CN107427588A - 包含poh衍生物的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种紫苏醇(POH)氨基甲酸酯，如POH‑咯利普兰。本发明还提供了一种通过向患者递送治疗有效量的POH‑咯利普兰治疗疾病诸如癌症的方法。本发明提供了一种包含紫苏醇氨基甲酸酯的药物组合物。所述紫苏醇氨基甲酸酯可以是与治疗剂，如化学治疗剂缀合的紫苏醇。所述化学治疗剂可为咯利普兰。在一个实施方案中，所述紫苏醇氨基甲酸酯可为4‑(3‑环戊氧基‑4‑甲氧基苯基)‑2‑氧代‑吡咯烷‑1‑羧酸4‑异丙烯基环己‑1‑烯基甲酯(POH‑咯利普兰)。

Description

包含POH衍生物的药物组合物
相关申请的交叉引用
本申请是要求保护2015年1月13日提交的美国申请第14/595,865号的优先权的国际申请，其是2014年8月8日提交的美国申请第14/455,293号的部份继续申请，后者是2012年8月3日提交的美国申请第13/566,731号的继续申请，现为2014年12月23日颁布的美国专利第8,916,545号，所述专利是2011年8月26日提交的国际申请第PCT/US2011/049392号的继续申请，所述国际申请要求2010年8月27日提交的美国临时申请第61/377,747号和2011年4月4日提交的美国临时申请第61/471,402号的优先权。
发明领域
本发明涉及POH衍生物。本发明还涉及使用POH衍生物如POH氨基甲酸酯治疗疾病诸如癌症的方法。
发明背景
恶性神经胶质瘤，中枢神经系统(CNS)癌症最常见的形式，目前被认为是基本上不能治愈的。在各种恶性神经胶质瘤中，间变性星形细胞瘤(III期)和多形性成胶质细胞瘤(GBM；IV期)具有特别差的预后，这是由于它们的侵袭性生长和对目前可用治疗的抗性。对恶性神经胶质瘤的现行标准化护理由外科手术、电离辐射和化疗组成。尽管医学上有最新的进展，但过去50年在对恶性神经胶质瘤的预后上尚未见任何显著改善。Wen等人，Malignant gliomas in adults.New England J Med.359:492-507,2008。Stupp等人，Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.New England J Med.352:987-996,2005。
另外，初始反应良好的肿瘤的获得性抗性和不希望的副作用是经常阻碍使用化学治疗剂长期治疗的其它问题。因此，已经制备了化学治疗剂的各种类似物以努力克服这些问题。类似物包括新型治疗剂，其为至少两种现有治疗剂的杂合分子。例如，顺铂(cisplatin)已与具有细胞毒性共药(codrug)的Pt-(II)复合物缀合，或与生物活性穿梭组分如卟啉(porphyrin)、胆汁酸、激素或加速跨膜输送或细胞内药物积聚的调节剂缀合。对一组人肿瘤细胞系测试经萜烯醇酯化的(6-氨基甲基烟酸酯)二氯化铂(II)复合物。这些复合物中的萜烯基部分似乎完成了跨膜穿梭功能并且增加这些缀合物摄取进入各个肿瘤细胞系中的速率和程度。Schobert等人，Monoterpenes as Drug Shuttles:Cytotoxic(6-minomethylnicotinate)dichloridoplatinum(II)Complexes with Potential ToOvercome Cisplatin Resistance.J.Med.Chem.2007,50,1288-1293。
紫苏醇(POH)，一种天然存在的单萜，已经被认为是抗多种癌症的有效药剂，包括CNS癌症、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、黑素瘤和结肠癌。Gould,M.Cancer chemoprevention andtherapy by monoterpenes.Environ Health Perspect.1997年6月；105(增刊4):977–979。已经制备了含有紫苏醇和类视黄醇两者的杂合分子以增加诱导细胞凋亡的活性。Das等人Design and synthesis of potential new apoptosis agents:hybrid compoundscontaining perillyl alcohol and new constrained retinoids.Tetrahedron Letters 2010,51,1462–1466。
仍然需要制备包括与其它治疗剂缀合的紫苏醇的紫苏醇衍生物，缀合并且将这种物质用于治疗癌症，如恶性神经胶质瘤，以及其它脑部病症如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。紫苏醇衍生物可以单独施用或与包括放射、标准化疗和外科手术的其它治疗方法组合施用辐射。所述施用也可以通过包括鼻内、经口、用于肺部递送的口腔气管和经皮的各种途径。
发明概述
本发明提供了包含紫苏醇氨基甲酸酯的药物组合物。所述紫苏醇氨基甲酸酯可以是与治疗剂，如化学治疗剂缀合的紫苏醇。所述化学治疗剂可为咯利普兰(rolipram)。在一个实施方案中，所述紫苏醇氨基甲酸酯可为4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)-2-氧代-吡咯烷-1-羧酸4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯(POH-咯利普兰)。
本发明的药物组合物可以在辐射之前、期间或之后施用。所述药物组合物可在施用化学治疗剂之前、期间或之后施用。所述药物组合物的施用途径包括吸入、鼻内、口服、静脉内、皮下或肌肉内施用。
本发明还提供了一种治疗哺乳动物的疾病的方法，其包括向所述哺乳动物递送治疗有效量的紫苏醇氨基甲酸酯的步骤。所述方法还可包括用辐射治疗哺乳动物的步骤，和/或还包括向哺乳动物递送化学治疗剂的步骤。所治疾病可为癌症，包括神经系统肿瘤，如成胶质细胞瘤。紫苏醇氨基甲酸酯的施用途径包括吸入、鼻内、口服、静脉内、皮下或肌肉内施用。
本发明还提供了一种制备POH氨基甲酸酯的方法，其包括使第一反应物紫苏氯甲酸酯与可为咯利普兰的第二反应物反应的步骤。该反应可在四氢呋喃和正-丁基锂催化剂的存在下进行。可通过使紫苏醇与光气反应来制备紫苏氯甲酸酯。
附图简述
图1示出MTT细胞毒性测定的结果，表明二甲基塞来昔布(DMC)在杀死U87、A172和U251人神经胶质瘤细胞中的功效。
图2示出MTT细胞毒性测定的结果，表明根据本发明POH-DMC缀合物在杀死U87、A172和U251人神经胶质瘤细胞中的功效。
图3示出MTT细胞毒性测定的结果，表明替莫唑胺(TMZ)在杀死U87、A172和U251人神经胶质瘤细胞中的功效。
图4示出MTT细胞毒性测定的结果，表明根据本发明POH-TMZ缀合物在杀死U87、A172和U251人神经胶质瘤细胞中的功效。
图5示出MTT细胞毒性测定的结果，表明POH-咯利普兰缀合物和咯利普兰在杀死A172人神经胶质瘤细胞中的功效。
图6示出MTT细胞毒性测定的结果，表明POH-咯利普兰缀合物和咯利普兰在杀死U87人神经胶质瘤细胞中的功效。
图7示出MTT细胞毒性测定的结果，表明POH-咯利普兰缀合物和咯利普兰在杀死U251人神经胶质瘤细胞中的功效。
图8示出MTT细胞毒性测定的结果，表明POH-咯利普兰缀合物和咯利普兰在杀死L229人神经胶质瘤细胞中的功效。
图9A和9B示出在小鼠模型中丁酰基-POH对肿瘤生长的抑制。图9A示出在经丁酰基-POH、纯度高于98.5％的纯化(S)-紫苏醇(“纯化POH”)、购自Sigma chemicals的POH(“Sigma”)或磷酸盐缓冲盐水(“PBS”，阴性对照)处理的裸小鼠中皮下U-87神经胶质瘤的图像。图9B示出随时间推移的平均肿瘤生长(总时限为60天)。
图10示出集落形成测定(CFA)的结果，表明TMZ和TMZ-POH对TMZ敏感的U251细胞(U251)和TMZ抗性的U251细胞(U251TR)的细胞毒性效果。
图11示出集落形成测定(CFA)的结果，表明POH对TMZ敏感的U251细胞(U251)和TMZ抗性的U251细胞(U251TR)的细胞毒性效果。
图12示出MTT细胞毒性测定的结果，表明POH-TMZ缀合物在杀死U251细胞、U251TR细胞和正常星形细胞中的功效。
图13示出MTT细胞毒性测定的结果，表明POH-TMZ缀合物在杀死正常星形细胞、脑内皮细胞(BEC；融合的和亚融合的)及肿瘤脑内皮细胞(TuBEC)中的功效。
图14示出MTT细胞毒性测定的结果，表明TMZ和POH-TMZ缀合物在杀死USC-04神经胶质瘤癌症干细胞中的功效。
图15示出MTT细胞毒性测定的结果，表明POH在杀死USC-04神经胶质瘤癌症干细胞中的功效。
图16示出MTT细胞毒性测定的结果，表明TMZ和POH-TMZ缀合物在杀死USC-02神经胶质瘤癌症干细胞中的功效。
图17示出MTT细胞毒性测定的结果，表明POH在杀死USC-02神经胶质瘤癌症干细胞中的功效。
图18示出蛋白质印迹，表明TMZ-POH在TMZ敏感的U251神经胶质瘤细胞(“U251-TMZs”)和TMZ抗性的U251神经胶质瘤细胞(“U251-TMZr”)中诱导ER应激(ERS)。
图19示出三个不同的成胶质细胞瘤细胞系在用不同浓度的POH-咯利普兰处理所述细胞系48小时后的阿尔玛蓝(Alarmar blue)测定结果。
图20A-20D示出不同成胶质细胞瘤细胞系(U251、U251TR、LN229和LN229TR)的MTT测定结果，表明POH-咯利普兰有效杀死抗药性成胶质细胞瘤细胞。
图21示出T98G成胶质细胞瘤细胞的MTT测定结果，表明POH-咯利普兰有效杀死抗药性成胶质细胞瘤细胞。
图22A-22B示出T98G和LN18成胶质细胞瘤细胞系的集落形成测定结果，表明POH-咯利普兰在杀死这些抗药性成胶质细胞瘤细胞中的长期有效性。
图23A-23D示出不同成胶质细胞瘤细胞系(U251、LN229、U251TR和LN229TR)的集落形成测定结果，表明POH-咯利普兰在杀死成胶质细胞瘤细胞中的长期有效性。
图24A-24C示出ELISA测定结果，表明POH-咯利普兰在诱导U251成胶质细胞瘤细胞以及化学抗性成胶质细胞瘤系U251TR和T98G的细胞死亡中的有效性。
图25A-25B示出阿尔玛蓝测定结果，表明POH-咯利普兰的耐受性。
图26示出蛋白质印迹测定结果，表明POH-咯利普兰对癌细胞某些细胞内信号途径的影响。
图27示出蛋白质印迹测定结果，表明POH-咯利普兰对癌细胞某些细胞内信号途径的影响。
图28-30示出蛋白质印迹测定结果，比较了POH-咯利普兰和咯利普兰对细胞内过程的作用。
图31示出蛋白质印迹测定结果，描述了POH-咯利普兰对细胞内过程的作用时程。
图32描述了用POH-咯利普兰处理细胞(免疫细胞化学)之后死亡受体5(DR5)的细胞膜定位。
发明详述
本发明提供了单萜或倍半萜衍生物，如紫苏醇衍生物。本发明还提供了包含单萜或倍半萜衍生物，如紫苏醇衍生物的药物组合物。例如，紫苏醇衍生物可以是紫苏醇氨基甲酸酯。紫苏醇衍生物可以是与治疗剂如化学治疗剂缀合的紫苏醇。单萜(或倍半萜)衍生物可以配制成药物组合物，其中单萜(或倍半萜)衍生物以如下范围的量存在：0.01％(w/w)至约100％(w/w)、约0.1％(w/w)至约80％(w/w)、约1％(w/w)至约70％(w/w)、约10％(w/w)至约60％(w/w)或约0.1％(w/w)至约20％(w/w)。本组合物可单独施用，或者可与辐射或另一试剂(例如，化学治疗剂)一起施用，以治疗疾病诸如癌症。治疗可以是相继的，使得在施用其它药剂之前或之后施用单萜(或倍半萜)衍生物。例如，紫苏醇氨基甲酸酯可用于使癌症患者对辐射或化疗敏感。可选地，可同时施用多种试剂。施用途径可以不同，并且可包括吸入、鼻内、口服、经皮、静脉内、皮下或肌肉内注射。本发明还提供了一种治疗疾病诸如癌症的方法，其包括向患者递送治疗有效量的单萜(或倍半萜)衍生物的步骤。
