CN107446946A - 禾本科植物抗病信号途径中的负调控因子及其应用 - Google Patents

禾本科植物抗病信号途径中的负调控因子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及禾本科植物抗病信号途径中的负调控因子及其应用。本发明揭示了GLIP1和GLIP2是水稻抗病信号途径中的负调控因子，且它们具有酯酶活性。GLIP1和GLIP2的下调剂可应用于植物杂交育种，获得防卫反应能力改变或品种改良的植物。

Description

禾本科植物抗病信号途径中的负调控因子及其应用
技术领域
本发明属于植物学和分子生物学领域，更具体地，本发明涉及禾本科植物抗病信号途径中的负调控因子及其应用。
背景技术
脂质(lipids)是一大类由脂肪酸和醇所形成的类脂及其衍生物的总称，它是人类重要的热量和营养来源，也是构成植物细胞膜的必需组份，具有生物活性的脂质分子还参与了众多生命活动的过程。过去几十年的研究极大地增加了本发明人对于植物脂类、脂类代谢物和脂类代谢以及修饰的酶在抵抗病原菌的过程中所发挥作用的了解。植物表皮的蜡质提供了抵抗病原菌入侵的物理防御壁垒，细胞膜提供了植物细胞识别病原菌激发子的表面平台，除了这些传统的认识外，目前人们研究和关注的更多的是从膜上释放的脂类和脂类代谢物作为信号分子在激发植物防卫反应的过程中发挥的重要作用。植物细胞膜是具有生物活性的脂质的库源，许多氧化脂质的前体从膜上会释放出来，其中最有代表性的是茉莉酸，它是植物抗病反应中重要的信号分子。近年来，研究发现脂肪酸(fatty acids，FAs)代谢途径在植物抵抗病原菌的过程中发挥重要的作用，很多证据表明脂质分子在植物抗病信号从近端往远端的传递中发挥重要的作用，脂质代谢的重要物质G3P和脂转运蛋白DIR1作为可移动的信号分子协同作用，共同参与了植物SAR的建立。
酯酶催化了脂质的代谢，它可以水解酯键生成脂肪酸和醇。GDSL酯酶是一大类新发现的水解酶家族，由于它们功能的多样性正受到越来越多的的关注。与一般的Gly-X-Ser-X-Gly(X代表任意氨基酸)酯酶不同，它含有5个非常保守的Blocks，活性位点丝氨酸位于N端保守的GDS(L)序列中。GDSL酯酶在生物体中广泛存在，它是一个非常庞大的家族。
水稻基因组含有114个预测编码GDSL酯酶的基因，按照它们在水稻12条染色体上的分布位置和顺序，命名为OsGELP1～OsGELP114。生物信息学结合芯片分析结果表明不同进化分支(clade)上的GDSL酯酶成员具有不同的功能，它们广泛参与了水稻的生长发育和形态建成、次生代谢途径以及对生物和非生物胁迫的响应。但是到目前为止只有两个基因进行了一些简单的功能研究，OsGELP33(GER1)基因受红光、远红光以及JA的诱导，它参与了胚芽鞘的伸长和发育过程；OsGELP63可能在水稻耐盐和耐冷的过程中起作用。除此以外，其他的绝大多数成员功能都还是未知的。
发明内容
本发明的目的在于提供禾本科植物抗病信号途径中的负调控因子及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种提高禾本科植物的防卫反应能力的方法，所述方法包括：下调禾本科植物中GLIP1(GDSL LIPASE1)多肽和/或GLIP2(GDSL LIPASE2)多肽的表达或活性。
在一个优选例中，所述的下调植物体内GLIP1多肽的表达或活性的方法包括：在植物的基因组中敲除或沉默GLIP1多肽；或将下调GLIP1基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入植物中；或所述的下调植物体内GLIP2多肽的表达或活性的方法包括：在植物的基因组中敲除或沉默GLIP2多肽；或将下调GLIP2基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入植物中。
在另一优选例中，所述的下调GLIP1基因转录、多肽表达的下调剂是特异性干扰GLIP1基因表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是GLIP1基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物；或所述的下调GLIP2基因转录、多肽表达的下调剂是特异性干扰GLIP2基因表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是GLIP2基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
在另一优选例中，所述的提高禾本科植物的防卫反应能力是提高禾本科植物的抗病能力。
在另一优选例中，所述的提高禾本科植物的抗病能力是提高禾本科植物对于病菌的抗性；较佳地，所述的病菌包括(但不限于)：稻瘟病菌，白叶枯病菌。
在另一优选例中，所述的OsGLIP1多肽选自下组：(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)与(a)限定的蛋白序列有90％以上(较佳地95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。
在另一优选例中，所述的OsGLIP2多肽选自下组：(a’)如SEQ ID NO:4氨基酸序列的蛋白；(b’)将SEQ ID NO:4氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a’)蛋白功能的由(a’)衍生的蛋白；或(c’)与(a’)限定的蛋白序列有90％以上(较佳地95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a’)蛋白功能的由(a’)衍生的蛋白。
在本发明的另一方面，提供一种下调禾本科植物中GLIP1多肽和/或GLIP2多肽的表达或活性的物质的用途，用于提高禾本科植物的防卫反应能力。
在一个优选例中，所述的下调植物体内GLIP1多肽的表达或活性的方法包括：在植物的基因组中敲除或沉默GLIP1多肽；或将下调GLIP1基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入植物中；或所述的下调植物体内GLIP2多肽的表达或活性的方法包括：在植物的基因组中敲除或沉默GLIP2多肽；或将下调GLIP2基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入植物中。
在另一优选例中，所述的下调GLIP1基因转录、多肽表达的下调剂是特异性干扰GLIP1基因表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是GLIP1基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物；或所述的下调GLIP2基因转录、多肽表达的下调剂是特异性干扰GLIP2基因表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是GLIP2基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
在另一优选例中，，所述的特异性干扰GLIP1基因表达的干扰分子或特异性干扰GLIP2基因表达的干扰分子含有式(I)所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向或Seq反向-X-Seq正向 式(I)，
式(I)中，
Seq正向为SEQ ID NO:1中第727-1192位所示的多核苷酸，Seq反向为与Seq正向互补的多核苷酸；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在本发明的另一方面，提供GLIP1多肽和/或GLIP2多肽的用途，用于水解酯键，发挥酯酶活性。
在本发明的另一方面，提供一种GLIP1多肽和/或GLIP2多肽或其编码基因的用途，用作鉴定禾本科植物的防卫反应能力的标记物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、各种处理对OsGLIP1和OsGLIP2基因表达水平的影响。
