TWI643618B - 包含紫蘇醇衍生物之化合物於製造治療癌症之藥物的用途 - Google Patents

Abstract

用於治療在哺乳動物中之癌症的腦轉移癌的方法，包括給藥予該哺乳類動物像是TMZ-POH之治療有效量的紫蘇醇胺甲酸酯。腦轉移癌可源自乳癌或是自乳癌擴散。

Description

包含紫蘇醇衍生物之化合物於製造治療癌症之藥物的用 途

本申請主張2013年10月8日申請之美國臨時申請案61/888,253之優先權。本申請也與2012年8月3日申請之美國專利申請案13/566,731相關，其係為2011年8月26日申請之國際申請案PCT/US2011/049392的延續案，其主張美國臨時申請案61/377,747(申請於2010年8月27日)以及61/471,402(申請於2011年4月4日)的優先權。所有這些先前提出之申請案揭露的全部內容藉由參考併入於本文中。

本發明係關於紫蘇醇(POH)衍生物，像是POH胺甲酸酯(carbamate)的組成物，以及其用於治療癌症的用途。

為最普遍形式的中樞神經系統(CNS)癌症之惡性神經膠瘤近來被認為是實質上無法救癒的。在多種惡性神經膠瘤之中，退行性星狀細胞瘤(第三期)以及多形神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM；第四期)由於他們的侵略性生長以及對目前可用療法的抗性而具有實質上差的預後。目前對於 惡性神經膠瘤的標準照護包括外科手術、游離輻射、以及化學治療。儘管醫學上有最新進展，但過去50年來並沒有看到任何在惡性神經膠瘤預後上的顯著改進。Wen等人，《成人中的惡性神經膠瘤》(Malignant gliomas in adults)New England J Med.359：492-507，2008年。Stupp等人，《用於神經膠質母細胞瘤的放射治療加上伴隨物質與佐劑帝盟多胺》(Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.New England J Med.352：987-996，2005年。

腫瘤，包括惡性神經膠瘤，對多種種類的化學治療劑的反應差，通常是由於其內在抗藥性。另外，初始反應良好腫瘤的後天抗性和不想要的副作用是經常阻饒使用化學治療劑長期治療的其他問題。因此，已經致力於製備化學治療劑的各種類似物以克服這些問題。類似物包括新穎化學治療劑，其為至少兩個現存的化學治療劑的雜合分子。舉例來說，順鉑(cisplatin)已經以細胞毒共藥物(cytotoxic codrug)與Pt-(II)錯合物(Pt-(II)complexe)共軛、或與生物活性梭子(bioactive shuttle)成分諸如紫質(porphyrin)、膽酸、激素、或催促透膜運輸或細胞內之藥物累積的調節物共軛。以萜醇(terpene alcohol)酯化的(6-氨基甲基煙酸酯)二氯化鉬(II)((6-Aminomethylnicotinate)dichloridoplatinum(II))(II)複合物在人類腫瘤細胞株的平台上測試。在這些複合物中的萜基部分出現以完成透膜梭子功能以及增加這些共軛物進入多種腫瘤細胞株內的攝取的速度和程度。Schobert等人，《單萜作為藥物穿梭物：有著克服順鉑抗性潛能的細胞毒性(6-單甲基菸酸酯)二氯鉑(II)複合物》(Monoterpenes as Drug Shuttles：Cytotoxic(6-minomethylnicotinate)dichloridoplatinum(II)Complexes with Potential To Overcome Cisplatin Resistance)，J.Med.Chem.2007年，50，1288-1293。

諸如乳癌之已經蔓延至腦部的轉移癌具有類似於惡性神經膠瘤的嚴重治療挑戰。這挑戰曾經是疾病進程的後期態樣，但在其他原發腫瘤和顱外轉移的成功治療之後，逐漸地變成疾病進程的第一現場。傳統的乳癌治療學，諸如紫杉醇(paclitaxel)或多柔比星(doxorubicin)，只能以濃度遠低於治療上活性所需的濃度達到腦轉移癌。P.R.Lockman等人。《在乳癌的實驗腦轉移中異質性血腫瘤屏障滲透性決定藥物療效》(Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer)，Clin Cancer Res 16(2010年)5664-5678。對於化學療法有效進入腦內最重大的屏障是血腦障壁(blood brain barrier，BBB)，且非常少的抗癌藥物能夠克服這個障礙。E.Fokas、J.P.Steinbach、C.Rodel，《腦轉移和新穎標靶治療的生物學：是時候翻譯研究》(Biology of brain metastases and novel targeted therapies：time to translate the research)，Biochim Biophys Acta 1835(2013年)61-75。

紫蘇醇(perillyl alcohol，POH)，為天然生成的單萜(monoterpene)，已經被提出以作為對抗多種癌症的有效藥劑，包括CNS癌症、乳癌、胰臟癌、肺癌、黑色素瘤以及結腸癌。Gould,M。《藉由單萜的癌症化學預防以及治療》(Cancer chemoprevention and therapy by monoterpenes)，Environ Health Perspect.1997年6月；105(Suppl 4)：977-979。製備含有紫蘇醇和維他命A酸類(retinoid)兩者的雜交分子以增加凋亡誘導活性。Das等人。《潛能新細胞凋亡劑的設計和合成：含有紫蘇醇和新拘束的類視色素的雜合化合物》(Design and synthesis of potential new apoptosis agents：hybrid compounds containing perillyl alcohol and new constrained retinoids)Tetrahedron Letters 2010年，51,1462-1466。

烷化劑(alkylating agent)甲胺酸酯(temozolomide，TMZ)在口服給藥後能夠跨過BBB，且已經變成用於患有多形神經膠母細胞瘤(GBM)的病患之照護的化學治療標準。Zhang等人。《帝盟多胺：作用、修復和抗性的機制》(Temozolomide：mechanisms of action,repair and resistance)，Curr Mol Pharmacol 5(2012年)102-114。TMZ作為一前體藥物(prodrug)。其活化的機制涉及其四嗪酮(tetrazinone)環的水解開環，其在37℃下於水溶液中自發性地反應，且不需要細胞酵素的參與。其結果產物，不穩定的單甲基MTIC(5-(3-甲基三嗪-1-基)-咪唑-4-羧醯胺(5-(3-methyltriazen-1-yl)-imidazole-4-carboxamide))，與水反應以游離AIC(4-胺-5-咪唑-羧醯胺(4-amino-5-imidazole-carboxamide))以及高活性的甲基重氮陽離子，其甲基化DNA嘌呤殘基。

當在重度預治療的病患中測試TMZ用於對抗腦轉移的乳癌活性時，其展現從「激勵活性」以及「疾病控制」到「容忍良好，但無客觀反應」之範圍的混合結果。C.Christodoulou等人，《在患有腦轉移的嚴重治療前癌症病患中，締盟多胺的第二期研究》(Phase II study of temozolomide in heavily pretreated cancer patients with brain metastases)，Annals Oncol 12(2001年)249-254；L.E.Abrey等人，《用於患有腦轉移復發或進程的病患的帝盟多胺的第二期試驗》(A phase II trial of temozolomide for patients with recurrent or progressive brain metastases)，J Neurooncol 53(2001年)259-265；M.E.Trudeau等人，《在轉移性乳癌(MBC)中的帝盟多胺：加拿大國家癌症研究所-臨床試驗組(NCIC-CTG)的第二期試驗》(Temozolomide in metastatic breast cancer(MBC)：a phase II trial of the National Cancer Institute of Canada-Clinical Trials Group(NCIC-CTG).Annals Oncol 17(2006年)952-956；R.Addeo等人，《針對患有腦 轉移的非小細胞肺癌和乳癌病患使用持久的低劑量和全腦放射線治療的帝盟多胺的第二期試驗》(Phase 2 trial of temozolomide using protracted low-dose and whole-brain radiotherapy for nonsmall cell lung cancer and breast cancer patients with brain metastases)，Cancer 113(2008年)2524-2531；S.Siena等人，《用於治療不適合於手術或放射線治療的黑色素瘤、乳癌、或肺癌的腦轉移的劑量密度帝盟多胺：多中心第二期研究》(Dose-dense temozolomide regimen for the treatment of brain metastases from melanoma,breast cancer,or lung cancer not amenable to surgery or radiosurgery：a multicenter phase II study)，Annals Oncol 21(2010年)655-661；R.Addeo等人，《在用於治療有著腦轉移的乳癌病患中，以口服長春瑞濱和以全腦放射線治療的帝盟多胺的持久低劑量》(Protracted low dose of oral vinorelbine and temozolomide with whole-brain radiotherapy in the treatment for breast cancer patients with brain metastases)，Cancer Chemother Pharmacol 70(2012年)603-609。針對這些不一致結果的潛在基礎並沒有被探討，但可想像的是這些差異可能是由於O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT；也稱O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase，AGT))，移除位在鳥嘌呤的O6-位置上的烷基的DNA修復酵素的可變表現量。A.E.Pegg，《烴基轉移酶和相關蛋白在DNA修復、DNA損害、對化學治療的抗性多面向角色，以及研究工具》(Multifaceted roles of alkyltransferase and related proteins in DNA repair,DNA damage,resistance to chemotherapy,and research tools)，Chem Res Toxicol 24(2011年)618-639；M.Christmann等人，《O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)在正常組織和腫瘤中：酵素活性、啟動子甲基化和免疫組織化學》(O(6)-Methylguanine-DNA methyltransferase(MGMT)in normal tissues and tumors：enzyme activity,promoter methylation and immunohistochemistry)，Biochim Biophys Acta 1816(2011年)179-190。因為以TMZ設置的初級毒性DNA病灶是O6-鳥嘌呤的烷基化，所以MGMT的高表現量保護腫瘤細胞免於TMZ的細胞毒性效果且提供治療抗性。J.R.Silber等人，《O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶在神經膠瘤治療中：承諾和問題》(O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase in glioma therapy：promise and problems)，Biochim Biophys Acta 1826(2012年)71-82；A.V.Knizhnik等人，《神經膠瘤細胞的存活和死亡策略：藉由被帝盟多胺誘導的DNA損害的單一種類所引發的自噬作用、衰老和細胞凋亡》(Survival and death strategies in glioma cells：autophagy,senescence and apoptosis triggered by a single type of temozolomide-induced DNA damage)，PLoS One 8(2013年)e55665。當研究在對腦的乳癌轉移灶中的MGMT表現時，發現的是被分析的顱內病變超過半數對MGMT免疫反應性是強烈陽性。B.Ingold等人，《多種固體腫瘤的腦轉移中均質性MGMT免疫反應性相關於非甲基化的MGMT啟動子狀態》(Homogeneous MGMT immunoreactivity correlates with an unmethylated MGMT promoter status in brain metastases of various solid tumors)，PLoS One 4(2009年)e4775。

MGMT活性在其表示「自殺」機制中是不尋常的，因此來自DNA烷基的接受不可逆地使該酵素失去活性，且導致其快速降解。這個特點藉由使用特定的MGMT抑制劑，諸如O6-苄基鳥嘌呤(O6-benzylguanine，O6-BG)，其作為偽受質(pseudosubstrate)，來開發。B.Kaina等人，《標的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶與特異的抑制劑作為在癌症治療中的策略》(Targeting O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase with specific inhibitors as a strategy in cancer therapy)，Cell Mol Life Sci 67(2010年)3663-3681。透過與O6-BG反應，MGMT的苄基化在酵素中造成與在跟隨DNA修復後烷基化之後所看到的相同的結構改變，且因此也導致蛋白質的快速降解。A.E.Pegg等人，《針對人類O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶的抗體，以研究在以O6-苄基鳥嘌呤或N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍處理的細胞中此蛋白的內容的用途》(Use of antibodies to human O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase to study the content of this protein in cells treated with O6-benzylguanine or N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)，Carcinogenesis 12(1991年)1679-1683。在MGMT-陽性細胞以O6-BG治療之後，MGMT活性的消除通常會增加其對被TMZ殺死的敏感性，且這已經在無數體外和體內腫瘤模式中被完善地建立。然而，近來當O6-BG與TMZ被施予至有著TMZ-抗性腫瘤的腦癌病患時，第二期臨床試驗產生混和的結果：雖然MGMT抑制劑的添加在復原部份(16%)有著退行性神經膠瘤(anaplastic glioma)的病患中之TMZ-敏感性，其在有著GBM的病患中(3%)沒有顯著效果。J.A.Quinn等人，《在患有復發、帝盟多胺抗性惡性神經膠瘤的成人中，帝盟多胺加上O6-苄基鳥嘌呤的第二期試驗》(Phase II trial of temozolomide plus o6-benzylguanine in adults with recurrent,temozolomide-resistant malignant glioma)，J Clin Oncol 27(2009年)1262-1267。而對於這個令人失望的結果，潛在的理由仍然在被確立，在此次試驗中限制的反應記錄並無產生對此藥物組合在乳癌腦轉移癌病患中的潛在研究的熱情。

有需要製備有效的治療劑以及使用其於諸如惡性神經膠瘤和其他轉移進腦內的癌症的治療的方法。

本發明提供治療在哺乳動物中癌症的腦轉移癌的方法，其包含遞送治療有效量紫蘇醇衍生物，諸如紫蘇醇胺甲酸酯予哺乳動物。本發明也提供藉由遞送治療有效量紫蘇醇衍生物，像是紫蘇醇胺甲酸酯給哺乳動物以治療已經蔓延至腦部之哺乳動物的轉移癌症的方法。

紫蘇醇衍生物可為與治療劑共軛的紫蘇醇，諸如化學治療劑。可被使用在本發明中的化學治療劑包括DNA烷化劑、拓樸異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitor)、內質網應力誘導劑(endoplasmic reticulum stress inducing agent)、鉑化合物、抗代謝物質、酵素抑制劑、以及受體拮抗劑。在特定實施例中，治療劑可為帝盟多胺(temozolomide，TMZ)。紫蘇醇胺甲酸酯可為3-甲基4-氧代-3,4-二氫咪唑[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羰基-胺甲酸-4-異丙烯基環己-1烯-甲基酯(3-methyl 4-oxo-3,4-dihydroimidazo[5,1-d][1,2,3,5]tetrazine-8-carbonyl)-carbamic acid-4-isopropenyl cyclohex-1-enylmethyl ester，TMZ-POH))。

方法可進一步包含於藥學組成物的給藥之前、期間或之後以放射線治療該哺乳動物，及/或進一步包含遞送另一個化學治療劑給哺乳動物。被治療的腦轉移癌可起源於或自像是全身性癌、肺癌、前列腺癌、乳癌、造血系統癌、卵巢癌、膀胱癌、生殖細胞癌、腎癌、血癌、淋巴瘤以及黑色素瘤之癌蔓延。在一個實施例中，腦轉移癌起源於轉移的乳癌或從轉移的乳癌蔓延。

紫蘇醇衍生物的給藥途徑包括吸入、鼻內、經口、靜脈內、皮下、或肌內給藥。在一些實施例中，紫蘇醇衍生物可使用從由鼻內吸入器、鼻內噴霧裝置、霧化器、噴霧器、計量劑量吸入器(MDI)、加壓計量吸入器、吸進器、單位計量容器、泵、滴管、鼻腔噴霧瓶、擠壓瓶以及雙方向裝置所組成的群組中挑選的鼻腔遞送裝置來鼻內給藥。

