TWI640318B - 大豆種子萃取物、製造方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於大豆種子萃取物、製造方法及大豆種子萃取物於促進傷口癒合、促進神經細胞增殖及/或治療腦部疾病及/或神經變性疾病、治療乳癌、降低干擾DNA及/或RNA複製藥劑之副作用及加成干擾DNA及/或RNA複製藥劑療效之用途。

Description

大豆種子萃取物、製造方法及其用途

本發明係關於大豆種子萃取物、製造方法及大豆種子萃取物於促進傷口癒合、促進神經細胞增殖及/或治療腦部疾病及/或神經變性疾病、治療乳癌、降低干擾DNA及/或RNA複製藥劑之副作用及加成干擾DNA及/或RNA複製藥劑療效之用途。

大豆包含黃豆及黑豆，其為世界上最重要的油及蛋白質來源之一。舉例而言，大豆可加工成可食用之油，其可用作沙拉油或用於製造人造奶油及酥油。大豆油亦用於製造塗料、油氈、油布、油墨、肥皂、殺蟲劑及消毒劑。此外，自油料工業之副產品中獲得之卵磷脂可用作食品、化妝品、藥物、皮革、塗料、塑料、肥皂及清潔劑中之濕潤劑及穩定劑。大豆粉係一富含蛋白質之家畜用飼料。另外，大豆蛋白可用於製造合成纖維、黏合劑、織物上漿、防水、滅火泡沫等。

在醫學使用上，已報導大豆對許多疾病有作用。

大豆可用作一調節腸、心臟、腎、肝及胃之功能之營養性添加物。由於大豆油含有大量不飽和脂肪酸，故其可用于對抗高膽固醇血症。自大豆獲得之醫用卵磷脂可作為一抗脂肪肝劑。另外，吾人已知可自大豆製備一抗硬化因子之σ-類固醇及作為某些抗高血壓藥中薯蕷皂苷元之替代物之穀固醇。自大豆中發現之異黃酮及植物-雌激素已 表明對包含乳癌、前列腺癌及結腸癌在內的各種癌症具有預防作用(Adlercreutz,H.；Phyto-oestrogens and cancer.The Lancet Oncology，2002，Vol.3，p.364-373)；其他文獻表示異黃酮欲達到預防乳癌發生之效果，服用劑量須每日至少100mg持續一個月，其表示需高劑量異黃酮持續服用才有抗癌之作用(Lu LJ,Anderson KE,Grady JJ,Nagamani M.；Effects of soya consumption for one month on steroid hormones in premenopausal women：implications for breast cancer risk reduction.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.1996 Jan；5(1)：6370)。吾人亦發現，食用經添加植物固醇之人造奶油可降低中老年高膽固醇血症個體中之總血漿膽固醇及LDL-膽固醇之濃度(Matvienko,O.A.,Lewis,D.S.,Swanson,M.,Aendt,B.,Rainwater,D.L.,Stew art,J.，及Alekel,D.L.；A Single daily dose of soybean phytosterols in ground beef decreases serum total cholesterol and LDL cholesterol in young,mildly hypercholesterolemic men.Am J Clin Nutr.,2002,76,p.57-64)。

某些大豆萃取物亦經報導具有醫藥作用。取自棕色大豆變種(Akita-Zairai)種皮之70%含水丙酮萃取物具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)游離基清除活性(Takahata.Y.,O.-Kameyama,M.,Furuta,S.,Takahashi,and M.,Suda,I.；Highly polymerized procyanidins in brown soybean seed coat with a high radical-scavenging activity.J.Agric.Food Chem.,2001,49,p.5843-5847)。另外，取自胚芽萃取物、大豆、米糠、tear草、芝麻、小麥、香櫞、綠茶、綠葉萃取物及發芽的稻穀之萃取物，在低於60℃下經一電烘爐緩慢烘烤並使用米麯黴發酵3天以上，以將每一組分轉化為低分子量物質後可具有抗氧化作用(Minamiyama,Y.,Yoshikawa,T.,Tanigawa,T.,Takahashi,S.,Naito,Y.,Ichika wa,H.及Kondo,M.；Antioxidative effects of a processed grain food.J.Nutr.Sci.Vitaminol.,1994,40,p.467-477)。藉由量測大鼠中血清穀胺酸-草酸-轉胺酶(sGOT)及血清穀胺酸-丙酮酸-轉胺酶(sGPT)之活性，黑豆之水萃取物亦顯示對由乙醯胺基酚引發之肝病有作用(Wu,S.-J.,Wang,J.-S.及Chang C.-H.；Evaluation of hepatoprotective activity of legumes.Phytomedicine,2001,Vol.8(3),p.213-219)。

另一方面，某些特定的大豆萃取物可用於治療某些皮膚病之化妝品或藥物。含有規定比率之鞘磷脂及磷脂之大豆萃取物經揭示可用於治療乾性皮膚之化妝品中(美國專利公開案第US2002/0009509 A1號)。該等萃取物可藉由單獨使用脂族醇或其與水之混合物萃取成熟之完整大豆或無油大豆粉產生，且隨後使用脂族烴及脂族酮處理。故，該萃取物是脂溶性的。

再者，一含有一或多種植物萃取物(其係選自乳清、及一黃柏萃取物，及進一步選自黃芩、西門肺草及大豆(Glycine max(L.)Merrill)之一或多種萃取物)之化妝品組合物、粉刺藥、或黑頭粉刺生成抑制劑對預防或治療皮膚病(例如粉刺或由粉刺引起之發炎皸裂皮膚)有效(日本專利第2001097842號)。

使用微生物發酵大豆之產物亦可用作抗活性氧作用組合物、試劑、食品、化妝品及藥品(例如日本專利第4139132號)。

大豆之許多用途雖已經報導，但大豆之萃取物之不同應用仍待開發。

本發明係關於大豆種子萃取物、製造方法及大豆種子萃取物於促進傷口癒合、促進神經細胞增殖及/或治療腦部疾病及/或神經變性疾病、治療乳癌、降低干擾DNA及/或RNA複製藥劑之副作用及加成干擾DNA及/或RNA複製藥劑療效之用途。

本發明提供一種萃取組合物，其包含大豆種子萃取物，該大豆種子萃取物係由包含下述步驟之方法製備：(a)提供大豆種子與一萃取溶液，其中該萃取溶液為水或包含濃度低於約90wt%之醇；(b)在大氣壓力低於約1atm且溫度低於約60℃以該萃取溶液萃取該大豆種子，以獲得一粗萃物；及(c)去除步驟(b)該粗萃物中之固體，以獲得液體部分。

本發明另提供一種製備如前述萃取組合物之方法，其包含製備該大豆種子萃取物之方法，且該製備該大豆種子萃取物之方法包含下述步驟：(a)提供大豆種子與一萃取溶液，其中該萃取溶液為水或包含有濃度低於約90wt%之醇；(b)在大氣壓力低於約1atm且溫度低於約60℃以該萃取溶液萃取該大豆種子，以獲得一粗萃物；及(c)去除步驟(b)該粗萃物中之固體，以獲得液體部分。

本發明再提供一種如前述萃取組合物之用途，其係用以製備促進傷口癒合之藥物。

本發明又提供一種如前述萃取組合物之用途，其係用以製備促進神經細胞增殖及/或治療腦部疾病及/或神經變性疾病之藥物。

本發明另提供一種如前述萃取組合物之用途，其係用以製備治療乳癌之藥物。

本發明再提供一種如前述萃取組合物之用途，其係用以製備降低干擾DNA及/或RNA複製藥劑之副作用及/或加成干擾DNA及/或RNA複製藥劑療效之藥物。

圖1至3顯示根據本發明之大豆種子萃取物(GMA1)之離子層析分 析圖譜(ICS)。

圖4至6顯示根據本發明之大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)之離子層析分析圖譜(ICS)。

圖7顯示異黃酮標準品之HPLC分析圖譜。

圖8顯示大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)之HPLC分析圖譜。

圖9顯示0.3重量份大豆種子萃取物(GMA1)與1重量份大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)之萃取組合物之HPLC分析圖譜。

圖10顯示GMA1及GMC1於糖尿病傷口癒合之效果。為檢視GMC1及GMA1是否對增進傷口癒合具療效，使用STZ誘導之糖尿病大鼠模式，並同時比較乳膏賦形劑及CGS-21680治療組。結果顯示0.3% GMA1及GMC1與乳膏賦形劑相比皆對傷口癒合有效，0.3% GMA1治療組比GMC1組具有稍佳之傷口癒合效果。