本发明的组合物可含有一种或多种类型的单萜(或倍半萜)衍生物。单萜包括由两个异戊二烯单元组成的萜烯。单萜可为线性(非环状的)或含有环。本发明也涵盖类单萜衍生物。类单萜可通过单萜的生物化学修饰如氧化或重排而制备。单萜和类单萜的实例包括紫苏醇(S(-))和(R(+))、罗勒烯、月桂烯、香叶醇、柠檬醛、香茅醇、香茅醛、芳樟醇、蒎烯、萜品醇、萜品烯、柠檬烯、松油烯、水芹烯、萜品油烯、松油烯-4-醇(或茶树油)、蒎烯、萜品醇、萜品烯；诸如对-伞花烃的类萜，其源自单环萜烯如薄荷醇、百里酚和香芹酚；双环类单萜如樟脑、冰片和桉树脑。
单萜可按碳骨架的结构进行区分并且可分成非环状的单萜(例如，月桂烯、(Z)-和(E)-罗勒烯、芳樟醇、香叶醇、橙花醇、香茅醇、月桂烯醇、香叶醛、柠檬醛a、橙花醛、柠檬醛b、香茅醛等)、单环单萜(例如，柠檬烯、松油烯、水芹烯、萜品油烯、薄荷醇、香芹醇等)、双环单萜(例如，蒎烯,桃金娘烯醇、桃金娘烯醛、马鞭烷醇、马鞭烷酮、松香芹醇、蒈烯、桧烯、莰烯、侧柏烯等)和三环单萜(例如三环烯)。参见Encyclopedia of Chemical Technology，第四版，第23卷，第834-835页。
本发明的倍半萜包括由三个异戊二烯单元组成的萜烯。倍半萜可为线性(非环状的)或含有环。本发明也涵盖类倍半萜衍生物。可以通过倍半萜的生物化学修饰如氧化或重排而制备类倍半萜。倍半萜的实例包括法呢醇、法呢醛、法呢酸和橙花叔醇。
单萜(或倍半萜)的衍生物包括但不限于单萜(或倍半萜)的氨基甲酸酯、酯、醚、醇和醛。单萜(或倍半萜)醇可衍生化为氨基甲酸酯、酯、醚、醛或酸。
氨基甲酸酯是指共有以下官能团的一类化学化合物，
所述官能团基于通过氧和氮侧接的羰基。R1、R2和R3可以是可经取代的诸如烷基、芳基等基团。氮和氧上的R基团可以形成环。R1-OH可为单萜，例如POH。R2-N-R3部分可为治疗剂。
可通过使异氰酸酯和醇反应，或通过使氯甲酸酯和胺反应来合成氨基甲酸酯。可通过利用光气或光气等效物的反应来合成氨基甲酸酯。例如，可通过使光气、双光气或固体光气前体如三光气与两种胺或与一个胺和一个醇反应来合成氨基甲酸酯。氨基甲酸酯(也称为尿烷)也可由脲中间体与醇的反应制成。碳酸二甲酯和碳酸二苯酯也用于制备氨基甲酸酯。可选地，可通过醇和/或胺前体与酯取代的碳酸二芳酯，如碳酸二甲基水杨基醋(BMSC)的反应来合成氨基甲酸酯。美国专利公布第20100113819号。
可通过以下方法合成氨基甲酸酯：
合适的反应溶剂包括但不限于四氢呋喃、二氯甲烷、二氯乙烷、丙酮和二异丙醚。反应可以在约-70℃至约80℃或约-65℃至约50℃的温度范围下进行。紫苏氯甲酸酯与底物R–NH2的摩尔比范围可为约1:1至约2:1、约1:1至约1.5:1、约2:1至约1:1或约1.05:1至约1.1:1。合适的碱包括但不限于有机碱，如三乙胺、碳酸钾、N,N’-二异丙基乙胺、丁基锂和叔丁醇钾。
可选地，可通过以下方法合成氨基甲酸酯：
合适的反应溶剂包括但不限于二氯甲烷、二氯乙烷、甲苯、二异丙醚和四氢呋喃。反应可以在约25℃至约110℃或约30℃至约80℃，或约50℃的温度范围下进行。紫苏醇与底物R-N＝C＝O的摩尔比范围可为约1:1至约2:1、约1:1至约1.5:1、约2:1至约1:1或约1.05:1至约1.1:1。
本发明的单萜(或倍半萜)醇的酯可以源自无机酸或有机酸。无机酸包括但不限于磷酸、硫酸和硝酸、有机酸包括但不限于羧酸如苯甲酸、脂肪酸、乙酸和丙酸，及携带至少一个羧酸官能团的任何治疗剂。单萜(或倍半萜)醇的酯的实例包括但不限于羧酸酯(例如苯甲酸酯、脂肪酸酯(例如，棕榈酸酯、亚油酸酯、硬脂酸酯、丁酰酯和油酸酯)、乙酸酯、丙酸酯(或丙烷酸酯)和甲酸酯)、磷酸酯、硫酸酯和氨基甲酸酯(例如，N,N-二甲基氨基羰基酯)。
可用于本发明的单萜的具体实例为紫苏醇(常缩写为POH)。紫苏醇的实例包括紫苏醇氨基甲酸酯、紫苏醇酯、紫苏醛、二氢紫苏酸、紫苏酸、紫苏醛衍生物、二氢紫苏酸酯和紫苏酸酯。紫苏醇的衍生物还可包括其氧化物和亲核/亲电子加成衍生物。美国专利公布第20090031455号。美国专利第6,133,324和3,957,856号。紫苏醇衍生物的许多实例在化学文献中有报道(参见2010年1月25日检索的附录A：CAS Scifinder搜索输出文件)。
在某些实施方案中，POH氨基甲酸酯通过下述方法合成，该方法包括使第一反应物紫苏氯甲酸酯与第二反应物如二甲基塞来昔布(DMC)、替莫唑胺(TMZ)和咯利普兰反应的步骤。该反应可在四氢呋喃和碱如正-丁基锂的存在下进行。紫苏氯甲酸酯可通过使POH与光气反应来制备。例如，可通过使替莫唑胺与草酰氯反应，接着与紫苏醇反应来制备通过氨基甲酸酯键与替莫唑胺缀合的POH。该反应可在1,2-二氯乙烷的存在下进行。
本发明所涵盖的POH氨基甲酸酯包括但不限于4-(双-N,N’-4-异丙烯基环己-1-烯基甲氧基羰基[5-(2,5-二甲基苯基)-3-三氟甲基吡唑-1-基]苯磺酰胺、4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)-2氧代-吡咯烷-1-羧酸4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯和(3-甲基4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羰基)氨基甲酸-4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯。生成这些化合物的化学反应的详情在下面实施例中有描述。
在某些实施方案中，紫苏醇衍生物可以是紫苏醇脂肪酸酯，如POH的棕榈酰酯和POH的亚油酰酯，其化学结构如下所示。
十六烷酸4-异丙基-环己-1-烯基甲酯(POH的棕榈酰酯)
十八碳-9,12-二烯酸4-异丙基-环己-1-烯基甲酯(POH的亚油酰酯)
单萜(或倍半萜)衍生物可以是与治疗剂缀合的单萜(或倍半萜)。本发明所涵盖的单萜(或倍半萜)缀合物是具有通过化学连接基团与治疗剂共价键合的单萜(或倍半萜)的分子。单萜(或倍半萜)缀合物中单萜(或倍半萜)与治疗剂的摩尔比可为1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1、4:1，或任何其它合适的摩尔比。单萜(或倍半萜)和治疗剂可通过氨基甲酸酯键、酯键、醚键或任何其它合适的化学官能团共价连接。当单萜(或倍半萜)和治疗剂通过氨基甲酸酯键缀合时，治疗剂可以是携带至少一个羧酸官能团的任何药剂，或携带至少一个胺官能团的任何药剂。在具体实例中，紫苏醇缀合物是通过化学连接基团与化学治疗剂共价键合的紫苏醇。
根据本发明，可与单萜(或倍半萜)缀合的治疗剂包括但不限于化学治疗剂，用于治疗CNS病症(包括但不限于原发性退行性神经障碍，如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化、注意缺陷伴多动障碍或ADHD、心理障碍、精神病和抑郁)的治疗剂、免疫治疗剂、血管生成抑制剂和抗高血压剂。可与单萜(或倍半萜)缀合的抗癌剂对癌细胞或受试者具有以下的一种或多种作用：细胞死亡；细胞增殖减少；细胞数量减少；细胞生长抑制；细胞凋亡；坏死；有丝分裂障碍；细胞周期停滞；细胞尺寸减小；细胞分裂减少；细胞存活减少；细胞代谢降低；细胞损伤或细胞毒性的标志物；细胞损伤或细胞毒性的间接指示如肿瘤收缩；受试者存活率提高；或与不良、有害或异常细胞增殖相关的标志物消失。美国专利公布第20080275057号。
本发明还涵盖了单萜(或倍半萜)和至少一种治疗剂的共混物和/或联合制剂。
化学治疗剂包括但不限于DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应激诱导剂、铂化合物、抗代谢物、长春花生物碱(vincalkaloid)、紫杉烷(taxane)、埃博霉素(epothilone)、酶抑制剂、受体拮抗剂、酪氨酸激酶抑制剂、硼辐射敏化剂(即，万珂(velcade))和化学治疗组合疗法。
DNA烷化剂的非限制性实例包括氮芥，如环磷酰胺(异环磷酰胺(Ifosfamide)、曲洛磷胺(Trofosfamide))、苯丁酸氮芥(美法仑(Melphalan)、泼尼莫司汀(Prednimustine))、苯达莫司汀(Bendamustine)、乌拉莫司汀(Uramustine)和雌莫司汀(Estramustine)；亚硝基脲，如卡莫司汀(Carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(Lomustine)(司莫司汀(Semustine))、福莫司汀(Fotemustine)、尼莫司汀(Nimustine)、雷莫司汀(Ranimustine)和链佐星(Streptozocin)；烷基磺酸酯，如白消安(甘露舒凡(Mannosulfan)、曲奥舒凡(Treosulfan))；氮丙啶(Aziridine)，如卡波醌(Carboquone)、三亚胺醌(Triaziquone)、三亚乙基蜜胺；肼(甲基苄肼(Procarbazine))；三氮烯(Triazene)如达卡巴嗪(Dacarbazine)和替莫唑胺(TMZ)；六甲蜜胺(Altretamine)和二溴甘露醇(Mitobronitol)。
拓扑异构酶I抑制剂的非限制性实例喜树碱(Campothecin)衍生物，包括如在Pommier Y.(2006)Nat.Rev.Cancer 6(10):789-802和美国专利公布第200510250854号中描述的SN-38、APC、NPC、喜树碱、拓扑替康(topotecan)、依喜替康甲磺酸盐(exatecanmesylate)、9-硝基喜树碱、9-氨基喜树碱、勒托替康(lurtotecan)、鲁比替康(rubitecan)、斯拉替康(silatecan)、吉马替康(gimatecan)、二氟替康(diflomotecan)、依喜替康(exatecan)、BN-80927、DX-8951f和MAG-CPT；原小檗碱类生物碱及其衍生物，包括如在Li等人(2000)Biochemistry 39(24):7107-7116和Gatto等人(1996)Cancer Res.15(12):2795-2800中描述的小檗红碱(berberrubine)和甲氧檗因(coralyne)；菲咯啉衍生物包括如在Makhey等人(2003)Bioorg.Med.Chem.11(8):1809-1820中描述的苯并[i]菲啶、两面针碱(Nitidine)和花椒宁碱(fagaronine)；如在Xu(1998)Biochemistry 37(10):3558-3566中描述的Terbenzimidazole及其衍生物；和蒽环类衍生物，包括如在Foglesong等人(1992)Cancer Chemother.Pharmacol.30(2):123-]25,Crow等人(1994)J.Med.Chem.37(19):31913194和Crespi等人(1986)Biochem.Biophys.Res.Commun.136(2):521-8中描述的阿霉素(Doxorubicin)、柔红霉素(Daunorubicin)和米托蒽醌(Mitoxantrone)。拓扑异构酶II抑制剂包括但不限于依托泊苷(Etoposide)和替尼泊苷(Teniposide)。拓扑异构酶I和II双重抑制剂包括但不限于沙托品(Saintopin)和其它萘并萘二酮(Naphthecenedione)、DACA和其它吖啶-4-羧酰胺、茚托利辛(Intoplicine)和其它苯并吡啶并吲哚、TAS-I03和其它7H-茚并[2,1-c]喹啉-7-酮、吡唑啉吖啶、XR 11576和其它苯并吩嗪、XR 5944和其它二聚化合物、7-氧代-7H-二苯并[f,ij]异喹啉和7-氧代-7H-苯并[e]嘧啶，及如在Denny和Baguley(2003)Curr.Top.Med.Chem.3(3):339-353中描述的蒽基-氨基酸缀合物。一些药剂抑制拓扑异构酶II并且具有DNA插入活性，例如但不限于蒽环类(阿柔比星(Aclarubicin)、柔红霉素、阿霉素、表柔比星(Epirubicin)、伊达比星(Idarubicin)、氨柔比星(Amrubicin)、吡柔比星(Pirarubicin)、戊柔比星(Valrubicin)、佐柔比星(Zorubicin))和蒽二酮类(米托蒽醌和匹杉琼(Pixantrone))。