第1圖顯示演示二甲基塞來昔布(DMC)在殺死U87、A172和U251人類神經膠瘤細胞中的功效之MTT細胞毒性檢測的結果。

第2圖顯示演示根據本發明POH-DMC共軛物在殺死U87、A172和U251人類神經膠瘤細胞中的功效之MTT細胞毒性檢測的結果。

第3圖顯示演示帝盟多胺(TMZ)在殺死U87、A172和U251人類神經膠瘤細胞中的功效之MTT細胞毒性檢測的結果。

第4圖顯示演示根據本發明TMZ-POH共軛物在殺死U87、A172和U251人類神經膠瘤細胞中的功效之MTT細胞毒性檢測的結果。

第5圖顯示演示POH-洛利普蘭共軛物和洛利普蘭在殺死A172人類神經膠瘤細胞中的功效之MTT細胞毒性檢測的結果。

第6圖顯示演示POH-洛利普蘭共軛物和洛利普蘭在殺死U87人類神經膠瘤細胞中的功效之MTT細胞毒性檢測的結果。

第7圖顯示演示POH-洛利普蘭共軛物和洛利普蘭在殺死U251人類神經膠瘤細胞中的功效之MTT細胞毒性檢測的結果。

第8圖顯示演示POH-洛利普蘭共軛物和洛利普蘭在殺死L229人類神經膠瘤細胞中的功效之MTT細胞毒性檢測的結果。

第9A圖和第9B圖顯示在小鼠模型內被丁醯-POH抑制的腫瘤生長。第9A圖顯示在以丁醯-POH、以具有純度大於98%的純化(S)-紫蘇醇(「純化POH」)、以從西格瑪奧瑞奇購得的POH(「西格瑪」)、或是以磷酸緩衝鹽水(「PBS」，陰性控制組)治療的裸鼠中，皮下U87神經膠瘤的圖像。第9B圖顯示隨著時間的平均腫瘤生長(總共60天的時間期間)。

第10圖顯示演示TMZ和TMZ-POH在TMZ敏感性U251細胞(U251)以及TMZ抗性U251細胞(U251TR)上的細胞毒性效果的群落形成檢測(CFA)的結果。

第11圖顯示演示POH在TMZ敏感性U251細胞(U251)以及TMZ抗性U251細胞(U251TR)上的細胞毒性效果的群落形成檢測(CFA)的結果。

第12圖顯示演示TMZ-POH共軛物在殺死U251細胞、U251TR細胞、以及正常星狀細胞內的效果的MTT細胞毒性檢測的結果。

第13圖顯示演示TMZ-POH共軛物在殺死正常星狀細胞、腦內皮細胞(BEC；融合的與次融合的(subconfluent))、以及腫瘤腦內皮細胞(TuBEC)內中的效果的MTT細胞毒性檢測的結果。

第14圖顯示演示TMZ和TMZ-POH共軛物在殺死USC-04神經膠瘤癌症幹細胞中的效果的MTT細胞毒性檢測的結果。

第15圖顯示演示POH在殺死USC-04神經膠瘤癌症幹細胞中的效果的MTT細胞毒性檢測的結果。

第16圖顯示演示TMZ和TMZ-POH共軛物在殺死USC-02神經膠瘤癌症幹細胞中的效果的MTT細胞毒性檢測的結果。

第17圖顯示POH在殺死USC-02神經膠瘤癌症幹細胞中的效果的MTT細胞毒性檢測的結果。

第18圖顯示演示TMZ-POH在TMZ敏感性U251神經膠瘤細胞(「U251-TMZs」)和抗性U251神經膠瘤細胞(「U251-TMZr」)中誘導ER應力(ERS)的西方墨點轉漬圖。

第19圖顯示在藥物治療之後乳癌的存活率，其中多種乳癌細胞株被暴露在增加濃度的TMZ或TMZ-POH中48小時，且存活率透過群落形成檢測(CFA)來測定。顯示的是群落形成細胞的部分，其中以控制組細胞(僅以DMSO溶媒處理)的群落形成設為1。有誤差線的圖表展示來自3個獨立實驗的平均數(±SD)；沒有誤差線的圖表顯示來自兩個獨立實驗的平均值。

第20A圖至第20B圖顯示TMZ-POH的細胞毒性效能以及其個體組成，其中經藥物處理的MDA-MB-231細胞的存活率以CFA來測定。在第20A圖中，細胞被暴露48小時以增加TMZ(菱形)、TMZ-POH(圓形)、POH(三角形)、或等莫耳濃度(方塊)的TMZ加上POH的濃度。由控制組細胞(僅以溶媒處理)的群落形成設為1；圖表展示來自3個獨立實驗的平均數(±SD)。在第20B圖中，細胞被暴露在10μM TMZ-POH、TMZ、或POH、或10μM TMZ-POH或與10μM POH組合的TMZ。顯示的是一個代表性CFA的照片。

第21A圖至第21C圖顯示在多種細胞株中MGMT表現量，其中所有部分顯示以肌動蛋白作為加載控制組的MGMT蛋白表現量的西方墨點轉漬分析。第21A圖顯示使用在本研究中的六個乳癌細胞株的MGMT基礎表現量。第21B圖顯示相比於MCF7乳癌細胞在三個GBM細胞株中MGMT基礎表現量。在第21C圖，在收集細胞裂解物(cellular lysates)之前，MDA-MB-468細胞以指示濃度的TMZ-POH、TMZ、或O6-BG處理17小時。vh.=僅以溶媒處理的細胞。

第22A圖至第22B圖顯示MGMT轉染的細胞的藥物敏感性，其中MDA-MB-231細胞以MGMT cDNA穩定地轉染。在第22A圖中，兩個個別的選殖株，231-MGMT-1和-2，藉由西方墨點轉漬法分析相較於親代細胞，基礎量的MGMT蛋白表現。在第22B圖中，231-MGMT-1和-2以增加濃度的TMZ-POH和 TMZ處理48小時，且細胞存活率以CFA分析。有著231-MGMT-1細胞的圖表顯示來自3個獨立實驗的平均數(±SD)，231-MGMT-2細胞的圖表顯示來自兩個獨立實驗的平均數。

第23A圖至第23C圖顯示包含O6-BG的效果，其中在有O6-BG存在或沒有O6-BG的存在下，細胞被暴露在TMZ或TMZ-POH中48小時，且細胞存活率由CFA測定。第23A圖MDA-MB-231細胞的群落存活率；第23B圖顯示MGMT轉染的231-MGMT-2細胞，且第23C圖顯示MDA-MB-468細胞。顯示的是來自3個平行處理的孔盤中的群落的平均數(±SD)。

第24A圖至第24D圖顯示在DNA損害標記物上的藥物效果，其中細胞以不同濃度的TMZ-POH或TMZ處理，且以西方墨點轉漬分析用於雙股DNA損害標記物之γ-H2AX的表現量。使用肌動蛋白作為加載控制組。MDA-MB-231細胞以50μM TMZ-POH處理指示的時間期間(第24A圖)；MDA-MB-231細胞以50μM TMZ-POH或50μM TMZ處理指示的時間期間(第24B圖)；MDA-MB-231細胞以TMZ-POH、TMZ、POH、或與POH結合的TMZ來處理(所有皆在10μM)24小時(第24C圖)；在有30μM O6-BG或沒有的情況下，MCF7細胞以或不以50μM TMZ-POH處理48小時(第24D圖)。

第25A圖至第25B圖顯示DNA損害和細胞死亡標記物分析，其中MDA-MB-231細胞被用於DNA損害標記物(γ-H2AX)以及細胞死亡標記物(活化的凋亡蛋白酶7以及裂解的PARP)的表現量的西方墨點轉漬分析。在第25A圖中，細胞以15μM TMZ-POH處理，且直到第六天，每24小時地收集；控制組細胞保持無處理，或僅接受溶媒(vh.)。在第25B圖中，細胞以不論20μM的TMZ-POH、TMZ、或以POH個別地、或以與20μM的POH結合的20μM的TMZ (TMZ+POH)處理且24小時之後或5天之後收集；控制組細胞保持無處理，或僅接受溶媒(vh.)。在蛋白酶7的情況下，只顯示活化的(裂解的)形式(cl.C-7)。在PARP的情況中，上部分圖顯示蛋白的全長和蛋白的蛋白水解裂解形式兩者，然下部分圖僅顯示偏移較快、裂解的PARP。

第26A圖至第26C圖描繪藥物穩定性的測定，其中MDA-MB-231細胞在群落形成檢測中被分析。在第26A圖中，細胞以15μM的TMZ-POH或30μM的TMZ處理30分鐘或1、2、4和24小時。之後，移除含有藥物的培養基，添加新鮮的培養基(沒有藥的)，且直到12天之後的群落染色為止，維持細胞不受干擾。在第26B圖中，細胞暴露在上清液中(即，從顯示在第26A圖中的細胞移除之含有藥物的培養基)。箭頭表示哪個細胞接受哪個上清液。在24小時的培養之後，移除所有含有藥物的培養基，添加新鮮的培養基(沒有藥物)，且直到12天之後的群落染色為止，維持細胞不受干擾。第26C圖顯示有著染色的群落的代表性6孔盤。左邊的分圖(未經處理)：並無藥物處理之控制組細胞。中間分圖(0-24h)：接受15μM的TMZ-POH或30μM的TMZ24小時的細胞。右邊分圖(1-25h)：在對細胞添加24小時最終濃度15μM的TMZ-POH和30μM的TMZ之前，TMZ-POH和TMZ在37℃下以中性緩衝液培養1小時。

第27A圖至第27B圖顯示藥物在顱內腫瘤生長的影響，其中螢光素酶-陽性的D3H2LN細胞被植入到24隻裸鼠的腦中。十天之後，透過生物發光成像來確認腫瘤的生成，且初始以僅溶媒(控制組)、25mg/kg TMZ-POH、或25mg/kg TMZ、每天一次歷時10天的期間進行治療。在第27A圖中，所有存活的動物再次於21天、28天和36天攝像。上部分圖顯示來自僅有溶媒治療組的一隻代表性小鼠。注意在第10天到第21天之間，從1.65E7到1.92E8增加12倍ROI輻射率 (腫瘤生長的代表性)。下部分圖顯示來自TMZ-POH治療動物組的一隻代表性小鼠。於此，輻射率在第10天到第21天之間僅增加1.7倍(從1.11E7到1.92E7)，但在第43天時到達1.88E8(相似於在第21天的控制組小鼠)。右側的熱長條圖顯示輻射率的尺度。第27B圖顯示所有帶有顱內腫瘤的動物的Kaplan-Meier存活率圖。標記Rx的箭頭表示治療的時間期間。在TMZ治療動物組和TMZ-POH-治療動物組之間的統計上差異：p<0.001。

本發明提供單萜或倍半萜(sesquiterpene)的衍生物，像是紫蘇醇衍生物。本發明也提供包含單萜或倍半萜的衍生物，像是紫蘇醇衍生物的藥學組成物。

舉例來說，紫蘇醇衍生物可為紫蘇醇胺甲酸酯。紫蘇醇衍生物可為與治療劑像是化學治療劑共軛的紫蘇醇。單萜(或倍半萜)衍生物可被製劑成藥學組成物，其中單萜(或倍半萜)衍生物是以大約0.01%(w/w)到大約100%(w/w)、大約0.1%(w/w)到大約80%(w/w)、大約1%(w/w)到大約70%(w/w)、大約10%(w/w)到大約60%(w/w)、或大約0.1%(w/w)到大約20%(w/w)範圍的量存在。本組成物可被單獨給藥、或可與放射線或或其他藥劑(例如，化學治療劑)一起共同給藥，以治療像是癌症的疾病。治療可為連續的，在其他藥劑的給藥之前或之後以單萜(或倍半萜)衍生物給藥。舉例來說，紫蘇醇胺甲酸酯可被使用於使癌症病患對放射線或化學治療敏感。另外，藥劑可被同時給藥。給藥的途徑可變化多端，且可包括：吸入、鼻內、經口、經皮(transdermal)、靜脈內、皮下或肌內注射。本發明也提供用於治療像是癌症之疾病的方法，其包含對病患遞送治療有效量的單萜(或倍半萜)的衍生物的步驟。

本發明的組成物可含有單萜(或倍半萜)的衍生物的一種或多種類型。單萜包括由兩個異戊二烯(isoprene)單元組成的萜類。單萜可為線性(非環)或含有環。類單萜(monoterpenoid)的衍生物也被囊括在本發明中。類單萜可藉由單萜的生物化學的修飾，像是氧化作用或重排來產生。單萜和類單萜的實例包括：紫蘇醇(S(-))以及(R(+))、蘿勒萜(ocimene)、月桂油烯(myrcene)、香葉草醇(geraniol)、檸檬油醛(citral)、香茅醇(citronellol)、香茅醛(citronellal)、沈香醇(linalool)、蒎烯(pinene)、萜品醇(terpineol)、萜品(terpinen)、薴烯(limonene)、萜品烯(terpinene)、茴香萜(phellandrenes)、萜品油烯(terpinolene)、萜品-4-醇(terpinen-4-ol(或茶樹油))、蒎烯、萜品醇、萜品；類萜像是從單環萜品諸如薄荷腦(menthol)、百里酚(thymol)和香旱芹酚(carvacrol)中衍生的對蒔蘿烴(p-cymene)；二環類單萜，像是樟腦(camphor)、龍腦(borneol)以及桉油醇(eucalyptol)。

單萜可以碳骨架的結構來區分，且可被分類為非環類單萜(例如，月桂油烯、(Z)-與(E)-蘿勒萜、沈香醇、香葉草醇、橙花醇(nerol)、香茅醇、香葉烯醇(myrcenol)、香葉草醛(geranial)、檸檬油醛a、橙花醛(neral)、檸檬油醛b、香茅醛，等)、單環單萜(例如，薴烯、萜品烯、茴香萜、萜品油烯、薄荷腦、香旱芹醇(carveol)，等)、二環單萜(例如，蒎烯、桃金孃烯醇(myrtenol)、桃金孃烯醛(myrtenal)、馬鞭醇(verbanol)、馬鞭烷酮(verbanon)、松香芹醇(pinocarveol)、蒈烯(carene)、檜烯(sabinene)、莰烯(camphene)、側柏烯(thujene)，等)以及三環單萜(例如，三環萜(tricyclene))。參閱Encyclopedia of Chemical Technology，第四版，冊23，頁次834-835。

本發明的倍半萜包括由三個異戊二烯單元組成的萜類。異戊二烯可為線性(非環)或含有環。類倍半萜的衍生物也被本發明中囊括。類倍半萜可由倍半萜的生物化學修飾，像是氧化作用或重排來產生。倍半萜的實例包括菌綠烯醇(farnesol)、金合歡醛(farnesal)、法尼基酸(farnesylic acid)以及橙花叔醇(nerolidol)。

