至约110℃。

在本发明的一个具体实施方案中，该萃取步骤(ii)可重复实施，并收集合并该大豆种子蒸气分馏物。

在本发明的一个具体实施方案中，该大豆种子蒸气分馏物为使用分析管柱CarboPacPA1Analytical(4x 250mm)进行离子层析分析，其条件为移动相为87％水与13％的500mMNaOH，并以麦芽糖单水合物(maltose monohydrate)作为内部标准品进行等位冲提(isocraticelution)，流速为1.0ml/min，以0.5秒为一周期，每一周期中于0.00秒至0.2秒以相对电位0.1伏特进行、于0.2秒至0.4秒以0.1伏特进行、0.41秒至0.42秒以相对电位-2.0伏特进行、0.43秒以相对电位0.6伏特进行、0.44秒至0.5秒以相对电位-0.1进行，总分析时间为55分钟。

所得的图谱示于图4至图6。各图中波峰的出峰时间如下表2所示：

表2：

	波峰出峰时间
		图4	2.690
图5	2.587
		图6	2.664

根据本发明的一个具体实施方案中，基于萃取组合物，该大豆种子萃取物的含量为自约0.001wt％至约10wt％；优选为自约0.01wt％至约5wt％；更优选为自约0.001wt％至约1.5wt％。另一方面，该大豆种子蒸气分馏物的含量为自约0.04wt％至约99.999wt％；优选为自约10wt％至约99.9wt％；更优选为自约30wt％至约99wt％。

根据本发明的萃取组合物优选为药物组合物、食品组合物或化妆品组合物。

本发明的药物组合物可通过本发明领域中已知的任何方法局部或全身施用，包括但不限于通过肌肉内、皮内、静脉内、皮下、腹膜内、鼻内、经口、黏膜或外部途径施用。适当的施用途径、调配方法及施用时程可由本领域技术人员来决定。在本发明中，药物组合物可根据相应施用途径以多种方式调配，例如液体溶液、悬浮液、乳液、糖浆、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物、散剂、颗粒、安瓿、注射液、输注液、套组、软膏、洗剂、擦剂、乳膏或其组合。视情况，其可经灭菌或与任何药学上可接受的载剂或赋形剂混合，其中有许多药学上可接受的载剂或赋形剂已为本领域技术人员所知。

本发明所言的外部途径亦可称为局部施用，包含但不限于以吹气或吸入施用。局部施用的各类制剂示例包含软膏、乳液、乳霜、凝胶、发泡体，以经皮贴片输送的制剂，吸入或吹气用的粉末、喷雾剂、气溶胶、胶囊或药匣，或滴剂(例如眼睛用或鼻子用滴剂)，供雾化用溶液/悬浮液、栓剂、阴道药栓、驻留灌肠剂及咀嚼剂或可吸入的锭剂或药片或脂质或为胶囊制剂。

软膏、乳霜及凝胶可例如配合水性或油性基质，且添加适用增稠剂和/或胶凝剂和/或溶剂调配。该基质因此可包含例如水和/或油，如液态链烷或植物油，如花生油或蓖麻油，或溶剂如聚乙二醇。可依据基质性质使用的增稠剂及胶凝剂包含软质链烷、硬脂酸铝、鲸酰硬脂基醇、聚乙二醇、毛脂肪、蜜蜡、羧基聚亚甲基及纤维素衍生物，和/或单硬脂酸甘油酯，和/或非离子性乳化剂。

乳液可配合水性或油性基质调配，且通常亦含有一或多种乳化剂、安定剂、分散剂、悬浮剂或增稠剂。

外涂用粉末可配合任何适用的粉末状基质形成，例如滑石、乳糖或淀粉。滴剂可配合水性或非水性基质调配，且亦包括一或多种分散剂、溶解剂、悬浮剂或保存剂。

喷雾组合物可例如调配成水溶液或悬浮液，或调配成自预加压袋输送的气溶胶，如剂量吸入器，且配合使用适用的液化推进剂。适用于吸入用的气溶胶组合物可为悬浮液或溶液，该气溶胶组合物可视情况含有额外的技艺中习知的调配佐药，如接口活性剂例如油酸或卵磷脂及共溶剂例如乙醇。

局部用制剂可通过每天对欲作用的区域施用一或多次投药；且在皮肤区域上优选使用覆盖贴片。可通过黏着剂储存系统持续或延长输送。

根据本发明的化妆品组合物可为水相调配物，其本质上包括水；其亦可包含水及与水互溶溶剂的混合物(在25℃为大于50重量％的水互溶力)，例如含1至5个碳原子的低碳单醇，如乙醇或异丙醇，含2至8个碳原子的二醇，如丙二醇、乙二醇、1,3-丁二醇、或二丙二醇，C3-C4酮与C2-C4醛，及甘油。该水相调配物优选为水性凝胶或水凝胶调配物的形式。水凝胶调配物包含增稠剂以将液态溶液增稠。增稠剂的示例包括但不限于碳合物、纤维素为主材料、胶、海藻素、瓜尔胶、果胶、鹿角菜苷、明胶、矿物性或经改质矿物性增稠剂、聚乙二醇与多醇、聚丙烯酰胺、及其他的聚合增稠剂。优选为使用对组合物赋与安定性及最适流动特性的增稠剂。