A、B：水稻14天幼苗用300μM BTH喷施处理，不同时间点取样检测OsGLIP1(A)和OsGLIP2(B)基因表达水平的变化；
C、D：水稻14天的幼苗，用1mΜSA喷施处理，不同时间点取样检测OsGLIP1(C)和OsGLIP2(D)基因表达水平的变化；
E、F：水稻生长2个月的植株接种白叶枯病小种PXO99，不同时间点取样检测OsGLIP1(E)和OsGLIP2(F)基因表达水平的变化。
所有实验重复三次得到相同的结果。水稻Actin1基因为内表。
图2、OsGLIP1和OsGLIP2基因结构示意图。
图3、OsGLIP1和OsGLIP2具有酯酶活性
A、OsGLIP1蛋白的纯化过程：1：诱导前菌液，2：诱导后菌液，3：超声后沉淀，4：超声后上清，5：过柱后流出液，6：PBS洗脱液，7：蛋白所在液；
B、蛋白电泳考染检测纯化的OsGLIP1和OsGLIP2蛋白；
C、以4-硝基苯乙酯为底物检测酶活；
D、以4-硝基苯丁酯为底物检测酶活。
注：OsGLIP1和OsGLIP2的反应蛋白量都为30μg，GST蛋白30μg为反应阴性对照。
图4、OsGLIP1和OsGLIP2基因的表达模式。Real-time PCR检测水稻不同组织OsGLIP1和OsGLIP2基因的表达量：(A)为OsGLIP1；(B)为OsGLIP2；(C)和(E)依次分别是OsGLIP1启动子驱动GUS表达幼苗、穗、叶片、叶鞘、节和节间的GUS染色结果；(D)和(F)依次分别是OsGLIP2启动子驱动GUS表达幼苗、穗、叶片、叶鞘、节和节间的GUS染色结果。
图5、OsGLIP1/2-RNAi植株基因表达量以及抗病性检测。
A、Real-time PCR检测OsGLIP1和OsGLIP2基因的表达量；
B、OsGLIP1/2-RNAi植株接种白叶枯病菌小种PXO99 14天后病斑长度统计，数值代表病斑长度平均值±标准差，**表明统计有极显著差异(Fisher’sLSD，α＝0.01)；
C、各挑选2片代表性病斑长度叶片拍照；
D、接种白叶枯病0、4、8、12天发病病斑长度统计；
E、白叶枯病菌生长曲线。
图6、OsGLIP1和OsGLIP2过表达分析。
A、OsGLIP1-OE植株基因表达量检测；
B和C、分别是OsGLIP1-OE植株接种PXO99 14天后病斑长度统计以及代表性叶片；
D、OsGLIP2-OE植株基因表达量检测；
E和F、分别是OsGLIP2-OE植株接种PXO99 14天后病斑长度统计以及代表性叶片。
B和E中的数值代表病斑长度平均值±标准差，**表明有极显著差异(Fisher’s LSD，α＝0.01)。
图7、OsGLIP基因表达影响水稻对真菌病原菌的抗性。
A、孕穗期水稻接种稻瘟病菌孢子悬浮液7天后的叶片发病情况。
B、接种后第7天稻瘟病菌病斑的相对面积百分比(病斑面积/叶面积)。**P<0.01。
图8、OsGLIP1/2-RNAi和OsGLIP1-OE植株抗感病原因分析。
水稻2个月大的成熟苗，接种白叶枯病菌小种PXO99，分别于0、3、6、9、12、24、48和72小时取样，Real-time PCR检测PR基因诱导表达的情况。A、OsPR1a；B、OsPR1b；C、OsPR5；D、OsPR10。
图9、OsGLIP1和OsGLIP2的亚细胞定位。
A～D为OsGLIP1在水稻原生质体的亚细胞定位；E和F为水稻OsGLIP1-eGFP转基因植株幼苗根中OsGLIP1的亚细胞定位；G和H是E和F质壁分离的结果；I～L为水稻OsGLIP1-eGFP幼苗根与Nile Red的共染结果；M和N为水稻OsGLIP2-eGFP转基因植株幼苗根中OsGLIP2的亚细胞定位；O和P是M和N质壁分离的结果。图中所有Bar＝20μm。
图10、OsGLIP1-eGFP的转基因植株感病性增强。
A、Western Blot检测OsGLIP1-eGFP的转基因植株不同的株系，一抗使用兔血清GFP抗体。NS表示非特异性带作为上样量的内标；
B、OsGLIP1-eGFP的转基因植株接种白叶枯病菌小种14天后的病斑长度。数值代表病斑长度平均值±标准差，**表明有极显著差异(Fisher’s LSD，α＝0.01)。灰色代表白叶枯病菌小种PXO99，黑色代表白叶枯病菌小种DY89031；
C、每个植株挑选2片代表性病斑长度叶片拍照。
图11、OsGLIP的脂质体单位是其生物学功能必须的。
A、OsGLIP1全长及截除信号肽后与GFP融合蛋白的结构示意图。
B-D、转基因植物根中不同OsGLIP1蛋白的亚细胞定位。截除信号肽后完全解除了OsGLIP1-GFP蛋白的脂质体定位(C)，而仅含有信号肽的SP-GFP定位于脂质体(D)。
E-F、去除信号肽后降低了的OsGLIP1抑制植物免疫的功能。OsGLIP1-GFP和OsGLIP1ΔSP-GFP转基因植株接种白叶枯病后的代表性病斑的叶片(E)和病斑长度(F)。箭头显示病斑的底部。数值代表病斑长度平均值±标准差，**表明有极显著差异P<0.01。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究，揭示了与禾本科植物防卫反应能力相关的多肽，所述多肽是GDSL酯酶家族的两个成员GLIP1和GLIP2，其是水稻抗病信号途径中的负调控因子。GLIP1和GLIP2的下调剂可应用于植物杂交育种，获得防卫反应能力改变或品种改良的植物。
本发明中，对于适用于本发明的植物(或作物)没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物或林业植物等。所述的植物比如可以是(但不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于禾本科植物。比如，禾本科的水稻，小麦，大麦，黑麦，高粱，玉米。较佳地，所述的“植物”是水稻。
本发明中，“防卫反应”是指当外界因素侵染植物时，植物细胞会发生一系列的应激反应，以防御外界因素的侵害。所述的外界因素包括(但不限于)：细菌侵染，真菌侵染，病毒侵染，昆虫侵害。所述的“提高防卫反应能力”包括“提高抗病能力”；所述的“提高抗病能力”包括“提高植物对于病菌的抗性”。所述的病菌包括(但不限于)：稻瘟病菌，白叶枯病菌。
在本发明中，术语“GLIP1多肽”指具有调节禾本科植物防卫反应能力的功能的SEQ ID NO:2序列的多肽；该术语还包括具有调节禾本科植物防卫反应能力功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。术语“GLIP2多肽”指具有调节禾本科植物防卫反应能力的功能的SEQ ID NO:4序列的多肽；该术语还包括具有调节禾本科植物防卫反应能力功能的、SEQ ID NO:4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-50个，更佳地1-30个，更佳地1-20个，还更佳如1-10个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(如50个以内，更佳地30个以内，较佳地为20个以内，更佳地为10个以内)氨基酸。
多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与GLIP1多肽和/或GLIP2多肽的DNA杂交的DNA所编码的多肽。
来源于水稻的GLIP2和GLIP1是同源基因，水稻中GLIP1多肽和GLIP2多肽的氨基酸序列有73％的相似度。本发明还包括来源于其它禾本科水稻的，与GLIP1多肽和GLIP2多肽具有同源性、且具有调节植物防卫反应能力的功能的多肽。它们可以与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4表征的多肽具有40％以上的同源性；较佳地具有50％以上的同源性；更佳地具有60％以上的同源性；进一步更佳地具有80％以上的同源性；例如85％以上，90％以上，95％以上。