圖11顯示不同劑量GMA1及GMC1於糖尿病傷口癒合之效果。研究糖尿病傷口癒合之GMA1及GMC1最佳組合。如圖所示，將GMC1分別以不同濃度之GMA1組合：0.009%、0.045%及0.09%。為比較，乳膏賦形劑及CGS-21680治療組亦進行。結果顯示，GMC1及0.009%、0.045%及0.09%不同濃度之GMA1組合治療之傷口癒合效果比單獨使用GMC1之效果為佳，最有效之組合為GMA1之最高劑量(0.09%)。

圖12顯示大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物合併用藥對HaCaT細胞遷移之作用。

圖13顯示以GMA1處理之IMR-32細胞存活率。數據為7組之平均±標準差。以25mg/ml GMA1及陽性控制組處理之IMR-32細胞存活率具有非常顯著及顯著之增加(GMA1 p=0.0008，陽性控制組p=0.0246)。結果顯示GMA1可增進細胞生長(*** p<0.001)。

圖14顯示以GMC1處理之IMR-32細胞存活率。數據為7組之平均±標準差。以25mg/ml GMC1及陽性控制組處理之IMR-32細胞存活率具 有顯著之增加(GMC1 p=0.0255，陽性控制組p=0.0246)。結果顯示GMC1可增進細胞生長(* p<0.05)。

圖15顯示顯示以GMA1與GMC1(GM)處理之IMR-32細胞存活率。數據為7組之平均±標準差。以25mg/ml GM及陽性控制組處理之IMR-32細胞存活率具有顯著之增加(GM p=0.0059，陽性控制組p=0.0246)。結果顯示GM可增進細胞生長(**p<0.01)。

圖16顯示旋臂迷宮之示意圖。

圖17顯示失智大鼠之旋臂迷宮軌跡圖，第4日大鼠迷宮軌跡圖顯示失智誘發+包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物(AlCl₃+N2)組經治療後可依記憶快速尋找出食物位置，而失智誘發(AlCl₃)及失智誘發+乳膏賦形劑(AlCl₃+乳膏賦形劑)組則否。

圖18顯示失智大鼠經旋臂迷宮檢測之總體記憶失誤(TME)分析圖，其顯示失智誘發(AlCl₃)組TME值與失智誘發+乳膏賦形劑(AlCl₃+乳膏賦形劑)組並無顯著差異(p>0.05)，而經包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物治療(AlCl₃+N2)第4日之後，TME值皆顯著小於AlCl₃組(AlCl₃+N2 p=0.0128)，代表包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物具有治療失智大鼠之療效。數據以平均值±標準差表示，並以未配對Student’s t-檢驗進行統計分析。當AlCl₃組和AlCl₃+N2組相比較，p<0.05以*標示；p<0.001以**標示，代表具有統計學的顯著差異。

圖19顯示失智大鼠經旋臂迷宮檢測之參考(長期)記憶失誤(RME)次數分析圖，其顯示失智誘發(AlCl₃)組RME值與失智誘發+乳膏賦形劑(AlCl₃+乳膏賦形劑)組並無顯著差異(p>0.05)，而經包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物(AlCl₃+N2)治療後於檢測第4日之RME值顯著小於AlCl₃組(p=0.0046)，代表包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物具有恢復大鼠長期記憶力之療 效。數據以平均值±標準差表示，並以未配對Student’s t-檢驗進行統計分析。p<0.05以*標示；p<0.001以**標示，代表具有統計學的顯著差異。

圖20顯示以乳膏賦形劑(M)、GMC1(M1)及GMC1+0.5%GMA1(M3)治療血管性失智大鼠經旋臂迷宮檢測之總體記憶失誤(TME)次數分析圖，其顯示雙側頸總動脈結紮(2VO)組TME值與假手術(sham)組相比顯著較高(第8天，p=0.0013)，顯示雙側頸總動脈結紮成功誘發血管性失智。而經M1及M3治療後，與2VO組相比TME值顯著改善(第8天，M1 p=0.0019；M3 p=0.0355)，代表M1及M3具有治療大鼠血管性失智之療效。數據以平均值±標準差表示，並以未配對Student’s t-檢驗進行統計分析。p<0.05以*標示；p<0.001以**標示，代表具有統計學的顯著差異。

圖21顯示以乳膏賦形劑(M)、GMC1(M1)及GMC1+0.5%GMA1(M3)治療血管性失智大鼠經旋臂迷宮檢測之參考(長期)記憶失誤(RME)次數分析圖，其顯示雙側頸總動脈結紮(2VO)組TME值與假手術sham組相比顯著較高(第8天，p=0.0016)，顯示雙側頸總動脈結紮成功誘發血管性失智。而經M1及M3治療後，與2VO組相比RME值顯著改善(第8天，M1 p=0.0029；M3 p=0.0171)，代表M1及M3具有治療大鼠血管性失智RME之療效。數據以平均值±標準差及ANOVA表示，並以未配對Student’s t-檢驗進行統計分析。p<0.05以*標示；p<0.001以**標示，代表具有統計學的顯著差異。

圖22顯示以乳膏賦形劑(M)、GMC1(M1)及GMC1+0.5%GMA1(M3)治療血管性失智大鼠經旋臂迷宮檢測之工作記憶失誤(WME)次數分析圖，其顯示雙側頸總動脈結紮(2VO)組TME值與假手術sham組相比顯著較高(第8天，p=0.0111)，顯示雙側頸總動脈結紮成功誘發血管性失智。而經M1及M3治療後，與2VO組相比WME值顯著改善(第8 天，M1 p=0.0111；第6天，M3 p=0.0139)，代表M1及M3具有治療大鼠血管性失智WME之療效。數據以平均值±標準差表示，並以未配對Student’s t-檢驗進行統計分析。p<0.05以*標示；p<0.001以**標示，代表具有統計學的顯著差異。

圖23顯示血管性失智大鼠之旋臂迷宮軌跡圖，第8日大鼠迷宮軌跡圖顯示假手術(sham)、GMC1(M1)及GMC1+0.5%GMA1(M3)組經治療後可依記憶快速尋找出食物位置，而乳膏賦形劑(M)AlCl₃及2VO組則否。

圖24顯示電腦斷層掃描血管性失智大鼠腦損傷程度分析，腦損傷之程度分為0至4級，其結果顯示雙側頸總動脈結紮(2VO組)之嚴重腦損傷(p=0.0000)經由GMC1(M1)及GMC1+0.5%GMA1(M3)治療後顯著降低(M1 p=0.0030；M3 p=0.0238)，數據以平均值±標準差表示，並以未配對Student’s t-檢驗進行統計分析。p<0.05以*標示；p<0.001以**標示，代表具有統計學的顯著差異。

腦損傷之電腦斷層分級：

0：於電腦斷層掃描無顯著異常

1：腦組織有小區域之不正常密度區

2：單側腦組織之不正常密度區佔超過25%，或於雙側腦組織有小區域之不正常密度區

3：單側腦組織之不正常密度區佔超過50%，中線位移或於雙側腦組織不正常密度區佔超過25%

4：雙側腦組織之不正常密度區估超過50%或明顯中線位移/扭曲

圖25為裸鼠誘發腫瘤並待生長到一定體積後，裸鼠進行分組並給予背部皮膚和腫瘤生長區域皮膚0.1g/天萃取組合物進行治療，觀察測量裸鼠腫瘤大小的生長速度。由圖中結果顯示，與腫瘤誘發控制組相較之下，給予萃取組合物可以延緩腫瘤生長速度。

圖26為裸鼠誘發腫瘤並待生長到一定體積後，裸鼠進行分組並給予背部皮膚和腫瘤生長區域皮膚0.1g/天GMC1及GMA1進行治療，觀察測量裸鼠腫瘤大小的生長速度。由圖中結果顯示，與腫瘤誘發控制組相較之下，給予萃取組合物可以延緩腫瘤生長速度。

圖27為裸鼠誘發腫瘤並待生長到一定體積後，裸鼠進行分組並給予CTX藥物注射以及背部皮膚和腫瘤生長區域皮膚0.1g/day萃取組合物進行治療，觀察測量裸鼠腫瘤大小的生長速度。由圖中結果顯示，與CTX控制組相較之下，給予萃取組合物可以進一步延緩腫瘤生長速度。

本發明提供一種萃取組合物，其包含大豆種子萃取物，該大豆種子萃取物係由包含下述步驟之方法製備：(a)提供大豆種子與一萃取溶液，其中該萃取溶液為水或包含濃度低於約90wt%之醇；(b)在大氣壓力低於約1atm且溫度低於約60℃以該萃取溶液萃取該大豆種子，以獲得一粗萃物；及(c)去除步驟(b)該粗萃物中之固體，以獲得液體部分。