根据本发明的化妆品组合物可为乳液或乳霜调配物的形式。其可含乳化界面活性剂，这些界面活性剂可选自阴离子及非离子界面活性剂。对于界面活性剂的性质及功能(乳化)，可参考文件"Encyclopedia of Chemical Technology,Kirk-Othmer"，第22卷，第333-432页，第3版，1979,Wiley，对于阴离子及非离子界面活性剂，特别是该参考数据的第347-377页。

优选地，用于本发明组合物的界面活性剂为选自：非离子界面活性剂：脂肪酸，脂肪醇，聚乙氧化或聚乙二醇化脂肪醇，如聚乙氧化硬脂醇或鲸蜡基硬脂醇，蔗糖的脂肪酸酯，烷基葡萄糖酯，特别是C₁-C₆烷基葡萄糖的聚氧伸乙基化脂肪酸酯，及其混合物；阴离子界面活性剂：经胺、氨水或碱盐中和的C₁₆-C₃₀脂肪酸，及其混合物。优选为使用可得到水包油或水包蜡乳液的界面活性剂。

根据本发明的化妆品组合物可进一步包含有效量的生理上可接受抗氧化剂，其选自由丁基化对甲酚、丁基化氢醌一甲醚与生育酚组成的群组。

本发明的组合物可进一步包含天然或改质胺基酸、天然或改质固醇化合物、天然或改质胶蛋白、丝蛋白或大豆蛋白。

本发明的组合物优选为调配成局部应用于角蛋白材料，如皮肤、毛发、睫毛、或指甲。其可为正常用于此型应用的任何表现形式，特别是水性或油性溶液、水包油或油包水乳液、聚硅氧乳液、微乳液或纳米乳液、水性或油性凝胶或液体、浆状或固态水合产物的形式。

本发明通常可为流体且可具有白色或有色乳霜、软膏、乳汁、洗剂、浆液、浆料、慕斯、或凝胶的外观。其可视需要以气溶胶、贴片或粉末的形式局部地应用于皮肤上。其亦可为固态形式，例如棒形式。其可作为皮肤用保养产品和/或化妆产品使用。或者，其可调配成洗发精或润丝精。

在已知方式中，本发明的组合物亦可含化妆品常用的添加剂及佐剂，如亲水性或亲脂性胶化剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香料、填料、颜料、臭味吸收剂、与染料。

根据本发明的食品组合物中，该萃取组合物可在食品制造过程中，添加于习用的食品组合物中(亦即可食用的食品或饮品或其前驱物)。几乎所有的食品组合物皆可添加根据本发明的该萃取组合物。可添加根据本发明的该萃取组合物的食品组合物包含，但不限于糖果、烘焙食品、冰淇淋、乳制品、甜品及风味小点、小吃、肉类替代产品、快餐食品、汤类、面食、面条、罐头食品、冷冻食品、干制食品、冷藏食品、油脂、婴儿食品、软食物、或面包涂酱或其混合物。

本发明再提供一种如前述萃取组合物的用途，其为用以制备促进伤口愈合的药物。

本发明又提供一种于一个体中促进伤口愈合的方法，其包含给予该个体治疗有效量的如前述萃取组合物及视需要的药学上可接受的载剂或赋形剂。

优选地，根据本发明的萃取组合物通过促进皮肤细胞迁移以促进伤口愈合。在本发明的一个具体实施方案中，该萃取组合物可促进角质细胞的迁移，因此该皮肤细胞优选为角质细胞。另一方面，在本发明的动物模式中，根据本发明的萃取组合物可在糖尿病患者中促进伤口愈合，因此该伤口优选为糖尿病患者的伤口。

在本发明的具体实施方案中，包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物与乳膏赋形剂相比皆在糖尿病大鼠模型中对伤口愈合有显著效果(p<0.5)，且大豆种子萃取物治疗组比大豆种子蒸气分馏物组具有稍佳的伤口愈合效果。

于本发明的另一个具体实施方案中，将不同剂量大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物组合，以测试在糖尿病伤口愈合的效果。结果显示，包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物组合治疗的伤口愈合效果比单独使用大豆种子蒸气分馏物的效果为佳，最有效的组合为大豆种子萃取物的最高剂量。

在本发明的具体实施方案中，将大豆种子萃取物、大豆种子蒸气分馏物分别及合并使用，检测对皮肤角质细胞迁移促进的效果，结果显示当以包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物合并用药时，其促进皮肤角质细胞迁移效果比单独用药组的效果佳。

本发明又提供一种如前述萃取组合物的用途，其为用以制备促进神经细胞增殖和/或治疗脑部疾病和/或神经变性疾病的药物。

本发明又提供一种在一个体中促进神经细胞增殖和/或治疗脑部疾病和/或神经变性疾病的方法，其包含给予该个体治疗有效量的如前述萃取组合物及视需要的药学上可接受的载剂或赋形剂。

优选地，该神经细胞为中枢神经细胞；更优选为脑神经细胞；最优选为神经母细胞。

根据本发明的脑部疾病和/或神经变性疾病优选选自由血管性失智、阿兹海默氏症、帕金森氏病、血管性脑疾病、发炎性脑损伤、脑损伤外围炎性反应、脑组织病变、脑血肿、脑室肿胀及脑室扩张所组成的群。

在本发明的一个具体实施方案中，以大豆种子萃取物、大豆种子蒸气分馏物及包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物处理人类神经母细胞瘤细胞。结果可知大豆种子萃取物、大豆种子蒸气分馏物或包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物可显著增加人类神经母细胞瘤细胞的细胞存活率，因此大豆种子萃取物、大豆种子蒸气分馏物或包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物可促进人类神经母细胞瘤细胞的增殖。