本发明还提供了编码本发明GLIP1多肽和/或GLIP2多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码GLIP1多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体；编码GLIP2多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽或其变异形式但与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的编码区序列有差别的核酸序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明的实施例中表明，GLIP1多肽和GLIP2多肽的表达受BTH处理和白叶枯病菌侵染的抑制。体外生化实验证明GLIP1和GLIP2具有酯酶的活性。GLIP1主要在叶片和叶鞘表达，而GLIP2在节和节间中有表达。亚细胞定位结果显示GLIP1定位于脂质体(lipid body)，其N端的29个氨基酸信号肽对于GLIP1脂质体的定位是必需的；不同的是，GLIP2则定位于细胞壁。本发明人还通过RNA干扰和过表达详细研究了这两个基因的在抗病途径中的功能，明确了GLIP1和GLIP2是水稻抗病信号途径中的负调控因子。
可基于GLIP1多肽和/或GLIP2多肽对于植物的上述影响作用来改变植物，从而达到根据实际生产需要改良植物品质的目的。较佳地，所述的植物是禾本科植物；最佳地，所述的植物是水稻。
本发明提供了所述的GLIP1和/或GLIP2多肽或其编码基因的用途，用于调节禾本科植物的防卫反应能力。所述的GLIP1和/或GLIP2多肽可以作为调节禾本科植物的防卫反应能力的靶标，通过下调GLIP1多肽和/或GLIP2多肽的表达或活性，从而提高禾本科植物的防卫反应能力。
本发明还涉及GLIP1多肽和/或GLIP2多肽或其编码基因的下调剂(如反义的GLIP1和/或GLIP2基因，或siRNA，miRNA，shRNA，反义核苷酸)及其用途。由于GLIP1和/或GLIP2的下调剂(也成为抑制剂或拮抗剂)可下调GLIP1和/或GLIP2的表达和/或抑制GLIP1和/或GLIP2的活性等，因此，所述的GLIP1和/或GLIP2的下调剂可通过对GLIP1和/或GLIP2的影响来调节植物的性状，从而达到改良植物的目的。
任何可抑制GLIP1和/或GLIP2蛋白的活性、下调GLIP1和/或GLIP2蛋白的稳定性、抑制GLIP1和/或GLIP2基因的表达、减少GLIP1和/或GLIP2蛋白有效作用时间、或降低GLIP1和/或GLIP2基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于改良植物，特别是提高禾本科植物的防卫反应能力的有效物质。
本发明提供了一种提高禾本科植物的防卫反应能力的方法，所述的方法包括：下调禾本科植物中GLIP1多肽和/或GLIP2多肽的表达或活性。
在得知了所述的GLIP1多肽和/或GLIP2多肽的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低GLIP1和/或GLIP2蛋白的表达或使之缺失表达，比如将携带反义GLIP1和/或GLIP2基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达GLIP1多肽和/或GLIP2多肽。或将下调GLIP1和/或GLIP2基因转录、蛋白表达或蛋白活性的下调剂转入植物中；例如，所述的下调剂是特异性干扰GLIP1和/或GLIP2基因转录的干扰分子。
作为本发明的一种方式，一种提高禾本科植物的防卫反应能力的方法包括：
(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有GLIP1和/或GLIP2基因表达的干扰分子(包括但不限于dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物)；
(s2)将植物细胞、组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使所述GLIP1和/或GLIP2基因的干扰分子转入植物细胞；
(s3)选择出转入了GLIP1和/或GLIP2基因的干扰分子的植物细胞、组织、器官；和
(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物，即为所需的转基因植物。
可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
目前已知的小分子干扰方式包括但不限于：miRNA调控的基因沉默，正义RNA引起的共抑制(Cosuppression)，反义RNA抑制，病毒介导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing，VIGS)，发卡式RNA(hairpinRNA，hpRNA)介导的基因沉默等，这些也可被应用于本发明中。
本发明人在反复比较的基础上确定了一种能够同时干扰水稻GLIP1和/或GLIP2基因，并且干扰效果非常理想的干扰分子。所述的干扰分子含有式(I)所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向或Seq反向-X-Seq正向 式(I)，
式(I)中，Seq正向为SEQ ID NO:1中第727-1192位所示的多核苷酸，Seq反 向为与Seq正向互补的多核苷酸；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。所述的间隔序列(X)本身不构成互补双链结构。
式(I)所示的结构在转入植物细胞后，形成式(II)所示的二级结构：
式(II)中，||表示在Seq正向和Seq反向之间的基本上互补的关系。
GLIP1多肽和/或GLIP2多肽的另一个应用是作为酯酶，水解具有酯键的底物。
GLIP1多肽和/或GLIP2多肽或其基因的另一个应用作为鉴定禾本科植物防卫反应能力的分子标记。可通过分析待测植物(如植物的种子或幼苗)中GLIP1多肽和/或GLIP2多肽或其基因的表达情况，来判断其防卫反应能力。例如，鉴定到植物中GLIP1多肽和/或GLIP2多肽的表达低或无，则该植株可呈现具有强的防卫反应能力；而若鉴定到GLIP1多肽和/或GLIP2多肽的较高表达(过量表达)，则该植株可呈现具有弱的防卫反应能力。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、材料与方法
1.克隆构建
1.1 RNAi克隆pTCK303-OsGLIP1/2的构建
以OsGLIP1的cDNA克隆为模板，用引物GLIP1/2-CK303-F：5’-GGATCCTTCGCGCTCTACCTGA-3’(SEQ ID NO:5)(含有BamHI位点)和GLIP1/2-CK303-R：5’-GGTACC ACTAGTGCAGAATGGGCG-3’(SEQ ID NO:6)(含有KpnI SpeI位点)扩增出目的片段(477bp，其中含有SEQ ID NO:1中第727-1192位所示的多核苷酸)，连入T-easy载体，测序正确后，先用SacI和SpeI双酶切将片段正向连入到pTCK303，得到pTCK303-GLIP1/2(SacI-SpeI)，然后再用KpnI和BamHI双酶切将目的片段反向连入到pTCK303-GLIP1/2(SacI-SpeI)，最终得到pTCK303-GLIP1/2(SacI-SpeI)-GLIP1/2(KpnI-BamHI)，其可以干扰OsGLIP1，也可以干扰OsGLIP2。
1.2 过表达克隆pUN1301-OsGLIP1的构建
选用玉米的启动子UBI驱动OsGLIP1的cDNA表达，构建OsGLIP1的过表达克隆。以水稻TP309的cDNA为模板，用引物GLIP1-OE-F：5’-GGATCCAGGAAAACGAAAGCCAT-3’(SEQ ID NO:7)(含有BamHI位点)和GLIP1-OE-R：5’-GGTACCGGAGGGAAGGGAGTAT-3’(SEQ ID NO:8)(含有KpnI位点)扩增出目的片段，连入T-easy载体，测序正确后，用BamHI和KpnI双酶切，连入pUN1301载体，获得pUN1301-OsGLIP1。