單萜(或倍半萜)的衍生物包括，但不限於，單萜(或倍半萜)的胺甲酸酯、酯、醚、醇和醛。單萜(或倍半萜)醇可衍生為胺甲酸酯、酯、醚、醛和酸。

胺甲酸酯指稱享有官能基的化學化合物的一類，其以側翼為一氧原子和一氮原子的羰基為基礎。R¹、R²以及R³可為像是可被取代之烷基、芳基，等基團。在氮原子和氧原子上的R基團可形成環。R¹-OH可為單萜，例如，POH。R²-N-R³部分可為治療劑。

胺甲酸酯可藉著反應異氰酸鹽(isocyanate)與醇類，或藉由反應氯甲酸酯與胺類來合成。胺甲酸酯可藉由使用光氣(phosgene)或光氣等價物的反應來合成。舉例來說，胺甲酸酯可藉由反應光氣氣體、雙光氣或固體光氣前驅物諸如三光氣與兩個胺或一個胺和一個醇來合成。胺甲酸酯(也被稱為烏拉坦(urethane)也能從尿素中間物與醇的反應而製成。碳酸二甲酯(Dimethyl carbonate)以及碳酸二苯酯也被用於製作胺甲酸酯。另外，胺甲酸酯可透過醇及/或胺類前驅物與經酯取代的碳酸二芳酯，諸如碳酸雙水楊甲酯基碳酸酯(bismethylsalicylcarbonate，BMSC)的反應來合成。美國專利申請號20100113819。

胺甲酸酯可藉由下列反應式合成： 合適的反應溶劑包括，但不限於，四氫呋喃(tetrahydrofuran)、二氯甲烷(dichloromethane)、二氯乙烷(dichloroethane)、丙酮(acetone)、以及二異丙醚(diisopropyl ether)。反應可在溫度範圍大約-70℃至大約80℃、或大約-65℃至大約50℃下執行。紫蘇氯甲酸酯(perillyl chloroformate)比受質R-NH₂的莫耳比率可為大約1：1至大約2：1、大約1：1至大約1.5：1、大約2：1至大約1：1、或大約1.05：1至大約1.1：1之範圍。合適的鹼基包括，但不限於，有機鹼，諸如三乙胺(triethylamine)、碳酸鉀(potassium carbonate)、N,N’-二異丙乙胺(N,N’-diisopropylethylamine)、丁基鋰(butyl lithium)、以及叔丁醇鉀(potassium-t-butoxide)。

另外，胺甲酸酯可藉由下列反應式合成： 合適的反應溶劑包括，但不限於，二氯甲烷、二氯乙烷、甲苯(toluene)、二異丙醚、以及四氫呋喃。反應可在溫度範圍大約25℃至大約110℃、或大約30℃至大約80℃、或大約50℃下執行。紫蘇醇比受質R-N=C=O的莫耳比率可為大約1：1至大約2：1、從大約1：1至大約1.5：1、從大約2：1至大約1：1、或從大約1.05：1至大約1.1：1之範圍。

本發明的單萜(或倍半萜)醇的酯可從無機酸或有機酸衍生。無機酸包括，但不限於，磷酸、硫酸、以及硝酸。有機酸包括，但不限於，羧酸，諸如苄酸(benzoic acid)、脂肪酸(fatty acid)、醋酸以及丙酸、以及任何攜帶至少一個羧酸官能基的治療劑。單萜(或倍半萜)醇的酯實例包括，但不限於，羧酸酯(諸如苯甲酸酯、脂肪酸酯(例如，棕櫚酸酯(palmitate ester)、亞麻油酸酯(linoleate ester)、硬脂酸酯(stearate ester)、丁醯酯(butyryl ester)以及油酸酯(oleate ester))、醋酸鹽(acetate)、丙酸鹽(propionate，或丙酸酯(propanoates))、以及甲酸鹽(formate))、磷酸鹽(phosphate)、硫酸鹽(sulfate)、以及胺甲酸鹽(例如，N,N-二甲胺羧基(N,N-dimethylaminocarbonyl))。

可使用在本發明中的單萜的具體實例是紫蘇醇(一般簡寫為POH)。紫蘇醇的衍生物包括：紫蘇醇胺甲酸酯、紫蘇醇酯、紫蘇醛(perillic aldehydes)、二氫紫蘇酸(dihydroperillic acid)、紫蘇酸(perillic acid)、紫蘇醛衍生物、二氫紫蘇酸酯(dihydroperillic acid esters)以及紫蘇酸酯(perillic acid esters)。紫蘇醇的衍生物也可包括其氧化物和親核的/親電子的其他衍生物。美國專利申請號20090031455。美國專利號6,133,324與3,957,856。化學文獻裡記載紫蘇醇衍生物的許多實例(參閱附錄A：CAS SciFinder的搜索輸出文件，2010年1月25日檢索)。

在具體實施例中，POH胺甲酸酯藉由包含反應紫蘇氯甲酸酯的第一反應物與諸如二甲基塞來昔布(dimethyl celocoxib，DMC)、帝盟多胺(TMZ)以及洛利普蘭(rolipram)的第二反應物反應的步驟的過程來合成。反應可在四氫呋喃以及諸如正丁基鋰的存在下發生。紫蘇氯甲酸酯可藉由反應POH與光氣而生成。舉例來說，透過胺甲酸酯鍵與帝盟多胺共軛的POH可藉由反應帝盟多胺與 草醯氯(oxalyl chloride)後與紫蘇醇反應而合成。該反應可在1,2-二氯甲烷的存在下進行。

被囊括在本發明中的POH胺甲酸酯包括不限於：4-(二-N,N’-4-異丙烯環己-1-烯甲氧基羰基[5-(2,5-二甲苯)-3-三氟甲基吡唑-1-基]苯磺醯胺(4-(bis-N,N’-4-isopropenyl cyclohex-1-enylmethyloxy carbonyl[5-(2,5-dimethyl phenyl)-3-trifluoromethyl pyrazol-1-yl]benzenesulfonamide)；4-(3-環戊氧-4-甲氧基苯)-2-氧代-吡咯啶-1-羧酸4-異丙烯環己-1-烯甲基酯(4-(3-cyclopentyloxy-4-methoxy phenyl)-2-oxo-pyrrolidine-1-carboxylic acid 4-isopropenyl cyclohex-1-enylmethyl ester)；以及3-甲基4-氧代-3,4-二氫咪唑[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羰基-胺甲酸-4-異丙烯環己-1-烯甲基酯(3-methyl 4-oxo-3,4-dihydroimidazo[5,1-d][1,2,3,5]tetrazine-8-carbonyl)carbamic acid-4-isopropenyl cyclohex-1-enylmethyl ester)。產生這些化合物的化學反應之細節在以下實例中描述。

在特定實施例中，紫蘇醇衍生物可為紫蘇醇脂肪酸酯，諸如POH的棕櫚醯酯(palmitoyl ester)以及POH的亞麻油酯(linoleoyl ester)，這些的化學結構被顯示如下：

十六烷酸4-異丙烯環己-1-烯甲基酯(Hexadecanoic acid 4-isopropenyl-cyclohex-1-enylmethyl ester)(POH的棕櫚醯酯)

十八碳-9,12-二烯酸4異丙烯環己-1-烯甲基酯(Octadeca-9,12-dienoic acid 4-isopropenyl-cyclohex-1-enylmethyl ester)(POH的亞麻油酯)

單萜(或倍半萜)衍生物可為與治療劑共軛的單萜(或倍半萜)。被本發明囊括的單萜(或倍半萜)共軛物是具有透過化學連接基團共價地連結至治療劑的單萜(或倍半萜)的分子。在單萜(或倍半萜)共軛物內的單萜(或倍半萜)比治療劑的莫耳比率可為1：1、1：2、1：3、1：4、2：1、3：1、4：1、或任何其他合適的莫耳比率。單萜(或倍半萜)以及治療劑可透過胺甲酸酯、酯、醚鍵結、或任何其他合適的化學官能基團共價地連接。當單萜(或倍半萜)以及治療劑透過胺甲酸酯鍵結共軛時，治療劑可為攜有至少一個羧酸官能基的任何藥劑、或是攜有至少胺官能基的任何藥劑。在一個特定的實例中，紫蘇醇共軛物是紫蘇醇透過化學連結基團共價地結合至化學治療劑。

根據本發明，可與單萜(或倍半萜)共軛的治療劑包括，但不限於，化學治療劑、用於CND病症(包括，不限於，原發性退行性神經系統病症諸如阿滋海默、帕金森氏、多發性硬化症(multiple sclerosis)、注意力不足過動症(Attention-Deficit Hyperactivity Disorder)或ADHD、心理障礙(psychological disorder)、精神病以及憂鬱)的治療的治療劑、免疫治療劑、血管生成抑制劑、以及抗高血壓劑。可與單萜或倍半萜共軛的抗癌劑在癌細胞上或受試者細胞上可具有一個或多個下列效果：細胞死亡；減少細胞增殖；減少細胞的數目；抑制細胞生長；細胞凋亡；壞死；有絲分裂的遽變；細胞週期停止；減小細胞尺 寸；降低細胞分裂；降低細胞存活率；降低細胞新陳代謝；細胞損害或細胞毒性的標記物；細胞損害或細胞毒性的間接標記物，像是腫瘤收縮；改善受試者的存活率；或與不想要的、非預期的、或迷走的細胞增殖相關的標記物的消失。美國專利申請號20080275057。

也被本發明囊括的是單萜(或倍半萜)以及至少一個治療劑的混合物及/或共製劑。

化學治療劑包括，但不限於，DNA烷化劑、拓樸異構酶抑制劑、內網應力誘導劑、鉑化合物、抗代謝藥、長春花生物鹼(vincalkaloid)、紫杉烷(taxane)、埃博黴素(epothilone)、酵素抑制劑、受體拮抗劑、酪胺酸激酶抑制劑、硼放射增敏劑(radiosensitizer)(即，萬科(velcade))、以及化學治療組合療法。

DNA烷化劑的非限制性實例是氮芥劑(nitrogen mustard)、諸如環磷醯胺(Cyclophosphamide)(依弗醯胺(Ifosfamide)、氯乙環磷醯胺(Trofosfamide))、氯芥苯丁酸(Chlorambucil)(威克瘤錠(Melphalan)、松龍苯芥(Prednimustine))、苯達莫斯汀(Bendamustine)、烏拉莫斯汀(Uramustine)以及雌氮芥(Estramustine)；亞硝脲(nitrosoureas)，諸如卡莫斯汀(Carmustine，BCNU)、環己亞硝脲(Lomustine)(司莫斯汀(Semustine))、福莫斯汀(Fotemustine)、尼莫斯汀(Nimustine)、雷莫斯汀(Ranimustine)以及鏈脲黴素(Streptozocin)；烷基磺酸鹽，諸如白消安(Busulfan)(甘露舒凡(Mannosulfan)、曲奧舒凡(Treosulfan))；氮丙錠(Aziridine)，像是卡巴醌(Carboquone)、三亞胺醌(Triaziquone)、三乙烯三聚氰胺(Triethylenemelamine)；聯胺(Hydrazines)(甲基苄肼(Procarbazine))；三氮烯(Triazenes)諸如氮烯唑胺(Dacarbazine)以及帝盟多胺(TMZ)；六甲蜜胺(Altretamine)以及二溴甘露醇(Mitobronitol)。

拓樸異構酶I抑制劑的非限制性實例為包括如描述在Pommier Y.(2006年)Nat.Rev.Cancer 6(10)：789-802以及美國專利申請號200510250854中的SN-38、APC、NPC、喜樹鹼(campothecin)、拓樸替康(topotecan)、鉀磺酸伊莎替康(exatecan mesylate)、9-硝基喜樹鹼(9-nitrocamptothecin)、胺基喜樹鹼(9-aminocamptothecin)、勒托替康(lurtotecan)、魯比特康(rubitecan)、甲矽烷喜樹堿(silatecan)、吉馬替康(gimatecan)、二氟替康(diflomotecan)、伊莎替康(extatecan)、BN-80927、DX-8951f、以及MAG-CPT的喜樹鹼衍生物；描述在Li等人，(2000年)Biochemistry 39(24)：7107-7116以及Gatto等人(1996年)Cancer Res.15(12)：2795-2800的包括小蘖紅鹼(berberrubine)以及柯南因(coralyne)的原小蘖鹼類生物鹼(Protoberberine alkaloid)以及其衍生物；如描述於Makhey等人(2003年)Bioorg.Med.Chem.11(8)：1809-1820的包括苯並啡啶(Benzo[i]phenanthridine)、光葉花椒鹼(Nitidine)以及弗蓋羅倪(fagaronine)之啡啉(Phenanthroline)衍生物；如描述在Xu(1998年)Biochemistry 37(10)：3558-3566的泰爾苯並咪唑(terbenzimidazole)以及其衍生物：以及描述在Foglesong等人(1992年)Cancer Chemother.Pharmacol.30(2)：123-125、Crow等人(1994年)J.Med.Chem.37(19)：31913194以及Crespi等人(1986年)Biochem.Biophys.Res.Commun.136(2)：521-8之包括小紅莓、道諾紅菌素(Daunorubicin)、以及米托蒽醌(Mitoxantrone)的蒽環類(anthracycline)衍生物。拓樸異構酶II抑制劑包括，但不限於，依托泊甘(Etoposide)以及替尼泊苷(Teniposide)。雙重拓樸異構酶I和II抑制劑包括，但不限於，聖托品(Saintopin)以及其他四並苯醌(Naphthecenediones)、DACA以及其他吖啶-4-羧醯胺(Acridine-4-Carboxamindes)、茚托利辛(Intoplicine)以及其他苯並吡啶並吲哚類(Benzopyridoindoles)、TAS-I03以及其他7H-茚並[2,1-c]喹啉 -7-酮(7H-indeno[2,1-c]Quinoline-7-ones)、吡唑並吖啶(Pyrazoloacridine)、XR 11576以及其他苯並啡嗪類(Benzophenazines)、XR 5944以及其他二聚化合物(Dimeric compounds)、7-氧代-7H-二苯[f,ij]異喹啉(7-oxo-7H-dibenz[f,ij]Isoquinoline)以及7-氧代-7H-苯並[e]嘧啶(7-oxo-7H-benzo[e]pyrimidines)、以及蒽環-胺基酸共軛物，如描述在Denny與Baguley(2003年)Curr.Top.Med.Chem.3(3)：339-353。一些藥劑抑制拓樸異構酶II並具有DNA交互作用活性像是，但不限於蒽環類(阿柔比星(Aclarubicin)、道諾紅菌素、小紅莓、表阿黴素(Epirubicin)、艾達黴素(Idarubicin)、胺柔比星(Amrubicin)、吡柔比星(Pirarubicin)、戊柔比星(Valrubicin)、佐柔比星(Zorubicin))以及蒽二酮(Antracenediones)(米托蒽醌和匹杉瓊(Pixantrone))。

內質網應力誘導劑的實例包括，但不限於，二甲基-塞來昔布(DMC)、娜芙薇亞(nelfinavir)、塞來昔布以及硼放射增敏劑(即，萬科(硼替佐米(Bortezomib))。

