CN107441098A

CN107441098A - Fxr拮抗剂在在制备抗hbv药物中的应用

Info

Publication number: CN107441098A
Application number: CN201710507209.0A
Authority: CN
Inventors: 陈卫东; 周云; 王艳东; 聂小博; 叶文凌; 周静宜
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2017-06-28
Publication date: 2017-12-08

Abstract

本发明将法尼酯衍生物X受体（farnesoid X receptor，FXR）拮抗剂用于治疗HBV感染者。HBV感染者血清胆汁酸通过FXR促进HBV复制表达,而FXR受体拮抗剂抑制HBV复制表达，及促进HBV清除，改善肝功能，抑制肝纤维化和肝硬化，降低肝癌转化风险。

Description

FXR拮抗剂在在制备抗HBV药物中的应用

技术领域

本发明涉及新药研发领域，具体内容为法尼酯衍生物X受体(farnesoid Xreceptor，FXR)拮抗剂用于治疗HBV感染，抑制HBV复制表达，促进HBV清除，改善肝功能，降低肝癌转化风险等方面的应用。

背景技术

乙型肝炎病毒感染仍是一个全球公共卫生问题，它与人类的慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝毛玻璃病变和肝癌的发生有着密切的关系。目前，世界上有20亿人口曾被HBV感染，约3.5亿人变成慢性感染者，每年死于慢性肝炎、肝硬化及肝癌人数在50万至120万，占死因的第10位。HBV是一个3.2kb部分双链DNA包膜病毒。HBV转录受4个启动子和2个增强子调控。HBV由聚合酶、表面抗原、e抗原、核心抗原和X蛋白组成。表面蛋白主要由大蛋白、中蛋白和小蛋白组成，镶嵌在宿主细胞膜的双层脂质结构。这些表面蛋白具有相同的C端结构域，但是N端结构不同，如pre-S1是大蛋白结构成分，也是HBV进入肝细胞结构域。HBV感染分为急性感染和慢性感染，由于HBV细胞免疫的不足可造成HBV持续感染，造成慢性肝炎、肝细胞玻璃样变、纤维化、肝衰竭及肝癌。

HBV治疗目标是抑制病毒的复制表达，降低肝损伤促进肝功能恢复。目前药物主要有两类，一类是普通IFNα及长效IFNα，另一类为核苷(酸)类似物。IFNα具有很多副作用，并且只有30％病人有效。核苷(酸)类似物虽然能够快速抑制病毒，但是经常形成HBV耐药，停药后HBV复制反弹。因此，急迫需要开发新的抗病毒药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种FXR拮抗剂在在制备抗HBV药物中的应用。

胆汁酸在HBV急慢性感染中发挥重要作用。急性HBV感染，患者体内胆汁酸浓度急剧升高，而HBV清除后血清胆汁酸水平恢复正常。在急性转为慢性HBV感染过程中，胆汁酸水平持续升高，这也说明HBV和胆汁酸之间存在着相互关系。最近研究发现，NTCP作为肝细胞摄取胆汁酸转运蛋白，又作为HBV感染肝细胞功能受体。HBV感染过程中，preS1蛋白与肝细胞膜NTCP结合，导致CYP7A1表达升高，胆汁酸水平增高及胆固醇和脂质代谢紊乱，从而形成胆汁淤积和肝损伤。升高的胆汁酸通过核受体FXR而促进HBV复制表达。核受体FXR和RXR形成异二聚体，与HBV核心启动子和增强子结合，促进HBV前基因组RNA和DNA复制中间体的合成。因此，我们认为胆汁酸促进HBV复制表达，不利于病毒清除。而我们在FXR KO小鼠证明，FXR敲除显著抑制HBV复制表达，并促进HBV清除。采用FXR拮抗剂同时可以显著抑制HBeAg表达。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：FXR拮抗剂在在制备抗HBV药物中的应用。

优选的，所述FXR拮抗剂为(Z)-Guggulsterone(CAS号39025-23-5,Sigma)。

优选的，所述药物为FXR拮抗剂或者为FXR拮抗剂和其它抗病毒药物组成的复方药物。

优选的，所述其它抗病毒药物为IFNα和/或核苷(酸)类似物等抗病毒药物。

优选的，所述药物包括FXR拮抗剂和药学上可接受的载体。

优选的，所述药物的剂型为任意一种临床可接受的剂型，如片剂、胶囊、粉末或液体制剂等剂型。

本发明提供新的药物治疗HBV感染病人，FXR受体拮抗剂抑制HBV复制表达、促进HBV清除，改善肝功能，抑制肝纤维化和肝硬化，降低向肝癌转化风险，因此，提高病人生存质量，降低社会家庭经济负担，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：在HepG2细胞系，转染pHBV1.3，转染后24小时加CDCA，加药后24和48小时，取上清液，ELISA检测HBeAg表达；

图2：在HepG2细胞系，转染pHBV1.3和FXR siRNA，转染后24小时加CDCA，加药后48小时，取上清液，ELISA检测HBeAg表达；

图3：在WT小鼠(C57BL/6J小鼠)和FXR^-/-小鼠，高压尾静脉注射pHBV1.3，注射后D1、D7、D14天静脉采血，ELISA检测HBeAg表达；

图4：在HepG2细胞系，转染pGL3-EN2/Cp和pRL-TK或pFXR表达质粒，转染后24小时加CDCA，转染72小时后进行双荧光素酶报告分析；

图5：在HepG2细胞中，转染pHBV1.3，24小时后加(Z)-Guggulsterone(10μM)或DMSO对照，作用48小时，收集上清液，ELISA检测HBeAg表达。