1.3 过表达克隆pUN1301-OsGLIP2的构建
选用玉米的启动子UBI驱动OsGLIP2的gDNA表达，构建OsGLIP2的过表达克隆。以OsGLIP2的基因组DNA为模板，在前后的UTR区域设计引物GLIP2-OE-F：5’-GGTACCGAGCTGTGGCGTTGCG-3’(SEQ ID NO:9)(含有KpnI位点)和GLIP2-OE-R：5’-GGTACCGAGCTGTGGCGTTGCG-3’(SEQ IDNO:10)(含有SacI位点)，扩增出目的片段，连入T-easy载体测序鉴定，再用KpnI和SacI双酶切，连入到pUN1301载体，获得pUN1301-OsGLIP2。
1.4 亚细胞定位克隆pUN1301-OsGLIP1-eGFP及其相关截短克隆的构建
选用pUN1301载体，在其eGFP的两端引入KpnI和SacI酶切位点，PCR产物连T-easy测序正确后，用KpnI和SacI双酶切连入到pUN1301载体，得到pUN1301-eGFP。然后，以OsGLIP1的cDNA为模板，采用引物GLIP1-eGFP-F：5’-GGATCCAGGAAAACGAAAGCCAT-3’(SEQ ID NO:11)(含有BamHI位点)和GLIP1-eGFP-R：5’-GGTACCGAGCAGAATGGGCGGGTGGCAG-3’(SEQ IDNO:12)(含有KpnI位点)(注意：该引物设计过程中需要去除终止密码子以及确保读码框与eGFP融合不发生移码)，扩增出目的条带，连入T-easy测序正确后，再用BamHI和KpnI双酶切将GLIP1片段连到pUN1301-eGFP载体，最终得到pUN1301-OsGLIP1-eGFP。
采用截短克隆引物GLIP1Δ29-eGFP-F：5’-GGATCCATGGAGCATGGCGGCGGC-3’(SEQ ID NO:13)(含有BamHI位点)和GLIP1Δ29-eGFP-R：5’-GGTACCGAGCAGAATGGGCGGGTGGCAG-3’(SEQ ID NO:14)(含有KpnI位点)，以OsGLIP1的cDNA为模板，扩增出目的片段，连入pUN1301-eGFP载体，得到pUN1301-OsGLIP1ΔSP-eGFP克隆。
采用引物SP(GLIP1)-eGFP-F：5’-GGATCCAGGAAAACGAAAGCCAT-3’(SEQ ID NO:15)(含有BamHI位点)和SP(GLIP1)-eGFP-R：5’-GGTACCGCCGGCGACGACGCC GACGA-3’(SEQ ID NO:16)(含有KpnI位点)，以OsGLIP1的cDNA为模板，扩增出目的片段，连入pUN1301-eGFP载体，得到pUN1301-SP(GLIP1)-eGFP克隆。
1.5 亚细胞定位克隆pUN1301-OsGLIP2-eGFP的构建
以OsGLIP2的基因组DNA为模板，采用引物GLIP2-eGFP-F：5’-GGATCCGTGGCGTTGCGAGTG-3’(SEQ ID NO:17)(含有BamHI位点)和GLIP2-eGFP-R：5’-GGTACCGTGGTGCAGGATGGG-3’(SEQ ID NO:18)(含有KpnI位点)，去除终止密码子，确保表达的eGFP融合蛋白不发生移码，高保真酶扩增出目的片段，测序正确后，用BamHI和KpnI双酶切将OsGLIP2的cDNA片段连到之前构建好的克隆pUN1301-eGFP，从而得到pUN1301-OsGLIP2-eGFP。
1.6 组织表达模式克隆proOsGLIP1::GUS的构建
选用OsGLIP1基因ATG上游3300bp的启动子序列驱动GUS报告基因的表达，来检测OsGLIP1的组织表达特异性。首先将GUS从pBI101.1上用BamHI和SacI双酶切连到pCambia1300上，得到1300-GUS；然后以OsGLIP1基因所在的BAC为模板，采用引物GLIP1-promoter-F：5’-CTGCAGCCTATGACTGGCTACTTCAGT-3’(SEQ ID NO:19)(含有PstI位点)和GLIP1-promoter-R：5’-GTCGACTTTCGTTTTCCTGCACTCT-3’(SEQ IDNO:20)(含有SalI位点)，用高保真酶扩增出目的片段，连T-easy测序正确后，用PstI和SalI双酶切连入到1300-GUS，最终得到proOsGLIP1::GUS。
1.7 组织表达模式克隆proOsGLIP2::GUS的构建
选用OsGLIP2基因起始密码子ATG上游2906bp的启动子序列驱动GUS报告基因的表达。以OsGLIP2基因所在的BAC为模板，采用引物GLIP2-promoter-F：5’-AAGCTTATCAACTTGGTTTGC-3’(SEQ ID NO:21)(含有HindⅢ位点)和GLIP2-promoter-R：5’-GTCGACGCGAGACAGTGGCAT-3’(SEQ ID NO:22)(含有SalI位点)，用高保真酶扩增出目的片段，连T-easy测序正确后，用HindⅢ和SalI双酶切连入到1300-GUS，从而得到proOsGLIP2::GUS。
1.8 表达OsGLIP1重组蛋白克隆pGEX-4T-3-GLIP1的构建
由于在大肠杆菌BL21(DE3)中表达OsGLIP1的全长蛋白有困难，本发明人对其序列进行了分析，以确定影响表达的因素。结果发现OsGLIP1有29个氨基酸的信号肽，该信号肽对表达有影响。因此，本发明人表达了截短信号肽的OsGLIP1蛋白。采用引物GLIP1Δ29-enzyme-F：GGATCCGAGCATGGCGGCGGCGGC(SEQ ID NO:23)(含有BamHI位点)和GLIPΔ29-enzyme-R：CTCGAGAGCAGAATGGGCGGGTGGCA(SEQ ID NO:24)(含有XhoI位点)，以OsGLIP1的cDNA为模板，PCR扩增出目的片段，连T-easy测序正确后，用BamHI和XhoI双酶切连到pGEX-4T-3，得到pGEX-4T-3-GLIP1。
1.9 表达OsGLIP2重组蛋白克隆pGEX-4T-3-GLIP2的构建
同样地，本发明人也分析了OsGLIP2，同样发现其存在35个氨基酸的信号肽。并且，本发明人在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了不含其信号肽的重组蛋白。采用引物GLIP2Δ35-enzyme-F：GGATCCGGTGGCGTCGGCGGCGGC(SEQ ID NO:25)(含有BamHI位点)和GLIP2Δ35-enzyme-R：CTCGAGTGGTGCAGGATGGGAGGGT(SEQ ID NO:26)(含有XhoI位点)，以OsGLIP1的cDNA为模板，PCR扩增出目的片段，连T-easy测序正确后，用BamHI和XhoI双酶切连到pGEX-4T-3，得到pGEX-4T-3-GLIP2。
2.大肠杆菌感受态细胞制备、转化及鉴定
2.1 大肠杆菌感受态细胞制备
(1)将-70℃保菌的大肠杆菌DH5α划线活化2-3次，挑取新活化的DH5α单菌落接种于3-5ml LB培养基中，于37℃摇床培养过夜。
(2)按1:50～1:100的比例放大接种于100ml的LB培养基中扩增，于37℃摇床继续培养约2-3小时，至OD600＝0.4-0.6。将菌液置于冰上，冷却静置20min。
(3)4000rpm，4℃离心10min，弃上清，将菌体悬于10ml 0.05M CaCl2中，置于冰上30min。
(4)4000rpm，4℃离心10min，弃上清，菌体用4ml于4℃预冷的含15％甘油的0.05M CaCl2轻轻悬浮，分管保存，每管分装100μl，液氮快速冷冻后放置于-70℃冰箱保存备用。
2.2 大肠杆菌转化及鉴定
(1)取出贮存的大肠杆菌感受态细胞置冰上融化，加入质粒(0.1-0.5μg)或连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min。
(2)42℃热激处理90s，冰上放置5min，加入1ml液体LB培养基，37℃复苏培养60min。
(3)涂布于含有相应抗生素的选择平板上，培养约16h。
(4)挑取单菌落克隆，小摇培养约16h后，碱裂解法提取质粒DNA，酶切鉴定。