參考以下對本發明之各態樣、實例、及伴隨相關描述之化學圖式及表格的詳細描述，可更容易地瞭解本發明。在揭示及描述本發明之萃取物、組合物及/或方法之前，應瞭解，除非由申請專利範圍另外特別地指出，否則本發明不受限於特定製備方法、載劑或調配物、或將本發明萃取物調配成用於局部、經口或非經腸投予之產物或組合物的特定模式，此係由於熟習相關技術之通常知識者非常清楚此等事情是可以加以變化的。亦應瞭解，本文所用之術語僅用於描述特定態樣之目的而不意欲用於限制性本發明之範疇。

除非另外指出，否則如本發明所用之以下術語應解釋為具有以下 含義。

範圍在本文中通常表述為「約」一個特定值及/或至「約」另一個特定值。當表述此類範圍時，一態樣為包括一個特定值及/或至另一個特定值之範圍。類似地，當值藉由使用字「約」表述為近似值時，應瞭解特定值可形成另一態樣。另外應瞭解，每一範圍之各端點皆有顯著性，一端點與另一端點既有相關性，亦彼此獨立。

「視情況」或「視情況地」意謂隨後所述之事件或狀況可能發生或可能不發生，且該描述包括該事件或狀況發生之情況及其未發生之情況。舉例而言，「視情況包含藥劑」意謂該藥劑可能存在或可能不存在。

必須指出，除非上下文另外清楚規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一」及「該」包括複數個所指標的物。因此，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。

如本文所用之術語「個體」表示任何動物，較佳為哺乳動物，且更佳為人類。個體之實例包括人類、非人類靈長類動物、齧齒動物、天竺鼠、兔、綿羊、豬、山羊、母牛、馬、狗及貓。

術語如本文所提供之化合物的「有效量」意謂該萃取物之量足以提供對所需功能之所需調節。如下文所指出，確實的需要量將在個體之間有變化，此視個體之疾病病況、身體狀況、年齡、性別、物種及體重、組合物之特性及配方等而定。給藥方案可經調整以誘導最佳治療反應。舉例而言，可每日投予若干分次劑量，或可依治療情形之緊急程度按比例減少劑量。因此，很難指定確實的「有效量」。然而，本發明領域中具有通常知識者使用常規實驗即可確定適當的有效量。

如本文所用之術語「治療」表示逆轉、減輕或改善此術語所適用之病症或病狀、或該病症或病狀之一或多種症狀，或抑制其進展。

如本文所用之術語「載劑」或「賦形劑」係指自身並不為治療劑，而是用作用於將治療劑傳遞至個體之載劑及/或稀釋劑及/或佐劑或媒劑，或添加至調配物中以改善調配物之處理或儲存性質或允許或有助於組合物之劑量單位形成適於投予之劑量單位的任何物質。適合之載劑或賦形劑為一般熟習製造醫藥調配物或食品之通常知識者所熟知。載劑或賦形劑可包括(舉例而言但不限於)緩衝劑、稀釋劑、崩解劑、黏合劑、黏著劑、濕潤劑、聚合物、潤滑劑、滑動劑、為遮蔽或抵消不良味道或氣味而添加之物質、調味劑、染料、芳香劑及為改善組合物之外觀而添加之物質。可接受之載劑或賦形劑包括檸檬酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑、碳酸氫鹽緩衝劑、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸及硫酸之鈉鹽及鈣鹽、碳酸鎂、滑石、明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、果膠、糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、澱粉、明膠、纖維素物質(諸如烷酸之纖維素酯及纖維素烷基酯)、低熔點蠟、可可脂、胺基酸、尿素、醇類、抗壞血酸、磷脂、蛋白質(例如血清白蛋白)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲亞碸(DMSO)、氯化鈉或其他鹽、脂質體、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油或粉末、聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇及聚乙二醇)、及其他醫藥學上可接受之物質。載劑不應破壞治療劑之藥理學活性，且在以足以傳遞治療量之藥劑的劑量投予時應無毒性。

根據本發明之萃取組合物係包含大豆種子萃取物。根據本發明之大豆因種皮顏色之不同，可稱為黃豆、毛豆、白豆、青皮豆、烏豆、青豆、黑豆；較佳為黃豆或黑豆。根據本發明之大豆係屬於豆科(Fabaceae)大豆屬(Glycine)，較佳地，該大豆為Glycine max(L.)Merrill、Glycine formosana Hosokawa或Glycine soja auct.non Sieb.& Zucc.。

根據本發明之大豆種子較佳係指去除莢果外殼之種子。一般而 言，大豆之果實係為有毛的莢果，由莢果外殼包覆種子，莢果外殼非常堅硬並且防水，可以保護其內之種子。自大豆果實中獲得大豆種子，亦即去除莢果外殼之方式係為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知。較佳地，根據本發明之大豆種子包含種皮、子葉及胚軸。

根據本發明之大豆種子萃取物係由包含下述步驟之方法製備：(a)提供大豆種子與一萃取溶液，其中該萃取溶液為水或包含濃度低於約90wt%之醇；(b)在大氣壓力低於約1atm且溫度低於約60℃以該萃取溶液萃取該大豆種子，以獲得一粗萃物；及(c)去除步驟(b)該粗萃物中之固體，以獲得液體部分。

根據本發明用以萃取大豆種子之該萃取溶液係為水或包含濃度低於約90wt%之醇。較佳地，該醇係為具有1至7碳數之醇。本文中所言之「具有1至7碳數之醇」乙詞係指直鏈或支鏈、具取代或不具取代、單元或多元、飽和或不飽和之醇，較佳係為不具取代、單元及飽和醇。另一方面，該具有1至7碳數之醇較佳為1至4碳數之醇。於本發明之一較佳具體實施例中，該具有1至7碳數之醇係為甲醇、乙醇、正丙醇(n-propanol)、異丙醇(isopropanol)、正丁醇、異丁醇(iso-butanol)、仲丁醇(sec-butanol)、叔丁醇(tert-butanol)、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-己醇、2,4-己二烯-1-醇、2-甲基-環戊醇、環己醇、1-庚醇、2-庚醇或環庚醇；尤佳地，該醇係為甲醇或乙醇；最佳地，該醇為乙醇。該醇可單獨使用或混合多種使用。

本文中所言之醇較佳係為水溶液，其濃度為低於約90wt%之醇溶液；較佳為約5wt%至約90wt%之醇溶液；更佳為約30wt%至約85wt%之醇溶液；尤佳為約50wt%至約75wt%之醇溶液。

根據本發明之方法，其包含(b)在大氣壓力低於約1atm且溫度低 於約60℃以該萃取溶液萃取該大豆種子，以獲得一粗萃物。以一溶液萃取種子部位之方式為本發明所屬技術領域中通常用來自植物種子獲得粗萃物之任何方法。舉例而言，該粗萃物可藉由任何方法，例如研磨、攪拌、擾動、切割或切碎方法將種子分成碎塊並將其浸沒在該萃取溶液中來獲得，本發明所屬技術領域中通常用來分割種子之任何方式均可用于實施本發明。於本發明之一較佳具體實施例中，該大豆種子係攪碎為粉末。於本發明之一較佳具體實施例中，該大豆種子係浸於該萃取溶液中以供萃取，更佳地，該大豆種子係浸於該萃取溶液中，並經超音波震盪以供萃取。

另一方面，根據本發明之製備方法，於步驟(b)前該大豆種子較佳係經乾燥。

根據本發明，大豆種子與萃取溶液之比例並無限制，在本發明之較佳具體實施例中，大豆種子與萃取溶液之比例為約1：1至約1：30；較佳地，約1：5至約1：20；尤佳地；約1：10。

根據本發明之步驟(b)中萃取溫度為低於約60℃，較佳為約25℃至約55℃；更佳為約30℃至約50℃；尤佳為約45℃。

於本發明之一較佳具體實施例中，該萃取步驟(b)可重複實施，並收集合併該萃取物。

根據本發明之方法包含(c)去除步驟(b)該粗萃物中之固體，以獲得液體部分。去除固體部份以獲得該液體部分之方法係為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知，例如但不限於使用過濾、離心、沉澱等方式。

較佳地，根據本發明之方法進一步包含步驟(d)濃縮步驟(c)中所獲得之液體部分，以獲得一濃縮固體部分。濃縮之方法係為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知，例如使用減壓濃縮機進行。

較佳地，根據本發明之方法進一步另包含步驟(e)烘乾步驟(d)所 得之濃縮固體部分。烘乾之方法係為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知，例如使用自然風乾或冷凍乾燥機進行。