鉑系化合物是DNA烷化劑的子類。這樣的藥劑的非限制性實例包括順鉑、奈達鉑(Nedaplatin)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、四硝酸三鉑(Triplatin tetranitrate)、賽特鉑(Satraplatin)、Aroplatin、洛鉑(Lobaplatin)以及JM-216。(參見McKeage等人，(1997年)J.Cjinl Oncol.201：1232-1237，以及一般性的，參見《用於婦科腫瘤的化學治療，目前療法和新穎方法》(CHEMOTHERAPY FORGYNECOLOGICAL NEOPLASM,CURRENT THERAPY AND NOVEL APPROACHES)，在Series Basic andClinical Oncology中，Angioli等人，編著，2004年)。

「FOLFOX」是用於治療結腸直腸癌的組合療法的類型的縮寫。此療法包括5-FU、奧沙利鉑以及甲醯四氫葉酸(leucovorin)。關於此治療的資訊可在美國國家癌症研究所(National Cancer Institute)的網站上，cancer.gov得到，最後一次登入是在2008年1月16日。

「FOLFOX/BV」是用於治療結腸直腸癌的組合療法的類型的縮寫。此療法包括5-FU、奧沙利鉑、甲醯四氫葉酸以及貝伐單抗(Bevacizumab)。此外，「XELOX/BV」是用於治療結腸直腸癌的另一種組合療法，其包括5-FU的前體藥物，其被稱為卡培他濱(Capecitabine)(截瘤達(Xeloda))與奧沙利鉑和貝伐單抗的組合。關於這些治療的資訊可在美國國家癌症研究所的網站，cancer.gov上得到，或者可從23個美國國家綜合癌症網(NationalComprehensive Cancer Network)的網站，nccn.org得到，最後一次登入是在2008年5月27日。

抗代謝藥的非限制性實例包括葉酸系的(藥劑)，即，二氫葉酸鹽還原酶抑制劑，像是胺喋呤(Aminopterin)、胺甲喋呤(Methotrexate)以及培美曲塞(Pemetrexed)；胸苷酸合成酶抑制劑，諸如雷替曲塞(Raltitrexed)、培美曲塞；嘌呤系(的藥劑)，即，腺核苷(adenosine)去胺酶抑制劑，諸如噴司他丁(Pentostatin)、硫嘌呤(thiopurine)，像是硫鳥嘌呤(Thioguanine)以及巰嘌呤(Mercaptopurine)、鹵化/核糖核苷酸還原酶抑制劑，像是克拉曲濱(Cladribine)、氯法拉濱(Clofarabine)、氟達拉濱(Fludarabine)、或鳥嘌呤/鳥苷：硫嘌呤，像是硫鳥嘌呤；或嘧啶系(的藥劑)，即，胞嘧啶/胞苷：去甲基化劑(hypomethylating agent)，像是阿札胞苷(Azacitidine)和氮雜胞苷(Decitabine)、DNA聚合酶抑制劑，例如阿糖胞苷(Cytarabine)、核糖核苷酸還原酶抑制劑，像是吉西他濱(Gemcitabine)、或胸腺嘧啶/胸苷：胸苷酸合成酶抑制劑，諸如氟尿嘧啶(Fluorouracil)(5-FU)。5-FU的等 價物包括其前體藥物、類似物及衍生物，如舉例來說描述在Papamicheal(1999年)The Oncologist 4：478-487中的，諸如5’-去氧-5-氟尿苷(5'-deoxy-5-fluorouridine)(去氧氟尿苷(doxifluroidine))、1-四氫呋喃基-5-氟尿嘧啶(1-tetrahydrofuranyl-5-fluorouracil)(呋氟尿嘧啶(ftorafur))、卡培他濱(截瘤達)、S-I(MBMS-247616，由替加氟(tegafur)和兩種調節物：5-氯-2,4-二羥基吡啶(5-chloro-2,4-dihydroxypyridine)和草醯鉀(potassium oxonate)組成)、雷替曲噻(拓優得(tomudex))、諾拉曲塞(nolatrexed)(Thymitaq，AG337)、LY231514以及ZD9331。

長春花生物鹼的實例，包括，但不限於長春鹼(Vinblastine)、長春新鹼(Vincristine)、長春氟寧(Vinflunine)、長春地辛(Vindesine)和長春瑞濱(Vinorelbine)。

紫杉烷的實例包括，但不限於，多西他塞(docetaxel)、拉洛他塞(Larotaxel)、沃塔紫杉醇(Ortataxel)、紫杉醇以及替司他賽(Tesetaxel)。埃博黴素的實例是伊莎匹隆(iabepilone)。

酵素抑制劑的實例包括，但不限於，法尼基轉移酶抑制劑(farnesyltransferase)(替吡法尼(Tipifarnib))；CDK抑制劑(Alvocidib、Seliciclib)；蛋白酶體抑制劑(硼替佐米)、磷酸二酯酶抑制劑(阿娜格雷(Anagrelide)；洛利普蘭)；IMP去氫酶抑制劑(噻唑呋林(Tiazofurine))；以及脂肪加氧酶(lipoxygenase)抑制劑(馬索羅酚(Masoprocol))。受體拮抗劑的實例包括，但不限於ERA(阿曲生坦(Atrasentan))；維他命A酸類X受體(貝薩羅汀(Bexarotene))；以及性類固醇(睾內酯(Testolactone))。

酪胺酸激酶抑制劑的實例包括，但不限於，對ErbB的抑制劑：HER1/EGFR(埃羅替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、凡德他尼(Vandetanib)、舒尼替尼(Sunitinib)、來娜替尼(Neratinib))；HER2/neu(拉帕替尼、來娜替尼)；RTK第三類：C-kit(阿西替尼(Axitinib)、舒尼替尼、索拉菲尼(Sorafenib))、FLT3(來他替尼(Lestaurtinib))、PDGFR(阿西替尼、舒尼替尼、索拉替尼)；以及VEGFR(凡德他尼、馬沙尼(Semaxanib)、西蒂尼布(Cediranib)、阿西替尼、索拉菲尼)；bcr-abl(伊瑪替尼(Imatinib)、尼羅替尼(Nilotinib)、達沙替尼(Dasatinib))；Src(博舒替尼(Bosutinib))以及Janus激酶2(來他替尼)。

「拉帕替尼」(泰嘉錠(Tykerb)是EGFR與erbB-2的雙重抑制劑。拉帕替尼已經作為抗癌單藥治療而被探討，且於數個臨床試驗中與曲妥珠單抗(trastuzumab)、卡陪他濱、來曲唑(letrozole)、紫杉醇以及FOLFIRI(伊利替康(irinotecan)、5-氟尿嘧啶以及甲醯四氫葉酸)組合。目前已在針對轉移的乳癌、腦癌及頸部癌、肺癌、胃癌、腎臟癌以及膀胱癌的口服治療的第三期測試。

拉帕替尼的化學等價物是為酪胺酸激酶抑制劑(TKI)或替換地HER-1抑制劑或HER-2抑制劑的小分子或化合物。多種TKI已經發現具有有效的抗腫瘤活性且已經被證實或在臨床試驗。這樣的實例包括，但不限於，Zactima(ZD6474)、艾瑞莎(吉非替尼)、伊瑪替尼甲磺酸(imatinib mesylate)(STI571；基利克(Gleevec))、埃羅替尼(OSI-1774；得舒緩(Tarceva))、卡紐替尼(canertinib)(CI 1033)、馬沙尼(SU5416)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584)、索拉菲尼(BAY 43-9006)、紓癌特(sutent)(SUI 1248)以及來氟米特(lefltmomide)(SU101)。

PTK/ZK是有著廣泛的特異性的酪胺酸激酶抑制劑，其標的為所有VEGF受體(VEGFR)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor， PDGF)受體、c-KIT以及c-Fms。Drevs(2003年)Idrugs 6(8)：787-794。PTK/ZK是標的藥物，其藉由抑制與包括VEGFR-I(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)以及VEGFR-3(Flt-4)的VEGF結合之所有已知受體的活性，來阻斷血管生成以及淋巴管生成。PTK/ZK的化學名稱為1-[4-氯苯胺]-4-[4-吡啶甲基]呔嗪琥珀酸(1-[4-Chloroanilino]-4-[4-pyridylmethyl]phthalazine Succinate)或是1-呔嗪胺，N-(4-氯苯基)-4-(4-吡啶甲基)-丁二酸(1：1)(1-Phthalazinamine,N-(4-chlorophenyl)-4-(4-pyridinylmethyl)-butanedioate(1：1))。PTK/TK的同物異名和類似物被稱為瓦他拉尼、CGP79787D、PTK787/ZK 222584、CGP-79787、DE-00268、PTK-787、PTK787A、VEGFR-TK抑制劑、ZK 222584以及ZK。

可與單萜或倍半萜共軛的化學治療劑也可包括安吖啶(amsacrine)、曲貝替啶(Trabectedin)、維他命A酸類(阿利維甲酸(Alitretinoin)、維甲酸(Tretinoin))、三氧化二砷(Arsenic trioxide)、天門冬醯胺酸衰竭天門冬醯胺酸酶(asparagine depletion Asparaginase)/培門冬酶(Pegaspargase)、塞來昔布、脫羰秋水仙胺(Demecolcine)、伊利司莫(Elesclomol)、伊沙蘆星(Elsamitrucin)、乙環氧啶(Etoglucid)、氯尼達明(Lonidamine)、硫蒽酮(Lucanthone)、丙酮雙米腙(Mitoguazone)、米坦托(Mitotane)、奧利默森(Oblimersen)、西羅莫斯(Temsirolimus)、以及伏利諾他(Vorinostat)。

單萜和倍半萜衍生物可與血管生成抑制劑共軛。血管生成抑制劑的實例包括，但不限於，血管抑制素(angiostatin)、抗血管合成酶(angiozyme)、抗凝血酶(antithrombin III)、AG3340、VEGF抑制劑、巴馬司他(batimastat)、貝伐單抗(癌思停(avastin)、BMS-275291、CAI、2C3、HuMV833 Canstatin、卡托普利(Captopril)、羧基胺三唑(carboxyamidotriazole)、軟骨原性抑制劑(cartilage derived inhibitor，CDI)、CC-5013、6-O-(氯乙醯-羰基)-煙曲黴素醇(6-O-(chloroacetyl-carbonyl)-fumagillol)、COL-3、康普瑞汀(combretastatin)、康普瑞汀A4磷酸鹽(combretastatin A4 Phosphate)、達肝素(Dalteparin)、EMD 121974(西崙吉泰(Cilengitide))、內皮抑素(endostatin)、埃羅替尼、吉非替尼(艾瑞莎)、金雀異黃酮(genistein)、鹵夫酮溴酸鹽(halofuginone hydrobromide)、Id1、Id3、IM862、伊瑪替尼甲磺酸、IMC-IC11誘導蛋白10(IMC-IC11 Inducible protein 10)、干擾素-α(interferon-alpha)、介白素12(interleukin 12)、薰草菌素(lavendustin A)、LY317615或AE-941、瑪立馬思他(marimastat)、mspin、醋酸甲羥孕酮(medroxpregesterone acetate)、Meth-1、Meth-2、2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)、neovastat、骨橋蛋白裂解產物(oteopontin cleaved product)、PEX、色素上皮生長因子(pigment epithelium growth factor，PEGF)、血小板因子4(platelet factor 4)、促乳素片段(prolactin fragment)、增值蛋白相關蛋白(proliferin-related protein，PRP)、PTK787/ZK 222584、ZD6474、重組人類血小板因子4(recombinant human platelet factor 4，rPF4)、restin、角鯊胺(squalamine)、SU5416、SU6668、SU11248蘇拉明(suramin)、紫杉醇(Taxol)、Tecogalan、沙利度胺(thalidomide)、凝血栓蛋白(thrombospondin)、TNP-470、肌鈣蛋白-1(troponin-1)、vasostatin、VEG1、VEGF-Trap、以及ZD6474。

血管生成抑制劑的非限制性實例也包括，酪胺酸激酶抑制劑，像是酪胺酸激酶受體Flt-1(VEGFR1)以及Flk-1/KDR(VEGFR2)的抑制劑、表皮衍生、纖維母細胞衍生、或血小板衍生的生長因子的抑制劑、MMP(基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotease))抑制劑、整聯蛋白阻斷劑(integrin blocker)、多戊糖多硫酸酯(pentosan polysulfate)、血管張力素II型拮抗劑(angiotensin II antagonist)、 環氧合酶抑制劑(包括非類固醇類抗發炎藥物(NSAIDs)諸如阿斯匹靈和伊布洛芬，以及挑選的環氧合酶-2抑制劑諸如塞來昔布和羅非昔布(rofecoxib))，以及固醇類抗發炎物(諸如皮質類固醇(corticosteroid)、礦物性皮質素(mineralocorticoid)、迪皮質醇(dexamethasone)、強體松(prednisone)、腎上腺皮質酮(prednisolone)、甲潑尼龍(methylpred)、貝皮質醇(betamethasone))。

調節或抑制血管生成且也可與單萜或倍半萜共軛的其他治療劑包括調節或抑制凝結作用以及纖維蛋白分解系統的藥劑，其包括，但不限於，肝素、低分子量肝素以及羧肽酶U抑制劑(carboxypeptidase U inhibitor)(也被稱為活性凝血酶激活的纖維蛋白分解抑制劑的抑制劑[TAFIa])。美國專利申請號20090328239。美國專利號7,638,549。

抗高血壓劑的非限制性實例包括血管張力素轉化酵素抑制劑(例如，硫甲丙脯酸(captopril)、伊那拉普利(enalapril)、地拉普利(delapril)等、血管張力素II型拮抗劑(例如，坎地沙坦酯(candesartan cilexetil)、坎地沙坦(candesartan)、氯沙坦(losartan)(或可悅您(Cozaar))、氯沙坦鉀(losartan potassium)、伊普沙坦(eprosartan)、維沙坦(valsartan)(或得安穩(Diovan))、替米沙坦(termisartan)、厄貝沙坦(irbesartan)、他索沙坦(tasosartan)、奧美沙坦(olmesartan)、奧美沙坦酯(olmesartan medoxomil)等)、鈣離子拮抗劑(例如，馬尼地平(manidipine)、硝苯地平(nifedipine)、胺氯地平(amlodipine)(或Amlodin)、伊福地平(efonidipine)、硝苯吡啶(nicardipine)等)、利尿劑(diuretics)、腎素抑制劑(例如，aliskiren等)、醛固酮拮抗劑(例如，螺環固醇內酮(spironolactone)、伊普利酮(eplerenone)等)、β-阻斷劑(例如，美托洛爾(metoprolol)(或Toporol)、天諾敏(atenolol)、普萘洛爾(propranolol)、卡維地洛(carvedilol)、吲哚洛爾(pindolol)等)、 血管舒張劑(vasodilators)(例如，硝酸鹽、可溶的鳥苷酸環化酶刺激物或活化物、前列環素(prostacycline)等)、血管張力素疫苗、可尼丁(clonidine)以及類似物。美國專利申請號20100113780。