3.农杆菌感受态细胞制备、转化及鉴定
3.1 农杆菌感受态细胞制备
(1)将-70℃冻存的EHA105菌株于含Rif(20mg/L)的YEP平板活化2-3次。
(2)挑取单克隆菌落于YEP液体培养基(含20mg/L Rif)，28℃过夜振荡培养。
(3)按1:10的比例接种于50ml的YEB培养基(含20mg/L Rif)扩增培养，28℃振荡培养约6－7小时，至OD600达到0.4-0.6，将菌液悬于冰上30分钟。
(4)4℃，5,000rpm离心15分钟，弃上清，加10ml 0.15M NaCl溶液悬浮菌体，室温30min。
(5)4℃，5,000rpm离心15分钟，弃上清，用1ml预冷的20mM CaCl2悬浮，冰上放置30min。
(6)4℃，5,000rpm离心15分钟，弃上清，用1ml预冷的含20％甘油的20mMCaCl2轻轻悬浮。
(7)分装于1.5ml离心管，每管200μl，快速于液氮中冷冻，于-70℃冰箱保存。
3.2 农杆菌的转化及鉴定
(1)将10μl质粒DNA加入200μl农杆菌感受态中，轻轻混匀，冰浴30min。
(2)液氮冷冻3-5min，37℃水浴5min。
(3)加入1ml YEP培养基，28℃振荡培养4-6小时。
(4)室温6000rpm，离心2分钟，弃去部分上清，留200μl YEP培养基重悬菌体，涂于YEP(含50mg/L Kan，20mg/L Rif)平板上，28℃培养2天。
(5)挑取单克隆于YEP液体培养基(含50mg/L Kan，20mg/L Rif)，28℃振荡培养。
(6)碱裂解法提取农杆菌质粒DNA，通过PCR的方法鉴定阳性克隆，或者重新转化大肠杆菌(DH5α)，过夜培养后，挑取单菌落液体培养，提取质粒DNA，再通过酶切鉴定阳性克隆。鉴定正确的克隆用于下一步的水稻遗传转化。
通过上述方法分别将质粒pTCK303-OsGLIP1/2、pUN1301-OsGLIP1、pUN1301-OsGLIP2、pUN1301-OsGLIP1-eGFP、pUN1301-OsGLIP2-eGFP、proOsGLIP1::GUS或proOsGLIP2::GUS转入农杆菌中，进行水稻遗传转化。
Gus染色鉴定：
剪下一小片T0代转基因水稻幼苗叶片浸泡在30μl GUS染色液(含100mM pH7.0磷酸钠缓冲液，10mM EDTA，0.1％Triton100，1mM X-Gluc)，37℃放置1-2小时后观察叶片剪切处的GUS染色情况。
PCR鉴定：
根据转化克隆的核苷酸序列设计特异引物，通过PCR方法筛选阳性植株。或者可利用转基因载体所带的潮霉素基因序列设计引物，PCR扩增出1.29kb大小的DNA片段，引物序列为：Hyg-F：5’-CGA CAG TGG TCC CAA AGA-3’(SEQ ID NO:27)；Hyg-R：5’-TAT TTC TTT GCC CTC GGA CG-3’(SEQ ID NO:28)。
4.基因表达分析
4.1 水稻总RNA的提取
采用RNAase-free产品提取水稻的总RNA。
4.2 RNA的反转录
按照Invitrogen反转录试剂盒说明书(SuperScript III first-strand synthesissystem)操作将RNA反转录为cDNA。
4.3 Real-time PCR
检测仪器采用Eppendorf Mastercylcer ep realplex实时荧光定量PCR仪。
反应体系如下：
反应程序采用两步法扩增：95℃预变性30秒；95℃变性10秒，60℃退火及延伸30秒，40个循环；熔解曲线分析。采用2-△△CT法分析基因相对表达量。
Real-time PCR引物如表1。
表1
5.Western Blot检测蛋白的表达
5.1 植物蛋白的提取
水稻叶片于液氮中研磨，加入5％SDS(每100mg植物材料加200μl 5％SDS)置于冰上，沸水浴5min，13000rpm离心10min，吸取上清后加入等体积2×SDSLoading Buffer沸水浴5min。
5.2 SDS-PAGE电泳
缓冲液的配置及电泳方法参照《分子克隆实验指南》(Sambrook and Russell，2001)。制备浓度为5％的浓缩胶以及依据蛋白大小选择不同浓度的分离胶。每个样品取25μl上样，浓缩胶和分离胶分别用50V电压和100V电压跑电泳。
5.3 Western blot检测
(1)电泳结束后取出凝胶放入Transfer Buffer中浸泡至少20min。
(2)准备PVDF膜：将剪裁成适当大小的膜在甲醇中浸泡10s，再在dd H2O中浸洗5min，最后浸于蛋白转膜缓冲液至少10min。
(3)打开转膜仪，按如下顺序放置好凝胶：(下)滤纸→PVDF膜→凝胶→滤纸(上)，注意要赶走所有气泡，采用半干电转移系统转膜(15V，60min)，转膜结束后切角标记PVDF膜以识别正面。
(4)将膜在5％的封闭液中浸泡，摇床上振荡60min。
(5)在TBST中漂洗2次，每次2min。
(6)将一抗用TBST按一定比例稀释后,将膜浸入其中，37℃振荡结合60min。
(7)将膜在TBST中漂洗2次，再在100ml新鲜的TBST中洗3次，每次15min。
(8)用TBST稀释HRP标记的二抗，将膜浸入其中，37℃振荡结合60min。
(9)将膜在TBST中漂洗2次，再将膜在新鲜的TBST中洗3次，每次15min。
(10)将ECL Plus显色液的Solution A和Solution B各200μl混合,置暗处反应。将膜沥干，然后把膜放在保鲜膜上(有蛋白面朝上)，将ECL Plus混合液均匀滴在膜上，赶走气泡，封口。在暗室中压X-film，在显影液中显影，再于定影液中定影。
所用试剂配制：
SDS凝胶加样缓冲液：50mM Tris-Cl(PH6.8)，100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油。
Transfer Buffer：39mM甘氨酸，48mM Tris，0.037％SDS(电泳级)，20％甲醇；5×TBS(PH7.5)：100mM Tris-Cl(PH7.5)，2.5M NaCl。
TBS-T：TBS+0.05％Tween 20(v/v)。
封闭液：TBST+5％脱脂奶粉。
6.病原菌的接种
6.1 白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae，Xoo)
(1)取Xoo菌种，在PSA平板上活化2-3次，置于28℃培养48-72h。
(2)待长出单克隆菌落后，可以挑单克隆至PSA液体培养基小摇1-2天。
(3)吸取100μl菌液至PSA平板，用干净涂棒均匀涂布，置于28℃培养48-72h，长出的白叶枯病菌可用于水稻接种。
(4)将PSA培养基上长好的白叶枯菌用灭菌水刮洗下来，稀释至OD值为1.0。
(5)用剪刀沾取菌液，斜向下剪水稻叶尖1～2cm处。
(6)接种12-14天后，量取叶片病斑的长度。
(7)如果做生长曲线，按下面的步骤：
取接病不同天数的水稻叶片10cm，表面用75％乙醇擦拭干净，剪碎放到研钵中，加入少量灭菌的石英砂和1-2ml灭菌水，研磨好后，继续加无菌水至10ml，一起转移至10ml的管子中，振荡混匀，充分释放菌体。按照所需不同的浓度稀释菌液，涂含有15mg/L头孢氨苄的PSA平板，待生长2-3天后，统计长出的克隆数目。
6.2 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae，M.oryzae)
稻瘟病菌采用注射接种的方法。在水稻长至分蘖盛期时，利用医用注射器(针头型号4.5)在距离水稻茎顶端10厘米处，将0.1ml稻瘟病菌的孢子悬浮液注入稻茎的中央部位，注射接种的孢子浓度为2×104个/ML。接种后第7天调查发病情况，通过测量病斑的面积百分比(病斑面积/叶面积)计算病情指数。
7.GST融合蛋白的表达与纯化
(1)将构建好的蛋白原核表达载体pGEX-4T-3-GLIP1和pGEX-4T-3-GLIP2转入大肠杆菌BL21(DE3)，挑单克隆酶切验证正确后，小摇过夜；
(2)按1:50的比例接种到LB液体培养基中，28℃培养至OD600＝0.4～0.6；
(3)加入至终浓度0.2mM IPTG，18℃培养8-12h，诱导目的蛋白表达；
