CN107430266A - 用于对试样进行光片显微检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于对试样(1)进行光片显微检测的方法，其中，选择多个曝光波长，基于所述多个曝光波长将针对试样(1)的曝光光线集中起来。针对平均波长，将相位选择元件的调制深度确定为π。这里，对于相位选择元件表现出预设的相分布并且对于孔板平面的孔板(24)表现出预设的孔板结构，其实现了，基于多个曝光波长将曝光光线集中起来且利用从多色组成的光片对试样(1)曝光。为此，选出优先波长，且在曝光物镜(10)的焦平面中，针对预设形状的光片，利用优先波长的光确定出光片的电场。由此计算出要预设的相分布。相位选择元件被以曝光光线曝光，并且曝光光线借助于相位选择元件结构化。经结构化的曝光光线成像到孔板平面中，多色的经结构化的光线的零阶在孔板平面中被消隐，使得在布置于后面的曝光物镜(10)的焦平面中，成形有经结构化的光片，具有垂直于曝光物镜(10)的焦平面设置的光片平面。试样(1)被以结构化的光片在光片平面中曝光，从试样射出的光线沿检测方向得到检测，检测方向与光片平面围成不为零的角度。

Description

用于对试样进行光片显微检测的方法

技术领域

本发明涉及一种用于对试样进行光片显微检测的方法以及主要涉及对利用多种染料标记的试样进行分析的问题。

背景技术

对生物试样的研究在近年来越来越重要，其中，试样的照射被利用光片实现，光片的平面(光片平面)与检测的光轴(检测方向)夹成不为零的角度相交。通常，光片平面在此与检测方向(一般相对于检测物镜的光轴)夹成不为零的、但通常也不一定是直角的角度。这种研究方法主要用在荧光显微成像中并且被归纳为术语LSFM(光片荧光显微术)。示例是在DE10257423A1以及以上述文献为基础构成的WO2004/0535558A1介绍的而且称为SPIM(选择性平面照明显微术)的方法，利用这种方法，在相对短的时间内也能够在空间上容纳比较厚的试样：基于光学剖面，在与沿垂直于剖切平面的方形的相对运动组合下，能够对试样进行图像上/空间上拉伸的显示。

相对于其他设计的方法，诸如共焦激光扫描显微术或者双光子显微术，LSFM方法具有多种优点。因为能够实现在宽视场内的检测，所以能够检测更大的试样区域。虽然分辨率略低于共焦激光扫描显微术的情况，但是，能够利用LSFM技术分析较厚的试样，因为透入深度较大。此外，在这种方法中，对试样的光负荷加载最低，这降低了试样褪色的风险，因为试样仅受到薄的光片以相对于检测方向不为零的角度照射。

替代纯静置的光片，也可以产生一定程度上静置的光片，方式为：试样以光束快速扫描。光片类型的照明以如下方式产生，光束相对于需要观察的试样经历非常快速的相对运动并且在此，在时间上彼此跟随地多重地并排排列。在此，照相机的在其传感器上成像出试样的合成时间以如下方式选择，使得扫描在积分时间内结束。

光片显微术的主要应用在于对几百微米直至几毫米的中等大小的生物体的成像。一般，生物体嵌入凝胶中，例如琼脂中，凝胶又处在玻璃毛细管中。玻璃毛细管从上方或从下方被嵌入填入水的试样腔室中，并且试样作为一块被从毛细管中压出。琼脂中的试样被以光片照明，并且荧光利用成像物镜(其优选、但是一定垂直于光片、进而也垂直于用于产生光片的光学系统的照明物镜而置)成像到照相机上。

但是，光片显微成像术的方法具有一定局限。一方面，需要研究的试样相对较大，该试样来自发展生物学。第二方面，由于试样制备和试样腔室的尺寸，光片相对较厚并且进而能够实现的轴向解析度受到限制。第三，试样的制备很复杂并且不与针对单个细胞的荧光显微术的标准试样制备和标准试验固定相兼容。

为了部分地规避上述限制，在近年来，实现了新型的结构，其中，照明物镜和检测物镜优选彼此垂直而置并且以45°的角度朝向上方指向试样。操作方式例如在WO2012/110488A1以及在WO2012/122027A1中介绍。