在本发明的另一个具体实施方案中，在失智大鼠作为动物模型的旋臂迷宫测试中，以包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物治疗后，总体记忆失误值及参考记忆失误值皆显著小于未治疗组，代表包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物具有治疗失智大鼠的疗效。

在血管性失智测试中，结果显示血管性失智造成的记忆损伤可经由根据本发明的萃取组合物治疗后明显改善。大豆种子蒸气分馏物及包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物皆可改善血管性失智大鼠的工作记忆失误、参考记忆失误及总体记忆失误，且包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物的效果与大豆种子蒸气分馏物相比，其治疗血管性失智的记忆损伤的效果更佳。

本发明另提供一种如前述萃取组合物的用途，其用以制备治疗乳癌的药物。

本发明又提供一种在一个体中治疗乳癌的方法，其包含给予该个体治疗有效量的如前述萃取组合物及视需要的药学上可接受的载剂或赋形剂。

优选地，该乳癌为p53基因突变型乳癌。

在本发明的一个具体实施方案中，以p53蛋白异常人类乳癌细胞株建立动物模型，仿真在原发部位的状况，以用于观测肿瘤在小鼠模型中生长曲线。模拟在人体用药情形，分别给予不同浓度的根据本发明的萃取组合物，观察其结果，发现根据本发明的萃取组合物可以抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长速度。

本发明再提供一种如前述萃取组合物的用途，其用于制备降低干扰DNA和/或RNA复制药物的副作用和/或加强干扰DNA和/或RNA复制药物疗效的药物。

本发明又提供一种在一个体中降低干扰DNA和/或RNA复制药物的副作用及加强干扰DNA和/或RNA复制药物疗效的方法，其包含给予该个体治疗有效量的如前述萃取组合物及视需要的药学上可接受的载剂或赋形剂。

本发明所言的“干扰DNA和/或RNA复制药物”是指可在DNA和/或RNA复制过程中，阻止细胞分裂所需的DNA和/或RNA复制过程的药物，并由此杀死肿瘤细胞，优选地，该干扰DNA和/或RNA复制药物为环磷酰胺(cyclophosphamide)、替莫唑胺(temozolomide)、六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)、金属铂络合物、博来霉素、长春花碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、紫杉醇(Paclitaxel)、欧洲紫杉醇(Docetaxel)、叶酸拮抗物、嘧啶拮抗物或嘌呤拮抗物。

在本发明的一个具体实施方案中，以人类乳癌细胞株建立动物模型，仿真在原发部位的状况，对于施用环磷酰胺的荷瘤小鼠相较之下，给予根据本发明的萃取组合物的荷瘤小鼠有加强化疗药物消除肿瘤的效果。给予根据本发明的萃取组合物可以抑制肿瘤成长和加强化疗药物消除肿瘤大小，并因减少肿瘤的压迫进而减少疼痛，而给予癌症治疗患者有较好的生活质量。

以下的非限制性的实施例有助于本领域技术人员实施本发明。这些实施例不应视为过度地限制本发明。本领域技术人员可在不背离本发明的精神或范畴的情况下对本文所讨论的实施例进行修改及变化，而仍属于本发明的范围。

实施例

大豆种子萃取物(GMA1)

将大豆(Glycine max(L.)Merr.)种子研磨粉碎，并使用按重量计70％的乙醇或蒸馏水，其中种子与乙醇或蒸馏水的比例为1：10，在大气压力约1atm且温度约45℃的环境萃取该大豆种子，以获得粗萃物。接着利用过滤去除步骤该粗萃物中的固体，以获得液体部分。再真空浓缩所得的液体部分，以获得浓缩固体部分，再于温度70℃烘干所得的浓缩固体部分。

大豆种子蒸气分馏物(GMC1)

将大豆(Glycine max(L.)Merr.)种子研磨粉碎，并使用按重量计2％的乙醇或蒸馏水，其中种子与乙醇或蒸馏水的比例为1：10，在大气压力约1atm且温度约90℃在旋转蒸发器(EYELA N-1000S,1000S-W)内蒸发该粗萃物并使其通过供有冷水的冷凝管获得。

大豆种子萃取物(GMA1)及大豆种子蒸气分馏物(GMC1)的分析

将所制得的大豆种子萃取物(GMA1)及大豆种子蒸气分馏物(GMC1)使用分析管柱CarboPac PA1Analytical(4x250mm)进行离子层析分析，其条件为移动相为87％水与13％的500mM NaOH，并以麦芽糖单水合物(maltose monohydrate)作为内部标准品进行等位冲提(isocratic elution)，流速为1.0ml/min，以0.5秒为一周期，每一周期中于0.00秒至0.2秒以相对电位0.1伏特进行、于0.2秒至0.4秒以0.1伏特进行、0.41秒至0.42秒以相对电位-2.0伏特进行、0.43秒以相对电位0.6伏特进行、0.44秒至0.5秒以相对电位-0.1进行，总分析时间为55分钟。

大豆种子萃取物(GMA1)所得的图谱示于图1至图3。各图中波峰的出峰时间如表1所示。

大豆种子蒸气分馏物(GMC1)所得的图谱示于图4至图6。各图中波峰的出峰时间如表2所示。

大豆种子萃取物(GMA1)含有极微量的异黄酮及大豆种子蒸气分馏物(GMC1)不含有异黄酮

使用高效液相层析(HPLC)分析大豆种子萃取物(GMA1)及大豆种子蒸气分馏物(GMC1)中是否包含异黄酮类化合物。

高效液相层析分析的条件如下：

仪器：Hitachi HPLC CM5000Series；帮浦：CM5110；检测器：CM5430(DAD)；自动进料：CM5210；管柱烘箱：CM5310；使用OpenLab软件。