可與單萜(或倍半萜)共軛的其他治療劑包括，但不限於，舍曲林(Sertraline)(樂復得(Zoloft)、妥品美(Topiramate)(妥泰(Topamax))、度洛西汀(Duloxetine)(千憂解(Cymbalta))、舒馬普坦(Sumatriptan)(英明格(Imitrex))、普瑞巴林(Pregabalin)(利瑞卡(Lyrica))、拉莫三嗪(Lamotrigine)(樂命達(Lamictal))、伐席洛維(Valaciclovir)(祛疹易(Valtrex))、坦舒洛辛(Tamsulosin)(Flomax)、疊氮胸苷(Zidovudine)(卡貝茲錠(Combivir))、拉脈優(Lamivudine)(卡貝茲錠)、依法韋倫(Efavirenz)(Sustiva)、阿巴卡韋(Abacavir)(Epzicom)、洛匹那韋(Lopinavir)(克利之(Kaletra))、吡格列酮(Pioglitazone)(愛妥糖(Actos))、地氯雷他定(Desloratidine)(Clarinex)、鹽酸西替利嗪(Cetirizine)(Zyrtec)、泮托拉唑(Pentoprazole)(保衛康治潰樂(Protonix))、蘭索拉唑(Lansoprazole)(Prevacid)、雷貝拉唑(Rebeprazole)(Aciphex)、莫西沙星(Moxifloxacin)(威洛速(Avelox))、美洛昔康(Meloxicam)(莫比可(Mobic))、多佐胺(Dorzolamide)(Truspot)、雙氯芬酸鈉(Diclofenac)(服他靈(Voltaren))、依那普利(Enlapril)(Vasotec)、孟魯斯特(Montelukast)(欣流(Singulair))、西蒂娜非(Sildenafil)(威而鋼(Viagra))、卡維地洛(Carvedilol)(Coreg)、雷米普利(Ramipril)(Delix)。

表1列出可與單萜(或倍半萜)共軛的藥學試劑，包括藥學試劑的結構以及用於共軛的優選衍生物。

單萜(或倍半萜)衍生物的純度可藉由氣相層析(GC)或高壓液相層析(HPLC)來分析。用於分析單萜(或倍半萜)衍生物的純度以及確定雜質的存在的其它技術包括，但不限於，核磁共振(NMR)光譜、質譜測定法(MS)、GC-MS、紅外光譜(IR)、以及薄層層析法(TLC)。手性(chiral)純度能藉由手性GC或旋光度的測量來評估。

單萜(或倍半萜)衍生物可藉由像是結晶作用的方法，或根據該衍生物之獨特物理化學性質(例如，溶解度或極性)，將單萜(或倍半萜)衍生物從雜質中分離來純化。因此，單萜(或倍半萜)衍生物可藉由所屬領域中已知的適合的分離技術，像是製備層析(preparative chromatography)、(分)餾、或(分級)結晶法((fractional)crystallization)，與單萜(或倍半萜)分離。

本發明也提供使用單萜(或倍半萜)衍生物以治療疾病，諸如癌症或其它神經系統病症的方法。單萜(或倍半萜)衍生物可單獨給藥，或與放射線、外科手術或化學治療劑組合給藥。單萜或倍半萜衍生物也可與抗病毒劑、消炎劑或抗生素共同給藥。試劑可同時地或依序給藥。單萜(或倍半萜)衍生物可在其它活性劑(active agent)的給藥之前、期間或之後給藥。

單萜或倍半萜衍生物可與放射線治療組合使用。在一個實施例中，本發明提供以放射線來治療腫瘤細胞，諸如惡性神經膠瘤細胞或腦轉移癌的方法，其中細胞以有效量的單萜衍生物，諸如紫蘇醇胺甲酸酯來處理，且接著暴露於放射線中。單萜衍生物治療可在放射線之前、期間及/或之後。舉例來說，單萜或倍半萜衍生物可從放射線治療的開始之前一星期開始連續給藥，並且在放射線治療完成之後持續兩個星期。美國專利號5587402以及5602184。

在一個實施例中，本發明提供以化學治療來治療腫瘤細胞如惡性神經膠瘤細胞或腦轉移癌的方法，其中細胞被以有效量的單萜衍生物，諸如紫蘇醇胺甲酸酯來處理，然後暴露於化學治療。單萜衍生物治療可在化學治療之前、期間及/或之後。

單萜(或倍半萜)衍生物可被用於神經系統癌症的治療，像是惡性神經膠瘤(例如，星細胞瘤、退行性變化的星形細胞瘤、多形神經膠母細胞瘤)、視網膜母細胞瘤(retinoblastoma)、毛細胞性星細胞瘤(第一期)(pilocytic astrocytomas)、腦膜瘤(meningiomas)、轉移性腦腫瘤、神經胚細胞瘤(neuroblastoma)、垂體腺瘤(pituitary adenomas)、顱底腦膜瘤(skull base meningiomas)、以及顱底癌症(skull base cancer)。如本文使用的，術語「神經系統腫瘤」是指其中受試者具有神經系統細胞的惡性增殖之狀態。

可被本單萜(或倍半萜)衍生物治療的癌症包括，但不限於，肺癌、耳、鼻和喉癌、血癌、結腸癌、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、乳癌、造血癌、卵巢癌、基底細胞癌、膽道癌；膀胱癌；骨癌；乳癌；子宮頸癌；絨毛膜癌；結腸和直腸癌；結締組織癌；消化系統的癌症；子宮內膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部的癌；胃癌；上皮內贅瘤(neoplasm)；腎癌；喉癌；包括急性骨髓血癌、急性淋巴樣血癌、慢性骨髓血癌、慢性淋巴樣血癌之血癌；肝癌；包括霍金奇氏和非霍奇金氏淋巴瘤之淋巴瘤；骨髓瘤；纖維瘤、神經母細胞瘤(neuroblastoma)；口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)；直腸癌；腎癌；呼吸系統的癌症；肉瘤(sarcoma)；皮膚癌；胃癌；睾丸癌；甲狀腺癌；子宮癌；泌尿系統的癌症，以及其它癌和肉瘤。美國專利號7601355。

本單萜(或倍半萜)衍生物可被使用於治療起源於原發癌症或從原發癌症擴散之腦轉移癌，原發癌症像是，全身癌、肺癌、前列腺癌、乳癌、造血癌、卵巢癌、膀胱癌、生殖細胞腫瘤、腎癌、血癌、淋巴瘤、以及黑色素瘤所蔓延的腦轉移。在一些實施例中，本發明提供藉由給藥哺乳動物本文描述的單萜(或倍半萜)衍生物，例如，POH胺甲酸酯，諸如TMZ-POH来治療具有轉移的癌症，像是已經蔓延至腦的轉移性乳癌的哺乳動物的方法。

本發明也提供治療CNS失調的方法，包括，但不限於，第一期退行性神經失調諸如阿茲海默、帕金森氏、心理障礙、精神病和憂鬱。治療可包括單獨使用單萜或倍半萜衍生物，或與目前於帕金森氏、阿茲海默症或心理障礙的治療中使用的藥物組合使用。

本發明也提供增進免疫調節治療反應的方法，其包括在免疫調節治療之前或期間，將細胞暴露於有效量的單萜或倍半萜衍生物，諸如紫蘇醇胺甲酸酯中的步驟。優選的免疫調節劑是細胞介素，如介白素、淋巴介質、單核因子(monokine)、干擾素和趨化介素。

本發明組成物可藉由任何所屬領域已知的方法給藥，包括，但不限於，鼻內、經口、經皮、經眼、腹膜內、吸入、靜脈內、ICV、腦池內(intracisternal)注射或輸液、皮下、植入、陰道內、舌下、尿道(例如，尿道塞劑)、皮下、肌內、靜脈內、直腸、舌下、黏膜、眼的、脊髓、脊柱內(intrathecal)、關節內、動脈內、蜘蛛膜下、支氣管和淋巴管給藥。局部製劑可為凝膠、軟膏(ointment)、乳膏劑、氣霧劑(aerosol)等的形式；鼻內製劑可以噴霧或液滴形式遞送；經皮製劑可藉由透過透皮貼劑或離子電滲(iontophoresis)給藥；吸入製劑可使用噴霧器或相似的 裝置。組成物也可採用片劑、丸劑、膠囊、半固體、粉末、緩釋製劑、溶液、懸浮液、酏劑(elixir)、氣霧劑，或任何其它合適的組成物的形式。

為了製備這種藥學組成物，一種或多種單萜(或倍半萜)衍生物可根據常規的藥物調合技術與藥學上可接受的載體、佐劑及/或賦形劑混合。可被使用於本發明組成物中的藥學上可接受的載體囊括任何標準藥學載體，像是磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水和乳液，諸如油/水或水/油乳液、以及各種類型的潤濕劑。組成物可額外含有固體藥學賦形劑，像是澱粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽凝膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯(glycerol monostearate)、氯化鈉、脫脂奶粉和其類似物。液體和半固體賦形劑可選自甘油、丙二醇、水、乙醇和各種油類，包括石油、動物、植物或合成來源的那些油類，例如：花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。液體載體，特別是可注射液體，包括水、鹽水、葡萄糖水溶液和乙二醇。載體、穩定劑和佐劑的實例，參見Remington's PharmaceuticalSciences，E.ff.Martin編著，(Mack Publishing Company，第18版，1990年)。所述組成物還可包括穩定劑和防腐劑。

如用於本文中，用語「治療有效量」是足以治療特定失調或疾病的量，或者替代地以獲得治療失調或疾病的藥學反應的量。測定最有效給藥的措施和劑量的方法可根據使用於治療的組成物、治療的目的、被治療的標的細胞、以及被治療的受試者而變化。治療劑量通常可被滴定以最佳化安全性和療效。單次或多次給藥可藉由治療醫生所選擇的劑量和方式來進行。合適劑量製劑和該藥劑的給藥方法可容易地由所屬領域技術人員決定。舉例來說，組成物以大約0.01mg/kg至大約200mg/kg、大約0.1mg/kg至大約100mg/kg、或大 約0.5mg/kg至約50mg/kg地給藥。當在本文描述的化合物與另一個藥劑或療法共同給藥時，有效量可小於當該藥劑被單獨使用時的有效量。

經皮製劑可藉由結合活性劑於搖變性(thixotropic)或膠性的(gelatinous)載體，諸如纖維素介質，例如：甲基纖維素或羥乙基纖維素(hydroxyethyl)中而製備，將結果製劑接著裝入適用於固定在與穿用者的皮膚皮膚接觸的經皮裝置內。若組成物是凝膠形式，組成物可被揉塗到病患的表層上，例如，肩部或上臂及/或上半身軀的皮膚，較佳為完整、乾淨且乾燥的肩部或上臂及/或上半身軀的皮膚上，並在其上保持一段足以使單萜(或倍半萜)衍生物遞送至病患血清的時間。凝膠形式的本發明的組成物可被包含在管、藥囊(sachet)或計量泵中。這樣的管或藥囊可包含有一個單位劑量或多於一個單位劑量的組成物。計量泵可能夠分一個計量劑量的配藥組成物。

本發明也提供用於鼻內給藥的如上所述的組成物。如此，組成物可進一步包含滲透性增強劑。Southall等人，Developments in Nasal Drug Delivery,2000年。單萜(或倍半萜)衍生物可以液體形式諸如溶液、乳液、懸浮液、滴劑，或固體形式諸如粉末、凝膠或軟膏而被鼻內給藥。遞送鼻內藥物的裝置是所屬領域中公知的。鼻腔藥物的遞送可使用裝置進行，其包括但不限於，鼻內吸入器、鼻內噴霧裝置、霧化器、鼻腔噴霧瓶、單位劑量容器、泵、滴管、擠壓瓶、噴霧器、計量劑量吸入器(MDI)、加壓劑量吸入器、吸進器和雙方向裝置。鼻腔遞送裝置可被計量以施用精確的有效劑量的量予鼻腔。鼻腔遞送裝置可用于單一單位遞送或多單位遞送。在特定的實例中，來自Kurve Technology(BethelI，華盛頓州)的ViaNase Electronic Atomizer可被使用於本發明中(http：//www.kurvetech.com)。本發明的化合物也可透過管、導管、注射器、 packtail、棉紗(pledget)、鼻棉塞來遞送，或藉由黏膜下輸液來遞送。美國專利號20090326275、20090291894、20090281522和20090317377。

單萜(或倍半萜)衍生物可使用標準程序配製成氣霧劑。單萜(或倍半萜)衍生物可與溶劑一起或不與溶劑一起配製，以及可與載體一起或不與載體一起配製。製劑可為溶液，或可為有著一種或多種界面活性劑的水性乳液。舉例來說，氣霧劑噴霧可由帶有適合的推進劑諸如：二氯二氟甲烷(dichlorodifluoromethane)、三氯氟甲烷(trichlorofluoromethane)、二氯四氟乙烷(dichlorotetrafluoroethane)、烴類(hydrocarbon)、壓縮空氣(compressed air)、氮氣、二氧化碳、或其它合適氣體的加壓容器產生。劑量單位可藉由提供閥門來確定以遞送計量的量。泵噴霧分配器可分配計量的劑量或是具有特定的粒徑或液滴尺寸的劑量。如用於本文中，用語「氣霧劑」是指稱在氣體中的精細固體顆粒的懸浮液或液體溶液液滴。具體而言，如同可在任何合適的裝置，諸如MDI、噴霧器或微粒噴霧機(mist sprayer)中產生的，氣霧劑包括單萜(或倍半萜)的液滴的氣載(gas-borne)懸浮液。氣霧劑也包括懸浮在空氣或其它載體氣體中的本發明之組成物的乾粉組成物。Gonda(1990年)Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，6：273-313。Raeburn等人，(1992年)Pharmacol.Toxicol.Methods，27：143-159。

單萜(或倍半萜)衍生物可如像是被鼻腔吸進器所遞送的微球形式的粉末般地被遞送到鼻腔。單萜(或倍半萜)衍生物可吸附至固體，例如，載體之表面。粉末或微球可以乾燥的、空氣為非必需的(air-dispensable)的形式給藥。粉末或微球可儲存在吸進器的容器中。替代的粉末或微球可填充進膠囊中，像是明膠膠囊，或其它適合於鼻腔給藥的單一劑量單元。

藥學組成物可藉由在鼻腔中組成物的直接置放來遞送至鼻腔，舉例來說，凝膠、軟膏、鼻腔乳液、洗劑(lotion)、乳膏劑、鼻棉塞、滴管或生物黏附條(bioadhesive strip)的形式。在特定實施例中，理想的是延長藥學組成物在鼻腔中的駐留時間，舉例來說，為了增強吸收。因此，藥學組成物可選擇性地與生物黏附聚合物、膠狀物(gum)(例如，黃原膠(xanthan gum))、幾丁聚糖(chitosan)(例如，高純度陽離子多醣)、果膠(或當施加到鼻黏膜時，像凝膠一樣稠化或乳化的任何醣類)、微球(例如，澱粉、白蛋白(albumin)、聚葡萄糖、環糊精)、明膠、脂質體、卡波姆(carbamer)、聚乙烯醇、藻酸鹽、阿拉伯膠、幾丁聚糖及/或纖維素(例如，甲基或丙基；羥基或羧基；羧甲基或羥丙基)一起配製。