为了照明试样，一般使用透镜的相干的光。光的波长在荧光显微术中根据标记选定，所述标记应当被激励发射荧光。在最简单的情况下，例如能够将具有符合高斯函数分布的强度分布的光束静态地借助于圆柱透镜形成光片，或者一定程度静态地借助于扫描和与之相协调的照相机合成时间来形成光片。在此，有利的是对试样结构化的照明，由此，能够提高分辨率。于是，例如在V.Kettunen等人的文章“不变传播的点阵列(Propagation-invariant spot arrays)”(出现在光学通信杂志1998年第1247页23(16)(Optics Letters23(16)，Seite 1247，1998))中，介绍了贝塞尔光束的相干叠加。这种叠加通过借助于算法计算能够引入光瞳的相分量的方式来实现。当贝塞尔光束的光谱成像到光瞳中时，相分量产生多束在试样中叠加的贝塞尔光束。相分量类似于相位值为0至π的星形光栅。作为条件给出的是，各个贝塞尔光束的间距必须很大，因为否则可能发生不希望的干涉效应。

在US2013/0286181A1中，有针对性地利用各个贝塞尔光束之间的干涉效应来产生拉伸的而且结构化的光片。在此，贝塞尔光束彼此如此近地挨着设置，使得各个贝塞尔光束的次极大值在传播平面、光片平面的上方和下方解构地(desruktiv)叠加。根据各个贝塞尔光束彼此间的间距，获得不同的干涉图案。

在WO2014/005682A1中介绍了所谓的sinc³光束的产生。在试样中，由此能够产生仅具有较小的次极大值的近乎方形的光片。sinc³光束可以在频率范围内表达为三个sinc³函数的乘积：

f＝f_vrf_vxf_vy与和

系数c_r、c_x和c_y给出sinc³光束在光瞳平面中的位置，系数w_x、w_y和w_z给出sinc³光束沿相应方向的宽度。

函数f的傅里叶变换获得了光片的混合电场EF。焦点上的强度分布通过I＝abs(EF)²获得，相位获得sinc³光束也可以相干地叠加，从而产生结构化的、光栅状的光片。

为了产生上面介绍的光束类型，例如可以使用空间光调制器(SLM，spatial lightmodulator)。对于贝塞尔光束，这例如在Rohrbach等的文章“利用自重构光束类型的相的线扫描光片显微镜”(A line scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams)中有所介绍，见于2010年的光学快讯，第24229页(Optics Express18，Seite 24229im Jahr 2010)。在此，给出两种类型的空间光调制器，其通过所用的液晶来区别。

向列SLM实现了从0至6π的最大连续可调的相行程。但是，SLM相对缓慢：一般SLM具有约60Hz、最大直至500Hz的图像重复速率。相反，向列SLM的衍射效率高于90％。

另一方面，给出铁电SLM，铁电SLM仅能够在无相行程与相行程为π的状态之间来回切换。为此，SLM能够非常快速地切换，使得图像重复速率可以达到最高4000Hz。但是，向列SLM的衍射效率非常低，约为14％。

两种SLM类型具有相同之处是，能够实现相行程与入射激光的波长相关。理想情况下，向列SLM应当被校准，使得向列SLM具有从0至整个波长、也就是2π的连续的相行程。但是，相行程可以在唯一的波长下调整，于是，相行程针对所述波长来设计。一旦SLM以其他波长的激光入射时，相行程发生改变并且不等于2π。在波长较短的情况下，相行程较大，在波长较大的情况下，相行程减小。

对于铁电SLM而言，有类似的表现。同样在这里，相行程仅在根据SLM上显示的图案设计的相应波长下达到。在波长发生偏差时，相行程不为π。这对于上面提到的贝塞尔光束或sinc³光束的产生具有直接影响，于是，光束仅当相行程连续在0与2π之间改变时，才能最佳地产生，正如其针对贝塞尔光束和马丢光束所需那样，或者当相行程恰好为π时，才最佳地产生，正如针对相干叠加的贝塞尔光束或sinc³光束的情况那样。