管柱：RP C₁₈，4.6×250mm5μm；检测波长UV 254nm；流速：0.8min/ml；管柱烘箱温度：30℃；梯度冲提，如表3所示。

表3：

＊冲提液1：1％甲酸+0.01％三氟乙酸(TFA)于水中

＊冲提液2：1％甲酸+0.01％三氟乙酸于乙腈中

异黄酮标准品的HPLC分析图谱如图7所示，其于18.853分钟及24.693分钟具有吸收峰。

大豆种子蒸气分馏物(GMC1)的HPLC分析图谱如图8所示，其并未出现任何吸收峰。

包含0.3重量份大豆种子萃取物(GMA1)与1重量份大豆种子蒸气分馏物(GMC1)的萃取组合物制成乳膏后的HPLC分析图谱如图9所示，其于17.307分钟、19.313分钟、20.267分钟、20.853分钟、24.307分钟及25.247分钟具有吸收峰。

经比较图7、图8及图9可知，图8的大豆种子蒸气分馏物(GMC1)的HPLC图谱并未出现异黄酮的指纹吸收峰，因此可知大豆种子蒸气分馏物(GMC1)并不包含异黄酮类化合物；图9中包含0.3重量份大豆种子萃取物(GMA1)与1重量份大豆种子蒸气分馏物(GMC1)的萃取组合物的HPLC图谱对应异黄酮的指纹吸收峰出现极微量的峰值，经换算为Daidzin含量为4.8μg/ml及Genistin含量为8.23μg/ml，与一般具疗效的异黄酮有效剂量相差很大。因此可知大豆种子萃取物(GMA1)仅包含极微量的异黄酮类化合物，且其相关疗效并非所含的极微量异黄酮所具有。

萃取组合物促进伤口愈合

材料与方法：

使用获得自中国台湾国家实验动物中心的约8周大，体重约250g至300g的雄性SD大鼠，经过7天的隔离后，直到大鼠体重超过350g则将其移动。大鼠以耳槽标示，而每个饲养箱上标记饲养箱编号、研究编号、性别和组名。每一聚碳酸酯饲养箱内饲养2只大鼠，并饲养于AAALAC认证的动物设施中。

饲养条件为温度21±2℃、相对湿度50±20％、光照12小时，避光12小时，于整个研究期间自由摄食Laboratory Rodent Diet 5001(PMI^R Nutrition International,Inc.,MO,USA)，并将水以水瓶供给自由摄取，并附着至饲养箱。

实验方法：

依下表4分组并制备样品。

表4：

CGS-21680：特异性腺苷A_2A亚型受体激动剂，1.67mg的CGS-21680加入248.4g乳膏赋形剂中制得。

糖尿病大鼠：

将体重超过300g的大鼠以静脉注射一剂链脲佐菌素(STZ，65mg/kg)。选择具有2个月高血糖(超过300mg/dL)的STZ诱导大鼠进行伤口愈合测试。

糖尿病大鼠的创伤手术：

淘汰体重低于300g的糖尿病大鼠，其余随机分组。将大鼠以戊巴比妥麻醉，并将手术区域(背侧区域)的毛发除去，接着在每只大鼠背中隔区域的三块皮肤(距两肩胛骨的中点4、6和8公分)用圆形切刀切除(全皮层)。

药物治疗及伤口愈合测量：

每隔一天将动物称重，并测量伤口面积，以评价伤口愈合的结果。每天将药物给予每个伤口两次，并以粗棉布覆盖伤口。在大鼠的脖子戴上罩被，以防止伤口受到动物的抓划。在伤口愈合的测量中，在第4、6、8、10、12和14天拍摄伤口照片，拍照时，在伤口旁边放置一个标准尺。在以Image pro(Media cybernetics)分析伤口前，将照片中的长度以标准尺进行标准化，以避免因不同照相距离产生的误差。

资料分析及统计：

以Image pro分析大鼠背上的三个伤口面积。以原始伤口面积作为第0天的面积。原始伤口面积减去不同时间点的伤口面积，再除以原始伤口面积，以得到伤口愈合百分比。每只大鼠三个伤口愈合百分比的平均值表示每只大鼠的伤口愈合。数据以平均值±标准偏差(SEM)表示，并以统计软件(SYSTAT，Systat software Inc)计算t检验表示测试结果的p值。p<0.05表示显著差异，并标记*。p<0.01表示非常显著差异，并标记**。p<0.001表示非常大幅显著差异，并标记***。

结果：

在给药后，以统计软件分析不同时间点所测得的伤口面积，以得到伤口愈合比例，并示于表5及图10。在第4天，乳膏赋形剂、CGS-21680、GMC1及0.3％GMA1组的伤口愈合比例分别为-83.33±6.60(％)、21.87±5.61(％)、-11.44±4.34(％)及-7.09±3.65(％)。所有的治疗组在整个实验期间与乳膏赋形剂组相比具有显著差异。在第8至10天，伤口愈合比例于GMC1组及0.3％GMA1组更加提高，分别自-4.10±3.04(％)至40.15±6.47(％)及自21.21±5.52(％)至62.19±3.85(％)。在第14天，伤口愈合比例于GMC1组及0.3％GMA1组显著提高，分别为86.20±1.88(％)及91.21±2.23(％)，而相比之乳膏赋形剂为58.92±13.14(％)。