於本發明之一較佳具體實施例中，該大豆種子萃取物係使用分析管柱CarboPac PA1 Analytical(4x250mm)進行離子層析分析，其條件為移動相為87%水與13%之500mM NaOH，並以麥芽糖單水合物(maltose monohydrate)作為內部標準品進行等位沖提(isocratic elution)，流速為1.0ml/min，以0.5秒為一週期，每一週期中於0.00秒至0.2秒以相對電位0.1伏特進行、於0.2秒至0.4秒以0.1伏特進行、0.41秒至0.42秒以相對電位-2.0伏特進行、0.43秒以相對電位0.6伏特進行、0.44秒至0.5秒以相對電位-0.1進行，總分析時間為55分鐘。

所得之圖譜示於圖1至圖3。各圖中波峰之出峰時間如下表1所示：

較佳地，根據本發明之萃取組合物，視情況地進一步包含大豆種子蒸氣分餾物，該大豆種子蒸氣分餾物係由包含下述步驟之方法製備：(i)提供大豆種子與一第二萃取溶液，其中該第二萃取溶液為水或包含濃度低於約15wt%之醇；及(ii)在大氣壓力低於約1atm且溫度低於約110℃下以該第二萃取溶液萃取該大豆種子，並收集該蒸氣分餾物。

根據本發明用以製備大豆種子蒸氣分餾物之該第二萃取溶液係為水或包含濃度低於約15wt%之醇，較佳係為水。該醇之種類可與製備大豆種子萃取物之萃取溶液之種類相同，不再於此贅述。

本文中所言之第二萃取溶液中醇為低於約15wt%之醇溶液；較佳為低於約10wt%之醇溶液；更佳為低於約5wt%之醇溶液。

根據本發明之製備大豆種子蒸氣分餾物方法，其包含(ii)在大氣壓力低於約1atm且溫度低於約110℃下以該第二萃取溶液萃取該大豆種子，並收集該蒸氣分餾物。該萃取可與製備大豆種子萃取物之萃取方法相同，惟該大豆種子蒸氣分餾物係在大氣壓力低於約1atm且溫度低於約110℃下受到蒸發。該蒸氣分餾物可藉由冷卻該蒸氣以液體形式收集。

在本發明之一較佳具體實施例中，在一給定大氣壓力及溫度下蒸發該大豆種子且藉由冷卻蒸氣收集該蒸氣分餾物之方法可在一旋轉蒸發器中實施，其中蒸氣被蒸發至供有冷水之冷凝管中，並隨後使該蒸氣通過該冷凝管冷卻且以液體形式收集該蒸氣分餾物。該作業簡單且成本低廉。

根據本發明，大豆種子與第二萃取溶液之比例並無限制，在本發明之較佳具體實施例中，大豆種子與萃取溶液之比例可為約1：1至約1：30；較佳地，約1：5至約1：20；尤佳地；約1：10。

根據本發明之步驟(ii)中萃取溫度為低於約110℃，較佳介於約60℃至約110℃。

於本發明之一較佳具體實施例中，該萃取步驟(ii)可重複實施，並收集合併該大豆種子蒸氣分餾物。

於本發明之一較佳具體實施例中，該大豆種子蒸氣分餾物係使用分析管柱CarboPac PA1 Analytical(4 x 250mm)進行離子層析分析，其條件為移動相為87%水與13%之500mM NaOH，並以麥芽糖單水合物 (maltose monohydrate)作為內部標準品進行等位沖提(isocratic elution)，流速為1.0ml/min，以0.5秒為一週期，每一週期中於0.00秒至0.2秒以相對電位0.1伏特進行、於0.2秒至0.4秒以0.1伏特進行、0.41秒至0.42秒以相對電位-2.0伏特進行、0.43秒以相對電位0.6伏特進行、0.44秒至0.5秒以相對電位-0.1進行，總分析時間為55分鐘。

所得之圖譜示於圖4至圖6。各圖中波峰之出峰時間如下表2所示：

根據本發明之一具體例中，基於萃取組合物，該大豆種子萃取物之含量為自約0.001wt%至約10wt%；較佳為自約0.01wt%至約5wt%；更佳為自約0.001wt%至約1.5wt%。另一方面，該大豆種子蒸氣分餾物之含量為自約0.04wt%至約99.999wt%；較佳為自約10wt%至約99.9wt%；更佳為自約30wt%至約99wt%。

根據本發明之萃取組合物較佳為醫藥組合物、食品組合物或化妝品組合物。

本發明之醫藥組合物可藉由本發明領域中已知之任何方法局部或全身投予，包括但不限於藉由肌肉內、皮內、靜脈內、皮下、腹膜內、鼻內、經口、黏膜或外部途徑投予。適當的投藥途徑、調配方法及投藥時程可由本發明領域中具有通常知識者來決定。在本發明中，醫藥組合物可根據相應投藥途徑以多種方式調配，諸如液體溶液、懸浮液、乳液、糖漿、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物、散劑、顆粒、安瓿、注射液、輸注液、套組、軟膏、洗劑、擦劑、乳膏或其組合。視情況，其可經滅菌或與任何醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混 合，其中有許多醫藥學上可接受之載劑或賦形劑已為一般技術者所知。

本發明所言之外部途徑亦可稱為局部投藥，包含但不限於以吹氣或吸入投藥。局部投藥之各類製劑實例包含軟膏、乳液、乳霜、凝膠、發泡體，以經皮貼片輸送之製劑，吸入或吹氣用之粉末、噴霧劑、氣溶膠、膠囊或藥匣，或滴劑(例如眼睛用或鼻子用滴劑)，供霧化用溶液/懸浮液、栓劑、陰道藥栓、駐留灌腸劑及咀嚼劑或可吸入之錠劑或藥片或脂質或為膠囊製劑。

軟膏、乳霜及凝膠可例如配合水性或油性基質，且添加適用增稠劑及/或膠凝劑及/或溶劑調配。該基質因此可包含例如水及/或油，如液態鏈烷或植物油，如花生油或蓖麻油，或溶劑如聚乙二醇。可依據基質性質使用之增稠劑及膠凝劑包含軟質鏈烷、硬脂酸鋁、鯨醯硬脂基醇、聚乙二醇、毛脂肪、蜜蠟、羧基聚亞甲基及纖維素衍生物，及/或單硬脂酸甘油酯，及/或非離子性乳化劑。

乳液可配合水性或油性基質調配，且通常亦含有一或多種乳化劑、安定劑、分散劑、懸浮劑或增稠劑。

外塗用粉末可配合任何適用之粉末狀基質形成，例如滑石、乳糖或澱粉。滴劑可配合水性或非水性基質調配，且亦包括一或多種分散劑、溶解劑、懸浮劑或保存劑。

噴霧組合物可例如調配成水溶液或懸浮液，或調配成自預加壓袋輸送之氣溶膠，如劑量吸入器，且配合使用適用之液化推進劑。適用於吸入用之氣溶膠組合物可為懸浮液或溶液，該氣溶膠組合物可視情況含有額外之技藝中習知之調配佐藥，如介面活性劑例如油酸或卵磷脂及共溶劑例如乙醇。

局部用製劑可藉由每天對欲作用之區域施用一或多次投藥；且在皮膚區域上較佳使用覆蓋貼片。可藉由黏著劑儲存系統持續或延長輸 送。

根據本發明之化妝品組合物可為水相調配物，其本質上包括水；其亦可包含水及與水互溶溶劑之混合物(在25℃為大於50重量%之水互溶力)，例如含1至5個碳原子之低碳單醇，如乙醇或異丙醇，含2至8個碳原子之二醇，如丙二醇、乙二醇、1,3-丁二醇、或二丙二醇，C 3-C 4酮與C 2-C 4醛，及甘油。該水相調配物較佳為水性凝膠或水凝膠調配物之形式。水凝膠調配物包含增稠劑以將液態溶液增稠。增稠劑之實例包括但不限於碳合物、纖維素為主材料、膠、海藻素、瓜爾膠、果膠、鹿角菜苷、明膠、礦物性或經改質礦物性增稠劑、聚乙二醇與多醇、聚丙烯醯胺、及其他之聚合增稠劑。較佳為使用對組合物賦與安定性及最適流動特性之增稠劑。

根據本發明之化妝品組合物可為乳液或乳霜調配物之形式。其可含乳化界面活性劑，這些界面活性劑可選自陰離子及非離子界面活性劑。對於界面活性劑之性質及功能(乳化)，可參考文件"Encyclopedia of Chemical Technology,Kirk-Othmer"，第22卷，第333-432頁，第3版，1979,Wiley，對於陰離子及非離子界面活性劑，特別是該參考資料之第347-377頁。

較佳地，用於本發明組合物之界面活性劑係選自：非離子界面活性劑：脂肪酸，脂肪醇，聚乙氧化或聚乙二醇化脂肪醇，如聚乙氧化硬脂醇或鯨蠟基硬脂醇，蔗糖之脂肪酸酯，烷基葡萄糖酯，特別是C₁-C₆烷基葡萄糖之聚氧伸乙基化脂肪酸酯，及其混合物；陰離子界面活性劑：經胺、氨水或鹼鹽中和之C₁₆-C₃₀脂肪酸，及其混合物。較佳為使用可得到水包油或水包蠟乳液之界面活性劑。