为了进行荧光显微分析，试样通常利用不同的标记来制备，其分别能够使试样的不同区域可见。因此，所希望的是，在光片显微术中，对试样以不同波长的光片加以激励。在用于空间调制器来形成光束时，能够实现最佳的彩色激励，这时，各个不同色彩的光片被依次入射并且在变换波长时，将相图案与SLM相匹配。例如，在第一次通过时，SLM被调整到第一激光波长，并且沿z方向、检测方向在该波长上拍摄图像栈。接下来，SLM被调整到第二波长，并且再在该波长下拍摄图像栈。但是，这种方法具有不利之处，图像栈的照片可能相对长时间地持续，直至数十秒。当试样在此期间运动或改变时，不同色彩的图像栈不再重叠，并且不能组合成整体图像。

可替换地，图像栈的每幅单图在图像栈的下一幅图被拍摄之前，被以不同波长拍摄。但是，这具有不利之处，在约10ms的曝光时间下，对空间光调制器的优化必须根据新的激光波长每秒钟进行100次。凭借常规的向列SLM，这是不能实现的，从而必须使用具有其很低的光效率和受限的相行程的铁电SLM。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种方法，这种方法实现了：对试样以不同波长的彩色光片同时或几乎同时地在非常短的时间内以静态相调制来曝光，使得同时能够针对多个色彩进行检测，并且拍摄时长相比于依次激励减少，其中，优选也应当对向列SLM基于其高衍射效率加以应用。

所述目的针对一种用于对试样进行光片显微检测的方法来实现，方式为：选择多个曝光波长，基于所述多个曝光波长将针对试样的曝光光线集中起来。针对平均波长，将相位选择元件的调制深度确定为π。在此，平均波长可以是所用波长的平均值，以便对应从中选取波长的整个范围来获得类似的条件，但是，有利的是，将最长波长和最短波长的平均值用作平均波长。但是，平均波长也可以借助于其他标准来确定，例如平均波长能够与激光的如下波长相一致，所述波长相比于其他同时用于其他波长的激光具有较小功率而且针对该波长希望获得具有尽可能低损耗的高衍射效率。

在此，为了对曝光光线进行重构，对于相位选择元件，表现出预设的相分布并且对于孔板平面的孔板表现出预设的孔板结构。为此，在第一步骤中，选出优先波长。优先波长一般选自通常也包括了用于曝光试样的波长，也就是相应的设置用于激励荧光标记的激光射线。但是，优先波长也可以处在上述波长范围之外。但是，优先波长通常等于波长最长的曝光波长或者本身比波长最长的曝光波长的波长还要长。

针对优先波长，在这时，在曝光物镜的焦平面中针对预设形状的光片，以优先波长的光来确定光片的电场。由此，计算出要预设的相分布，要预设的相分布是复合电场的幅度，在相位为时，在此，为了确定或计算光片的电场，出发点在于，针对优先波长，在孔板平面中的中间或中心区域被消隐，以便同样排除在计算时，在实际中为了产生结构化的光片而必须消隐的零阶。曝光物镜的的焦点上的电场的计算例如可以通过所谓的光瞳函数的傅里叶变换、也就是频率范围内的电场、在这里为其在光瞳中的分布来实现。经计算的相分布可以对应相位选择元件来表现，相位选择元件优选处在中间像中。涉及的是一种静态的相位选择元件，例如相应制造的相位板。可驱动的相位选择元件例如空间光调制器相应得到操控和调整。

可选地，可以执行其他调校措施。例如，相位分布能够乘以垂直于光片平面的包络函数，按照这种方式能够调整光片的厚度，此外，能够抑制垂直于光片平面的次极大值。相分布也可以与相位选择元件通过尺寸设定来匹配，光瞳中的光谱等于初始计算的数值，或者光片具有试样中预设的规格。