表5：以GMC1及0.3％GMA1治疗的糖尿病大鼠伤口愈合比例的比较

注记：每一数值以平均±标准偏差表示，两组之间的比较数据经Student’s t检测为**p<0.01及***p<0.001。

结果显示0.3％GMA1及GMC1与单独乳膏赋形剂相比皆有效促进伤口愈合，其中0.3％GMA1治疗组比GMC1组具有稍佳的伤口愈合效果。

进一步研究糖尿病伤口愈合的GMA1及GMC1最佳组合。将GMC1分别与不同浓度的GMA1组合：0.009％、0.045％及0.09％。为比较，乳膏赋形剂及CGS-21680治疗组亦进行。

在给药后，以统计软件分析不同时间点所测得的伤口面积，以得到伤口愈合比例，并示于表6与图11。如表6及图11所示，与乳膏赋形剂组相比，与GMC1组合中，随着GMA1浓度自0.009％、0.045％至0.09％的增加，其显著差异度亦增加。以GMC1及0.009％、0.045％及0.09％不同浓度的GMA1组合治疗的糖尿病大鼠伤口愈合比例结果显示，组合治疗的效果比单独使用GMC1的效果为佳。最有效的组合为GMA1的最高剂量(0.09％)。

表6：以GMC1及0.009％至0.09％不同浓度的GMA1组合治疗的糖尿病大鼠伤口愈合比例的比较

萃取组合物促进皮肤细胞迁移

利用HaCaT细胞(人类皮肤角质细胞)评估萃取组合物促进皮肤细胞迁移功效评估。

细胞迁移活性测试样品为：

A1-0.3：含0.3μg/mL的GMA1

A1-0.3-CSTC-2500X：含2500倍稀释的GMC1和0.3μg/mL的GMA1

细胞株：HaCaT

培养基：10％胎牛血清DMEM培养基

正向控制：CGS-21680

细胞培养：HaCaT人类皮肤角质细胞株培养于含10％胎牛血清DMEM培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，每星期继代两次。

伤口愈合(Wound healing assay)试验：

利用Oris Cell Migration Assay kit，将细胞植入具有制止器(stopper)的96孔细胞培养盘(4×10⁴cells/well)，并培养在二氧化碳培养箱中。隔夜将制止器拔出制造伤口，加入新细胞培养基或含有测试样品的细胞培养基后，并加入不同待测药物或CGS-21680(正向控制组)处理后0、16及24小时，在光学显微镜下以100倍的放大倍率观察，并利用相机拍摄每道伤口的愈合情形。

分析方法：

利用软件image j来量化伤口愈合的面积；以0小时面积为伤口原始大小，经过一段时间后，伤口面积逐渐变小，计算伤口相对于0小时面积来量化伤口愈合的程度(愈合率＝T16或T24时间点与T0的面积差/T0面积)，以评估药物对HaCaT细胞迁移活性。

统计分析：

每组至少四重复，数据以平均值±标准偏差表示，利用t-检验判断统计显著性。

结果：

利用HaCaT细胞迁移试验进行GMC1和GMA1在伤口愈合能力的比较，当以0.3μg/mL的GMA1和2500倍稀释的GMC1合并用药(A1-0.3-CSTC-2500X)时，其促进HaCaT细胞迁移效果比单独用药组(A1-0.3)的效果佳(图12)。

萃取组合物促进神经细胞增殖

材料与方法：

细胞株：人类神经母细胞瘤细胞IMR-32(购自中国台湾财团法人食品工业发展研究所)

试剂：HyClone^TMDMEM/High Glucose Media(Thermo Scientific)、胎牛血清(FBS、)、磷酸缓冲盐水(PBS、Thermo Scientific)、抗生素抗真菌溶(Pen/Strep/Fungizone 100x；Thermo Scientific)、台盼蓝、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)，二甲亚砜(DMSO，Sigma)。

仪器：流式细胞仪(VERTICAL HF-4BH)

细胞培养：IMR-32细胞培养于含10％胎牛血清DMEM/高糖培养基(HyClone公司^TM)中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。

将IMR-32细胞以5×10⁴密度接种至96孔板，并用100μL补充有10％FBS的培养基培养24小时。给药时，将培养基改变为100μL补充有5％FBS培养基，每组配制成25mg/mL的GMA1、GMC1或GMC1+0.3％GMA1(GM)与PBS(控制组)，并与100μL补充有10％FBS培养基组合并以FBS为阳性控制组。各组至少7重复，在96孔板中培养72小时，以进行MTT分析。

MTT分析：

将培养盘自培养箱转移到层流罩，以每孔100μL含有0.5mg/mL MTT试剂的无血清培养基替换培养基，并培养30-60分钟。添加等体积二甲基亚砜到各孔中，并摇动5分钟。以ELISA读取器测定570nm之吸光度。

数据分析及统计：

将结果以GraphPad Prism 6及T-检验统计分析，并以细胞存活百分率±标准偏差表示。

结果：

细胞存活率结果示于表7至9及图13至15。结果可知细胞存活率在以25mg/ml的GMA1(表7及图13)、GMC1(表8及图14)或GMC1+0.3％GMA1(GM，表9及图15)处理时，与PBS控制组相比显著增加。