根據本發明之化妝品組合物可進一步包含有效量之生理上可接受抗氧化劑，其選自由丁基化對甲酚、丁基化氫醌一甲醚與生育酚組成之群組。

本發明之組合物可進一步包含天然或改質胺基酸、天然或改質固醇化合物、天然或改質膠蛋白、絲蛋白或大豆蛋白。

本發明之組合物較佳為調配成局部應用於角蛋白材料，如皮膚、毛髮、睫毛、或指甲。其可為正常用於此型應用之任何表現形式，特別是水性或油性溶液、水包油或油包水乳液、聚矽氧乳液、微乳液或奈米乳液、水性或油性凝膠或液體、漿狀或固態水合產物之形式。

本發明通常可為流體且可具有白色或有色乳霜、軟膏、乳汁、洗劑、漿液、漿料、慕斯、或凝膠之外觀。其可視需要以氣溶膠、貼片或粉末之形式局部地應用於皮膚上。其亦可為固態形式，例如棒形式。其可作為皮膚用保養產品及/或化妝產品使用。或者，其可調配成洗髮精或潤絲精。

在已知方式中，本發明之組合物亦可含化妝品常用之添加劑及佐劑，如親水性或親脂性膠化劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、香料、填料、顏料、臭味吸收劑、與染料。

根據本發明之食品組合物中，該萃取組合物可在食品製造過程中，添加於習用之食品組合物中(亦即可食用之食品或飲品或其前驅物)。幾乎所有之食品組合物皆可添加根據本發明之該萃取組合物。可添加根據本發明之該萃取組合物之食品組合物包含，但不限於糖果、烘焙食品、冰淇淋、乳製品、甜品及風味小點、小吃、肉類替代產品、快餐食品、湯類、麵食、麵條、罐頭食品、冷凍食品、乾製食品、冷藏食品、油脂、嬰兒食品、軟食物、或麵包塗醬或其混合物。

本發明再提供一種如前述萃取組合物之用途，其係用以製備促進傷口癒合之藥物。

本發明又提供一種於一個體中促進傷口癒合之方法，其包含給予該個體治療有效量之如前述萃取組合物及視需要之醫藥上可接受之載劑或賦形劑。

較佳地，根據本發明之萃取組合物係藉由促進皮膚細胞遷移以促進傷口癒合。於本發明之一較佳具體實施例中，該萃取組合物可促進角質細胞之遷移，因此該皮膚細胞較佳係為角質細胞。另一方面，於本發明之動物模式中，根據本發明之萃取組合物可於糖尿病患者中促進傷口癒合，因此該傷口較佳係為糖尿病患者之傷口。

於本發明之具體實施例中，包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物與乳膏賦形劑相比皆於糖尿病大鼠模式中對傷口癒合有顯著效果(p<0.5)，且大豆種子萃取物治療組比大豆種子蒸氣分餾物組具有稍佳之傷口癒合效果。

於本發明之另一具體實施例中，將不同劑量大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物組合，以測試於糖尿病傷口癒合之效果。結果顯示，包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物組合治療之傷口癒合效果比單獨使用大豆種子蒸氣分餾物之效果為佳，最有效之組合為大豆種子萃取物之最高劑量。

於本發明之具體實施例中，將大豆種子萃取物、大豆種子蒸氣分餾物分別及合併使用，檢測對皮膚角質細胞遷移促進之效果，結果顯示當以包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物合併用藥時，其促進皮膚角質細胞遷移效果比單獨用藥組的效果佳。

本發明又提供一種如前述萃取組合物之用途，其係用以製備促進神經細胞增殖及/或治療腦部疾病及/或神經變性疾病之藥物。

本發明又提供一種於一個體中促進神經細胞增殖及/或治療腦部疾病及/或神經變性疾病之方法，其包含給予該個體治療有效量之如前述萃取組合物及視需要之醫藥上可接受之載劑或賦形劑。

較佳地，該神經細胞係為中樞神經細胞；更佳為腦神經細胞；尤佳為神經母細胞。

根據本發明之腦部疾病及/或神經變性疾病較佳係選自由血管性 失智、阿茲海默氏症、帕金森氏病、血管性腦疾病、發炎性腦損傷、腦損傷週邊炎性反應、腦組織病變、腦血腫、腦室腫脹及腦室擴張所組成之群。

於本發明之一具體實施例中，以大豆種子萃取物、大豆種子蒸氣分餾物及包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物處理人類神經母細胞瘤細胞。結果可知大豆種子萃取物、大豆種子蒸氣分餾物或包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物可顯著增加人類神經母細胞瘤細胞之細胞存活率，因此大豆種子萃取物、大豆種子蒸氣分餾物或包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物可促進人類神經母細胞瘤細胞之增殖。

於本發明之另一具體實施例中，於失智大鼠作為動物模型之旋臂迷宮測試中，以包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物治療後，總體記憶失誤值及參考記憶失誤值皆顯著小於未治療組，代表包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物具有治療失智大鼠之療效。

於血管性失智測試中，結果顯示血管性失智造成之記憶損傷可經由根據本發明之萃取組合物治療後明顯改善。大豆種子蒸氣分餾物及包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物皆可改善血管性失智大鼠之工作記憶失誤、參考記憶失誤及總體記憶失誤，且包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物之效果與大豆種子蒸氣分餾物相比，其治療血管性失智之記憶損傷之效果更佳。

本發明另提供一種如前述萃取組合物之用途，其係用以製備治療乳癌之藥物。

本發明又提供一種於一個體中治療乳癌之方法，其包含給予該個體治療有效量之如前述萃取組合物及視需要之醫藥上可接受之載劑或賦形劑。

較佳地，該乳癌係為p53基因突變型乳癌。

於本發明之一較佳具體實施例中，以p53蛋白異常人類乳癌細胞株建立動物模式，模擬在原發部位的狀況，以用於觀測腫瘤在小鼠模式中生長曲線。模擬在人體用藥情形，分別給予不同濃度的根據本發明之萃取組合物，觀察其結果，發現根據本發明之萃取組合物可以抑制荷瘤小鼠腫瘤之生長速度。

本發明再提供一種如前述萃取組合物之用途，其係用以製備降低干擾DNA及/或RNA複製藥劑之副作用及/或加成干擾DNA及/或RNA複製藥劑療效之藥物。

本發明又提供一種於一個體中降低干擾DNA及/或RNA複製藥劑之副作用及加成干擾DNA及/或RNA複製藥劑療效之方法，其包含給予該個體治療有效量之如前述萃取組合物及視需要之醫藥上可接受之載劑或賦形劑。

本發明所言之「干擾DNA及/或RNA複製藥劑」係指可於DNA及/或RNA複製過程中，阻止細胞分裂所需的DNA及/或RNA複製過程之藥物，並藉此殺死腫瘤細胞，較佳地，該干擾DNA及/或RNA複製藥劑為環磷醯胺(cyclophosphamide)、替莫唑胺(temozolomide)、六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)、金屬鉑絡合物、博來黴素、長春花鹼(Vinblastine)、長春新鹼(Vincristine)、紫杉醇(Paclitaxel)、歐洲紫杉醇(Docetaxel)、葉酸拮抗物、嘧啶拮抗物或嘌呤拮抗物。

於本發明之一較佳具體實施例中，以人類乳癌細胞株建立動物模式，模擬在原發部位的狀況，對於投與環磷醯胺的荷瘤小鼠相較之下，給予根據本發明之萃取組合物的荷瘤小鼠有加成化療藥物消除腫瘤的效果。給予根據本發明之萃取組合物可以抑制腫瘤成長和加成化療藥物消除腫瘤大小，並因減少腫瘤的壓迫進而減少疼痛，而給予癌症治療患者有較好的生活品質。

以下之非限制性之實例有助於本發明所屬技術領域中具通常知識者實施本發明。該等實例不應視為過度地限制本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。

實例

大豆種子萃取物(GMA1)

將大豆(Glycine max(L.)Merr.)種子研磨粉碎，並使用按重量計70%之乙醇，其中種子與乙醇之比例為1：10，在大氣壓力約1atm且溫度約45℃之環境萃取該大豆種子，以獲得一粗萃物。接著利用過濾去除步驟該粗萃物中之固體，以獲得液體部分。再真空濃縮所得之液體部分，以獲得一濃縮固體部分，再於溫度70℃烘乾所得之濃縮固體部分。

大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)