(4)5000rpm，4℃离心10min，收集菌体；
(5)用预冷的细菌裂解缓冲液悬浮菌体，超声破碎，400W，工作12s，间隙8s，共50次；
(6)12000rpm，4℃离心20min，去除沉淀，将上清用0.45μm的滤膜过滤，待用；
(7)通过快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography，FPLC)，将蛋白上清过GST纯化柱子，再用PBS缓冲液洗去未结合蛋白，最后再用含有还原型谷胱甘肽的洗脱液置换出结合的目的蛋白。依次收集流出液1、2和3，流出液3即为蛋白所在液，分装后-70℃保存。
所需溶液配制：
PBS缓冲液：140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4
洗脱液：50mM Tris-Cl(PH 7.5)，10mM reduced glutathione
8.酯酶活性的测定
酶活反应混合液中含有0.5M HEPES(pH 6.5)，1mM反应底物4-硝基苯乙酸酯(4-Nitrophenyl acetate，Fluka 46021)或者4-硝基苯丁酸酯(4-Nitrophenylbutyrate，Sigma N9876)，分别加入纯化的OsGLIP1和OsGLIP2重组蛋白30μg，在30℃下反应60min或120min，每隔5min测定405nm的吸光值。纯化的GST蛋白30μg作为反应阴性对照。
9.水稻叶鞘细胞原生质体制备与转化
(1)水稻种子脱壳经消毒处理后播种与1/2MS，28℃生长10天左右。
(2)将水稻幼苗取出，剪去根部和叶片，保留叶鞘组织。
(3)用单面刀片将叶鞘组织切成0.5-1mm小段，转移到15ml TVL中，继续切碎成泥。
(4)将切碎的叶鞘转移到锥形瓶中，置于暗处。
(5)配制Enzyme Solution 15ml，加入到切碎的叶鞘组织中。
(6)用锡箔纸包住叶鞘组织，避光消化4h。
(7)配制W5溶液100ml。
(8)将原生质体用滤网过滤，转移到Falcon离心管中。
(9)加入等体积的W5溶液，轻轻颠倒混匀。
(10)4℃静置过夜，分层。
(11)将中间层吸出转移至新的离心管中，镜检。
(12)加入等体积的W5溶液，轻轻颠倒混匀。
(13)离心60g，5min。
(14)去除上清，加入10ml W5溶液重悬，离心60g，5min。
(15)去除上清，加入5ml W5溶液重悬，置于冰上，避光，自然沉降30min。
(16)离心60g，5min，收集原生质体，将上层的W5溶液尽量去除干净。
(17)加入适量的MMG溶液(100μl/管)，轻轻重悬，镜检。
(18)加入10μl质粒DNA(1μg/μl)至2ml圆底离心管，再加入100μl原生质体，轻轻混匀，最后加入110μl PEG-Ca2+转化液，手指轻弹，混匀，转化时间5min。
(19)5min转化结束后，加入400μl W5溶液，颠倒混匀，终止反应，100g离心，2min。
(20)去除上清，加入1ml W5溶液重悬，25℃平放培养，过夜。
(21)100g离心，2min，留100μl W5溶液悬浮原生质体，Confocal观察荧光。
相关溶液配制：
TVL：0.3M Sotbitol，50mM CaCl2。
Enzyme Solution：0.5M Sucrose，20mM MES.KOH(PH 5.7)，20mM CaCl2，40mM KCl，3％Cellulose，0.6％Macerozyme。
W5溶液：0.1％Glucose，0.08％KCl，0.9％NaCl，1.84％CaCl2.2H2O，2mM MES.KOH(PH 5.7)。
MMG溶液：4mM MES.KOH(PH 5.7)，0.4M mannitol，15mM MgCl2。
PEG-Ca2+转化液：40％PEG4000，0.2M mannitol，100mM CaCl2。
10.DAB和Trypan Blue染色
10.1 DAB染色检测活性氧的迸发
(1)将小段叶片置于DAB solution(1mg/ml，PH＝3.8)，真空抽气30min。
(2)加入95％乙醇，煮沸脱色。
(3)解剖镜下拍照观察。
10.2 Trypan Blue染色检测细胞死亡
(1)配制染液：
(2)放入水稻叶片，加热煮10min。
(3)水合氯醛(70g/100ml)脱色，不断更换。
11.苯丙噻重氮(BTH)和水杨酸(SA)处理
防卫反应信号分子BTH和SA采用喷洒法处理TP309两周大的幼苗(Shimono et al.，2007)。BTH的喷洒浓度为300μM(含有0.5％[v/v]acetone+0.05％[v/v]Tween 20)，SA的处理浓度为1mM(含有0.01％[v/v]Tween 20)，对照处理仅含有溶剂，平均每株苗喷洒1ml溶液。处理后分别于0、3、6、9、12、24、48和72小时取样，液氮速冻后置于-80℃保存。
12.SA含量的测定
(1)每个样品取0.1克每管，共取两管(2ml离心管)，液氮速冻后每管加入钢珠，用球磨仪粉碎样品。
(2)每管加入1ml 90％甲醇，上下颠倒数下后，同一样品的两管液体及钢珠并入同一10ml离心管中(每个离心管中预先加入250ng/ml的茴香酸溶液1ml，90％甲醇配制)。
(3)2ml离心管中再加入1ml 90％甲醇，颠倒两次，离心数秒备用。
(4)10ml离心管涡旋，超声处理20min。12000rpm，4℃离心20min。将上清液移入新的离心管。
(5)沉淀中加入(3)中离心备用的2ml 90％甲醇，重复(4)，取上清液，将这两步的上清液合并，分成两等分(分别用于自由态SA和总SA测定)于5ml或10ml梨形瓶中。
(6)旋转蒸发干燥(<42℃)，parafilm膜封口，-80℃保存。
(7)在测定总SA的样品中加入500μl葡萄糖苷酶(80U/ml，100mM乙酸钠，pH5.2)。超声处理5min，涡旋后以锡箔覆盖，37℃温育90min。
(8)在测定自由态SA和总SA的样品中加入2.5ml 5％三氯乙酸，涡旋，超声处理20min，12000rpm离心20min。
(9)转移到10ml离心管中。上清用2.5ml乙酸乙酯：环戊烷(体积比为1:1)溶液抽提2次(剧烈振荡，静置5分钟即可)，将有机相混合，旋转蒸发干燥(<42℃)，-80℃冻存。
(10)HPLC上样前，样品用500μl 20％甲醇重新悬浮，涡旋，转移入1.5ml离心管备用。
(11)5μm，15×4.6mm ID Supelcosil LC-ABZPlus柱(先过LC-ABZPlusguard柱)稳定于27℃，用15％乙腈(溶于25mM KH2PO4，pH2.6)平衡，流速为1.0ml/min。每个样品上样量为100μl。
(12)洗脱过程为：首先用15％的乙腈(溶于25mM KH2PO4，pH2.6)洗脱1min；然后5min梯度到20％乙腈洗脱，20％乙腈洗脱20min；在17.5min内20％-55％乙腈梯度洗脱；然后在5min内上升到90％乙腈。
(13)重新上样前柱子洗脱梯度降到55％乙腈洗脱后，用乙腈：水(体积比为1:1)洗脱1min，然后用100％乙腈洗脱5min以减少柱子中的盐沉积，柱子用水洗1-2min后用15％乙腈(溶于25mM KH2PO4，pH2.6，0.45μm滤膜过滤)平衡15min，即可重新上样。
(14)茴香酸和水杨酸的含量用荧光检测仪测定：茴香酸的激发/发射值为305nm/365nm，水杨酸的激发/发射值为305nm/407nm。
(15)茴香酸的校准曲线为y＝13.6x+8.29(R2＝1.0)；水杨酸的校准曲线为：y＝14.27x-10.5(R2＝1.0)；(y为面积，x为ng)。
二、实施例
实施例1、各种处理抑制OsGLIP1和OsGLIP2基因的表达
BTH是SA的类似物，它可以直接作为一种信号分子诱导植物防卫基因的表达，激活抗病性。
本发明人应用BTH处理水稻TP309。结果表明，OsGLIP1和OsGLIP2基因的表达受BTH处理的抑制，在处理3h后即可观察到这两个基因表达量的明显下调(图1A和B)。
本发明人进一步用SA处理水稻TP309。结果表明，SA的处理也可以使OsGLIP1和OsGLIP2基因的表达量大大降低(图1C和D)。