表7：

表8：

表9：

表7至9的注记：每一数值以平均±标准偏差表示，两组之间的比较数据经T-检验。p<0.05表示显著差异，并标记*。p<0.01表示非常显著差异，并标记**。p<0.001表示非常大幅显著差异，并标记***。

萃取组合物治疗脑部疾病和/或神经变性疾病

(I)诱发失智症

材料与方法：

使用获得自中国台湾BioLASCO的约6周大，体重约250g至300g的雄性大鼠，经过7天的隔离后，直到大鼠体重超过300g则将其移动。大鼠以尾巴纹身标示，而每个饲养箱上标记饲养箱编号、研究编号、性别和组名。每一聚碳酸酯饲养箱内饲养2只大鼠，并饲养于动物设施中。

饲养条件为温度25±1℃、相对湿度60±5％、光照12小时，避光12小时，饲料为Altromin 1324FORTI(德国)，并将自来水以水瓶供给自由摄取，置于聚碳酸酯瓶中，并附着至饲养箱。

分组示于表10。

表10：

组别	失智诱发	试验样品内容
			正常组	无	无
AlCl₃	AlCl₃	AlCl₃的控制组
			AlCl₃+乳膏赋形剂	AlCl₃	乳膏赋形剂
AlCl₃+N2	AlCl₃	0.5％GMA1+GMC1

失智诱发：

8周龄大鼠连续11周每日口服给药饲喂15mg/mL的AlCl₃溶液，剂量为100mg/kg，以诱发失智模拟症状。将大鼠分成如表10所示的3组，并于第5周至第11周将药物局部施用于头部与颈部区域，并按摩30秒，同时施用于鼻腔粘膜。于第11周开始训练，并以第11周通过旋臂迷宫的记忆力评估失智症，在处理期间，大鼠仍连续供给AlCl₃。

旋臂迷宫：

旋臂迷宫是衡量大鼠空间学习和记忆中最常用的方法之一。旋臂迷宫是由Olton在70年代设计，它是基于迫使饥饿大鼠检查在每个旋臂末端部的食物，训练他们在一段时间内记住食物在迷宫中的位置，其可同时测量大鼠的工作记忆(代表短期记忆)和参考记忆(代表长期记忆)。所使用的旋臂迷宫如图16所示，尺寸为(A)122cm(B)47cm(C)30cm(D)10cm(E)20cm。

使大鼠习惯于该环境1周。每只大鼠称重，让大鼠禁食24小时。在实验前，使大鼠的体重保持在原始体重的80％至85％，并于日常训练(每天两次)后给予正常饮食的60％的。在第1天及第2天，将饵料散落在旋臂和中央平台。同时放置4只大鼠在中央平台上，使之探索迷宫10分钟。在第3天及第4天，将饵料置于每个旋臂的端部。单独放置每只大鼠在中央平台上，让老鼠探索迷宫，直到食物吃完。如果大鼠未在10分钟内吃完，则训练停止。第5至14天，将饵料置于固定4个旋臂的端部。单独放置每只大鼠在中央平台上，让老鼠探索迷宫，直到置于4个旋臂的食物吃完。如果大鼠未在10分钟内吃完，则训练停止。记录和自动分析旋臂的进入。每只大鼠每天训练两次，相隔每个训练之间相隔1小时。

分析下列三个指标：

(a)工作(短期)记忆失误(WME)：再进入放置饵料旋臂的数目

(b)参考(长期)记忆失误(RME)：再进入未放置饵料旋臂的数目

(c)总体记忆失误(TME)：WME+RME

前述三个指标代表大鼠学习及记忆的能力，其随着大脑损伤的程度而显著增加。

数据分析及统计：

使用Student t检验及反复ANOVA统计分析，并以平均±标准偏差显示每组的数据。比较AlCl₃组与正常组的数据以计算统计学上的显著性，亦比较AlCl₃组与AlCl₃+N2组的数据，以计算统计学上的显著性。p<0.05表示显著差异，并标记*。p<0.01表示非常显著差异，并标记**。

结果：

据报导，重金属诱导的失智类似于阿兹海默症。两者皆引起淀粉样前体蛋白，并导致老年斑和神经原纤维缠结的形成。因此，采用失智大鼠作为动物模型以了解包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物对类阿兹海默症的影响。结果示于图17至19。图17的第4日大鼠迷宫轨迹图显示AlCl₃+N2组经治疗后可依记忆快速寻找出食物位置，而AlCl₃及AlCl₃+乳膏赋形剂组则不能；图18显示AlCl₃组TME值与AlCl₃+乳膏赋形剂组并无显著差异(p>0.05)，而经包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物治疗后于检测第4日之后TME值皆显著小于AlCl₃组(AlCl₃+N2p＝0.0128)，代表包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物具有治疗失智大鼠的疗效；图19显示AlCl₃组RME值与AlCl₃+乳膏赋形剂组并无显著差异(p>0.05)，而经包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物治疗第4日的RME值显著小于AlCl₃组(p＝0.0046)，代表包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物具有恢复大鼠长期记忆力的疗效。结果显示，AlCl₃组的失智大鼠在旋臂迷宫测试中的失误显著比控制组高，显示AlCl₃确实成功造成失智，而此参考记忆障碍亦经包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物治疗后显著改善，显示包含大豆种子萃取物及大豆种子蒸气分馏物的萃取组合物具有治疗失智的效果。