相位选择元件可以在中间像平面的附近以照明光路被曝光光线所曝光并且曝光光线通过相位选择元件被结构化。经结构化的曝光光线成像到布置在相位选择元件后面的孔板平面中，在其中产生曝光光线的频率光谱。然后，进行孔板结构的匹配，方式为：使结构化的曝光光线的零阶在孔板平面中基本上被消隐，由此，在布置于后面的曝光物镜的焦平面中形成有彩色的、结构化的光片，具有垂直于曝光物镜的焦平面而置的光片平面。于是，试样被以光片平面中的结构化的光片曝光并且从试样射出的光线沿检测方向得到检测，检测方向与光片平面围成不为零的角度。

孔板平面中的孔板能够按照不同的方式进一步匹配。当例如执行尺寸设定时，则孔板调校可以使得所叠加的光线的零阶恰好被消隐。调校孔板的另一可行方案在于使光瞳函数的不希望的次极大值被消隐。

按照这种方式，光片显微曝光装置以如下方式调校，使得其在应用对应优先波长的光线时，产生最佳可行地结构化的光片，并且光片对应其余波长同样具有高品质，这特别是涉及结构化方面。由此，能够同时或几乎同时地以多个波长对试样进行激励。

在此，入射光束，例如高斯光束，优选椭圆准直化，以便一方面使得零阶的光线功率保持得尽可能低，并且另一方面仅尽可能小地影响到光片。

例如可以将衍射光学元件用作相位选择元件。衍射光学元件可以设计为相位板并且一次性与确定的波长相匹配。针对波长的不同组合，可以将不同的相位板引入光路中。另一可行方案在于，将空间光调制器(SLM)用作衍射光学元件。这提供如下优点，能够将空间调制器借助于操控调整到不同的优先波长和曝光波长，而不一定进行变换，此外，利用SLM能够实现针对光片不同的光束形状。在分析试样期间，空间光调制器(SLM)不发生改变，SLM表现为静态。

在应用SLM时，能够在光路本身中进行容易的匹配，例如能够将沿垂直于光片平面的方向的包络函数乘以相分布，并且执行其他调整方案。尺寸设定也可以根据SLM简便地执行。

通常将具有高斯形强度分布的光束用作被准直化而且转向到相位选择元件上的输入光束，而针对光片电场的计算，优选设定如下形式，其相比于这种高斯光束更好地适用于对试样均匀的照明或者结构化的曝光，高斯光束当然也可以用于对光片的电场进行计算。

在本发明的优选构造方案中，光片的电场以如下方式确定，为了成形光片，使用两个sinc³函数，这两个sinc³函数在曝光物镜的焦平面中相干叠加。在此情况下，从上面说明的光瞳函数出发，对试样中、也就是焦平面中的光片的电场通过傅里叶变换来计算。基于在焦平面中获得的电场、叠加场，确定出相位并且其表现为相位选择元件。sinc³函数的主要优点在于，利用其能够形成在试样中具有均匀曝光度的近乎方形的光片，仅具有很小的次极大值。在相干叠加的情况下，能够产生结构化的、光栅状的光片。

在另一优选构造方案中，光片的电场以如下方式来确定，为形成光片，使用预设形状的贝塞尔光束。针对这种贝塞尔光束，确定出焦平面中的电场并且加以计算出电场与电场的叠加程度，以便分别确定出在焦平面中彼此间隔的电场的预设的量值Δ。在此，间距Δ以如下时长改变，直至调整出最佳光片，也就是各贝塞尔光束的次极大值优选解构地叠加，使得在横截面中长而且薄的光片仅以很小的次极大值产生。