内质网应激诱导剂的实例包括但不限于二甲基塞来昔布(DMC)、奈非那韦(nelfinavir)、塞来昔布和硼辐射敏化剂(即，万珂(硼替佐米(Bortezomib))。
铂基化合物是DNA烷化剂的亚类。此类药剂的非限制性实例包括顺铂、萘达铂(Nedaplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、四硝酸三铂、赛特铂(Satraplatin)、阿罗铂(Aroplatin)、洛铂(Lobaplatin)和JM-216。(参见McKeage等人(1997)J.Clin.Oncol.201:1232-1237和通常，CHEMOTHERAPY FOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM,CURRENT THERAPY ANDNOVEL APPROACHES，在the Series Basic and Clinical Oncology中，Angioli等人编辑，2004)。
“FOLFOX”是一类用于治疗结直肠癌的组合疗法的缩写。其包括5-FU、奥沙利铂和亚叶酸(leucovorin)。关于这种治疗的信息在美国国家癌症研究所的网站cancer.gov上可用，最后一次访问于2008年1月16日。
“FOLFOX/BV”是一类用于治疗结直肠癌的组合疗法的缩写。这种疗法包括5-FU、奥沙利铂、亚叶酸和贝伐单抗(Bevacizumab)。此外，“XELOX/BV”是用于治疗结直肠癌的另一种组合疗法，其包括被称为卡培他滨(Capecitabine)(希罗达(Xeloda))的5-FU的前药与奥沙利铂和贝伐单抗的组合。关于这些治疗的信息可以从美国国家癌症研究所的网站cancer.gov上或来自于23个美国国家综合癌症网络网站nccn.org上得到，最后一次访问于2008年5月27日。
抗代谢物药剂的非限制性实例包括基于叶酸的抑制剂，即二氢叶酸还原酶抑制剂，如氨基蝶呤(Aminopterin)、甲氨蝶呤(Methotrexate)和培美曲塞(Pemetrexed)；胸苷酸合成酶抑制剂，如雷替曲塞(Raltitrexed)、培美曲塞；基于嘌呤的抑制剂，即腺苷脱氨酶抑制剂，如喷司他丁(Pentostatin)，硫嘌呤如硫鸟嘌呤(Thioguanine)和巯基嘌呤(Mercaptopurine)，卤化/核糖核苷酸还原酶如克拉屈滨(Cladribine)、氯法拉滨(Clofarabine)、氟达拉滨(Fludarabine)，或鸟嘌呤/鸟苷：硫嘌呤，如硫鸟嘌呤；或基于嘧啶的药剂，即胞嘧啶/胞苷：低甲基化药剂，如阿扎胞苷(Azacitidine)和地西他滨(Decitabine)，DNA聚合酶抑制剂如阿糖孢苷(Cytarabine)，核糖核苷酸还原酶抑制剂如吉西他滨(Gemcitabine)，或胸腺嘧啶/胸苷：胸苷酸合成酶抑制剂，如氟尿嘧啶(5-FU)。5-FU的等效物包括其前药、类似物和衍生物，如例如在Papamicheal(1999)The Oncologist 4:478-487中所述的5'-脱氧-5-氟尿苷(去氧氟尿苷)、1-四氢呋喃-5-氟尿嘧啶(替加氟(ftorafur))、卡培他滨(希罗达)、S-I(MBMS-247616，由替加氟和两种调节剂(5-氯-2,4-二氢吡啶和氧嗪酸钾组成)、雷替曲噻(ralititrexed)(tomudex)、诺拉曲塞(Thymitaq，AG337)、LY231514和ZD9331。
长春花生物碱的实例包括但不限于长春花碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春氟宁(Vinflunine)、长春地辛(Vindesine)和长春瑞滨(Vinorelbine)。
紫杉烷类的实例包括但不限于多西他赛(docetaxel)、拉洛他赛(Larotaxel)、奥他赛(Ortataxel)、紫杉醇(Paclitaxel)和替司他赛(Tesetaxel)。埃博霉素的实例为伊沙匹隆(iabepilone)。
酶抑制剂的实例包括但不限于法尼基转移酶抑制剂(替吡法尼(Tipifarnib))；CDK抑制剂(阿伏西地(Alvocidib)、塞利西利(Seliciclib))；蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)；磷酸二醋酶抑制剂(阿那格雷(Anagrelide)；咯利普兰)；IMP脱氢酶抑制剂(噻唑呋林(Tiazofurine))；和脂肪氧合酶抑制剂(马索罗酚(Masoprocol))。受体拮抗剂的实例包括但不限于ERA(阿曲生坦(Atrasentan))；类视黄醇X受体(蓓萨罗丁(Bexarotene))；和性类固醇(睾内酯(Testolactone))。
酪氨酸激酶抑制剂的实例包括但不限于ErbB:HER1/EGFR的抑制剂(埃罗替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、凡德他尼(Vandetanib)、舒尼替尼(Sunitinib)、来那替尼(Neratinib))；HER2/neu(拉帕替尼、来那替尼)；III类RTK：C-kit的抑制剂(阿西替尼(Axitinib)、舒尼替尼、索拉非尼(Sorafenib))，FLT3抑制剂(来他替尼(Lestaurtinib))，PDGFR抑制剂(阿西替尼、舒尼替尼、索拉非尼)；和VEGFR抑制剂(凡德他尼、司马沙尼(Semaxanib)、西地尼布(Cediranib)、阿西替尼、索拉非尼)；bcr-abl抑制剂(伊马替尼(Imatinib)、尼罗替尼(Nilotinib)、达沙替尼(Dasatinib))；Src抑制剂(博舒替尼(Bosutinib))和Janus激酶2抑制剂(来他替尼)。
“拉帕替尼”是EGFR和erbB-2双重抑制剂。在许多临床试验中已将拉帕替尼作为抗癌单一疗法，以及与曲妥珠单抗(trastuzumab)、卡培他滨、来曲唑(letrozole)、紫杉醇和FOLFIRI(伊立替康(irinotecan)、5-氟尿嘧啶和亚叶酸)组合进行了研究。目前正对转移性乳腺癌、头颈癌、肺癌、胃癌、肾癌和膀胱癌的口服治疗进行III期试验。
拉帕替尼的化学等效物是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或可选地HER-1抑制剂或HER-2抑制剂的小分子或化合物。已发现有几种TKI具有有效的抗肿瘤活性，并且已被批准或正处于临床试验中。此类的实例包括但不限于凡德他尼(Zactima)(ZD6474)、易瑞沙(Iressa)(吉非替尼)、甲磺酸伊马替尼(STI571；格列卫(Gleevec))、埃罗替尼(OSI-1774；特罗凯(Tarceva))、卡奈替尼(canertinib)(CI 1033)、司马沙尼(semaxinib)(SU5416)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY 43-9006)、索坦(sutent)(SUI 1248)和来氟米特(lefltmomide)(SU10l)。
PTK/ZK是具有广泛特异性的酪氨酸激酶抑制剂，其靶向所有VEGF受体(VEGFR)、血小板源生长因子(PDGF)受体、c-KIT和c-Fms。Drevs(2003)Idrugs 6(8):787-794。PTK/ZK是通过抑制结合VEGF的所有已知受体的活性来阻断血管生成和淋巴管生成的靶向药物，所述受体包括VEGFR-I(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)。PTK/ZK的化学名称为1-[4-氯苯胺基]-4-[4-吡啶基甲基]酞嗪琥珀酸酯或1-酞嗪胺，N-(4-氯苯基)-4-(4-吡啶基甲基)-丁二酸酯(1:1)。PTK/ZK的同义词和类似物称为瓦他拉尼、CGP79787D、PTK787/ZK222584、CGP-79787、DE-00268、PTK-787、PTK787A、VEGFR-TK抑制剂、ZK 222584和ZK。
可与单萜或倍半萜缀合的化学治疗剂还可包括安吖啶(amsacrine)、曲贝替定(Trabectedin)、类视黄醇(阿利维A酸(Alitretinoin)、维甲酸(Tretinoin))、三氧化二砷、天冬酰胺贫化剂(天冬酰胺酶/培门冬酶)、塞来昔布、秋水仙胺(Demecolcine)、伊利司莫(Elesclomol)、依沙芦星(Elsamitrucin)、依托格鲁(Etoglucid)、氯尼达明(Lonidamine)、甲硫蒽酮(Lucanthone)、米托胍腙(Mitoguazone)、米托坦(Mitotane)、奥利默森(Oblimersen)、替西罗莫司(Temsirolimus)和伏立诺他(Vorinostat)。
单萜或倍半萜衍生物可与血管生成抑制剂缀合。血管生成抑制剂的实例包括但不限于血管抑素(angiostatin)、抗血管生成核酶(angiozyme)、抗凝血酶III(antithrombinIII)、AG3340、VEGF抑制剂、巴马司他(batimastat)、贝伐单抗(阿瓦斯丁(avastin))、BMS-275291、CAI、2C3、HuMV833血管能抑素、卡托普利(Captopril)、羧胺三唑、软骨源抑制剂(CDI)、CC-5013、6-O-(氯乙酰基-羰基)-烟霉醇、COL-3、康普瑞汀(combretastatin)、康普瑞汀A4磷酸盐、达肝素(Dalteparin)、EMD 121974(西仑吉肽(Cilengitide))、内皮抑素(endostatin)、埃罗替尼、吉非替尼(易瑞沙)、染料木素(genistein)、氢溴酸卤夫酮、Id1、Id3、IM862、甲磺酸伊马替尼、IMC-IC11诱导蛋白10、干扰素-α、白细胞介素12、熏草菌素A(lavendustin A)、LY317615或AE-941、马立马司他(marimastat)、mspin、醋酸甲羟孕酮、Meth-1、Meth-2、2-甲氧雌二醇(2-ME)、癌立消(neovastat)、骨桥蛋白(oteopontin)裂解产物、PEX、色素上皮生长因子(PEGF)、血小板因子4、催乳素片段、增殖蛋白相关蛋白(PRP)、PTK787/ZK 222584、ZD6474、重组人血小板因子4(rPF4)、休眠蛋白(restin)、角鲨胺(squalamine)、SU5416、SU6668、SU11248苏拉明(suramin)、紫杉醇(Taxol)、替可加兰(Tecogalan)、沙利度胺(thalidomide)、凝血栓蛋白(thrombospondin)、TNP-470、肌钙蛋白-1(troponin-1)、血管形成抑制素(vasostatin)、VEG1、VEGF-Trap和ZD6474。