將大豆(Glycine max(L.)Merr.)種子研磨粉碎，並使用按重量計2%之乙醇，其中種子與乙醇之比例為1：10，在大氣壓力約1atm且溫度約90℃於一旋轉蒸發器(EYELA N-1000S,1000S-W)內蒸發該粗萃物並使其通過一供有冷水之冷凝管獲得。

大豆種子萃取物(GMA1)及大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)之分析

將所製得之大豆種子萃取物(GMA1)及大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)係使用分析管柱CarboPac PA1 Analytical(4x250mm)進行離子層析分析，其條件為移動相為87%水與13%之500mM NaOH，並以麥芽糖單水合物(maltose monohydrate)作為內部標準品進行等位沖提(isocratic elution)，流速為1.0ml/min，以0.5秒為一週期，每一週期中於0.00秒至0.2秒以相對電位0.1伏特進行、於0.2秒至0.4秒以0.1伏特進行、0.41秒至0.42秒以相對電位-2.0伏特進行、0.43秒以相對電位0.6伏特進行、0.44秒至0.5秒以相對電位-0.1進行，總分析時間為55分 鐘。

大豆種子萃取物(GMA1)所得之圖譜示於圖1至圖3。各圖中波峰之出峰時間如表1所示。

大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)所得之圖譜示於圖4至圖6。各圖中波峰之出峰時間如表2所示。

大豆種子萃取物(GMA1)含有極微量之異黃酮及大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)不含有異黃酮

使用高效液相層析(HPLC)分析大豆種子萃取物(GMA1)及大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)中是否包含異黃酮類化合物。

高效液相層析分析之條件如下：儀器：Hitachi HPLC CM5000 Series；幫浦：CM5110；偵測器：CM5430(DAD)；自動進料：CM5210；管柱烘箱：CM5310；使用OpenLab軟體。

管柱：RP C₁₈，4.6×250mm 5μm；偵測波長UV 254nm；流速：0.8min/ml；管柱烘箱溫度：30℃；梯度沖提，如表3所示。

異黃酮標準品之HPLC分析圖譜如圖7所示，其於18.853分鐘及24.693分鐘具有吸收峰。

大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)之HPLC分析圖譜如圖8所示，其並未出現任何吸收峰。

包含0.3重量份大豆種子萃取物(GMA1)與1重量份大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)之萃取組合物製成乳膏後之HPLC分析圖譜如圖9所示，其於17.307分鐘、19.313分鐘、20.267分鐘、20.853分鐘、24.307分鐘及25.247分鐘具有吸收峰。

經比較圖7、圖8及圖9可知，圖8之大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)之HPLC圖譜並未出現異黃酮之指紋吸收峰，因此可知大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)並不包含異黃酮類化合物；圖9中包含0.3重量份大豆種子萃取物(GMA1)與1重量份大豆種子蒸氣分餾物(GMC1)之萃取組合物之HPLC圖譜對應異黃酮之指紋吸收峰出現極微量之峰值，經換算為Daidzin含量為4.8μg/ml及Genistin含量為8.23μg/ml，與一般具療效之異黃酮有效劑量相差很大。因此可知大豆種子萃取物(GMA1)僅包含極微量之異黃酮類化合物，且其相關療效並非所含之極微量異黃酮所具有。

萃取組合物促進傷口癒合

材料與方法：

使用獲得自台灣國家實驗動物中心之約8週大，體重約250g至300g之雄性SD大鼠，經過7天之隔離後，直到大鼠體重超過350g則將其移動。大鼠以耳槽標示，而每個飼養箱上標記飼養箱編號、研究編號、性別和組名。每一聚碳酸酯飼養箱內飼養2隻大鼠，並飼養於AAALAC認證之動物設施中。

飼養條件為溫度21±2℃、相對濕度50±20%、光照12小時，避光12小時，於整個研究期間自由攝食Laboratory Rodent Diet 5001 (PMI^R Nutrition International,Inc.,MO,USA)，並將水以水瓶供給自由攝取，並附著至飼養箱。

實驗方法：

依下表4分組並製備樣品。

CGS-21680：特異性腺苷A_2A亞型受體激動劑，1.67mg之CGS-21680加入248.4g乳膏賦形劑中製得。

糖尿病大鼠：

將體重超過300g之大鼠以靜脈注射一劑鏈脲佐菌素(STZ，65mg/kg)。選擇具有2個月高血糖(超過300mg/dL)之STZ誘導大鼠進行傷口癒合測試。

糖尿病大鼠之創傷手術：

淘汰體重低於300g之糖尿病大鼠，其餘隨機分組。將大鼠以戊巴比妥麻醉，並將手術區域(背側區域)之毛髮除去，接著在每隻大鼠 背中隔區域之三皮膚(距兩肩胛骨的中點4、6和8公分)用圓形切刀切除(全皮層)。

藥物治療及傷口癒合測量：

每隔一天將動物稱重，並測量傷口面積，以評價傷口癒合之結果。每天將藥物給予每個傷口兩次，並以粗棉布覆蓋傷口。於大鼠之脖子戴上罩被，以防止傷口受到動物之抓劃。於傷口癒合之測量中，在第4、6、8、10、12和14天拍攝傷口照片，拍照時，於傷口旁邊放置一個標準尺。在以Image pro(Media cybernetics)分析傷口前，將照片中之長度以標準尺進行標準化，以避免因不同照相距離產生之誤差。

資料分析及統計：

以Image pro分析大鼠背上之三個傷口面積。以原始傷口面積作為第0天之面積。原始傷口面積減去不同時間點的傷口面積，再除以原始傷口面積，以得到傷口癒合百分比。每隻大鼠三個傷口癒合百分比的平均值表示每隻大鼠的傷口癒合。數據以平均值±標準差(SEM)表示，並以統計軟體(SYSTAT，Systat software Inc)計算t檢驗表示測試結果的p值。p<0.05表示顯著差異，並標記*。p<0.01表示非常顯著差異，並標記**。p<0.001表示非常大幅顯著差異，並標記***。

結果：

於給藥後，以統計軟體分析不同時間點所測得之傷口面積，以得到傷口癒合比例，並示於表5及圖10。於第4天，乳膏賦形劑、CGS-21680、GMC1及0.3% GMA1組之傷口癒合比例分別為-83.33±6.60(%)、21.87±5.61(%)、-11.44±4.34(%)及-7.09±3.65(%)。所有的治療組在整個實驗期間與乳膏賦形劑組相比具有顯著差異。於第8至10天，傷口癒合比例於GMC1組及0.3% GMA1組更加提高，分別自-4.10±3.04(%)至40.15±6.47(%)及自21.21±5.52(%)至62.19± 3.85(%)。於第14天，傷口癒合比例於GMC1組及0.3% GMA1組顯著提高，分別為86.20±1.88(%)及91.21±2.23(%)，而相比之乳膏賦形劑為58.92±13.14(%)。

結果顯示0.3% GMA1及GMC1與單獨乳膏賦形劑相比皆有效促進傷口癒合，其中0.3% GMA1治療組比GMC1組具有稍佳之傷口癒合效果。

進一步研究糖尿病傷口癒合之GMA1及GMC1最佳組合。將GMC1分別與不同濃度之GMA1組合：0.009%、0.045%及0.09%。為比較，乳膏賦形劑及CGS-21680治療組亦進行。

於給藥後，以統計軟體分析不同時間點所測得之傷口面積，以得到傷口癒合比例，並示於表6與圖11。如表6及圖11所示，與乳膏賦形劑組相比，與GMC1組合中，隨著GMA1濃度自0.009%、0.045%至0.09%之增加，其顯著差異度亦增加。以GMC1及0.009%、0.045%及0.09%不同濃度之GMA1組合治療之糖尿病大鼠傷口癒合比例結果顯示，組合治療之效果比單獨使用GMC1之效果為佳。最有效之組合為 GMA1之最高劑量(0.09%)。

萃取組合物促進皮膚細胞遷移

利用HaCaT細胞(人類皮膚角質細胞)評估萃取組合物促進皮膚細胞遷移功效評估。

細胞遷移活性測試樣品為：A1-0.3：含0.3μg/mL的GMA1

A1-0.3-CSTC-2500X：含2500倍稀釋的GMC1和0.3μg/mL的GMA1

細胞株：HaCaT

培養基：10%胎牛血清DMEM培養基

正向控制：CGS-21680

細胞培養：HaCaT人類皮膚角質細胞株培養於含10%胎牛血清DMEM培養基，於37℃、5%CO₂培養箱中培養，每星期繼代兩次。

傷口癒合(Wound healing assay)試驗：

利用Oris Cell Migration Assay kit，將細胞植入具制止器(stopper) 的96孔細胞培養盤(4×10⁴cells/well)，並培養於二氧化碳培養箱。隔夜將制止器拔出製造傷口，加入新細胞培養基或含有測試樣品的細胞培養基後，並加入不同待測藥物或CGS-21680(正向控制組)處理後0、16及24小時，在光學顯微鏡下以100倍的放大倍率觀察，並利用相機拍攝每道傷口的癒合情形。