(II)血管性失智

材料与方法：

依下表11分组：

表11：

组别	失智诱发	试验样品内容
			Sham	无	假手术
2VO	双侧颈总动脉结扎	双侧颈总动脉结扎的控制组
			M	双侧颈总动脉结扎	乳膏赋形剂
M1	双侧颈总动脉结扎	GMC1
			M3	双侧颈总动脉结扎	GMC1+0.5％GMA1

与前述(I)诱发失智症中使用相同的大鼠及饲养条件。

将大鼠以1：1.5的氯胺酮-甲苯噻嗪混合物(0.1mL/100g，i.p.)麻醉，并固定于手术板。经由中线颈切口在背颈部区域露出双侧颈总动脉，并用丝线缝合进行双重结扎。伤口缝合后，将大鼠放置在温暖光线下直到康复。

将乳膏赋形剂(M)、GMC1(M1)和GMC1+0.5％GMA1(M3)药物局部施用于头部与颈部区域，并按摩30秒，同时施用于鼻腔粘膜。治疗持续4周，并于最后2周进行旋臂迷宫的测试。与前述(I)诱发失智症中使用相同的旋臂迷宫测试。

数据分析及统计：

使用非配对Student t检验及双向ANOVA统计分析，并以平均±标准偏差显示每组的数据。比较假手术组与2VO组的数据以计算统计学上的显著性，亦比较药物治疗组与2VO组的数据，以计算统计学上的显著性。p<0.05表示显著差异，并标记*。p<0.01表示非常显著差异，并标记**。

结果：

结果显示2VO组的失误比假手术组显著升高(图20至23)，可知双侧颈总动脉结扎成功诱导大鼠的血管性失智，而此血管性失智造成的记忆障碍可经由2周的M1及M3的治疗显著改善。根据计算机断层扫描扫描患病大鼠的大脑，其显示双侧颈总动脉双边阻塞(2VO)引起脑组织的肿胀、软化及组织溶解，甚至血液凝块形成，因而引起失智。而此脑损伤在使用M1及M3的治疗后显著下降。

萃取组合物治疗乳癌及降低干扰DNA和/或RNA复制药物的副作用及加强干扰DNA和/或RNA复制药物疗效

材料

细胞株及药品：

MDA-MB-231：购自食品工业研究所

Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture(100x)、胎牛血清(FBS)及Dulbecco'sModified Eagle Medium(DMEM)皆购自

环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)商品名为癌得星。

试验动物：试验动物为由行政院国科会国家实验动物中心繁殖、提供的6～8周大BALB/cAnN.Cg-Foxn1^nu/CrlNarl母裸鼠，室温维持在25±1℃，湿度维持在60±5％，水分与饲料充分供给的独立空调的高医动物房内。一周后，待动物稳定后开始试验。本研究中对实验动物的处理及一切实验过程，均依据实验动物委员会的标准章程规范进行。饲育于控制光线及温度的动物房。

荷瘤小鼠的肿瘤诱发

培养人类乳癌细胞MDA-MB-231细胞至5×10⁶cells后，以胰蛋白酶收集所需注射母裸鼠的细胞数后，回溶细胞至PBS溶液中，进行肿瘤的诱发。裸鼠肿瘤的诱发以皮下注射100μL的细胞溶液后放回饲养笼予以正常饮食，并于肿瘤生长约至300mm³后，进行萃取组合物不同浓度的外用施用与裸鼠分组，分为给予化疗药物CTX与不给予化疗药物组，之后每周观察各组裸鼠的体重、食欲、血糖与肿瘤大小生长情形，并评估裸鼠正常生理外观状态以了解萃取组合物的疗效。

荷瘤小鼠的分组及治疗

荷瘤小鼠肿瘤诱发至约300mm³后，如表12进行下列分组，其中化疗药物(一周一剂注射治疗)与萃取组合物一起施用，药物施用组则每天以萃取组合物于肿瘤生长位置、附近皮肤以及沿着脊椎的整个背部皮肤进行涂抹0.1g/天，以此治疗5周后观察并测量裸鼠体重、食欲、血糖及肿瘤大小的生长速度。

表12：

组别	肿瘤诱发	化疗药物	药物组合
				正常组	无	无	无
肿瘤组	MDA-MB-231诱发	无	无
				J1	MDA-MB-231诱发	无	GMC1
J2	MDA-MB-231诱发	无	0.3％GMA1
				NO CTX+L5	MDA-MB-231诱发	无	GMC1+0.5％GMA1
CTX	MDA-MB-231诱发	CTX/4剂	无
				CTX+L1	MDA-MB-231诱发	CTX/4剂	乳膏赋形剂
CTX+L5	MDA-MB-231诱发	CTX/4剂	GMC1+0.5％GMA1

荷瘤小鼠的临床评估

评估荷瘤小鼠的生理状态与肿瘤大小，评估生理状态标准则分为：体重、食欲、血糖、肿瘤大小。肿瘤的大小计算方式为肿瘤体积(mm³)＝ab²/2，以评估肿瘤生长速度。

结果：

在人类乳癌细胞MDA-MB-231诱发裸鼠肿瘤动物模式中，以萃取组合物治疗后，萃取组合物(J1与J2)对于裸鼠的肿瘤生长有抑制肿瘤成长效果(表13及图25)。在生理观察中，萃取组合物治疗组有较好的食欲和血糖值。