血管生成抑制剂的非限制性实例还包括酪氨酸激酶抑制剂，如酪氨酸激酶受体Flt-1(VEGFR1)和Flk-1/KDR(VEGFR2)的抑制剂，表皮源、成纤维细胞源或血小板源生长因子的抑制剂，MMP(基质金属蛋白酶)抑制剂，整联蛋白阻滞剂，戊聚糖多硫酸酯，血管紧张素II拮抗剂，环氧合酶抑制剂(包括非类固醇类抗炎药(NSAID)如阿司匹林(aspirin)和布洛芬(ibuprofen)，以及选择性环氧合酶-2抑制剂如塞来昔布和罗非昔布(rofecoxib))，及类固醇类抗炎药(如皮质类固醇(corticosteroid)、盐皮质激素(mineralocorticoid)、地塞米松(dexamethasone)、强的松(prednisone)、强的松龙(prednisolone)、甲基强的松龙(methylpred)、倍他米松(betamethasone))。
调节或抑制血管生成并且也可以与单萜或倍半萜缀合的其它治疗剂包括调节或抑制凝血和纤维蛋白溶解系统的试剂，包括但不限于肝素和羧肽酶U抑制剂(也称为活性凝血酶活化纤维蛋白溶解抑制剂[TAFIa])。美国专利公布第20090328239号。美国专利第7,638,549号。
抗高血压剂的非限制性实例包括血管紧张素转化酶抑制剂(例如，卡托普利、依那普利(enalapril)、地拉普利(delapril)等)、血管紧张素II拮抗剂(例如，坎地沙坦西酯(candesartan cilexetil)、坎地沙坦(candesartan)、氯沙坦(losartan)(或科素亚(Cozaar))、氯沙坦钾、依普沙坦(eprosartan)、缬沙坦(valsartan)(或代文(Diovan))、替米沙坦(termisartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、他索沙坦(tasosartan)、奥美沙坦(olmesartan)、奥美沙坦酯(olmesartan medoxomil)等)、钙拮抗剂(例如，马尼地平(manidipine)、硝苯地平(nifedipine)、氨氯地平(amlodipine)(或Amlodin)、依福地平(efonidipine)、尼卡地平(nicardipine)等)、利尿剂、肾素抑制剂(例如，阿利吉仑(aliskiren)等)、醛固酮拮抗剂(例如，安体舒通(spironolactone)、依普利酮(eplerenone)等)、β-阻滞剂(例如，美托洛尔(metoprolol)(或Toporol)、阿替洛尔(atenolol)、普萘洛尔(propranolol)、卡维地洛(carvedilol)、吲哚洛尔(pindolol)等)、血管舒张药(例如，硝酸盐、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂或活化剂、前列腺环素等)、血管紧张素疫苗、可乐定(clonidine)等。美国专利公布第20100113780号。
可与单萜(或倍半萜)缀合的其它治疗剂包括但不限于舍曲林(Sertraline)(左洛复(Zoloft))、托吡酯(Topiramate)(妥泰(Topamax))、度洛西汀(Duloxetine)(欣百达(Cymbalta))、舒马普坦(Sumatriptan)(舒马曲坦(Imitrex))、普瑞巴林(Pregabalin)(利痛抑(Lyrica))、拉莫三嗪(Lamotrigine)(利必通(Lamictal))、伐昔洛韦(Valaciclovir)(维德思(Valtrex))、坦索罗辛(Tamsulosin)(坦洛新)、齐多夫定(Zidovudine)(可比韦(Combivir))、拉米夫定(Lamivudine)(益平维(Combivir))、依法韦仑(Efavirenz)(依非韦伦(Sustiva))、阿巴卡韦(Abacavir)(Epzicom)、洛匹那韦(Lopinavir)(Kaletra)、吡格列酮(Pioglitazone)(爱妥糖(Actos))、地氯雷他定(Desloratidine)(地洛他定(Clarinex))、西替利嗪(Cetirizine)(仙特明(Zyrtec))、潘托拉唑(Pentoprazole)(泮托拉唑(Protonix))、兰索拉唑(Lansoprazole)(Prevacid)、雷贝拉唑(Rebeprazole)(Aciphex)、莫西沙星(Moxifloxacin)(拜复乐(Avelox))、美洛昔康(Meloxicam)(莫比可(Mobic))、多佐胺(Dorzolamide)(Truspot)、双氯芬酸(Diclofenac)(扶他林(Voltaren))、依那普利(Enlapril)(Vasotec)、孟鲁司特(Montelukast)(顺尔宁(Singulair))、西地那非(Sildenafil)(万艾可(Viagra))、卡维地洛(Carvedilol)(Coreg)、雷米普利(Ramipril)(Delix)。
表1列出了可与单萜(或倍半萜)缀合的药物制剂，包括药物制剂的结构和用于缀合的优选衍生物。
表1
单萜(或倍半萜)衍生物的纯度可通过气相色谱法(GC)或高压液相色谱法(HPLC)测定。用于测定单萜(或倍半萜)衍生物的纯度和确定杂质的存在的其它技术包括但不限于核磁共振(NMR)光谱法、质谱法(MS)、GC-MS、红外光谱法(IR)和薄层色谱法(TLC)。可以通过手性GC或旋光度的测量来评估手性纯度。
可通过诸如结晶等方法，或通过根据衍生物的独特物理化学性质(例如，溶解性或极性)将单萜(或倍半萜)衍生物与杂质分离来纯化单萜(或倍半萜)衍生物。因此，可通过本领域已知的合适分离技术将单萜(或倍半萜)衍生物与单萜(或倍半萜)分离，所述技术例如制备型色谱法、(分级)蒸馏或(分级)结晶。
本发明还提供了使用单萜(或倍半萜)衍生物治疗疾病，如癌症或其它神经系统病症的方法。单萜(或倍半萜)衍生物可以单独施用或与辐射、外科手术或化学治疗剂组合施用。单萜(或倍半萜)衍生物也可以与抗病毒剂、抗炎剂或抗生素共同施用。所述药剂可同时或相继施用。可以在施用其它活性剂之前施用单萜(或倍半萜)衍生物。
单萜或倍半萜衍生物可与辐射疗法组合使用。在一个实施方案中，本发明提供了用辐射处理肿瘤细胞，如恶性神经胶质瘤细胞的方法，其中用有效量的单萜衍生物如紫苏醇氨基甲酸酯治疗细胞，然后暴露于辐射。单萜衍生物处理可以在辐射之前、期间和/或之后。例如，可以在放疗开始前一周不断开始施用单萜或倍半萜衍生物并且在放疗完成之后继续两周。美国专利第5,587,402号和5,602,184号。
在一个实施方案中，本发明提供了用化疗治疗肿瘤细胞，如恶性神经胶质瘤细胞的方法，其中用有效量的单萜衍生物如紫苏醇氨基甲酸酯治疗细胞，然后暴露于化疗。单萜衍生物治疗可以在化疗之前、期间和/或之后。
单萜(或倍半萜)衍生物可用于治疗神经系统癌症，如恶性神经胶质瘤(例如，星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤)、视网膜母细胞瘤、毛细胞性星形细胞瘤(I期)、脑膜瘤、脑转移性肿瘤、成神经细胞瘤、垂体腺瘤、颅底脑膜瘤和颅底癌。如本文中所用，术语“神经系统肿瘤”是指其中受试者具有神经系统细胞恶性增殖的病状。
可用当前单萜(或倍半萜)衍生物治疗的癌症包括但不限于肺癌、耳鼻喉癌、白血病、结肠癌、黑素瘤、胰腺癌、乳癌、前列腺癌、乳腺癌、造血系统癌、卵巢癌、基底细胞癌、胆管癌；膀胱癌；骨癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病，包括急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病；肝癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；骨髓瘤；纤维瘤、成神经细胞瘤；口腔(例如，唇、舌、口和咽)癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肾癌；呼吸系统癌；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统癌，以及其它癌和肉瘤。美国专利第7,601,355号。
本发明还提供了治疗CNS病症，包括但不限于原发性退行性神经障碍，如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、心理障碍、精神病和抑郁的方法。治疗可由单萜或倍半萜衍生物单独使用或与用于治疗帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或心理障碍的当前药物组合使用组成。
本发明还提供了提高免疫调节治疗反应的方法，其包括在免疫调节治疗之前或期间，将细胞暴露于有效量的单萜或倍半萜衍生物，如紫苏醇氨基甲酸酯的步骤。优选的免疫调节剂为细胞因子，如白细胞介素、淋巴因子、单核因子、干扰素和趋化因子。
本组合物可通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于鼻内、口服、经皮、经眼、腹膜内、吸入、静脉内、ICV、脑池内注射或输注、皮下、植入、阴道内、舌下、尿道(例如，尿道栓剂)、皮下、肌肉内、静脉内、直肠、舌下、粘膜、眼部、脊髓、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管和淋巴管施用。外用制剂可以呈凝胶、软膏剂、乳膏剂、气溶胶等形式；鼻内制剂可呈喷雾或液滴形式递送；经皮制剂可经由透皮贴剂或离子渗透疗法施用；吸入制剂可以使用喷雾器或类似装置递送。组合物也可以呈片剂、丸剂、胶囊剂、半固体、粉剂、缓释制剂、溶液剂、混悬剂、酏剂、气溶胶或任何其它适当组合物的形式。
为制备此类药物组合物，可以根据常规制药化合技术，将一种或多种单萜(或倍半萜)衍生物与药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂混合。可用于本组合物中的药学上可接受的载体涵盖任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，如油/水或水/油乳液，及各种类型的湿润剂。组合物另外可含固体药物赋形剂如淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉等。液体和半固体赋形剂可选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。液体载体，特别是对于注射液而言，包括水、盐水、水性葡萄糖和二醇。载体、稳定剂和佐剂的实例，参见E.W.Martin编辑的Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，1990年，第18版)。组合物还可包括稳定剂和防腐剂。