分析方法：

利用軟體image j來量化傷口癒合的面積；以0小時面積為傷口原始大小，經過一段時間後，傷口面積逐漸變小，計算傷口相對於0小時面積來量化傷口癒合的程度(癒合率=T16或T24時間點與T0的面積差/T0面積)，以評估藥物對HaCaT細胞遷移活性。

統計分析：

每組至少四重覆，數據以平均值±標準差表示，利用t-檢驗判斷統計顯著性。

結果：

利用HaCaT細胞遷移試驗進行GMC1和GMA1在傷口癒合能力的比較，當以0.3μg/mL的GMA1和2500倍稀釋的GMC1合併用藥(A1-0.3-CSTC-2500X)時，其促進HaCaT細胞遷移效果比單獨用藥組(A1-0.3)的效果佳(圖12)。

萃取組合物促進神經細胞增殖

材料與方法：

細胞株：人類神經母細胞瘤細胞IMR-32(購自台灣財團法人食品工業發展研究所)

試劑：HyClone^TM DMEM/High Glucose Media(Thermo Scientific)、胎牛血清(FBS、Gibco®)、HyClone®磷酸緩衝鹽水(PBS、Thermo Scientific)、抗生素抗真菌溶(Pen/Strep/Fungizone 100x；Thermo Scientific)、台盼藍、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二 苯基四唑溴化物(dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)，二甲亞碸(DMSO，Sigma)。

儀器：流式細胞儀(VERTICAL HF-4BH)

細胞培養：IMR-32細胞培養於含10%胎牛血清DMEM/高糖培養基(HyClone公司^TM)中，於37℃、5%CO₂培養箱中培養。

將IMR-32細胞以5×10⁴密度接種至96孔板，並用100μL補充有10% FBS之培養基培養24小時。給藥時，將培養基改變為100μL補充有5% FBS培養基，每組配製成25mg/mL的GMA1、GMC1或GMC1+0.3% GMA1(GM)與PBS(控制組)，並與100μL補充有10% FBS培養基組合並以FBS為陽性控制組。各組至少7重複，在96孔板中培養72小時，以進行MTT分析。

MTT分析：

將培養盤自培養箱轉移到層流罩，以每孔100μL含有0.5mg/mL MTT試劑之無血清培養基替換培養基，並培養30-60分鐘。添加等體積二甲基亞碸到各孔中，並搖動5分鐘。以ELISA讀取器測定570nm之吸光度。

數據分析及統計：

將結果以GraphPad Prism 6及T-檢驗統計分析，並以細胞存活百分率±標準差表示。

結果：

細胞存活率結果示於表7至9及圖13至15。結果可知細胞存活率在以25mg/ml的GMA1(表7及圖13)、GMC1(表8及圖14)或GMC1+0.3% GMA1(GM，表9及圖15)處理時，與PBS控制組相比顯著增加。

萃取組合物治療腦部疾病及/或神經變性疾病

(I)誘發失智症

材料與方法：

使用獲得自台灣BioLASCO之約6週大，體重約250g至300g之雄性大鼠，經過7天之隔離後，直到大鼠體重超過300g則將其移動。大鼠以尾巴紋身標示，而每個飼養箱上標記飼養箱編號、研究編號、性別和組名。每一聚碳酸酯飼養箱內飼養2隻大鼠，並飼養於動物設施中。

飼養條件為溫度25±1℃、相對濕度60±5%、光照12小時，避光12小時，飼料為Altromin 1324 FORTI(德國)，並將自來水以水瓶供給自由攝取，置於聚碳酸酯瓶中，並附著至飼養箱。

分組示於表10。

失智誘發：

8週齡大鼠連續11週每日口服給藥飼餵15mg/mL之AlCl₃溶液，劑量為100mg/kg，以誘發失智模擬症狀。將大鼠分成如表10所示之3組，並於第5週至第11週將藥劑局部施用於頭部與頸部區域，並按摩30秒，同時施用於鼻腔粘膜。於第11週開始訓練，並以第11週通過旋臂迷宮之記憶力評估失智症，於處理期間，大鼠仍連續供給AlCl₃。

旋臂迷宮：

旋臂迷宮是衡量大鼠空間學習和記憶中最常用的方法之一。旋臂迷宮是由Olton在70年代設計，它是基於迫使飢餓大鼠檢查在每個旋臂末端部的食物，訓練他們在一段時間內記住食物在迷宮中的位置，其可同時測量大鼠的工作記憶(代表短期記憶)和參考記憶(代表長期記憶)。所使用之旋臂迷宮如圖16所示，尺寸為(A)122cm(B)47cm(C)30cm(D)10cm(E)20cm。

使大鼠習慣於該環境1週。每隻大鼠稱重，讓大鼠禁食24小時。在實驗前，使大鼠的體重保持於原始體重之80%至85%，並於日常訓練(每天兩次)後給予正常飲食的60%的。在第1天及第2天，將餌料散落在旋臂和中央平台。同時放置4隻大鼠於中央平台上，使之探索迷宮10分鐘。在第3天及第4天，將餌料置於每個旋臂的端部。單獨放置每隻大鼠於中央平台上，讓老鼠探索迷宮，直到食物完食。如果大鼠未在10分鐘內完食，則訓練停止。第5至14天，將餌料置於固定4個旋臂的端部。單獨放置每隻大鼠於中央平台上，讓老鼠探索迷宮，直到置於4個旋臂之食物完食。如果大鼠未在10分鐘內完食，則訓練停止。記錄和自動分析旋臂之進入。每隻大鼠每天訓練兩次，相隔每個訓練之間相隔1小時。

分析下列三個指標：

(a)工作(短期)記憶失誤(WME)：再進入放置餌料旋臂之數目

(b)參考(長期)記憶失誤(RME)：再進入未放置餌料旋臂之數目

(c)總體記憶失誤(TME)：WME+RME

前述三指標代表大鼠學習及記憶之能力，其隨著大腦損傷之程度而顯著增加。

數據分析及統計：

使用Student t檢驗及反覆ANOVA統計分析，並以平均±標準差顯示每組之數據。比較AlCl₃組與正常組之數據以計算統計學上之顯著 性，亦比較AlCl₃組與AlCl₃+N2組之數據，以計算統計學上之顯著性。p<0.05表示顯著差異，並標記*。p<0.01表示非常顯著差異，並標記**。

結果：

據報導，重金屬誘導之失智類似於阿茲海默症。兩者皆引起澱粉樣前體蛋白，並導致老年斑和神經原纖維纏結的形成。因此，採用失智大鼠作為動物模型以瞭解包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物對類阿茲海默症的影響。結果示於圖17至19。圖17之第4日大鼠迷宮軌跡圖顯示AlCl₃+N2組經治療後可依記憶快速尋找出食物位置，而AlCl₃及AlCl₃+乳膏賦形劑組則否；圖18顯示AlCl₃組TME值與AlCl₃+乳膏賦形劑組並無顯著差異(p>0.05)，而經包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物治療後於檢測第4日之後TME值皆顯著小於AlCl₃組(AlCl₃+N2 p=0.0128)，代表包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物具有治療失智大鼠之療效；圖19顯示AlCl₃組RME值與AlCl₃+乳膏賦形劑組並無顯著差異(p>0.05)，而經包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物治療第4日之RME值顯著小於AlCl₃組(p=0.0046)，代表包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物具有恢復大鼠長期記憶力之療效。結果顯示，AlCl₃組之失智大鼠在旋臂迷宮測試中之失誤顯著比控制組高，顯示AlCl₃確實成功造成失智，而此參考記憶障礙亦經包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物治療後顯著改善，顯示包含大豆種子萃取物及大豆種子蒸氣分餾物之萃取組合物具有治療失智之效果。

(II)血管性失智

材料與方法：

依下表11分組：

與前述(I)誘發失智症中使用相同之大鼠及飼養條件。

將大鼠以1：1.5之氯胺酮-甲苯噻嗪混合物(0.1mL/100g，i.p.)麻醉，並固定於手術板。經由中線頸切口在背頸部區域露出雙側頸總動脈，並用絲線縫合進行雙重結紮。傷口縫合後，將大鼠放置在溫暖光線下直到康復。

將乳膏賦形劑(M)、GMC1(M1)和GMC1+0.5%GMA1(M3)藥劑局部施用於頭部與頸部區域，並按摩30秒，同時施用於鼻腔粘膜。治療持續4週，並於最後2週進行旋臂迷宮之測試。與前述(I)誘發失智症中使用相同之旋臂迷宮測試。