含有純化單萜(或倍半萜)的組成物可藉由口腔吸入進入呼吸道，亦即，肺，來給藥。

用於可吸入藥劑的典型遞送系統包括噴霧器吸入器、乾粉吸入器(DPI)和計量劑量吸入器(MDI)。

噴霧器裝置產生高速度空氣流，其造成液體形式的治療劑如同霧般噴灑。治療劑被配製成液體形式，諸如溶液或合適尺寸的顆粒的懸浮液。在一個實施例中，顆粒是微粉化的(micronized)。用語「微粉化」被定義為具有大約90%或更多的顆粒具有小於約10μm的直徑。適合的噴霧器裝置是商業上提供的，例如，由PARI GmbH(Starnberg，德國)提供。其它噴霧器裝置包括Respimat(Boehringer Ingelheim)以及那些揭露在，例如，美國專利號7,568,480以及6,123,068、以及WO 97/12687的噴霧器裝置。單萜(或倍半萜)可被配製作為水性溶液或液體懸浮液以用於在噴霧器裝置中。

DPI裝置通常以可在呼吸期間被分散於病患的氣流內之自由流動的粉末形式施用治療劑。使用外部能源的DPI裝置也可被使用於本發明。為了得到自由流動粉末，治療劑可與適合的賦形劑(例如，乳糖)配製。舉例來說，可藉由結合具有大約1μm與100μm之間的顆粒尺寸的乾燥乳糖與單萜(或倍半萜)的微粉化顆粒，並乾燥摻合(dry blending)來製作乾粉製劑。另外，單萜可無賦形劑地配製。製劑被裝入乾粉分配器中，或裝入用於與乾粉遞送裝置一起使用的吸入匣或膠囊中。商業上提供的DPI裝置的實例包括Diskhaler(GlaxoSmithKline，三角研究園(Research Triangle Park)，北卡羅萊納州(N.C.))(參見，例如，美國專利號5,035,237)；Diskus(GlaxoSmithKline)(參見，例如美國專利號6,378,519)；Turbuhaler(AstraZeneca,Wilmington,Del.)(參見，例如美國專利號4,524,769)；以及Rotahaler(GlaxoSmithKline)(參見，例如，美國專利4,353,365)。合適的DPI裝置的進一步實例描述在美國專利號5,415,162、5,239,993、以及5,715,810號以及其中的參考文獻中。

MDI裝置通常使用壓縮的推進劑氣體釋放出測定量的治療劑。用於MDI給藥的製劑包括在液化推進劑中的活性成分的溶液或懸浮液。推進劑的實例包括氫氟烷烴(hydrofluoroalklane,HFA)，像是1,1,1,2-四氟乙烷(1,1,1,2-tetrafluoroethane,HFA 134a)以及1,1,1,2,3,3,3-七氟-正丙烷(1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propane,HFA 227)、以及氯氟碳化物(chlorofluorocarbon)，像是CCl₃F。用於MDI給藥的HFA製劑的其他成分包括共溶劑，諸如乙醇、戊烷、水；以及界面活性劑，諸如失水山梨醇三油酸酯(sorbitan trioleate)、油酸、卵磷脂(lecithin)和甘油。(參見，舉例來說，美國專利號5,225,183、EP 0717987、以及WO 92/22286)。製劑被裝入氣霧劑罐(canister)中，該氣霧劑罐 形成MDI裝置的一部分。為了與HFA推進劑一起使用而特別開發的MDI裝置的實例被提供在美國專利號6,006,745以及6,143,227中。用於製備適合製劑的過程和適合於吸入劑量的裝置的實例，參見美國專利號6,268,533、5,983,956、5,874,063、以及6,221,398、以及WO 99/53901、WO 00/61108、WO99/55319以及WO 00/30614。

單萜(或倍半萜)衍生物可被封裝在脂質體或微膠囊中以透過吸入來遞送。脂質體是由脂質雙層膜和水性內部所組成的囊泡。脂質膜可由磷脂來製成，磷脂的實例包括磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine)諸如卵磷脂(lecithin)和溶血卵磷脂(lysolecithin)；酸性磷脂諸如磷脂醯絲胺酸(phosphatidylserine)以及磷脂醯甘油(phosphatidylglycerol)；以及鞘磷脂(sphingophospholipid)諸如磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine)以及神經鞘磷脂(sphingomyelin)。或者，可添加膽固醇。微膠囊是塗有塗層材料的顆粒。舉例來說，塗層材料可由成膜(film-forming)聚合物、疏水性塑化劑(plasticizer)、界面活性劑或/及潤滑劑含氮聚合物(lubricant nitrogen-containing polymer)的混合物組成。美國專利號6,313,176以及7,563,768。

單萜(或倍半萜)衍生物也可單獨使用或透過像是乳癌或黑色素瘤之局部癌症的治療的局部施用與其它化學治療劑組合使用。單萜(或倍半萜)衍生物也可用於與經皮遞送之疼痛藥物的麻醉劑或止痛劑(analgesic)組合。

本發明也提供用於眼部給藥的如上所述的組成物。如此，組成物可進一步包含滲透增強劑。對於眼部給藥而言，本文描述的組成物可配製成溶液、乳液、懸浮液等。適用於將化合物施用於眼睛的各種載體是所屬領域技術已知的。具體的非限制性實例描述在美國專利號6,261,547；6,197,934； 6,056,950；5,800,807；5,776,445；5,698,219；5,521,222；5,403.841；5,077,033；4,882,150以及4,738,851中。

單萜(或倍半萜)衍生物可單獨或與用於上述疾病的治療的其他藥物組合地給予短或延長的時間區間。本組成物可給藥於哺乳動物，最佳為人類。哺乳動物包括，但不限於，鼠類、大鼠、兔、類人猿(simians)、牛、綿羊、豬、犬、貓、農畜、競技動物(sport animals)、寵物、馬(equine)和靈長目。

本發明也提供用於在體外、離體(ex vivo)或在體內抑制細胞的生長的方法，其中細胞，諸如癌症細胞，是與有效量的如本文所描述的單萜(或倍半萜)衍生物接觸。

病理的細胞或組織諸如過度增殖的細胞或組織可藉由使細胞或組織接觸有效量的本發明組成物來處理。細胞，諸如癌細胞，可為原發癌症細胞，或可為能從組織庫諸如美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)所獲得的培養細胞。病理細胞可為全身癌症、神經膠瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤(pituitary adenoma)、或來自全身癌症、肺癌、前列腺癌、乳癌、造血癌、卵巢癌、膀胱癌、生殖細胞腫瘤、腎癌、血癌、淋巴瘤、以及黑色素瘤的CNS轉移癌或腦轉移癌。細胞可來自於脊椎動物，較佳地為哺乳動物，更佳地為人類。美國專利號2004/0087651。Balassiano等人(2002年)Intern.T.Mol.Med.10：785-788。Thorne等人(2004年)Neuroscience 127：481-496。Fernandes等人(2005年)Oncology Reports 13：943-947。Da Fonseca等人(2008年)Surgical Neurology 70：259-267。Da Fonseca等人(2008年)Arch.Tmmunol.Ther.Exp.56：267-276。Hashizume等人(2008年)Neuroncology 10：112-120。

本發明組成物的體外療效可使用所屬領域技術中公知的方法來測定。舉例來說，本單萜(或倍半萜)及/或治療劑的細胞毒性可以MTT([3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-溴化二苯四唑][3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide])細胞毒性檢測來研究。MTT檢測是基於新陳代謝活躍細胞之MTT、四唑鹽(tetrazolium salt)的攝取原理，其在細胞中被代謝成可被光譜圖讀取之藍色的甲臢(formazon)產物。J.of Immunological Methods 65：5563，1983年。本單萜(或倍半萜)衍生物及/或治療劑的細胞毒性可藉由群落形成檢測來研究。用於VEGF分泌和IL-8分泌的抑制的功能性分析可透過ELISA執行。由本單萜(或倍半萜)衍生物及/或治療劑阻斷的細胞週期可藉由標準化的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色和流動式細胞測量術來研究。侵入抑制可藉由博登細胞移行器(Boyden chamber)來研究。在此檢測中，一層重組基底膜，Matrigel，被塗佈到趨化性過濾器上，並作為博登細胞移行器中細胞遷移的屏障。只有具有侵入能力的細胞能穿過Matrigel屏障。其它檢測包括，但不限於，細胞存活力檢測、細胞凋亡檢測、以及形態檢測。

以下是本發明的實例，其不應被解釋為限制性的。

實例

實例1：二甲基塞來昔布雙POH胺甲酸酯(4-(雙-N,N'-4-異丙烯基環己-1-烯甲氧基羰基[5-(2,5-二甲基苯基)-3-三氟甲基吡唑-1-基]苯磺醯胺)(4-(bis-N,N’-4-isopropenyl cyclohex-1-enylmethyloxy carbonyl[5-(2,5-dimethyl phenyl)-3-trifluoromethyl pyrazol-1-yl]benzenesulfonamide)的合成(本文也稱POH-DMC或DMC-POH)

反應機制如下：

以30分鐘的時間期間，添加光氣(於甲苯中20%，13ml、26.2mmol)至紫蘇醇(2.0克，13.1mmol)和乾燥甲苯(30ml)中之碳酸鉀(5.4克，39.1mmol)的混合物中，同時維持溫度在10℃至15℃之間。使反應混合物升溫至室溫且在N₂下攪拌8.0小時。用水(30ml)焠熄反應混合物，且分離有機層。用甲苯(20ml)萃取水層，且以水(50mL X 2)洗滌結合的有機層，以鹽水(15%，30ml)洗滌並用硫酸鈉(20克)乾燥。過濾的有機層在真空下濃縮以得到如油狀之紫蘇氯甲酸酯。重量：2.5克；產率：89%。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ 1.5(m，1H)，1.7(s，3H)，1.8(m，1H)，2.0(m，1H)，2.2(m，4H)，4.7(dd，4H)；5.87(m，1H)。

在N₂下，以5分鐘的時間期間，將紫蘇氯甲酸酯(0.11克，0.55mmol)緩慢添加至二甲基塞來昔布(0.2克，0.50mmol)和碳酸鉀(0.13克，1.0mmol)在無水丙酮(10mL)中的混合物中。將反應混合物加熱至回流，並維持3小時。由於TLC分析指明二甲基塞來昔布的存在(>60%)，另外添加1.0當量的紫蘇氯甲酸酯，並額外再回流5小時。反應混合物被冷卻，且在真空下濃縮丙酮以得到殘餘物。

所得之殘餘物被懸浮於水(15ml)中，且以乙酸乙酯(3 x 15mL)萃取。以水(20ml)洗滌結合的有機層，接著以鹽水(15%，20ml)洗滌，並用硫酸鈉 乾燥。真空下濃縮過濾的有機層以得到殘餘物，其以管柱層析術(column chromatography)來純化[柱尺寸：直徑：1.5cm、高度：10cm、二氧化矽：230-400篩孔]，並用己烷(100ml)洗脫，接著用己烷/乙酸乙酯的混合物(95：5，100ml)洗脫。己烷/乙酸乙酯部分被結合，並於真空下濃縮以得到膠狀物質(gummy mass)。

產物POH胺甲酸酯展現120mg的重量，且產率為31%。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ 0.9(m,2H)，1.4(m，2H)，1.7(m，7H*)，1.95(m，8H*)，2.1(m，4H)，2.3(s，3H)，4.4(d，2H)，4.7(dd，2H)，5.6(br d，2H)，6.6(s，1H)，7.0(br s，1H)，7.12(d，1H)，7.19(d，1H)，7.4(d，2H)，7.85(d，2H)；MS，m/e：751.8(M⁺ 3%)，574.3(100%)，530.5(45%)，396(6%)。*注意：在NMR積分中扣除了來自假定雜質的進一步2H重疊。

實例2：POH-DMC胺甲酸酯(POH-DMC)的體外細胞毒性研究

第一次細胞毒性檢測在細胞以二甲基-塞來昔布(DMC)單獨處理之後進行。第1圖顯示在人類惡性神經膠瘤細胞U87、A172和U251上單獨以DMC進行的MTT細胞毒性檢測的結果。

接著，U87、A172和U251細胞以二甲基塞來昔布雙POH胺甲酸酯(POH-DMC)(例如，被實例1中方法合成)處理，並進行MTT細胞毒性檢測(第2圖)。結果表明POH胺甲酸酯POH-DMC展現出比單獨DMC要強的細胞毒性。

實例3：帝盟多胺POH胺甲酸酯(3-甲基4-氧代-3,4-二氫咪唑[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羰基-胺甲酸-4-異丙烯基環己-1-烯甲基酯)(3-methyl 4-oxo-3,4-dihydroimidazo[5,1-d][1,2,3,5]tetrazine-8-carbonyl)-carbamic acid-4-isopropenyl cyclohex-1-enylmethyl ester)(本文中也被稱為TMZ-POH或POH-TMZ)的合成

反應機制如下：

在N₂下，以2分鐘的時間期間，將草醯氯(0.13克，1.0mmol)緩慢添加至1,2-二氯乙烷(10ml)中之帝盟多胺(OChem Incorporation，0.1克，0.5mmol)的混合物，同時維持溫度在10℃。使反應混合物升溫到室溫，然後加熱至回流3小時。藉由在真空下濃縮去除過量的草醯氯和1.2-二氯乙烷。所得到的殘餘物再溶於1,2-二氯乙烷(15ml)中，並在N₂下將反應混合物冷卻至10℃。以5分鐘的時間期間，添加1,2-二氯乙烷(3ml)中之紫蘇醇(0.086克，0.56mmol)溶液。反應混合物升溫至室溫，並攪拌14小時。1,2-二氯乙烷在真空下濃縮以得到殘餘物，其以己烷研磨(triturate)。所得到的黃色固體被過濾並用己烷洗滌。重量：170mg；產率：89%。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ 1.4-2.2(m，10H)，4.06(s，3H)，4.6-4.8(m，4H)，5.88(br s，1H)，8.42(s，1H)，9.31(br s，1H)；MS，沒有觀察到分子離子峰，m/e：314(100%)，286.5(17%)，136(12%)。

或者，帝盟多胺POH胺甲酸酯係根據以下過程合成。在N₂下，以2分鐘的時間期間，將草醯氯(0.13克，1.0mmol)緩慢添加至1,2-二氯乙烷(10mL)中之帝盟多胺(OChem Incorporation，0.1克，0.5mmol)混合物中，同時維持溫度在10℃。使反應混合物升溫至室溫並接著加熱以回流3小時。藉由在真空下濃縮以移除過量的草醯氯和1,2-二氯乙烷。所得到的殘餘物回溶於1,2-二氯乙烷(15 mL)中，且在N₂下，將反應混合物冷卻至10℃。以5分鐘之時間期間，添加1,2-二氯乙烷(3mL)中之紫蘇醇(0.086克，0.56mmol)溶液。使反應混合物升溫至室溫，並攪拌14小時。在真空下濃縮1,2-二氯乙烷以得到殘餘物，其藉由短的二氧化矽填充管柱[柱尺寸：直徑：2cm，高度：3cm，二氧化矽：230-400篩孔]來純化，並以己烷/乙酸乙酯(1：1，100ml)的混合物來洗脫。己烷/乙酸乙酯部分被結合，並在真空下濃縮以得到白色固體殘餘物，其以庚烷研磨並過濾以得到白色固體。重量：170mg；產率：89%。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：1.4-2.2(m，10H)，4.06(s，3H)，4.6-4.8(m，4H)。5.88(br s，1H)，8.42(s，1H)，9.31(br s，1H)；MS，沒有觀察到分子離子峰，m/e=314(100%)，286.5(17%)，136(12%)。