如本文中所用，术语“治疗有效量”是足以治疗指定病症或疾病的量或可选地足以获得治疗病症或疾病的药理反应的量。确定最有效的施用方式和剂量的方法可以随用于治疗的组合物、治疗目的、治疗的靶细胞和治疗的受试者而改变。通常可滴定治疗剂量以优化安全性和功效。可以按主治医师选定的剂量水平和模式进行单次或多次施用。合适的剂型和施用药剂的方法可由本领域的技术人员容易地确定。例如，按约0.01mg/kg至约200mg/kg、约0.1mg/kg至约100mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg施用组合物。当本文描述的化合物与另一种药剂或疗法共同施用时，有效量可低于单独使用该药剂时的量。
可以通过将活性剂掺入触变或胶状载体如纤维素介质，例如甲基纤维或羟乙基纤维素中来制备经皮制剂，然后将所得制剂装进适合于与穿戴者皮肤接触的经皮装置中。如果组合物呈凝胶的形式，则可以将组合物擦到患者的表层上，例如皮肤，优选肩部或上臂和或上身的完整、清洁和干燥的皮肤，并且在其上保持足以使单萜(或倍半萜)衍生物递送至患者血清中的一段时间。呈凝胶形式的本发明组合物可装在管、小袋或计量泵中。此类管或小袋可容纳一个单位剂量，或一个以上单位剂量的组合物。计量泵能够分散一个计量剂量的组合物。
本发明还提供了如上所述用于鼻内施用的组合物。同样，该组合物还可包含渗透促进剂。Southall等人Developmentsin Nasal Drug Delivery,2000。单萜(或倍半萜)衍生物可呈液体形式如溶液、乳液、混悬液、滴剂，或呈固体形式如粉末、凝胶或软膏鼻内施用。递送鼻内药物的装置是本领域中公知的。鼻部药物递送可以使用装置进行，包括但不限于鼻内吸入器、鼻内喷雾装置、雾化器、鼻喷雾瓶、单位剂量容器、泵、点滴器、挤压瓶、喷雾器、定剂量吸入器(MDI)、加压剂量吸入器、吹药器和双向装置。经鼻递送装置可以定量以向鼻腔施用精确有效剂量。经鼻递送装置可用于单一单位递送或多个单位递送。在具体实例中，来自Kurve Technology(Bethell,Washington)的ViaNase电子雾化器可用于本发明中(http://www.kurvetech.com)。本发明的组合物也可通过管、导管、注射器、包装尾(packtail)、小拭子、鼻塞或通过粘膜下输注来递送。美国专利公布第20090326275、20090291894、20090281522和20090317377号。
可以使用标准程序将单萜(或倍半萜)衍生物配制成气溶胶。单萜(或倍半萜)衍生物可以用或不用溶剂配制，并且可以用或不用载体配制。制剂可为溶液，或者可为具有一种或多种表面活性剂的水性乳液。例如，可由具有合适推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、烃、压缩空气、氮气、二氧化碳或其它合适其它的加压容器产生气溶胶喷雾。可通过提供阀来确定剂量单位以递送定量的量。泵喷雾分配器可分配定量的剂量或具有特定粒度或液滴尺寸的剂量。如本文中所用，术语“气溶胶”是指于气体中的细小固体颗粒或液体溶液液滴的悬浮液。具体地，气溶胶包括单萜(或倍半萜)液滴的气载悬浮液，正如可以在任何合适的装置，如MDI、喷雾器或弥雾机中产生一样。气溶胶还包括本发明组合物悬浮于空气或其它载气中的干粉组合物。Gonda(1990)Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313.Raeburn等人，(1992)Pharmacol.Toxicol.Methods27:143-159。
单萜(或倍半萜)衍生物可以以如通过鼻吹药器递送的微球形式的粉末递送至鼻腔。单萜(或倍半萜)衍生物可被吸到固体表面例如载体上。粉末或微球可呈干燥的、空气可分散的形式施用。粉剂或微球可储存在吹药器的容器中。可选地粉末或微球可填充到胶囊如明胶胶囊中，或适于鼻部施用的其它单剂量单位中。
可通过将组合物直接置于鼻腔内，例如呈凝胶、软膏、鼻用乳液、洗剂、乳膏剂、鼻塞、点滴器或生物粘附带的形式，将药物组合物递送至鼻腔。在某些实施方案中，可能需要延长药物组合物在鼻腔内的停留时间，例如以增强吸收。因此，可任选地用生物粘附聚合物、树胶(例如，黄原胶)、壳聚糖(例如，高度纯化的阳离子多糖)、果胶(或施用至鼻粘膜时，变稠如凝胶或乳化的任何碳水化合物)、微球(例如，淀粉、白蛋白、葡聚糖、环糊精)、明胶、脂质体、卡波姆(carbamer)、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯树胶、壳聚糖和/或纤维素(例如，甲基或丙基；羟基或羧基；羧甲基或羟丙基纤维素)配制药物组合物。
可通过口服吸入到呼吸道(即肺部)来施用含纯化单萜(或倍半萜)的组合物。
用于可吸入剂的典型递送系统包括喷雾器吸入器、干粉吸入器(DPI)、定剂量吸入器(MDI)。
喷雾器装置产生高速气流，致使呈液体形式的治疗剂以雾的形式喷出。将治疗剂配制成液体形式如合适尺寸的颗粒的溶液或悬浮液。在一个实施方案中，使颗粒微粉化。术语“微粉化”定义为有约90％或更多的直径小于约10μm的颗粒。合适的喷雾器装置经商业提供，例如由PARI GmbH(Starnberg,Germany)提供。其它喷雾器装置包括Respimat(Boehringer Ingelheim)和例如美国专利第7,568,480和6,123,068号及WO 97/12687中描述的那些。单萜(或倍半萜)可配制成水性溶液或液体悬浮液于喷雾器装置中使用。
DPI装置通常以自由流动的粉末形式施用治疗剂，该粉末可以在患者吸气期间分散在气流中。使用外部能源的DPI装置也可用于本发明。为了获得自由流动的粉末，可用合适的赋形剂(例如，乳糖)配制治疗剂。例如，通过混合粒度介于约1μm和100μm之间的干乳糖与单萜(或倍半萜)的微粉化颗粒并且干混，可以制成干粉制剂。可选地，可以不用赋形剂配制单萜。将制剂装入干粉分配器，或吸入药筒或胶囊中，随干粉递送装置一起使用。商业上提供的DPI装置的实例包括Diskhaler(GlaxoSmithKline,Research Triangle Park,N.C.)(参见，例如，美国专利第5,035,237号)；Diskus(GlaxoSmithKline)(参见，例如，美国专利第6,378,519号；Turbuhaler(AstraZeneca,Wilmington,Del.)(参见，例如，美国专利第4,524,769号)和Rotahaler(GlaxoSmithKline)(参见，例如，美国专利第4,353,365号)。合适的DPI装置的其它实例在美国专利第5,415,162、5,239,993和5,715,810号及其中的参考文献中有描述。
MDI装置通常使用压缩推进气体放出测定量的治疗剂。用于MDI施用的制剂包括活性成分于液化推进剂中的溶液或悬浮液。推进剂的实例包括氢氟烷烃(HFA)，如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134a)和1,1,1,2,3,3,3-七氟-正丙烷(HFA 227)，和氯氟烃如CCl3F。用于MDI施用的HFA制剂的附加组分包括共溶剂，如乙醇、戊烷、水和表面活性剂，如脱水山梨糖醇三油酸酯、油酸、卵磷脂和丙三醇。(参见，例如，美国专利第5,225,183号、EP 0717987和WO92/22286)。将制剂装入气溶胶罐中，气溶胶罐形成了MDI装置的一部分。在美国专利第6,006,745和6,143,227号中提供了明确公开与HFA推进剂一起使用的MDI装置的实例。制备合适制剂的方法及适于吸入给药的装置的实例，参见美国专利第6,268,533、5,983,956、5,874,063和6,221,398号及WO 99/53901、WO 00/61108、WO 99/55319和WO 00/30614。
可将单萜(或倍半萜)衍生物封装在脂质体或微胶囊中以通过吸入递送。脂质体是由脂质双层膜和含水内部组成的囊泡。脂质膜可由磷脂构成，其实例包括磷脂酰胆碱如卵磷脂和溶血卵磷脂；酸性磷脂如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油；和神经鞘氨醇磷脂如磷脂酰乙醇胺和神经鞘磷脂。可选地，可添加胆固醇。微胶囊是经包衣材料包被的颗粒。例如，包衣材料可由成膜聚合物、疏水性增塑剂、表面活性剂和/或润滑含氮聚合物的混合物组成。美国专利第6,313,176和7,563,768号。
单萜(或倍半萜)衍生物也可单独地或与其它化学治疗剂组合通过局部施用用以治疗局部癌如乳腺癌或黑素瘤。单萜(或倍半萜)衍生物也可与麻醉剂或止痛剂组合使用以经皮递送疼痛药物治疗。
本发明还提供了如上所述用于眼部施用的组合物。同样，该组合物还可包含渗透促进剂。对于眼部施用，本文描述的组合物可配制成溶液、乳液、混悬液等。适于向眼部施用化合物的各种媒介物是本领域已知的。美国专利第6,261,547、6,197,934、6,056,950、5,800,807、5,776,445、5,698,219、5,521,222、5,403,841、5,077,033、4,882,150和4,738,851号中描述了具体的非限制性实例。
单萜(或倍半萜)衍生物可以单独给予或与其它药物组合以短时间或长时间治疗上述疾病。本组合物可向哺乳动物，优选向人施用。哺乳动物包括但不限于鼠类、大鼠、兔、猿、牛、绵羊、猪、狗、猫、家畜、运动用动物、宠物、马和灵长类动物。
本发明还提供了抑制体外、活体外或体内的细胞生长的方法，其中使细胞，如癌细胞，与有效量的如本文所述的单萜(或倍半萜)衍生物接触。
病理性细胞或组织如过度增生性细胞或组织可以通过使细胞或组织与有效量的本发明组合物接触来治疗。所述细胞，如癌细胞，可以是原代癌细胞或者可以是可从组织库如美国模式培养物保藏所(ATCC)获得的培养细胞。病理性细胞可以是系统性癌症、神经胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤，或系统性癌症的CNS转移癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、造血系统癌或卵巢癌的细胞。所述细胞可来自脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人。美国专利公布第2004/0087651号。Balassiano等人(2002)Intern.J.Mol.Med.10:785-788。Thorne等人(2004)Neuroscience 127:481-496。Fernandes等人(2005)Oncology Reports 13:943-947。Da Fonseca等人(2008)Surgical Neurology 70:259267。Da Fonseca等人(2008)Arch.Immunol.Ther.Exp.56:267-276。Hashizume等人(2008)Neuroncology 10:112-120。
可以使用本领域公知的方法测定本组合物的体外功效。例如，可通过MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓]细胞毒性测定来研究本单萜(或倍半萜)和/或治疗剂的细胞毒性。MTT测定是基于代谢活性细胞对MTT即四唑鎓盐的摄取原理，其中四唑鎓盐代谢为蓝色甲臜(formazon)产物，其可以通过光谱法读取。J.of Immunological Methods 65:5563,1983。可以通过集落形成测定来研究本单萜(或倍半萜)衍生物和/或治疗剂的细胞毒性。可以通过ELISA进行VEGF分泌和IL-8分泌抑制的功能测定。可通过标准碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术研究本单萜(或倍半萜)衍生物和/或治疗剂的细胞周期阻滞。可通过博伊登室(Boyden chamber)研究侵袭抑制。在这项测定中将一层重组基底膜即Matrigel涂布到趋化性滤波器上并且在博伊登室内充当细胞迁移的屏障。仅具有侵袭能力的细胞可以穿过Matrigel屏障。其它测定包括但不限于细胞活力测定、细胞凋亡测定和形态学测定。