不言而喻的是，前面提到的还有后面还要阐释的特征不仅能够以给出的组合应用，而且也能够以其他组合应用或者单独应用，而不脱离本发明的范围。

附图说明

下面，例如借助于同样公开了本发明的重要特征的附图详细阐释本发明。其中：

图1示出颠倒的光片显微镜的示意结构，

图2示出光束成形模块的第一实施方案，

图3示出光束成形模块的第二实施方案，

图4示出光束成形模块的第三实施方案，

图5示出光束成形模块的第四实施方案，

图6示出具有根据图5的光束成形模块的光片产生方案的各个步骤，

图7示出第一孔板结构，以及

图8示出第二孔板结构。

具体实施方式

图1首先示出光片显微镜的基本结构，光片显微镜可以用于对试样进行光片显微检测。在这里，光片显微镜以倒置的构造示出，这仅示例性地可以理解为，在其中可对试样从上方或从侧面进行观察的光学显微镜也是可行的构造方案。试样1处在试样腔室2中并且由液体3、例如水或营养液包围。试样腔室2具有由玻璃制成的、预设厚度的侧壁和底部，在此，厚度例如等于常见的载玻片的厚度，例如为0.17mm。试样腔室2支承在试样台4上，试样台能够手动或以马达驱动地沿三个空间方向移动。光片显微镜的各个元件布置在试样腔室2的下方，试样腔室具有透明的底部5。在光片显微镜的物镜与试样腔室2的底部5之间存在所谓的虚拟中继器6，具有内透镜和外透镜。在虚拟中继器6的内透镜与试样腔室的底部5之间同样存在液体3。在虚拟中继器6的内透镜与外透镜之间存在包围的气氛，通常为空间，同样在虚拟中继器6的外透镜与光片显微镜的物镜之间也存在包围的气氛。

虚拟中继器6用于平衡由于曝光和检测物镜的光轴不垂直于试样腔室2的底部5地设置而产生的像差。取代虚拟中继器6地，在进行这种修正时，也可以使用其他修正机构，诸如前置透镜或自由形状透镜，其集成在物镜中。

在左侧示出曝光光路。在这里，出自激光模块7的光例如可以设置不同波长的多束激光，并且可以在不同的波长之间进行选取，其中，也可以同时选择多个波长，借助于光束成形模块8和扫描模块9将出自激光模块7的光转向到曝光物镜10上，扫描模块例如可以用于产生准静态的光片和/或用于角度扫描，曝光物镜使进入在这里包括了曝光物镜的光轴的光片平面的光片成像到试样中。曝光物镜10的焦点、也就是光片具有最薄的伸展的部位能够借助于驱动装置、例如压电驱动装置11来调整。可替换地，也可以移动试样台4。

在右侧呈现出示例性的检测光路。检测光路包括检测物镜12，检测物镜能够类似于曝光物镜10地借助于驱动装置、在这里为压电驱动装置13得到调整。检测物镜12的光轴与曝光物镜10的光轴处于其中的光片平面围成不为零的角，这里为直角。但是，这不是一定需要的，由此所述过程被函数化，在光片平面与检测物镜12的光轴之间不为零的角度就足够了。通过检测物镜12将从试样1发射的荧光通过分束器14转向到不同的检测模块15和16上。在同时或近乎同时地以包括多个波长的光片曝光试样时，例如可以有区别地根据波长来执行检测。在检测模块15、16中，一般存在扇形的检测器，这种检测器记录强度并且转换呈相应的电信号，所述电信号参与到图像处理中。光片显微系统通过能够借助于压电驱动装置18移动的概览物镜17来加以完善。概览物镜17用于首先检测试样的区别，并且选定要关注的区域(ROI)，然后能够将曝光和检测聚焦到所述区域上。

在图2至图5中，示出不同的辐射成形模块。在图2中所示的辐射成形模块中，将高斯激光束准直化。在所示的示例中，为此使用两个柱形透镜19和20，按照这种方式获得准直化的椭圆激光束，而不是像在应用旋转对称的透镜时所获得的旋转对称的激光束；当然，旋转对称的激光束也是可以的。但是，椭圆的准直化的光束提供针对光片成形的优点，因为形状事先就已经与光片相匹配，并且不像在旋转对称的光束的情况那样，需要很多的强度变为零阶。椭圆的准直化的光束成角地打到相位选择元件上，在这里为向列的SLM21，也就是向列SLM21与柱形透镜19和20的光轴所围成的角度不为零。可替换地，也可以应用分束器22，这在图3中示出。

向列SLM21在曝光光路中布置在中间像平面中或其附近并且被以曝光光线、准直化光束曝光。曝光光束借助于相位选择元件、向列SLM21被结构化。在此，优选的是，相位选择元件处在中间像平面中，否则，所产生的光具有失焦度。这种失焦则必须借助于额外的透镜元件或者直接通过将相位选择元件上的相分布借助于与相应的修正相图案的叠加而进行的匹配加以平衡。