具体实施方式

实施例1

细胞模型中CDCA(鹅去氧胆酸)通过FXR促进HBV表达：

实验材料：HepG2,pHBV1.3，pFXR,pGFP，HBV检测试剂盒(上海科华)，CDCA(Sigma)。

实验方法：在HepG2细胞中，共转染pHBV1.3，pFXR质粒或pGFP对照质粒，转染后24小时，荧光显微镜观察转染效率，然后加CDCA刺激24小时和48小时，收集上清液，ELISA检测HBeAg表达。具体包括以下步骤：

①试剂盒室温平衡30min；

②取细胞上清，每孔加50μl，同时设置阴性对照、阳性对照各2孔，空白对照1孔；

③每孔加酶结合物50μl(空白孔不加)，混匀，封板；

④37℃温箱孵育1h；

⑤倾去液体，洗涤液洗涤，重复5次，拍干；

⑥每孔均加入显色剂A、B各50μl，封板，37℃温箱孵育30分钟；

⑦加入终止液50μl，混匀，酶标仪读取450nm吸光度(参考波长为630nm)。

实施例1的实验结果如图1，在HepG2细胞系，转染pHBV1.3，转染后24小时加CDCA，加药后24和48小时，取上清液，ELISA检测HBeAg表达，CDCA通过FXR促进HBeAg表达(P<0.05)。

实施例2

在细胞模型中，干扰FXR表达反而抑制HBeAg表达：

实验材料：HepG2,pHBV1.3，siRNA FXR(广州锐博)，CDCA(Sigma)，HBV检测试剂盒(上海科华)。

实验方法：在HepG2细胞中，共转染pHBV1.3，siRNA FXR，转染后24小时，然后加CDCA刺激48小时，收集上清液，ELISA检测HBeAg表达。

实施例2的实验结果如图2，在HepG2细胞系，共转染pHBV1.3和FXR siRNA，转染后24小时加CDCA，加药后48小时，取上清液，ELISA检测HBeAg表达，干扰FXR表达反而抑制HBeAg表达(P<0.05)。

实施例3

HBV小鼠模型中FXR调控HBV表达

实验材料：FXR^-/-小鼠(购自美国Jackson实验室)，C57BL/6J小鼠(北京维通利华)，pHBV1.3，HBV检测试剂盒(上海科华)。

实验方法：

高压尾静脉注射HBV克隆建立HBV复制模型：用75％酒精消毒尾部，再用红外灯照射致小鼠尾静脉曲张，清晰可见。沿着尾静脉平行进针，注射液体的量为体制的8-10％，5-8秒内注射完。注射后第1、7、14天采血，腹腔注射1％戊巴比妥钠150μl，麻醉后用灭菌毛细管从小鼠眼眶内侧进针，血液滴入无菌EP管中，采血约300μl。37℃孵育1h，然后8000rpm离心10min，分离后的血清-80℃保存。ELISA检测血清HBeAg水平，检测结果如图3，FXR表达缺失，HBeAg表达显著下降(P<0.05)。

实施例4

双荧光素酶报告分析

实验材料：HepG2,pGL3-EN2/Cp，pRL-TK，pFXR，CDCA(Sigma)，双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)。

实验方法：在HepG2细胞系，转染pGL3-EN2/Cp和pRL-TK或pFXR表达质粒，转染后24小时加CDCA，转染72小时后进行双荧光素酶报告分析；具体包括以下步骤：

①洗涤细胞弃96孔板内培养基，加入提前预冷的1*PBS 200μl，洗涤细胞，彻底吸净PBS；

②裂解细胞在96孔板中加入20μl 1*PLB工作液,放置在摇床上轻摇15min，以充分裂解；

③酶标仪测空板背景值在裂解期间，取出白板，放置在酶标仪上测荧光值；

④再用排枪每孔加100μl的Luciferase Assery bufferⅡ(避光)，将裂解好的细胞20μl转移到白板中,用排枪混三次，快速放到酶标仪中读数；

⑤将substrate 50*加入到Stop Glo buffer中，混匀，配成Stop Glo buffer工作液，每孔加100μl，酶标仪再次读数。

双荧光素酶报告分析结果如图4所示，在HepG2细胞系，转染pGL3-EN2/Cp和pRL-TK或pFXR表达质粒，转染后24小时加CDCA，转染72小时后进行双荧光素酶报告分析，CDCA通过FXR显著促进HBV增强子/启动子活性(P<0.05)。

实施例5

FXR拮抗剂抑制HBeAg表达：

实验材料：HepG2,pHBV1.3，FXR拮抗剂(Z)-Guggulsterone(Sigma)，CDCA(Sigma)，HBV检测试剂盒(上海科华)。

实验方法：在HepG2细胞中，转染pHBV1.3，24小时后加(Z)-Guggulsterone(10μM)或DMSO对照，作用48小时，收集上清液，ELISA检测HBeAg表达。

实施例5的实验结果如图5，在HepG2细胞系，转染pHBV1.3，转染后24小时加(Z)-Guggulsterone，加药后48小时，取上清液，ELISA检测HBeAg表达，(Z)-Guggulsterone显著抑制HBeAg表达(P<0.05)。

Claims

1.FXR拮抗剂在在制备抗HBV药物中的应用。

2.所述FXR拮抗剂为(Z)-Guggulsterone。

3.根据权利要求1 所述的应用，其特征在于：所述药物为FXR拮抗剂或者为FXR拮抗剂和其它抗病毒药物组成的复方药物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述其它抗病毒药物为IFNα和/或核苷（酸）类似物。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物包括FXR拮抗剂和药学上可接受的载体。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为任意一种临床可接受的剂型。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为片剂、胶囊、粉末或液体制剂等。