以下是本发明的实施例并且不得解释为限制性的。
实施例
实施例1：二甲基塞来昔布双POH氨基甲酸酯(4-(双-N,N’-4-异丙烯基环己-1-烯基甲氧基羰基[5-(2,5-二甲基苯基)-3-三氟甲基吡唑-1-基]苯磺酰胺)的合成
反应方案如下：
在30分钟内，在将温度保持在10℃至15℃之间的同时，向紫苏醇(2.0克，13.1mmol)和碳酸钾(5.4克，39.1mmol)于无水甲苯(30mL)中的混合物添加光气(20％于甲苯中，13ml，26.2mmol)。使反应混合物升温至室温并且在N2下搅拌8.0小时。用水(30mL)淬灭反应混合物并分离有机层。用甲苯(20mL)萃取水层并且用水(50mLx2)、盐水(15％，30mL)洗涤合并的有机层并用硫酸钠(20克)干燥。在真空下浓缩过滤的有机层以产生呈油状物的紫苏氯甲酸酯。重量：2.5克。产率：89％。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ1.5(m,1H),1.7(s,3H),1.8(m,1H),2.0(m,1H),2.2(m,4H),4.7(dd,4H)；5.87(m,1H)。
在5分钟内在N2下将紫苏氯甲酸酯(0.11克，0.55mmol)缓慢地添加到二甲基塞来昔布(0.2克，0.50mmol)和碳酸钾(0.13克，1.0mmol)于无水丙酮(10mL)中的混合物中。加热反应混合物至回流并保持3小时。因为TLC分析表明存在二甲基塞来昔布(>60％)，所以再添加1.0个当量的紫苏氯甲酸酯并且再回流5小时。使反应混合物冷却并在真空下浓缩丙酮以产生残留物。
使所得残留物悬浮在水(15mL)中并用乙酸乙酯(3x15mL)萃取。用水(20mL)洗涤合并的有机层，接着用盐水(15％，20mL)洗涤并用硫酸钠干燥。在真空下浓缩过滤的有机层以产生残留物，通过柱色谱法[柱尺寸：直径：1.5cm，高度10cm，二氧化硅：230-400目]纯化残留物并用己烷(100mL)洗脱，接着用己烷/乙酸乙酯(95:5，100mL)洗脱。合并己烷/乙酸乙酯级分并在真空下浓缩以产生胶状物质。
产物POH氨基甲酸酯表现出120mg的质量和31％的产率。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ0.9(m,2H),1.4(m,2H),1.7(m,7H*),1.95(m,8H*),2.1(m,4H),2.3(s,3H),4.4(d,2H),4.7(dd,2H),5.6(br d,2H),6.6(s,1H),7.0(br s,1H),7.12(d,1H),7.19(d,1H),7.4(d,2H),7.85(d,2H)；MS,m/e:751.8(M+3％),574.3(100％),530.5(45％),396(6％)。*注意：在NMR积分中扣除了来自假定杂质的进一步2H重叠。
实施例2：二甲基塞来昔布双POH氨基甲酸酯(POH-DMC)的体外细胞毒性研究
在用单独的二甲基-塞来昔布(DMC)处理细胞之后进行第一次细胞毒性测定。图1示出了在人恶性神经胶质瘤细胞U87、A172和U251上单独使用DMC进行的MTT细胞毒性测定的结果。
用二甲基塞来昔布双POH氨基甲酸酯(POH-DMC)(例如，通过实施例1中的方法合成)处理U87、A172和U251细胞，并进行MTT细胞毒性测定(图2)。结果表明POH氨基甲酸酯POH-DMC表现出比单独的DMC强得多的细胞毒性。
实施例3：替莫唑胺POH氨基甲酸酯(3-甲基4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羰基)-氨基甲酸-4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯)的合成
反应方案如下：
在2分钟内，在将温度保持在10℃的同时在N2下，向替莫唑胺(OChemIncorporation，0.1克，0.5mmol)于1,2-二氯乙烷(10mL)中的混合物缓慢地添加草酰氯(0.13克，1.0mmol)。使反应混合物升温至室温，然后加热至回流3小时。通过在真空下浓缩去除过量的草酰氯和1,2-二氯乙烷。将所得残留物重新溶于1,2-二氯乙烷(15mL)中并且使反应混合物在N2下冷却至10℃。在5分钟内添加紫苏醇(0.086克，0.56mmol)于1,2-二氯乙烷(3mL)中的溶液。使反应混合物升温至室温并搅拌14小时。在真空下浓缩1,2-二氯乙烷以产生残留物，用己烷研磨残留物。过滤所得黄色固体并用己烷洗涤。重量：170mg。产率：89％。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ1.4-2.2(m,10H),4.06(s,3H),4.6-4.8(m,4H),5.88(br s,1H),8.42(s,1H),9.31(br s,1H)；MS，未观察到分子离子峰。m/e:314(100％),286.5(17％),136(12％)。
可选地，根据以下程序合成替莫唑胺POH氨基甲酸酯。在2分钟内，在将温度保持在10℃的同时在N2下，向替莫唑胺(OChem Incorporation，0.1克，0.5mmol)于1,2-二氯乙烷(10mL)中的混合物缓慢地添加草酰氯(0.13克，1.0mmol)。使反应混合物升温至室温，然后加热至回流3小时。通过在真空下浓缩去除过量的草酰氯和1,2-二氯乙烷。将所得残留物重新溶于1,2-二氯乙烷(15mL)中并且使反应混合物在N2下冷却至10℃。在5分钟内添加紫苏醇(0.086克，0.56mmol)于1,2-二氯乙烷(3mL)中的溶液。使反应混合物升温至室温并搅拌14小时。在真空下浓缩1,2-二氯乙烷以产生残留物，通过短的二氧化硅填充柱[柱尺寸：直径：2cm，高度3cm，二氧化硅：230-400目]纯化残留物并用己烷/乙酸乙酯的混合物(1:1，100mL)洗脱。合并己烷/乙酸乙酯级分并在真空下浓缩以产生白色固体残留物，用庚烷研磨残留物并过滤以获得白色固体。重量：170mg；产率：89％.1H-NMR(400MHz,CDCl3):1.4-2.2(m,10H),4.06(s,3H),4.6-4.8(m,4H),5.88(br s,1H),8.42(s,1H),9.31(br s,1H)；MS，未观察到分子离子峰，m/e:314(100％),286.5(17％),136(12％)。
实施例4：替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)的体外细胞毒性研究
用单独的替莫唑胺(TMZ)处理细胞之后进行第一次细胞毒性测定，替莫唑胺是恶性神经胶质瘤的治疗中使用的标准烷化剂。图3示出了在人恶性神经胶质瘤细胞U87、A172和U251上使用单独的TMZ进行的MTT细胞毒性测定的结果。升高TMZ的浓度对试验的细胞系有极小的细胞毒性。
用替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)(例如，通过实施例3中的方法合成)处理TMZ抗性神经胶质瘤细胞系U87、A172和U251细胞。MTT测定结果(图4)显示POH氨基甲酸酯POH-TMZ与单独的TMZ相比表现出对各种人神经胶质瘤细胞高很多的杀死率。
实施例5：咯利普兰POH氨基甲酸酯(4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)-2-氧代-吡咯烷-1-羧酸4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯)的合成
反应方案如下：
在30分钟内，在将温度保持在10℃至15℃之间的同时，向紫苏醇(2.0克，13.1mmol)和碳酸钾(5.4克，39.1mmol)于无水甲苯(30mL)中的混合物添加光气(20％于甲苯中，13ml，26.2mmol)。使反应混合物升温至室温并且在N2下搅拌8.0小时。用水(30mL)淬灭反应混合物并分离有机层。用甲苯(20mL)萃取水层并且用水(50mLx2)、盐水(15％，30mL)洗涤合并的有机层并用硫酸钠(20克)干燥。在真空下浓缩过滤的有机层以产生呈油状物的紫苏氯甲酸酯。重量：2.5克。产率：89％。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ1.5(m,1H),1.7(s,3H),1.8(m,1H),2.0(m,1H),2.2(m,4H),4.7(dd,4H)；5.87(m,1H)。
在-72℃下在5分钟内于N2下将丁基锂(2.5M,0.18mL,0.45mmol)添加到咯利普兰(GL synthesis,Inc.，0.1克，0.36mmol)于无水THF中的溶液中。在-72℃下搅拌反应混合物1.0小时，在15分钟内在将温度保持在-72℃的同时添加紫苏氯甲酸酯(溶于4mL THF中)。搅拌反应混合物2.5小时并用饱和氯化铵(5mL)淬灭。使反应混合物升温至室温并用乙酸乙酯(2x15mL)萃取。用水(15mL)、盐水(15％，15mL)洗涤合并的有机层，然后用硫酸钠干燥。浓缩过滤的有机层以产生油状物，通过柱色谱法[柱尺寸：直径：1.5cm，高度10cm，二氧化硅：230-400目]纯化并用8％乙酸乙酯/己烷混合物(100mL)洗脱，接着用12％乙酸乙酯/己烷混合物(100mL)洗脱。合并12％乙酸乙酯/己烷级分并在真空下浓缩以产生胶状物质。重量：142mg；产率：86％。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ1.5(m,1H),1.6(m,2H),1.7(s,3H),1.9(m,6H),2.2(m,5H),2.7(m,1H),2.9(m,1H),3.5(m,1H),3.7(m,1H),3.8(s,3H),4.2(m,1H),4.7(m,6H),5.8(br s,1H),6.8(m,3H)；MS,m/e:452.1(M+153％),274.1(100％),206.0(55％)。
实施例6：咯利普兰POH氨基甲酸酯(POH-咯利普兰)的体外细胞毒性研究
为了比较咯利普兰POH氨基甲酸酯(POH-咯利普兰)(例如，通过实施例5中的方法制备)与咯利普兰(诱导神经胶质瘤细胞分化和细胞凋亡的IV型磷酸二酯酶)的细胞毒性，用POH-咯利普兰或咯利普兰处理A172、U87、U251和LN229人神经胶质瘤细胞48小时。图5-8中示出了MTT测定结果。POH-咯利普兰与单独的咯利普兰相比对几种不同的人神经胶质瘤细胞类型中的每一种表现出高很多的杀死率。图5示出了浓度升高的咯利普兰和POH-咯利普兰对A-172细胞的MTT测定。单独的咯利普兰展示出大约1000uM(1mM)的IC50。在POH-咯利普兰的存在下，IC50达到在低至50uM的浓度。图6示出了浓度升高的咯利普兰对U-87细胞的MTT测定。在1000uM下未达到IC50。另一方面，用POH-咯利普兰，在180uM下达到IC50。图7显示单独的咯利普兰对U251细胞的IC50在170uM下达到；60％达到细胞毒性平台期。POH-咯利普兰在50uM下达到IC50，在100uM下达到接近100％的细胞毒性。图8显示单独的咯利普兰对LN229细胞的IC50甚至在100uM下也未达到。另一方面，对于POH-咯利普兰，在100uM下达到IC50，在10uM下接近100％的细胞毒性。