表13：

而在GMC1+0.5％GMA1(NO CTX+L5组)组亦可观察到萃取组合物对于裸鼠的肿瘤生长有抑制肿瘤成长效果(图26)。

比较正常组、肿瘤+化疗药物组(CTX组)与药物施用+化疗药物组(CTX+L1及CTX+L5组)的生理与肿瘤生长评估。由表14及图26及27可观察到CTX+L1组及CTX+L5组对于施用化疗药物的荷瘤裸鼠有加强化疗药物的消除肿瘤效果，且萃取组合物亦不影响体重、平均食量及平均血糖(表15至17)。

表14：消除肿瘤大小(mm³)

表15：平均体重(g)

表16：平均食量(g)

表17：平均血糖(mg/dL)

	5月2日	5月9日	5月16日	5月23日	5月30日
						正常组	110	84	99	97	98
肿瘤组	60	66	82	89	74
						CTX	113	93	109	122	108
CTX+L1	110	93	92	99	101
						CTX+L5	110	109	104	106	102

临床上经由癌症所引起的癌症疼痛是病人放弃治疗的主要原因之一，根据研究发现，癌症疼痛有一部分成因是由肿瘤造成，主要原因为肿瘤侵犯至内脏、外围神经、骨骼所造成的发炎反应以及神经压迫所造成。根据本发明的萃取组合物能有效抑制肿瘤生长，亦能抑制一部分由癌症引起的疼痛反应。对于治疗上也会有相当的帮助。

上述实施例仅为说明本发明的原理及其功效，而非限制本发明。本领域技术人员对上述实施例所做的修改及变化仍不违背本发明的精神。本发明的权利范围应如上述的权利要求所列。

Claims

1.一种萃取组合物，其包含大豆种子萃取物，该大豆种子萃取物由包含下述步骤的方法制备：

a)提供大豆种子与萃取溶液，其中该萃取溶液为水或包含浓度低于90wt％的醇；

b)在大气压力低于1atm且温度低于60℃以该萃取溶液萃取该大豆种子，以获得粗萃物；及

c)去除步骤b)该粗萃物中的固体，以获得液体部分。

2.根据权利要求1所述的萃取组合物，其中该制备大豆种子萃取物的方法另包含步骤d)浓缩步骤c)所得的液体部分，以获得浓缩固体部分。

3.根据权利要求2所述的萃取组合物，其中该制备大豆种子萃取物的方法另包含步骤e)烘干步骤d)所得的浓缩固体部分。

4.根据权利要求1所述的萃取组合物，其进一步包含大豆种子蒸气分馏物，该大豆种子蒸气分馏物由包含下述步骤的方法制备：

i)提供大豆种子与第二萃取溶液，其中该第二萃取溶液为水或包含浓度低于15wt％的醇；及

ii)在大气压力低于1atm且温度低于110℃下以该第二萃取溶液萃取该大豆种子，并收集蒸气分馏物。

5.根据权利要求4所述的萃取组合物，其中步骤i)中该第二萃取溶液中醇的浓度低于5wt％。

6.根据权利要求4所述的萃取组合物，其中基于萃取组合物，该大豆种子萃取物的含量为0.001wt％至5wt％，并且该大豆种子蒸气分馏物的含量为95wt％至99.999wt％。

7.一种制备根据权利要求1至6中任一项所述的萃取组合物的方法，其包含制备该大豆种子萃取物的方法，且该制备该大豆种子萃取物的方法包含下述步骤：

a)提供大豆种子与萃取溶液，其中该萃取溶液为水或包含有浓度低于90wt％的醇；

c)去除步骤b)该粗萃物中的固体，以获得液体部分。

8.根据权利要求7所述的方法，其中该制备萃取物的方法另外包含步骤d)浓缩步骤c)所得的液体部分，以获得浓缩固体部分。

9.根据权利要求7所述的方法，其中该制备萃取物的方法另外包含步骤e)烘干步骤d)所得的浓缩固体部分。

10.一种根据权利要求1至6中任一项所述的萃取组合物的用途，其用于制备促进伤口愈合的药物。

11.根据权利要求10所述的用途，其用于制备促进皮肤细胞迁移的药物。

12.根据权利要求11所述的用途，其中该皮肤细胞为角质细胞。

13.根据权利要求10所述的用途，其中该伤口为糖尿病患者的伤口。

14.一种根据权利要求1至6中任一项所述的萃取组合物的用途，其用于制备促进神经细胞增殖和/或治疗脑部疾病和/或神经变性疾病的药物。

15.根据权利要求14所述的用途，其中该神经细胞为神经母细胞。

16.根据权利要求14所述的用途，其中该脑部疾病和/或神经变性疾病选自血管性失智、阿兹海默氏症、帕金森氏病、血管性脑疾病、发炎性脑损伤、脑损伤外围炎性反应、脑组织病变、脑血肿、脑室肿胀及脑室扩张。

17.一种根据权利要求1至6中任一项所述的萃取组合物的用途，其用于制备治疗乳癌的药物。

18.根据权利要求17所述的用途，其中该乳癌为p53基因突变型乳癌。

19.一种根据权利要求1至6中任一项所述的萃取组合物的用途，其用于制备降低干扰DNA和/或RNA复制药物的副作用和/或加强干扰DNA和/或RNA复制药物疗效的药物。

20.根据权利要求19所述的用途，其中该干扰DNA和/或RNA复制药物选自环磷酰胺、替莫唑胺、六甲三聚氰胺、金属铂络合物、博来霉素、长春花碱、长春新碱、紫杉醇、欧洲紫杉醇、叶酸拮抗物、嘧啶拮抗物及嘌呤拮抗物。