借助于透镜23，将经重构的曝光光线成像到布置在相位选择元件后面的孔板平面中，透镜23在孔板24处于其中的孔板平面中产生经傅里叶变换的曝光光线，也就是光束的频率光谱。孔板24能够用于对光束进行光谱滤波，但是，特别是用于使孔板平面中的经结构化的光线的零阶基本上被消隐。由此，在布置于后面的曝光物镜10的焦平面中，以垂直于曝光物镜10的焦平面而置的光片平面对结构化的光片加以成形。接下来，透镜25和26将频率光谱例如成像到未示出的扫描镜上，扫描镜能够用于产生准静态的光片。可替换地，当不应用透镜26时，也可以将光束直接成像到曝光物镜10中。这在图5中示出。

于是，试样1被以光片平面中的结构化的光片曝光，从试样上射出的光沿检测方向得到检测，检测方向与光片平面围成不为零的角度，正如结合图1所介绍那样。

替代向列的SLM21也可以使用具有前置的λ/2板的铁电SLM27，这在图4中示出。因为在对SLM或相位选择元件加以调校之后使其特性在运行期间发生改变，所以替代SLM地也可以使用静态相位选择元件，例如相位板，但是，SLM更容易与不同的条件，例如不同的光束形状或不同的波长相匹配，因为SLM能够得到操控，而相位板则必须更换。

为了使光束成形模块为用于以不同波长的彩色光曝光试样1做好准备，对于相位选择元件事先表现出预设的相分布，同样地，孔板平面中的孔板表现出预设的孔板结构。在下面，这应当例如针对sinc³光束在不限制普遍性的情况下加以介绍，因为也可以使用其他光束形状。

在第一步骤中，选取多个、至少两个曝光波长，应当从中会合出针对试样1的曝光光线。因为相位选择元件以及特别是SLM的相行程与波长相关，所以针对平均的波长将相位选择元件的调整深度设定为π。在此，平均波长不一定与其中一个曝光波长一致，而是一般等于最长曝光波长和最短曝光波长的平均值。按照以重心取平均值的方式考虑到最长波长与最短波长之间各个波长在波长范围内的位置的加权平均值取法能够被用于确定平均波长。当例如应当将波长400nm、500nm和600nm用于产生彩色光片时，则相位选择元件相应地针对平均波长500nm进行调整。在较短的波长下，相行程大于π，并且在较长的波长下，相行程小于π。所希望的相行程的调整在SLM中一般利用控制电压来实现，从而在其他用于本示例的波长下获得400nm下1.6π的相行程，600nm下0.9π的相行程。

当对调制深度加以调整时，使得针对相位选择元件表现出预设的相位结构。为此，首先选出优先波长。优先波长具有至少一个等于最长曝光波长的波长，该波长也可以更长。在本示例中，优先波长为600nm。仅针对该波长执行上面和下面介绍的调校。所成形的光束的频率光谱的位置以如下方式匹配，使得频率光谱处在光瞳的边缘上，不对光片构成妨碍。

当然，同样可行的是，选择另一处在所述波长范围之外的优先波长，但是这具有的不利之处是，可能降低光片产生时的精确度。但是不排除的是，优先波长本身不用于曝光，也就是不作为曝光波长。

为了使调校变得容易，SLM能够选择性地完全被曝光。在孔板24的孔板平面中，首先将中心区域至少针对优先波长设法被消隐，也就是结构化的光线的零阶在孔板平面中基本被消隐，因为否则不能产生结构化的光片。

在曝光物镜10的焦平面中，则基于至少两个预设形状的光束与优先波长的光束的叠加形成的叠加电场。针对本实施例，应当将sinc³射束用作光束，也就是在焦平面中将至少两个sinc³光束相干叠加，但是也可以使用其他光束形状，也就是高斯光束。