实施例7：POH脂肪酸衍生物的体内肿瘤生长抑制
在裸小鼠皮下神经胶质瘤模型中研究丁酰基-POH对肿瘤生长的抑制。为小鼠注射U-87神经胶质瘤细胞(500,000个细胞/注射)并允许在两周内形成可触知的瘤。一旦可触知的瘤形成，就在8周内通过棉签(Q-tip)(1cc/施用/天)局部施用如图9A和9B所示的各种化合物来处理小鼠。图9A示出在经丁酰基-POH、纯度高于98.5％的纯化(S)-紫苏醇(“纯化POH”)、购自Sigma chemicals的POH或磷酸盐缓冲盐水(“PBS”，阴性对照)处理的裸小鼠中皮下U-87神经胶质瘤的图像。图9B示出随时间推移的平均肿瘤生长(总时限为60天)。丁酰基-POH展示出对肿瘤生长最强的抑制，接着是纯化POH和Sigma POH。
实施例8：替莫唑胺(TMZ)和替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)对TMZ敏感的神经胶质瘤细胞和TMZ抗性的神经胶质瘤细胞的体外细胞毒性研究
在用单独的TMZ、单独的POH和TMZ-POH缀合物处理细胞之后进行集落形成测定。如Chen TC等人，Green tea epigallocatechin gallate enhances therapeutic efficacyof temozolomide in orthotopic mouse glioblastoma models.Cancer Lett.2011年3月28日；302(2):100-8中所述，进行集落形成测定。图10示出用TMZ或TMZ-POH对TMZ敏感的U251细胞(U251)和TMZ抗性的U251细胞(U251TR)进行的集落形成测定的结果。TMZ对TMZ敏感的U251细胞展示出细胞毒性，但对TMZ抗性的U251细胞具有极小细胞毒性。TMZ-POH对TMZ敏感的U251细胞和TMZ抗性的U251细胞两者均展示出细胞毒性。
图11示出用POH对TMZ敏感的U251细胞(U251)和TMZ抗性的U251细胞(U251TR)进行的集落形成测定的结果。POH对TMZ敏感的U251细胞和TMZ抗性的U251细胞两者均展示出细胞毒性。POH-TMZ(图10)与单独的POH(图11)相比在集落形成测定中表现出高很多的效力。
实施例9：替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)对U251细胞、U251TR细胞和正常星形细胞的体外细胞毒性研究
在用TMZ-POH缀合物处理细胞之后进行MTT细胞毒性测定。如Chen TC等人，Greentea epigallocatechin gallate enhances therapeutic efficacy of temozolomide inorthotopic mouse glioblastoma models.Cancer Lett.2011年3月28日；302(2):100-8中所述，进行MTT细胞毒性测定。图12示出了对TMZ敏感细胞(U251)、TMZ抗性细胞(U251TR)和正常星形细胞进行的MTT细胞毒性测定的结果。TMZ-POH对TMZ敏感的U251细胞和TMZ抗性的U251细胞两者展示出细胞毒性，但对正常星形细胞未展示出细胞毒性。
实施例10：替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)对BEC、TuBEC和正常星形细胞的体外细胞毒性研究
在用TMZ-POH缀合物处理细胞之后进行MTT细胞毒性测定。如Chen TC等人，Greentea epigallocatechin gallate enhances therapeutic efficacy of temozolomide inorthotopic mouse glioblastoma models.Cancer Lett.2011年3月28日；302(2):100-8中所述，进行MTT细胞毒性测定。图13示出了对正常星形细胞、脑内皮细胞(BEC；融合的和亚融合的)及肿瘤脑内皮细胞(TuBEC)进行的MTT细胞毒性测定的结果。TMZ-POH对正常星形细胞、融合的BEC或TuBEC未诱导显著的细胞毒性。在高浓度的TMZ-POH下，在亚融合的BEC中展示出轻度至中度的细胞毒性。
实施例11：替莫唑胺(TMZ)和替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)对USC-04神经胶质瘤癌症干细胞的体外细胞毒性研究
在用单独的TMZ、单独的POH或TMZ-POH缀合物处理细胞之后进行MTT细胞毒性测定。如Chen TC等人，Green tea epigallocatechin gallate enhances therapeuticefficacy of temozolomide in orthotopic mouse glioblastoma models.Cancer Lett.2011年3月28日；302(2):100-8中所述，进行MTT细胞毒性测定。图14示出了对USC-04神经胶质瘤癌症干细胞进行的MTT细胞毒性测定的结果。TMZ在浓度升高(0-400uM)的情况下，未诱导显著的细胞毒性。TMZ-POH以150uM的IC50展示出细胞毒性的证据。图15示出了对经POH处理的USC-04神经胶质瘤癌症干细胞进行的MTT细胞毒性测定的结果。POH在浓度升高(0-2mM)的情况下展示出对USC-04的细胞毒性。
实施例12：替莫唑胺(TMZ)和替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)对USC-02神经胶质瘤癌症干细胞的体外细胞毒性研究
在用单独的TMZ、单独的POH或TMZ-POH缀合物处理细胞之后进行MTT细胞毒性测定。如Chen TC等人，Green tea epigallocatechin gallate enhances therapeuticefficacy of temozolomide in orthotopic mouse glioblastoma models.Cancer Lett.2011年3月28日；302(2):100-8中所述，进行MTT细胞毒性测定。图16示出了对USC-02神经胶质瘤癌症干细胞进行的MTT细胞毒性测定的结果。TMZ在浓度升高(0-400uM)的情况下，未诱导显著的细胞毒性。TMZ-POH展示出细胞毒性的证据，IC50为60uM。图17示出了对经POH处理的USC-02神经胶质瘤癌症干细胞进行的MTT细胞毒性测定的结果。POH在浓度升高(0-2mM)的情况下展示出对USC-02的细胞毒性。
实施例13：替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)对TMZ敏感的神经胶质瘤细胞和TMZ抗性的神经胶质瘤细胞的体外ER应激研究
在用TMZ-POH缀合物处理TMZ敏感的神经胶质瘤细胞和TMZ抗性的神经胶质瘤细胞18小时后进行蛋白质印迹分析。图18示出表明TMZ-POH在TMZ敏感的U251神经胶质瘤细胞和TMZ抗性的U251神经胶质瘤细胞中诱导ER应激(ERS)的蛋白质印迹。在TMZ-POH浓度低至60uM时，显示促凋亡蛋白CHOP活化。
实施例14：POH-咯利普兰的体外和体内研究
在该实施例中，POH-咯利普兰也称为NEO214。
将三个不同的确定成神经胶质细胞瘤细胞系暴露于这种NEO214，然后于48小时后测量这些细胞的活力。如图19所示，浓度升高的NEO214对全部三个细胞系产生强烈的细胞毒活性，IC50(即，杀死50％细胞的浓度)在40-60微摩尔范围内。NEO214对全部三个细胞系同样有效，这根据下述事实是值得注意的，已知这些细胞系中的一个T98G，由于称为MGMT(O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶)的DNA修复蛋白过度表达，对常用脑癌药物替莫唑胺有高度抗性。
然后将所观测到的NEO214肿瘤细胞杀死活性与其单独组分的活性做比较。用浓度升高的NEO214、咯利普兰、POH或与POH混合的咯利普兰(或咯利普兰加上POH，标注为R+P)处理不同的成胶质细胞瘤细胞。48小时后，通过MTT测定来测量细胞活力。如图20A-20D所示，NEO214是到目前为止最具细胞毒性的治疗并且比咯利普兰或POH或两种单独药剂的混合物更加有效地杀死这些癌细胞。
有趣地，NEO214在化学抗性细胞中同样有效。U251TR细胞(图20B)和LN229TR细胞(图20D)是源自U251细胞(图20A)和LN229细胞(图20C)的亚系，其对替莫唑胺(恶性神经胶质瘤的标准治疗)的化疗疗效具有高度抗性。然而，如图所示，NEO214对这些细胞也非常有效。
用浓度升高的NEO214，或用单独的POH、单独的咯利普兰或咯利普兰加上POH(R+P)的混合物处理T98G成胶质细胞瘤细胞，该T98G成胶质细胞瘤细胞是充分表征的替莫唑胺抗性细胞。48小时后，通过MTT测定来测量细胞活力。如图21所示，尽管存在其耐药性状况，但NEO214在这些细胞中高度有效。同样，NEO214比其单独组分(单独的咯利普兰或单独的POH)或其组分的混合物(咯利普兰加上POH)明显更有效。
图19-21中所示的结果源自短期实验，其中在48小时期限内研究NEO214的杀肿瘤作用。还通过进行实验以确定肿瘤细胞是否可以承受这种化合物毒性作用并且在从细胞培养基中去除NEO214之后可能稍后恢复，测定用NEO214处理的长期效应。朝着这个目标，进行集落形成测定以研究NEO214处理的细胞在用这种药剂最初48小时处理后是否可以于两周内恢复。T98G和LN18是对用替莫唑胺治疗(成胶质细胞瘤患者的现行化学标准化护理)有抗性的成胶质细胞瘤细胞。U251和LN229是成胶质细胞瘤细胞系，U251TR和LN229TR是对替莫唑胺具有高度抗性的亚系。用浓度升高的NEO214，或用单独的POH、单独的咯利普兰或咯利普兰加上POH(R+P)的混合物处理所有细胞系。48小时后，去除药物并且细胞接受未添加任何药物的新鲜培养基。保持细胞不受干扰12天，之后测定新形成的集落数量。将来自尚未接受任何药物或仅接受媒介物的那些培养物的集落数量设为100％。如图22A-22B和23A-23D所示，尽管存在其耐药性状况，但NEO214在所有这些细胞系中均高度有效。同样，NEO214比其单独组分(单独的咯利普兰或单独的POH)或其组分的混合物(咯利普兰加上POH)明显更有效。图22A-22B和23A-23D还显示，事实上，肿瘤细胞都不能从NEO214处理中恢复。NEO214的IC50(即，杀死50％细胞的浓度)在这项药物效应的长期研究(2周)中，与图19-21所示的实验(48小时)相比稍低。这里，NEO214的IC50范围为约30至55微摩尔。
值得注意的是，在图22A-22B和23A-23D所示的这些长期实验(2周)中，在用足够浓度的NEO214处理之后肿瘤细胞存活率一直下降到零，意味着长期用NEO214处理，没有肿瘤细胞能够存活。同样，正如之前在图19-21中所观察到的，具高度化学抗性的细胞被NEO214有效杀死，正如其更具化学敏感性的配对物一样。LN18和T98G细胞(图22A-B)由于DNA修复蛋白MGMT过度表达而具有化学抗性，而U251TR和LN229TR细胞(图23B、23D)基于其它细胞抗性机制而具有化学抗性。这后一种观察结果表明NEO214可对已经发展出不同的传统药物抗性机制的肿瘤细胞发挥效力。