为了进一步验证OsGLIP1和OsGLIP2在抗病反应中是否具有功能，本发明人接种水稻白叶枯病菌菲律宾小种PXO99，在不同的时间点取样检测OsGLIP1和OsGLIP2基因表达量。Real-time PCR的结果显示，OsGLIP1和OsGLIP2基因的表达也会受到病原菌侵染的抑制，但是下调的时间点要晚于BTH和SA的处理，在接种24h可以看到这两个基因表达量的明显下调(图1E和F)。
实施例2、OsGLIP1和OsGLIP2重组蛋白具有酯酶的活性
OsGLIP1的基因结构如图2所示，它的基因组DNA全长8226bp，中间含有一个6157bp的超长内含子。OsGLIP2是OsGLIP1在水稻中的同源基因，它们的氨基酸序列有73％的序列相同性。
为了验证OsGLIP1和OsGLIP2是否具有酯酶活性，本发明人尝试体外表达OsGLIP1和OsGLIP2的全长重组蛋白，但是结果发现表达OsGLIP1的全长蛋白有困难。通过研究分析，本发明人最终表达了截短N端信号肽的OsGLIP1重组蛋白。通过GST标签的亲和纯化，得到了39.5kD的OsGLIP130-398重组蛋白(图3A和B)。利用同样的方法，本发明人得到了截去N端35个氨基酸的OsGLIP2重组蛋白，进一步亲和纯化获得39.6kD的目的蛋白OsGLIP236-404(图3B)。
检测酯酶活性最常用的底物是4-硝基苯乙酯和4-硝基苯丁酯，本发明人把一定量的OsGLIP1和OsGLIP2蛋白加到含有底物的反应体系中去，可以看到随着时间的推移底物被逐渐水解，释放出硝基苯，说明OsGLIP1和OsGLIP2确实具有酯酶的活性(图3C和D)。
实施例3、OsGLIP1和OsGLIP2基因的表达模式
为了研究OsGLIP1和OsGLIP2基因的组织表达特异性，本发明人首先通过Real-time PCR检测了水稻不同组织中OsGLIP1和OsGLIP2基因的表达水平。结果发现，OsGLIP1在叶片和叶鞘中表达量较高，在穗中也有一定量的表达，而OsGLIP2主要在叶片、节和节间中表达量高(图4A和B)。
为了更好地说明OsGLIP1和OsGLIP2基因行使功能的部位，本发明人构建了OsGLIP1和OsGLIP2的启动子启动GUS表达的融合报告载体proOsGLIP1::GUS和proOsGLIP2::GUS，并转化水稻。转基因植株GUS活性检测的结果与Real-time PCR的结果基本一致，OsGLIP1主要在穗、叶片和叶鞘中有表达，在幼苗的叶片也可以检测到GUS弱的表达(图4C和E)；OsGLIP2则主要在节和节间中有表达，在叶片中似乎有弱的诱导表达，OsGLIP2在幼苗的根茎交界处有表达(图4D和F)。
实施例4、降低OsGLIP1和OsGLIP2的基因表达水平增强水稻对白叶枯的抗病性
前面提到OsGLIP1和OsGLIP2基因的表达量会受到病原菌接种的抑制，那么它们在水稻抗病反应中究竟起什么作用？为了研究这个问题，本发明人构建了OsGLIP1和OsGLIP2的RNA干扰克隆，制备了可以同时下调这两个基因的表达量的构建物。
在OsGLIP1/2-RNAi的转基因植株中，OsGLIP1和OsGLIP2基因的表达量确实发生下调(图5A)，然后接种白叶枯病菌PXO99检测其抗病性，可以看到与TP309相比，OsGLIP1/2-RNAi植株的抗病性显著提高(图5B和C)。
本发明人又挑选了两个代表性的株系，进一步调查接种白叶枯病菌后不同天数(0，4，8，12天)病斑的长度以及白叶枯病菌的生长曲线。结果可见，OsGLIP1/2-RNAi植株的的病斑长度显著减小(图5D)，白叶枯病菌生长量显著少于野生植株。
结果都表明，OsGLIP1/2-RNAi植株对白叶枯病菌的抗病性显著提高。
实施例5、OsGLIP1和OsGLIP2的过表达增加水稻对白叶枯的感病性
为了深入研究OsGLIP1和OsGLIP2基因的功能，本发明人构建了Ubi启动子驱动OsGLIP1和OsGLIP2基因过表达的克隆，转化TP309愈伤，各自得到大于30个独立的转基因株系(OsGLIP1-OE和OsGLIP2-OE)。
在OsGLIP1-OE的转基因植株中，Real-time PCR检测发现，OsGLIP1基因的表达量上调了500～2500倍(图6A)。接种白叶枯病小种PXO99，病斑长度的统计表明，OsGLIP1-OE植株更感病(图6B和C)。
本发明人同样通过Real-time PCR检测了OsGLIP2-OE的转基因植株中OsGLIP2基因的表达量。结果发现，OsGLIP2基因表达也上调了1000～5000倍(图6D)，接种白叶枯病小种PXO99，OsGLIP2基因的过表达植株也增强了水稻对白叶枯病的感病性，OsGLIP2-OE植株的病斑长度与TP309相比具有显著性差异(图6E和F)。
上述结果表明，OsGLIP1和OsGLIP2基因的过表达都增强了水稻对白叶枯病的感病性，再联系前面提到的降低OsGLIP1和OsGLIP2基因的表达量会增强水稻对白叶枯病的抗病性，表明OsGLIP1和OsGLIP2是水稻抗病反应中的负调控因子。
实施例6、OsGLIP1和OsGLIP2的影响水稻对稻瘟病的抗性
本发明人对孕穗期水稻接种稻瘟病菌孢子悬浮液，7天后的叶片发病情况。结果如图7A～B，可见OsGLIP1或OsGLIP2过表达植株对稻瘟病的抗性最弱，而OsGLIP1/2-RNAi植株则对稻瘟病的抗性较强。
实施例7、OsGLIP1/2-RNAi和OsGLIP1-OE植株影响了抗病相关基因的表达
本发明人挑选代表性的OsGLIP1/2-RNAi和OsGLIP1-OE株系，接种白叶枯病菌小种PXO99后于不同的时间点取样，检测PR基因表达量的变化。从Real-time PCR结果可以看出，PR基因在OsGLIP1/2-RNAi植株中受诱导表达上升地更为迅速和强烈，OsPR1a和OsPR1b在接种3-6h时即表达上调，OsPR1a表达量最高上升了9倍左右，OsPR1b最高上升了将近40倍(图8A和B)，PBZ1和OsPR10也分别最高上调了25倍和40倍左右(图8C和D)。而相反的是OsGLIP1-OE植株在接种白叶枯病菌后PR基因的诱导表达受到抑制，要低于TP309中PR基因的诱导表达(图8A、B、C和D)。
上述结果表明，PR基因的差异性诱导表达是造成OsGLIP1/2-RNAi和OsGLIP1-OE植株抗感病的原因之一，OsGLIP1和OsGLIP2可能作用于PR基因的上游，负调控了水稻对病菌的抗性。
实施例8、OsGLIP1和OsGLIP2的亚细胞定位
首先，本发明人构建了OsGLIP1-YFP融合的瞬时表达载体，转化水稻叶鞘细胞制备的原生质体，观察OsGLIP1的亚细胞定位。
Confocal结果显示，OsGLIP1在原生质体内呈现不均匀的点状分布(图9A)。进一步与脂质体(Lipid body)的特异性染料Nile Red共染，发现二者荧光可以很好地共定位(图9B、C和D)。
本发明人又构建了Ubi启动子驱动的OsGLIP1-eGFP融合表达克隆，转化愈伤获得转基因阳性植株，Confocal观察转基因幼苗的根部细胞，可以看到大小不均一的点状或球状分布(图9E和F)。质壁分离的结果表明GFP荧光信号主要在细胞膜内(图9G和H)。
接着，本发明人将水稻幼根与Nile Red共染，结果显示OsGLIP1主要定位于脂质体的内部(图9I、J、K和L)，这可能与OsGLIP1的酯酶功能一致。
本发明人也构建了Ubi启动子驱动的OsGLIP2-eGFP融合表达克隆，转化水稻，Confocal观察转基因幼苗的根部细胞，可以看到OsGLIP2定位于细胞壁(图9M和N)，质壁分离的实验进一步证明的确如此(图9O和P)。
为了验证OsGLIP1-eGFP的融合蛋白是否具有功能，本发明人检测了OsGLIP1-eGFP转基因植株的抗病性。首先，通过GFP抗体检测了OsGLIP1-eGFP转基因植株不同株系中融合蛋白的表达情况，可以看到在玉米UBI启动子驱动下的OsGLIP1-eGFP融合蛋白在转基因株系中的表达量很高(图10A)。本发明人进一步接种白叶枯病菌小种PXO99和DY89031，病斑长度的统计结果表明OsGLIP1-eGFP转基因植株对白叶枯病菌的感病性增强(图10B和C)，这与OsGLIP1-OE的过表达植株的感病结果相一致。上述结果表明OsGLIP1-eGFP的融合蛋白具有正常的功能，OsGLIP1的脂质体定位具有生物学意义。