在焦平面中基于叠加获得的叠加场通常以计算方式确定。这例如可以借助于所谓的光瞳函数来实现。在下一步中，对曝光物镜10的焦平面中的相分布加以确定，这通过将“arg”函数用于复合叠加1的方式来实现。可选地，相分布还可以与包络函数相乘，包络函数朝向上方和下方、垂直于光片平面对光片加以限制。

于是，这样计算的相分布相当于优先相分布，并且对于相位选择元件、例如SLM表现出来，也就是在其上显示。

可选地，在尺寸方面、也就是在相分布的伸展方面的设定在相位选择元件上执行，使得光瞳中的光谱等于初始计算得到的数值，或者使得光片具有在试样中相应预设的规格，该规格例如与试样的尺寸相对应。

孔板24这时仅对围绕光轴的中间或中心区域进行消隐，所述区域一般并不精确地等于优先波长的相干叠加的、经衍射的曝光光线的零阶，孔板24的孔板结构这时以如下方式匹配，使得尽可能好地恰好使优先波长以及还有所述或其他曝光波长的零阶被消隐。此外，孔板结构能够以如下方式匹配，使得光瞳函数的不希望出现的次极大值被消隐。

接下来，使曝光波长的光的打到SLM上或相位选择元件上的输入光束的准直化得到匹配。当使用椭圆准直化时，则匹配应当以如下方式进行，使得经衍射的零阶的功率尽可能小，光片同时不受影响。可替换地，相位选择元件也可以利用矩形函数等来曝光，但其中，入射光的主要部分经衍射变为必须被滤波除去的零阶，因为否则不可能产生光片。椭圆准直化的高斯强度分布例如也可以通过将相分布乘以一维包络函数(例如指数函数)来实现。与包络函数相乘能够可替换地用于对输入光束进行椭圆光学准直化，或者组合应用。

上述措施的作用方式在图6中示出。在图6a中示出：当SLM被以椭圆准直化的高斯光束曝光时，SLM上的强度。仅在中心的狭窄区域被曝光。相应地，在图6b中示出的在SLM上的相分布仅在其发生改变的中间区域中不为零。该区域在这里标记包络函数，在包络函数之外，相分布为零，也就是相位不发生改变。在孔板平面中，孔板24具有在图6c中示出的、针对单色sinc³光片的孔板结构。在具有孔板24的孔板平面中，获得图6d中所示的强度分布，并且在曝光物镜10的焦平面中，获得图6e中以横截面示出的结构化的光片，其中，纵坐标对应的是检测方向。

当SLM或相位选择元件被相同程度地曝光时，则最高达98％的入射光经衍射变为零阶，并且由此不再对应光片强度给出。优选的是，相位选择元件因此如介绍那样以具有高斯强度构型的、经椭圆准直化的光束曝光。所述光束应当大致具有SLM上的相分布的规格。如果相分布乘以包络函数，例如高斯函数的话，则这对光片形状具有直接影响。高斯函数越宽，光片越薄。但是，次极大值表现得相应强烈。另一方面，高斯函数选择得越窄，则光在曝光度保持相同的情况下，经衍射变为零阶。就此而言，有利的是，相分布不再乘以包络函数，而是直接对相位选择元件的曝光进行匹配。按照这种方式，能够在试样中实现相同的强度分布。有利之处在于，衍射变为零阶的能量份额极小，通常不高于10％。

替代将叠加的sinc³光束用于曝光，也可以使用其他预设形状的光束，例如贝塞尔光束。针对所述光束，叠加电场以如下方式确定，将预设形状的贝塞尔光束用作光束，贝塞尔光束的电场在焦平面中得到确定，并且以计算的方式确定该电场与相同的、分别以预设的量值Δ在曝光物镜10的焦平面中彼此间隔的电场的叠加或叠加度。在此，间距Δ以如下时长改变，直到调整出最佳的光片。否则，在产生结构化的光片那样，基于sinc³光束的叠加进行。

因为调校仅针对最长波长、在这里为优先波长(600nm)来执行，所以由多种颜色组成的、经成形的光束的位置以如下方式匹配，使得在相位选择元件上示出的、针对比用于调校的波长更短波长的相分布相当于具有较小数值孔径的sinc³光束，与之相应地，相应光束的频率光谱更靠内地处在光瞳中，类似情况适用于贝塞尔光束。