實例4：TMZ-POH的體外細胞毒性研究

第一次細胞毒性檢測在細胞以帝盟多胺(TMZ)單獨處理之後進行，其中帝盟多胺(TMZ)為使用在惡性神經膠瘤的治療中的標準烷化劑。第3圖顯示僅以TMZ在人類惡性神經膠瘤細胞U87、A172和U251上執行的MTT細胞毒性檢測的結果。升高濃度的TMZ對所測試的細胞株具有最小的細胞毒性。

接著，以TMZ-POH(例如，藉由實例3中的方法合成)來處理抗TMZ的神經膠瘤細胞株U87、A172和U251細胞。MTT檢測結果(第4圖)顯示，相比於只有TMZ，TMZ-POH展現出對各種人類神經膠瘤細胞明顯地更高的殺滅率。

實例5：洛利普蘭POH胺甲酸酯(4-(3-環戊氧-4-甲氧基苯基)-2-氧代-吡咯啶-1-羧酸4-異丙烯基環己-1-烯甲基酯)(4-(3-cyclopentyloxy-4-methoxy phenyl)-2-oxo-pyrrolidine-1-carboxylic acid 4-isopropenyl cyclohex-1-enylmethyl ester)(本文中也被稱為洛利普蘭-POH或POH-洛利普蘭)的合成

反應機制如下：

以30分鐘之時間期間，添加光氣(於甲苯中20%，13ml，26.2mmol)至紫蘇醇(2.0克，13.1mmol)和乾燥甲苯(30mL)中之碳酸鉀(5.4克，39.1mmol)的混合物中，同時維持溫度在10℃至15℃之間。在N₂下，使反應混合物升溫至室溫，並攪拌8.0小時。反應混合物以水(30ml)焠熄，且分離有機層。水層以甲苯(20mL)萃取，且組合的有機層以水(50ml x 2)洗滌，以鹽水(15%，30mL)洗滌並且經硫酸鈉(20克)乾燥。在真空下濃縮過濾的有機層以得到如油狀之紫蘇氯甲酸酯。重量：2.5克；產率：89%。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ 1.5(m，1H)，1.7(s，3H)，1.8(m，1H)，2.0(m，1H)，2.2(m，4H)，4.7(dd，4H)；5.87(m，1H)。

在N₂下，以5分鐘之時間期間，在-72℃下，將丁基鋰(2.5M，0.18mL，0.45mmol)添加至乾燥THF中之洛利普蘭(GL synthesis，Inc.，0.1克，0.36mmol)溶液中。反應混合物在-72℃下攪拌1.0小時之後，以15分鐘之時間期間，添加紫蘇氯甲酸酯(溶於4mL THF)，同時維持溫度在-72℃。攪拌反應混合物2.5 小時並以飽和氯化銨(ammonium chloride)(5ml)焠熄。使反應混合物升溫至室溫，且以乙酸乙酯(2x15mL)萃取。用組合有機層以水(15mL)、鹽水(15%，15mL)洗滌，且接著經硫酸鈉乾燥。濃縮過濾的有機層以得到油，其藉由管柱層析術[柱尺寸：直徑：1.5cm，高度：10cm，二氧化矽：230-400篩孔]來純化，且以8%乙酸乙酯/己烷的混合物(100mL)來洗脫，隨後以12%乙酸乙酯/己烷(100mL)洗脫。12%乙酸乙酯/己烷部分被合併且在真空下濃縮以得到膠狀固體。重量：142mg；產率：86%。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ 1.5(m，1H)，1.6(m，2H)，1.7(s，3H)，1.9(m，6H)，2.2(m，5H)，2.7(m，1H)，2.9(m，1H)，3.5(m，1H)，3.7(m，1H)，3.8(s，3H)，4.2(m，1H)，4.7(m，6H)，5.8(br s，1H)，6.8(m，3H)；MS，m/e：452.1(M⁺¹ 53%)，274.1(100%)，206.0(55%)。

實例6：洛利普蘭POH胺甲酸酯的體外細胞毒性研究

為了比較洛利普蘭POH胺甲酸酯(POH-洛利普蘭)(例如，以實例5的方法所合成)與洛利普蘭的細胞毒性，在神經膠瘤細胞A172、U87、U251和LN229人類神經膠瘤細胞中誘導分化和細胞凋亡的第四型磷酸二酯酶(type IV phosphodiesterase)，以POH-洛利普蘭或洛利普蘭處理48小時。MTT檢測結果顯示在第5圖至第8圖中。相比於只有洛利普蘭，POH-洛利普蘭對幾種不同的人類神經膠瘤細胞類型的各個展現出明顯地更高的殺滅率。第5圖顯示針對A-172細胞之增加濃度的洛利普蘭與POH-洛利普蘭的MTT檢測。只有洛利普蘭展示出大約1000μM(1mM)的IC50。在POH-洛利普蘭存在的情況下，於低至50μM的濃度達到IC50。第6圖顯示增加濃度的洛利普蘭與U-87細胞的MTT檢測。在1000μM尚未達到IC50。另一方面，使用POH-洛利普蘭在180μM時達到IC50。第7圖顯示，針對U251細胞，只有洛利普蘭時在170μM達到IC50；在60%時達到平線區(plateau)細胞毒性。POH-洛利普蘭在50μM時達到IC50，其在100μM時達到幾 乎100%細胞毒性。第8圖顯示對LN229細胞，只有洛利普蘭時甚至在100μM仍未達到IC50。另一方面，對於POH-洛利普蘭，在100μM時達到IC50，其中在10μM時幾乎為100%細胞毒性。

實例7：透過POH脂肪酸衍生物的體內腫瘤生長抑制

在裸鼠皮下的神經膠瘤模型中研究透過丁醯基-POH的腫瘤生長抑制。小鼠被注射U-87神經膠瘤細胞(500,000(個)細胞/注射)，且使其於兩周內形成可觸到的(palpable)結節(nodule)。一旦形成可觸到的結節，小鼠即在8周期間內透過棉花棒(Q-tip)(1cc/給藥/天)局部施加如第9A圖和第9B圖所指明的各種化合物的來治療。第9A圖顯示以丁醯基-POH、具有大於98.5%的純度的純化(S)-紫蘇醇(「純化POH」)、購自西格瑪化學公司的POH、或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；陰性控制組)治療的裸鼠中的皮下U-87神經膠瘤的圖像。第9B圖顯示隨著時間(60天的總時間期間)的平均腫瘤生長。丁醯基-POH展現出對腫瘤生長的最大抑制其次是純化POH及西格瑪POH。

實例8：TMZ以及TMZ-POH在TMZ敏感神經膠瘤細胞和TMZ抗性神經膠瘤細胞上的體外細胞毒性研究

群落形成檢測在以僅TMZ、僅POH、以及TMZ-POH共軛物處理細胞之後執行。群落形成檢測，如在Chen TC等人，《綠茶沒食子兒茶素和沒食子酸酯在正位的小鼠神經膠質母細胞瘤模型中帝盟多胺的治療療效》(Green tea epigallocatechin gallate enhances therapeutic efficacy of temozolomide in orthotopic mouse glioblastoma models)，CancerLett.2011年5月28日；302(2)：100-8中描述般地進行。第10圖顯示以TMZ或TMZ-POH於TMZ敏感U251細胞(U251)和TMZ抗性U251細胞(U251TR)上執行的群落形成檢測的結果。TMZ演示出針對 TMZ敏感U251細胞的細胞毒性，但針對TMZ抗性U251細胞則具有極小的細胞毒性。TMZ-POH演示出針對TMZ敏感U251及TMZ抗性U251細胞兩者的細胞毒性。

第11圖顯示以POH在TMZ敏感U251細胞(U251)和TMZ抗性U251細胞(U251TR)上執行群落形成檢測的結果。POH展示出針對TMZ敏感U251細胞和TMZ抗性U251細胞兩者的細胞毒性。在群落形成檢測中，相比於只有POH(第11圖)，TMZ-POH(第10圖)展現出明顯更強的效能。

實例9：在U251細胞、U251TR細胞、以及正常星狀細胞(astrocyte)上，TMZ-POH的體外細胞毒性研究

MTT細胞毒性檢測在以TMZ-POH共軛物處理細胞之後進行。MTT細胞毒性檢測如在Chen TC等人，《綠茶沒食子兒茶素和沒食子酸酯在正位的小鼠神經膠質母細胞瘤模型中帝盟多胺的治療療效》(Green tea epigallocatechin gallate enhances therapeutic efficacy of temozolomide inorthotopic mouse glioblastoma models)，Cancer Lett.2011年5月28日；302(2)：100-8，中所描述般地執行。第12圖顯示在TMZ敏感細胞(U251)、TMZ抗性細胞(U251TR)和正常星狀細胞上進行MTT細胞毒性檢測的結果。TMZ-POH展示出針對TMZ敏感U251細胞和TMZ抗性U251細胞兩者的細胞毒性，但無對正常星狀細胞的細胞毒性。

實例10：在BEC、TuBEC、以及正常星狀細胞上的TMZ-POH的體外細胞毒性研究

MTT細胞毒性檢測在以TMZ-POH共軛物處理細胞之後進行。MTT細胞毒性檢測如在Chen TC等人，Greentea epigallocatechin gallate enhances therapeutic efficacy of temozolomide inorthotopic mouse glioblastoma models.Cancer Lett.2011年五月28日；302(2)：100-8，中所描述般地執行。第13圖顯示 在正常星狀細胞、腦內皮細胞(brain endothelial cells，BEC；融合的與次融合的(subconfluent))、以及腫瘤腦內皮細胞(TuBEC)上進行的MTT細胞毒性檢測的結果。TMZ-POH於正常星狀細胞、融合的BEC、或TuBEC上未誘導顯著的細胞毒性。在高濃度的TMZ-POH下，在次融合的BEC中展現輕度到中度的細胞毒性。

實例11：TMZ以及TMZ-POH在USC-04神經膠瘤癌幹細胞上的體外細胞毒性研究

MTT細胞毒性檢測在以僅TMZ、僅POH、或TMZ-POH共軛物處理細胞之後執行。MTT細胞毒性檢測如在Chen TC等人，Green tea epigallocatechin gallate enhances therapeutic efficacy of temozolomide inorthotopic mouse glioblastoma models.Cancer Lett.2011年五月28日；302(2)：100-8，中所描述般地執行。第14圖顯示在USC-04神經膠瘤癌幹細胞(glioma cancer stem cells)上執行的MTT細胞毒性檢測的結果。在濃度增加下(0-400μM)，TMZ未誘導顯著的細胞毒性。TMZ-POH以在150μM之IC50展現細胞毒性的證據。第15圖顯示以POH處理的USC-04神經膠瘤癌幹細胞上執行的MTT細胞毒性檢測的結果。POH演示在濃度增加下(0-2mM)，在USC-04上的細胞毒性。

實例12：TMZ和TMZ-POH於USC-02神經膠瘤癌幹細胞上的體外細胞毒性研究

MTT細胞毒性檢測在以僅TMZ、僅POH、或TMZ-POH共軛物處理細胞之後執行。MTT細胞毒性檢測如在Chen TC等人，Green tea epigallocatechin gallate enhances therapeutic efficacy of temozolomide inorthotopic mouse glioblastoma models.Cancer Lett.2011年5月28日；302(2)：100-8，中所描述般地執行。第16圖顯示在USC-02神經膠瘤癌幹細胞上執行的MTT細胞毒性檢測的結果。在濃度增加下(0-400μM)，TMZ未誘導顯著的細胞毒性。TMZ-POH以在60μM之IC50展現細胞毒性的證據。第17圖顯示在以POH處理的USC-02神 經膠瘤癌幹細胞上執行的MTT細胞毒性檢測的結果。POH在濃度增加的情況下(0-2mM)展示出在USC-02上的細胞毒性。

實例13：在TMZ敏感神經膠瘤細胞和TMZ抗性神經膠瘤細胞上，透過TMZ-POH的體外ER應力研究

西方墨點轉漬法(Western blot)在TMZ敏感神經膠瘤細胞和TMZ抗性神經膠瘤細胞以TMZ-POH共軛物處理18小時之後執行。第18圖顯示展示TMZ-POH在TMZ敏感U251神經膠瘤細胞和TMZ抗性U251神經膠瘤細胞中誘導ER應力(ERS)的西方墨點轉漬。在低至60μM的TMZ-POH濃度下，顯示出促凋亡蛋白(proapoptotic protein)CHOP的活化。

實例14：TMZ-POH在特定乳癌細胞上的體外和體內研究藥劑

TMZ得自於南加州大學(University of Southern California，USC)的藥局，並溶解於乙醇至50mM的濃度。TMZ-POH，其在本實例中也被稱為T-P，由NeOnc Technologies Inc.公司提供且以100mM溶解於DMSO中。紫蘇醇(POH)以及O6-苄基鳥嘌呤(O6-BG)從西格瑪奧瑞奇公司(Sigma-Aldrich)(聖路易，密蘇里州(St.Louis,MO))購得，且以DMSO稀釋以形成100mM的儲備溶液。DMSO係來自西格瑪奧瑞奇公司。在細胞處理的所有情況下，在培養基中的最終DMSO濃度絕不超過0.5%。所有藥物的儲備溶液貯藏在-20℃。

細胞株

除了由Dr.Michael Press.提供之HCC-1937以外，人類癌細胞株得自美國組織培養庫(American Tissue Culture Collection,ATCC；馬納薩斯，維吉尼亞州(Manassas,VA))。細胞在潮濕的培養箱中於37℃和5%CO₂空氣下，在添加10%胎牛血清、2mmol/L麩醯胺酸、100U/mL青黴素、以及0.1mg/mL鏈黴素之DMEM(由USC諾里斯綜合癌症中心(USC/Norris Comprehensive Cancer Center) 的細胞培養核心實驗室所提供，且其係以來自Cellgro/MediaTech公司，馬納薩斯，維吉尼亞州的原始材料製備)中繁殖。

群落形成檢測

根據細胞株(以及塗盤效率(plating efficiency))，將200-350個細胞接種在6孔盤的每個孔中。細胞完全依附到培養基的表面之後，他們被暴露於藥物處理(或僅DMSO溶劑)，高達48小時之多種時間。之後，移除藥物，添加新鮮的生長培養基，且細胞被保持在培養基中不受干擾12-16天，期間存活的細胞孳生後代的群落。群落(定義為>50個細胞的群體)以1%亞甲藍(methylene blue)(於甲醇中)染色4小時來可視化，且接著被計數。