數據分析及統計：

使用非配對Student t檢驗及雙向ANOVA統計分析，並以平均±標準差顯示每組之數據。比較假手術組與2VO組之數據以計算統計學上之顯著性，亦比較藥物治療組與2VO組之數據，以計算統計學上之顯著性。p<0.05表示顯著差異，並標記*。p<0.01表示非常顯著差異，並標記**。

結果：

結果顯示2VO組之失誤比假手術組顯著升高(圖20至23)，可知雙側頸總動脈結紮成功誘導大鼠之血管性失智，而此血管性失智造成之記憶障礙可經由2週之M1及M3之治療顯著改善。根據電腦斷層掃描掃描患病大鼠之大腦，其顯示雙側頸總動脈雙邊阻塞(2VO)引起腦組 織的腫脹、軟化及組織溶解，甚至血液凝塊形成，因而引起失智。而此腦損傷在使用M1及M3之治療後顯著下降。

萃取組合物治療乳癌及降低干擾DNA及/或RNA複製藥劑之副作用及加成干擾DNA及/或RNA複製藥劑療效

材料

細胞株及藥品：

MDA-MB-231：購自食品工業研究所

Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture(100x)、胎牛血清(FBS)及Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)皆購自Gibco®。

環磷醯胺(cyclophosphamide，CTX)商品名為癌得星。

試驗動物：試驗動物為由行政院國科會國家實驗動物中心繁殖、提供之6~8週大BALB/cAnN.Cg-Eoxn1^nu/CrlNarl母裸鼠，室溫維持在25±1℃，濕度維持在60±5%，水分與飼料充分供給之獨立空調的高醫動物房內。一週後，待動物穩定後開始試驗。本研究中對實驗動物之處理及一切實驗過程，均依據實驗動物委員會之標準章程規範進行。飼育於控制光線及溫度之動物房。

荷瘤小鼠之腫瘤誘發

培養人類乳癌細胞MDA-MB-231細胞至5×10⁶cells後，以胰蛋白酶收集所需注射母裸鼠之細胞數後，回溶細胞至PBS溶液中，進行腫瘤的誘發。裸鼠腫瘤的誘發以皮下注射100μL的細胞溶液後放回飼養籠予以正常飲食，並於腫瘤生長約至300mm³後，進行萃取組合物不同濃度的外用投予與裸鼠分組，分為給予化療藥物CTX與不給予化療藥物組，之後每週觀察各組裸鼠的體重、食慾、血糖與腫瘤大小生長情形，並評估裸鼠正常生理外觀狀態以了解萃取組合物之療效。

荷瘤小鼠之分組及治療

荷瘤小鼠腫瘤誘發至約300mm³後，如表12進行下列分組，其中 化療藥物(一週一劑注射治療)與萃取組合物一起投予，藥物投予組則每天以萃取組合物於腫瘤生長位置、附近皮膚以及沿著脊椎的整個背部皮膚進行塗抹0.1g/天，以此治療5週後觀察並測量裸鼠體重、食慾、血糖及腫瘤大小的生長速度。

荷瘤小鼠之臨床評估

評估荷瘤小鼠之生理狀態與腫瘤大小，評估生理狀態標準則分為：體重、食慾、血糖、腫瘤大小。腫瘤之大小計算方式為腫瘤體積(mm³)=ab²/2，以評估腫瘤生長速度。

結果：

在人類乳癌細胞MDA-MB-231誘發裸鼠腫瘤動物模式中，以萃取組合物治療後，萃取組合物(J1與J2)對於裸鼠的腫瘤生長有抑制腫瘤成長效果(表13及圖25)。在生理觀察中，萃取組合物治療組有較好的食慾和血糖值。

而在GMC1+0.5%GMA1(NO CTX+ L5組)組亦可觀察到萃取組合物對於裸鼠的腫瘤生長有抑制腫瘤成長效果(圖26)。

比較正常組、腫瘤+化療藥物組(CTX組)與藥物投予+化療藥物組(CTX+L1及CTX+L5組)的生理與腫瘤生長評估。由表14及圖26及27可觀察到CTX+L1組及CTX+L5組對於投予化療藥物的荷瘤裸鼠有加成化療藥物的消除腫瘤效果，且萃取組合物亦不影響體重、平均食量及平均血糖(表15至17)。

臨床上經由癌症所引起的癌症疼痛是病人放棄治療的主要原因之一，根據研究發現，癌症疼痛有一部分成因是由腫瘤造成，主要原因為腫瘤侵犯至內臟、週邊神經、骨骼所造成的發炎反應以及神經壓迫所造成。根據本發明之萃取組合物能有效抑制腫瘤生長，亦能抑制一部分由癌症引起的疼痛反應。對於治療上也會有相當的幫助。

上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。

Claims (19)

1. 一種萃取組合物，其包含大豆種子萃取物，該大豆種子萃取物係由包含下述步驟之方法製備：(a)提供大豆種子與一萃取溶液，其中該萃取溶液為水或包含濃度低於約90wt%之醇；(b)在大氣壓力低於約1atm且溫度低於約60℃以該萃取溶液萃取該大豆種子，以獲得一粗萃物；及(c)去除步驟(b)該粗萃物中之固體，以獲得液體部分。
2. 如請求項第1項之萃取組合物，其中該製備大豆種子萃取物之方法另包含步驟(d)濃縮步驟(c)所得之液體部分，以獲得一濃縮固體部分。
3. 如請求項第2項之萃取組合物，其中該製備大豆種子萃取物之方法另包含步驟(e)烘乾步驟(d)所得之濃縮固體部分。
4. 如請求項第1項之萃取組合物，其進一步包含大豆種子蒸氣分餾物，該大豆種子蒸氣分餾物係由包含下述步驟之方法製備：(i)提供大豆種子與一第二萃取溶液，其中該第二萃取溶液為水或包含濃度低於約15wt%之醇；及(ii)在大氣壓力低於約1atm且溫度低於約110℃下以該第二萃取溶液萃取該大豆種子，並收集該蒸氣分餾物。
5. 如請求項第4項之萃取組合物，其中步驟(i)中該第二萃取溶液中醇之濃度低於約5wt%。
6. 如請求項第4項之萃取組合物，其中基於萃取組合物，該大豆種子萃取物之含量為自約0.001wt%至約5wt%及該大豆種子蒸氣分餾物之含量為自約95wt%至約99.999wt%。
7. 一種製備如請求項1至6項任何一項萃取組合物之方法，其包含製備該大豆種子萃取物之方法，且該製備該大豆種子萃取物之方法包含下述步驟：(a)提供大豆種子與一萃取溶液，其中該萃取溶液為水或包含有濃度低於約90wt%之醇；(b)在大氣壓力低於約1atm且溫度低於約60℃以該萃取溶液萃取該大豆種子，以獲得一粗萃物；及(c)去除步驟(b)該粗萃物中之固體，以獲得液體部分。
8. 如請求項第7項之方法，其中該製備萃取物之方法另包含步驟(d)濃縮步驟(c)所得之液體部分，以獲得一濃縮固體部分。
9. 如請求項第7項之方法，其中該製備萃取物之方法另包含步驟(e)烘乾步驟(d)所得之濃縮固體部分。
10. 一種如請求項第1至6項任何一項之萃取組合物之用途，其係用以製備促進傷口癒合之藥物。
11. 如請求項第10項之用途，其係用以製備促進皮膚細胞遷移以促進傷口癒合之藥物。
12. 如請求項第11項之用途，其中該皮膚細胞係為角質細胞。
13. 如請求項第10項之用途，其中該傷口係為糖尿病患者之傷口。
14. 一種如請求項第1至6項任何一項之萃取組合物之用途，其係用以製備促進神經細胞增殖及/或治療腦部疾病及/或神經變性疾病之藥物。
15. 如請求項第14項之用途，其中該神經細胞係為神經母細胞。
16. 如請求項第14項之用途，其中該腦部疾病及/或神經變性疾病係選自由血管性失智、阿茲海默氏症、帕金森氏病、血管性腦疾病、發炎性腦損傷、腦損傷週邊炎性反應、腦組織病變、腦血腫、腦室腫脹及腦室擴張所組成之群。
17. 一種如請求項第1至6項任何一項之萃取組合物之用途，其係用以製備治療乳癌之藥物。
18. 如請求項第17項之用途，其中該乳癌係為p53基因突變型乳癌。
19. 一種如請求項第1至6項任何一項之萃取組合物之用途，其係用以製備加成干擾DNA及/或RNA複製藥劑療效之藥物，其中該干擾DNA及/或RNA複製藥劑係為環磷醯胺(cyclophosphamide)。