通过量化程序性细胞死亡/凋亡程度的细胞死亡ELISA测定，进一步确认NEO214的强效肿瘤细胞杀死能力。U251成胶质细胞瘤细胞以及化学抗性成胶质细胞瘤系U251TR和T98G用浓度升高的NEO214处理24小时。然后，进行细胞死亡ELISA以测定死亡和濒死细胞的百分比。来自这些测定的结果，如图24A-24C所示，验证了NEO214杀死成胶质细胞瘤细胞，包括化学抗性系U215TR和T98G的强大效力。同样，图24A-24C显示NEO214比咯利普兰更加强效，咯利普兰在相似浓度下并未发挥任何细胞毒性效果。
对于任何癌症药物临床功效的重要考虑因素是其耐受性，即其杀死预期肿瘤靶标，而非健康的正常器官的能力。通过将源自人脑的正常细胞暴露于这种化合物来研究NEO214对肿瘤细胞的特异性。具体而言，将人正常星形细胞和脑内皮细胞(BEC)暴露于浓度升高的NEO214或咯利普兰72小时。并行地，也使用U251成胶质细胞瘤细胞。如图25A-25B所示，NEO214强效地杀死U251肿瘤细胞(NEO214杀死>90％的肿瘤细胞，IC50为50微摩尔和100微摩尔)，但即使在高达200微摩尔的浓度下对正常细胞(星形细胞、BEC)也无毒性作用。相比之下，咯利普兰对这些细胞中的任一种，正常细胞或肿瘤细胞均无毒性作用。这个结果表明NEO214具高度选择性：非常有效地杀死肿瘤细胞，但不伤害正常细胞，如星形细胞或肿瘤血管的细胞。
进行进一步研究以调查NEO214靶向癌细胞的哪些分子组分和细胞内途径。为此，研究了控制细胞生长、细胞死亡和存活，以及总体细胞功能和完整性所关键性涉及的六个细胞过程的反应：(i)细胞周期，如其关键组分如细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E所表示的；(ii)促有丝分裂控制，如Akt/PKB(蛋白激酶B)、MEK(促分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶)、P70S6K(S6蛋白激酶)和S6RP(S6核糖体蛋白)所发挥的；(iii)凋亡，如PARP(聚ADP-核糖聚合酶)和半胱天冬酶7(C7)所表明；(iv)ER(内质网)应激，如GRP78(分子质量为78的葡萄糖调控蛋白)、GRP94、CHOP(CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白)和ATF3(转录激活因子3)所揭示的；(v)自体吞噬，如LC3(微管相关蛋白1A和1B轻链)和p62(SQSTM1)所表明；和(vi)DNA损伤，如H2AX(组蛋白2A家族成员X)所表明。
U251成胶质细胞瘤细胞用浓度升高的NEO214处理24小时。之后，制备细胞裂解物并用特异性抗体通过蛋白质印迹分析。对于细胞周期分析而言，使用以下抗体：细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E。对于促有丝分裂途径而言，使用对Akt、MEK、P70S6K和S6RP的磷酸化形式(即，蛋白质的活化形式)有特异性的抗体。在所有情况下，将针对肌动蛋白的抗体用作负载对照以确认每条泳道中使用等量的蛋白质。对于凋亡分析而言，使用以下抗体：PARP(下方第二条带的出现表明细胞死亡开始)和裂解的半胱天冬酶7(强度增加表明细胞濒死)。对于ER应激而言，我们使用GRP78、GRP94、CHOP和ATF3的抗体，CHOP和ATF3增加表明存在促凋亡ER应激。通过磷酸化H2AX(p-H2AX)的量增加证实DNA损伤的存在。分析的自体吞噬标志物为LC3和p62；LC3下方第二条带的出现表明自体吞噬活性增强。在所有情况下，将针对肌动蛋白的抗体用作负载对照以确认每条泳道中使用等量的蛋白质。
如图26所示，用NEO214处理成胶质细胞瘤细胞导致细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E下调，并且细胞周期蛋白D的表达增加。这个结果表明NEO214的生长抑制作用并且停止于细胞周期的G1期。在相同处理条件下，正如磷酸化(p-MEK，即活化)形式的MEK的下调所表明，对MEK1/2活性存在显著抑制，这揭示了对这种关键促有丝分裂途径的阻滞。Akt活性微弱增强(正如其磷酸化p-Akt形式略微增加所表明)，并且P70S6K和S6RP的磷酸化(即，活性)也增加。
如图27所示，用NEO214处理成胶质细胞瘤细胞导致PARP裂解(即，出现更快迁移的第二信号)和对裂解C7的强烈诱导，两者均表示正在进行的细胞死亡/凋亡的确定指示。正如ER应激标志物GRP78、CHOP和ATF3的表达增加所表明的，NEO214还触发严重的内质网(ER)应激。正如对于LC3而言出现更快迁移的第二信号所表示的，存在对自体吞噬的弱诱导。NEO214还引起DNA损伤，这通过对DNA损伤标志物p-H2AX的强烈诱导所表明。总而言之，这些结果表明NEO214对几个细胞过程的强效影响，所述细胞过程对于维持细胞内稳态很关键。
将NEO214的效力与咯利普兰的效力做比较。U251成胶质细胞瘤细胞用浓度升高的NEO214或咯利普兰处理24小时。之后，制备细胞裂解物并用特异性抗体通过蛋白质印迹分析。如图28-30所概述的，咯利普兰对细胞内稳态的这些不同标志物产生一些与NEO214相同的影响。然而，NEO214比咯利普兰明显更强效。例如，50μM NEO214足以触发细胞死亡指示物C7的活化(即，裂解)，而对于相同影响而言咯利普兰需要高10倍以上的浓度(图28)；浓度低至40μM的NEO214强效地诱导应激蛋白CHOP和ATF3，而对于类似结果而言咯利普兰需要500至1,000μM(图29)；在关键有丝分裂刺激蛋白ERK的情况下，50μM NEO214引起完全抑制，而1,000μM咯利普兰也无法模拟这种抑制效应(图30)。
用NEO214处理U251成胶质细胞瘤细胞不同时间长度至24小时。之后，制备细胞裂解物并用特异性抗体通过蛋白质印迹分析。如图31所示，NEO214的作用早在开始处理后1小时就变得明显，并且在24小时期间在强度上增加。
有趣地，如图30和31中所见，用NEO214处理成胶质细胞瘤细胞引起对DR5(死亡受体5)表达的显著刺激。这是特别值得注意的，因为DR5属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，其在结合配体如TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体)之后触发外在凋亡性细胞死亡。呈活性形式的DR5位于细胞表面，在这里其接收死亡诱导信号，如TRAIL。用单独的媒介物(左)或用100μM NEO214处理U251成胶质细胞瘤细胞24小时。之后，用DR5的抗体对细胞进行原位染色。如图所示，NEO214引起对DR5的显著诱导并且在细胞表面存在DR5。用NEO214处理成胶质细胞瘤细胞(用单独的媒介物(图32，左)或用100μM NEO214(图32，右)处理U251成胶质细胞瘤细胞)显示DR5的细胞表面定位强烈增加。之后，用DR5的抗体对细胞进行原位染色。表明NEO214可能能够使肿瘤细胞对与DR5配体TRAIL组合之后进一步增加的细胞死亡敏感的可能性。
总的来说，NEO214在几个不同的肿瘤细胞系，包括强抗药性成胶质细胞瘤细胞中表现出突出的体外抗癌活性，并且其肿瘤细胞杀死效力比其单独组分，即单独的POH或咯利普兰明显更高。还显示NEO214对正常细胞无毒，这表明这种化合物可能为患者良好耐受。其作用机制似乎涉及几个关键的细胞内途径。对于通过药物对肿瘤细胞内稳态至关重要的几个过程的多方面、同时攻击提供有效的肿瘤细胞杀死而言，NEO214的这些特征是理想的。
本发明的范围不受上文明确示出和描述的内容限制。本领域的技术人员将认识到所描述的材料、构造、结构和尺寸的示例存在合适的替代物。在本发明的描述中引用并讨论了许多参考文献，包括专利和各自出版物。提供对此类参考文献的引用和讨论仅仅是为了阐明本发明的描述而非承认任何参考文献是本文所述发明的现有技术。本说明书中引用和讨论的所有参考文献均以引用的方式整体并入。在不背离本发明的精神和范围的前提下，对于本领域的普通技术人员而言将出现本文所述内容的变型、修改和其它实施方式。虽然已经示出并描述了本发明的某些实施方案，但对于本领域的技术人员将显而易见的是在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以进行变化和修改。前面的描述和附图中提出的内容仅以说明的方式提供而不是作为限制。

Claims (15)

1.一种包含紫苏醇氨基甲酸酯的组合物，其中所述紫苏醇氨基甲酸酯包含与咯利普兰缀合的紫苏醇。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述紫苏醇氨基甲酸酯为4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)-2-氧代-吡咯烷-1-羧酸4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯。
3.一种治疗哺乳动物的成胶质细胞瘤的方法，其包括向所述哺乳动物递送治疗有效量的紫苏醇氨基甲酸酯，其中所述紫苏醇氨基甲酸酯包含与咯利普兰缀合的紫苏醇。
4.根据权利要求3所述的方法，其还包括用辐射治疗所述哺乳动物。
5.根据权利要求3所述的方法，其还包括向所述哺乳动物递送化学治疗剂。
6.根据权利要求3所述的方法，其中通过吸入、鼻内、口服、静脉内、皮下或肌肉内施用所述紫苏醇氨基甲酸酯。
7.根据权利要求6所述的方法，其中使用雾化器鼻内施用所述紫苏醇氨基甲酸酯。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述紫苏醇氨基甲酸酯为4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)-2-氧代-吡咯烷-1-羧酸4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯。
9.一种治疗哺乳动物的疾病的方法，其包括使用经鼻递送装置向所述哺乳动物施用治疗有效量的紫苏醇氨基甲酸酯，其中所述紫苏醇氨基甲酸酯包含与咯利普兰缀合的紫苏醇。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述经鼻递送装置选自鼻内吸入器、鼻内喷雾装置、雾化器、喷雾器、定剂量吸入器(MDI)、加压剂量吸入器、吹药器、单位剂量容器、泵、点滴器、鼻喷雾瓶、挤压瓶和双向装置。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述疾病为癌症。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述癌症为神经系统的肿瘤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述肿瘤为成胶质细胞瘤。
14.根据权利要求9所述的方法，其还包括用辐射治疗所述哺乳动物的步骤。
15.根据权利要求9所述的方法，其还包括向所述哺乳动物递送化学治疗剂的步骤。
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