在为π的相行程的情况下，衍射效率最高，并且整体入射的激光光束被转换成sinc³光束或贝塞尔光束。在调制深度与此不同的情况下，衍射效率降低，并且一部分激光功率转换成零阶。当没有相行程或者为2π的数倍时，则整体的激光功率衍射变为零阶，使得不产生sinc³光束或贝塞尔光束。当零阶被利用孔板24滤波除去时，则不计功率的话，sinc³光片与相分布的调制深度无关。在本示例中，衍射效率在400nm的波长下为30％。在波长为500nm时，为85％，以及在波长为600nm时，为78％。尽管调制深度在平均波长为500nm时被调节到π，衍射效率不是100％，而是仅85％。原因在于，利用椭圆高斯光束的曝光仅表现为能够在真实结构中良好产生的逼近。为了实现100％的衍射效率，必须在SLM上仅显示相位，而不是所计算的光片的强度。但是，这仅能以极高的技术耗费来实现。针对彩色光片应用的相匹配的孔板针对sinc³光束在图7中示出，针对贝塞尔光束在图8中示出。

附图标记列表

1 试样

2 试样腔室

3 液体

4 试样台

5 透明的底部

6 虚拟中继器

7 激光模块

8 光束成形模块

9 扫描模块

10 曝光物镜

11 压电驱动装置

12 检测物镜

13 压电驱动装置

14 分束器

15、16 检测模块

17 概览物镜

18 压电驱动装置

19、20 柱形透镜

21 向列SLM

22 分束器

23 透镜

24 孔板

25、26 透镜

27 铁电SLM

28 λ/2板

Claims (8)

1.一种用于对试样(1)进行光片显微检测的方法，其中，

选择多个曝光波长，基于所述多个曝光波长将针对试样(1)的曝光光线集中起来，

针对平均波长，将相位选择元件的调制深度确定为π，

对于相位选择元件表现出预设的相分布并且对于孔板平面的孔板(24)表现出预设的孔板结构，方式为：(i)选出优先波长，所述优先波长具有至少一个等于最长曝光波长的波长，(ii)在曝光物镜(10)的焦平面中，针对预设形状的光片，利用优先波长的光确定出光片的电场，并且由此计算出要预设的相分布，在孔板平面中，对中间区域进行消隐，使得(iii)孔板结构将优先波长的经结构化的光的零阶消隐，

相位选择元件在曝光光路中，在中间像平面中或附近被以曝光光线曝光，并且曝光光线借助于相位选择元件结构化，

经结构化的曝光光线成像到布置在相位选择元件后面的孔板平面中，在孔板平面中产生曝光光线的频率光谱，

孔板结构得到匹配，使得经结构化的曝光光线的零阶在孔板平面中基本上被消隐，由此，在布置于后面的曝光物镜(10)的焦平面中，成形有经结构化的彩色光片，具有垂直于曝光物镜(10)的焦平面设置的光片平面，

试样(1)被以结构化的光片在光片平面中曝光，从试样(1)射出的光线沿检测方向得到检测，检测方向与光片平面围成不为零的角度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，确定出光片的电场，方式为：为了使光片成形，将至少两个sinc³光束在曝光物镜(10)的焦平面中相干叠加并且对在焦平面中获得的电场进行计算。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，确定出光片的电场，方式为：为了使光片成形，使用预设形状的贝塞尔光束，确定这种贝塞尔光束在焦平面中的电场，并且以计算的方式来确定所述电场与相同的、分别以预设的量值Δ在焦平面中彼此间隔的电场的叠加或者说叠加度。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，孔板结构对焦平面中的次极大值加以消隐。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，曝光光线在打到相位选择元件上之前，成形为具有相应于高斯分布的强度构型的、椭圆准直化的光束。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，将衍射光学元件用作相位选择元件。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将空间光调制器用作衍射光学元件。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，将具有最长波长和最短波长的曝光波长的平均值用作平均波长，或者将需要尽可能高的衍射效率的波长用作平均波长。