实施例9、OsGLIP1的脂质体定位是其发挥生物学功能所必需的
GDSL1和GDSL2蛋白的N-端分别29和35个氨基酸的信号肽，为了解信号肽在OsGLIP酯酶的定位和生物学功能中的作用，本发明人构建了截短29个氨基酸信号肽的OsGLIP1ΔSP-eGFP融合表达克隆以及单独信号肽的SP-eGFP融合表达克隆(图11A)，并转化植物。转基因植株的结果显示，OsGLIP1ΔSP-GFP的亚细胞定位是遍在的(图11B和11C)，而仅含有29个氨基酸信号肽的SP-GFP定位于脂质体，与全长OsGLIP1有着相同的亚细胞定位(图11D)，这个结果表明OsGDSL1N端29个氨基酸的信号肽对于OsGLIP1的脂质体定位是必须的。OsGLIP1-eGFP的融合蛋白的转基因具有与OsGLIP1相同的功能，而转OsGLIP1ΔSP-GFP的水稻表现出抗病性的增强，即失去了负调控抗病性的功能(图11E和11F)，表明OsGLIP1的脂质体定位是其发挥抑制植物免疫的生物学功能所必需的。
三、结论
1、OsGLIP1和OsGLIP2具有酯酶活性
酯酶催化了脂类的代谢，具有非常重要的功能。目前文献报道中主要有三个与抗病相关的GDSL酯酶：拟南芥中的AtGLIP1和AtGLIP2以及辣椒中的CaGLIP1。经过体外的酶活检测，这三个蛋白都具有酯酶的活性。但是研究也发现并不是所有的酯酶都具有活性，比如拟南芥抗病反应中具有关键作用的调控基因EDS1(Enhanced Disease Susceptibility1)和PAD4(PhytoalexinDeficient4)，它们都预测编码lipase，是拟南芥免疫信号途径的正调控因子。但是这两个酯酶一直以来都没有检测到lipase的活性，它们只是拟南芥抗病途径中信号分子。
在本发明中，鉴定了水稻GDSL酯酶家族的两个成员OsGLIP1和OsGLIP2。通过与这一大类已知的具有酯酶活性的蛋白的氨基酸序列比对，本发明人发现它们N端都含有保守的GDSL motif，在保守的BlockI、II、III和V中还分别含有保守的氨基酸S、G、N和H。这个结果表明，OsGLIP1和OsGLIP2很可能具有水解酯键的活性。本发明人表达和纯化OsGLIP1和OsGLIP2重组蛋白，进行体外酶活实验。结果表明它们可以水解通用的脂类底物4-硝基苯乙酯和4-硝基苯丁酯，从而证明它们确实具有酯酶的活性。
2、OsGLIP1和OsGLIP2在抗病反应中的功能分析
植物中的GDSL酯酶一般又被描述成乙酰水解酶(acylhydrolases)。它们的功能非常广泛，其水解酶活性影响种子萌发(Clauss et al.，2008)、花粉管的水解、角质的合成、对非生物胁迫的响应以及抗病反应。水稻基因组中的GDSL酯酶是一个庞大的家族，生物信息学以及表达谱分析也预测该家族的成员可能会参与了水稻的生长发育和形态建成、次生代谢途径以及对生物和非生物胁迫的响应。其中只有OsGELP33和OsGELP63有一些简单的研究，其它具体基因的功能研究都还没有报道。此处，OsGLIP1和OsGLIP2是水稻防卫反应的负调控因子。OsGLIP1和OsGLIP2在BTH、SA以及病原菌接种时表达量下调，说明当植物防卫反应被激活或者在植物抵抗病原菌入侵的过程中，该基因是受到抑制的，这与它们的负调控功能是一致的。另外，由于这两个基因是具有酯酶活性的，提示在植物体内会存在它们的脂类底物，而该未知的脂类底物很可能是水稻抗病反应的正调控因子，在防卫反应激活的时候由于OsGLIP1和OsGLIP2表达水平受到抑制，而相应地该未知脂类底物的含量升高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种提高禾本科植物的防卫反应能力的方法，其特征在于，所述方法包括：下调禾本科植物中GLIP1多肽和/或GLIP2多肽的表达或活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的下调植物体内GLIP1多肽的表达或活性的方法包括：在植物的基因组中敲除或沉默GLIP1多肽；或将下调GLIP1基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入植物中；或
所述的下调植物体内GLIP2多肽的表达或活性的方法包括：在植物的基因组中敲除或沉默GLIP2多肽；或将下调GLIP2基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入植物中。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的下调GLIP1基因转录、多肽表达的下调剂是特异性干扰GLIP1基因表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是GLIP1基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物；或
所述的下调GLIP2基因转录、多肽表达的下调剂是特异性干扰GLIP2基因表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是GLIP2基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提高禾本科植物的防卫反应能力是提高禾本科植物的抗病能力。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的提高禾本科植物的抗病能力是提高禾本科植物对于病菌的抗性；较佳地，所述的病菌包括：稻瘟病菌，白叶枯病菌。
6.一种下调禾本科植物中GLIP1多肽和/或GLIP2多肽的表达或活性的物质的用途，用于提高禾本科植物的防卫反应能力。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的下调植物体内GLIP1多肽的表达或活性的方法包括：在植物的基因组中敲除或沉默GLIP1多肽；或将下调GLIP1基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入植物中；或
所述的下调植物体内GLIP2多肽的表达或活性的方法包括：在植物的基因组中敲除或沉默GLIP2多肽；或将下调GLIP2基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入植物中。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的下调GLIP1基因转录、多肽表达的下调剂是特异性干扰GLIP1基因表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是GLIP1基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物；或
所述的下调GLIP2基因转录、多肽表达的下调剂是特异性干扰GLIP2基因表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是GLIP2基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的特异性干扰GLIP1基因表达的干扰分子或特异性干扰GLIP2基因表达的干扰分子含有式(I)所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向或Seq反向-X-Seq正向 式(I)，
式(I)中，
Seq正向为SEQ ID NO:1中第727-1192位所示的多核苷酸，Seq反向为与Seq正向互补的多核苷酸；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
10.GLIP1多肽和/或GLIP2多肽的用途，用于水解酯键，发挥酯酶活性。
11.一种GLIP1多肽和/或GLIP2多肽或其编码基因的用途，用作鉴定禾本科植物的防卫反应能力的标记物。
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