在O6-BG處理的情況中，在添加TMZ或TMZ-POH之前，細胞以10μM O6-BG預處理一小時。24小時之後，添加另外10μM的O6-BG至培養基中。再24小時之後，移除滲入藥物的培養基(drug-laced medium)，且添加新鮮的無藥物的培養基。之後，細胞維持不受干擾直到以亞甲藍染色。

穩定轉染作用(Stable transfections)

根據製造商的指示，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州(Carlsbad，CA))將MDA-MB-231細胞共轉染進6孔盤中。2μg的pSV2MGMT(含有人類MGMT cDNA)與0.2μg pSV2neo(含有用於細胞在G418中的篩選之新黴素基因)結合。兩者質體皆由Bernd Kaina博士(美因茨，德國(Mainz,Germany))所提供。轉染的細胞的個體轉殖株被挑選進含有750μg/mL的G418的培養基中且培植於250μg/mL的G418中。G418以來自西格瑪奧瑞奇的G418二硫酸鹽獲得且以75mg/mL溶解於PBS中。篩選培養基在實驗藥物處理的幾天之前從細胞移除。

免疫印漬(Immunoblots)

所有細胞溶解產物(lysate)以如描述於P.Pyrko等人，《藉由塞來昔布和其非環氧合酶-2-抑制類似物，二甲基塞來昔布(DMC)，在體內和體外的腫瘤細胞中的生存表現量的下調以及細胞凋亡的伴隨物質誘導》(Downregulation of survivin expression and concomitant induction of apoptosis by celecoxib and its non-cyclooxygenase-2-inhibitory analog,dimethyl-celecoxib(DMC),in tumor cells in vitro and in vivo)，Mol Cancer 5(2006年)19，中之西方墨點轉漬法來分析。一級抗體購自Cell Signaling Technology公司(比佛利，麻薩諸塞州(Beverly,MA))或是Santa Cruz Biotechnology,Inc.公司(聖塔克魯茲，加利福尼亞州(Santa Cruz,CA))，且根據製造商的指示來使用。所有的免疫印漬被重複至少一次以證實結果。

體內模型(In vivo model)

所有動物流程由南加州大學的實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)所批准，且對動物進行實驗期間遵守所有規章和規則。無胸腺(athymic)小鼠(Harlan,Inc.公司，印第安納波利斯，印第安那州(Indianapolis,IN))被顱內植入2x10⁵個細胞。使用稱為D3H2LN之MDA-MB-231細胞的亞株(subline)，其與螢火蟲螢光素酶基因一起被轉染且已經被選定以在體內針對積極性生長和轉移。在顱內移植十天之後，透過非侵入式全身生物發光成像(bioluminescent imaging)來確認在所有動物內已產生有效的腫瘤。為了此目的，小鼠被靜脈內注射50mg/kg螢蟲素(D-Luciferin)(珀金埃爾莫公司，沃爾瑟姆，麻薩諸塞州(Perkin Elmer,Waltham,MA))，且使用Xenogen IVIS-200成像系統(Caliper/珀金埃爾莫公司)來成像。圖像藉由使用Living Image套裝軟體(Caliper/珀金埃爾莫公司)的感興趣區域(region-of-interest，ROI)分析法來分析，以定量光輸出(輻射率，即，每球面度(steradian)每平方厘米每秒的光子數)。

動物被區分成三組以使得一開始每個組含有在ROI之內(即，頭部的區域)有著可相比的輻射率及藥物處理之動物。第一組為控制組，其透過皮下注射僅接受溶媒(45%甘油、45%乙醇、10%DMSO)。第二組為實驗組，其透過皮下(s.c.)注射接受25mg/kg的TMZ-POH。第三組為對照組且動物透過胃管灌食法(gavage)接受25mg/kg的TMZ。治療每天一次，歷時10天(即，總共10次處理)。之後，所有存活的動物再度攝像，每周一次。

統計學分析(Statistical analysis)

使用Student的t檢定(Student t-test)分析所有參數數據以計算顯著值；機率值(probability value)(p)<0.05被認為係統計上顯著的。

結果(Results)

TMZ-POH的細胞毒性效能藉由群落形成檢測(CFA)在多種人類乳癌細胞株中分析且與TMZ的細胞毒性進行比較。本發明人使用雌激素受體陽性細胞MCF7以及T47D；三重陰性細胞株(triple-negative lines)：MDA-MB-231、MDA-MB-468、以及HCC-1937；以及231細胞株的腦求(brain-seeking)變異型：MDA-MB-231-br。如第19圖中所顯示的，低微莫耳濃度的TMZ-POH在所有六個細胞株中防止群落形成，且所有情況下TMZ-POH的效能明顯強於TMZ的效能。

先前的研究顯示POH能夠在癌細胞中行使細胞毒性效果，雖然濃度需要達到毫莫耳的範圍。如此，本發明人測試是否簡單地混和兩個化合物TMZ和POH即可模仿TMZ-POH共軛物的效果。MDA-MB-231細胞僅以個別的化合物(TMZ-POH、TMZ或POH)來處理，或以等莫耳的TMZ加上POH的混合來處理，且細胞存活率以CFA來分析。如第20A圖和第20B圖所顯示的，TMZ-POH比TMZ加上POH的混合有更多的效能，即，混合TMZ與POH不能夠達到TMZ-POH的強細胞毒性效能，且事實上，添加莫耳濃度的POH至TMZ並未增加超過僅TMZ的效能。舉例來說，10μM的TMZ降低群落形成大約50%，且10μM的TMZ與10μM 的POH的組合也造成50%的減少；比較起來，10μM的TMZ-POH造成少於大約95%群落(第20A圖)。與先前研究一致，POH本身需要100μM以上的濃度以變成具細胞毒性，且其在MDA-MB-231細胞中的IC50是大約700μM(第20A圖)。

第20B圖顯示個別的CFA的代表性實例。其說明10μM的TMZ-POH阻斷群落形成明顯比TMZ更有效能，且不論對TMZ或TMZ-POH添加等莫耳濃度的POH皆無法再進一步增強細胞毒性。總的而言，上述結果顯示TMZ-POH具有超過TMZ的增加的效能，其不能以僅僅混合其個別的部分，TMZ和POH來匹敵。

因為已知DNA修復蛋白MGMT在對TMZ的細胞抗性中扮演關鍵角色，本發明人探討其是否影響TMZ-POH的細胞毒性效能。本發明人首先測定在上述所使用的六個乳癌細胞株中的該蛋白基底表現量。第21A圖顯示當由西方墨點轉漬分析測定時，三個細胞株(MDA-MB-468、HCC-1937、MCF7)為強烈的陽性，然而其他(T47D、MDA-MB-231、MDA-MB-231-br)具有未偵測到量的MGMT蛋白。為了對照的目的，本發明人也評估三個常用的GBM細胞株中已知為MGMT陰性((U251、LN229)和陽性(T98G)的MGMT蛋白表現量。這個並列的評估顯示MGMT蛋白表現量在陽性的乳癌細胞株中相似於在T98G腦癌細胞株中發現的表現量。

與TMZ相比，MGMT表現支持TMZ-POH的細胞毒性效能。如在表2中總結的，於所有三個MGMT-陽性的乳癌細胞株中，TMZ-POH的IC50(即，降低群落形成達50%的所需濃度)明顯地較高。然在MGMT-陰性細胞株中IC50範圍係從1.2至4.6μM，其在三個MGMT-陽性細胞株中增加到31至33μM。然而，這些IC50值仍明顯低於每個細胞株的TMZ的相應的IC50。還值得一提的是，TMZ-POH和TMZ之間的差(在效能增加的倍數)顯示在表2：當與TMZ相比，TMZ-POH細胞毒性效能的倍數增加，相比於MGMT-陰性細胞株(3.2至4.3-倍)， 於每個MGMT-細胞株中(6.3到15.5-倍)一致為較大的。此後者之發現表示TMZ-POH的增加效能超過TMZ，雖然在所有分析的細胞株中係顯而易見，可能變成在MGMT陽性細胞的治療目標之背景中是特別有利的。

以TMZ設置的主要細胞毒性DNA病灶是O6-鳥嘌呤的甲基化，且公知的是被MGMT對此甲基團的移除導致DNA修復蛋白的快速降解。以及，偽受質O6-BG也活化MGMT的自殺機制，其在第21C圖中被證實，其顯示利用O6-BG的細胞治療強烈地降低MGMT蛋白表現量。利用TMZ的細胞治療也下調MGMT表現量，但該效果相當地弱，且需要高濃度的藥物。相比之下，TMZ-POH較TMZ更強效地影響MGMT表現量；舉例來說，當50μM的TMZ不具效果時，50μM的TMZ-POH造成顯著的降低(第21C圖)。總結，這些結果表明了TMZ-POH優於TMZ的優異效能可涉及O6-鳥嘌呤標的之更大規模甲基化。

然而表示TMZ-POH的作用的機制的上述結果可能係由於設置細胞毒性的DNA病灶的藥物的加成效果，也有可能是共價地共軛的POH可能對新分子具有額外授予的機制特徵。執行額外的實驗以鑑明被TMZ-POH所造成的DNA損害的顯著性，且特別是O6-鳥嘌呤甲基化。

雖然在表2總結的實驗展現MGMT陽性與減少的TMZ-POH毒性的相關性，它們並沒有建立因果關係。為了探討後者，本發明人穩定地轉染MGMT陰性的MDA-MB-231細胞與MGMT cDNA，並且分離個別的轉殖株。第22A圖顯示在轉染細胞的兩個不同的轉殖株(231-MGMT-1與231-MGMT-2)中，提高的MGMT蛋白表現量。兩轉殖株皆以增加濃度的TMZ-POH和TMZ處理，且以CFA分析。如在第22B圖和表3中所顯示的，當與親代細胞比較時，細胞對藥物處理的抗性在TMZ-POH和TMZ兩者明顯地增加。然而奇妙地，相似於在表2中所提到的，對TMZ-POH的抗性的增加少於對TMZ的抗性(總結在表3)。

CFA也與MGMT抑制物O6-BG的添加一起執行。在TMZ-POH或TMZ的添加之前，細胞以O6-BG預處理60分鐘。如在第23A圖中所顯示的，O6-BG在藥物處理過的MDA-MB-231細胞的存活率上無效果，與其不提供O6-BG標的的MGMT-陰性狀態一致。相比之下，O6-BG大幅增強在231-MGMT-1細胞(第23B圖)以及231-MGMT-2細胞(未顯示)中，TMZ-POH和TMZ的毒性。相似地，O6-BG也增加在MGMT-陽性MDA-MB-468細胞(第23C圖)以及MCF7細胞(未顯示)中TMZ-POH與TMZ處理的細胞毒性結果。總結，這些結果指明TMZ-POH所造成的細胞死亡的關鍵觸發物是O6-鳥嘌呤的甲基化，比起TMZ其似乎藉由TMZ-POH更有效率地達成。

上述結論也由研究H2AX蛋白來進一步證實。H2AX的磷酸化，記為γ-H2AX，是用於在DNA中雙股斷裂的標記物。以TMZ-POH處理歷時72小時的時間進程的MDA-MB-231細胞展現了明顯增加的γ-H2AX表現量(第24A圖)，且此TMZ-POH的效果相比於TMZ更強(第24B圖)。並且，僅組合TMZ與POH是無法模仿共軛的TMZ-POH所造成的γ-H2AX的強烈誘導(第24C圖)，此與顯示在第20A圖和第20B圖中的CFA結果一致，且注意的是，TMZ-POH是表示和TMZ加上POH的混合完全不同的化學物。

與施加至MDA-MB-231細胞相同濃度的TMZ-POH也被添加至MGMT-陽性MCF-7細胞中。然而，在此情況下，沒有增加的H2AX的磷酸化，與MGMT快速修復O6-甲基-鳥嘌呤病灶的已建立的模型一致；然而，當這些細胞以O6-BG預處理時，γ-H2AX的增加的表現量變得顯而易見(第24D圖)。總結來說，上述結果表明TMZ-POH作為烷化劑具有相似於TMZ的細胞毒性機制，但以效能來說，是大幅地優於原本的化合物。

已知在大量細胞死亡開始出現之前，在體外以TMZ的生理濃度(<100μM)處理的GBM細胞可存活數天(5-7天)似乎不受影響。當以TMZ-POH處理乳癌細胞株時，本發明人觀察到相似的表現，即，細胞培養基在開始藥物處理之後僅開始惡化大約一周。為了更詳細地鑑別TMZ-POH-誘導的細胞死亡，本發明人以15μM的藥物處理MDA-MB-231細胞且每日收集細胞溶解產物，歷時6天的期間。溶解產物藉由西方墨點轉漬法來分析兩個細胞凋亡標記物：裂解的(即，活化的)凋亡蛋白酶(caspase)7以及裂解的PARP-1(聚-ADP-核糖聚合酶-1)(poly ADP-ribose polymerase-1)，與DNA損害標記物γ-H2AX。如上述，TMZ-POH處理導致斷然的γ-H2AX表現量的增加，其除了在第三天時無法解釋的陷落以外，隨著時間持續的增加(第25A圖)。活化的凋亡蛋白酶7和裂解的PARP兩者在第三天時開始增加，且提升維持好幾天直到第六天(第25A圖)，其大約正 是當被處理的細胞的顯微鏡檢查顯現出單細胞層(monolayer)的降解增加的時候。這些結果表明TMZ-POH-誘導的細胞死亡，相似於已經報導的TMZ的生理濃度，是一個緩慢的過程且涉及到細胞凋亡機制。

如以上在第20A圖至第20B圖所示，TMZ+POH的等莫耳組合在阻斷群落存活中無法達到與TMZ-POH共軛物相同的效能。已經建立TMZ-POH在DNA損害上以及其細胞凋亡活性的影響，本發明人接著測定是否TMZ-POH的優異效果也能夠反應在這些標記物蛋白的分子層次上。本發明人以相同濃度(20μM)的TMZ-POH、TMZ、POH、或與POH結合的TMZ(TMZ+POH)來處理細胞，且分析γ-H2AX、活化的凋亡蛋白酶7、以及裂解的PAPR的誘導作用。如在第25B圖所示，五天的之處理後所有三個指標蛋白皆被TMZ-POH相當明顯地誘導，然而在這些量測中TMZ或TMZ+POH明顯地發揮較弱的效果，且單單POH是無活性的。如此，來自細胞存活檢測的結果(第20A圖至第20B圖)與在DNA損害和細胞凋亡標記物上的這些化合物的效果(第25B圖)有密切關聯，且在所有情況中，TMZ-POH明確地產生最強的抗癌效果。

TMZ是前體藥物，且公知的是其活化作用自發地發生在37℃水性溶液內(即，針對此轉化作用不需要細胞作用)。以及，前體藥物和活化的產物兩者的半衰期相當短，其中所有的細胞毒性觸發物落在處理的首幾小時之內。為了評估TMZ-POH和TMZ在其的半衰期上是否有所不同，本發明人測定在細胞培養基中藥物展現出多快，以及多久的細胞毒性活性。首先，本發明人將細胞暴露在可變地短時間的藥物處理，洗掉藥物，接著持續保持細胞在沒有藥物的培養基中以測定存活率和群落形成能力。針對大部分的這些實驗，本發明人使用15μM TMZ-POH和30μM TMZ，因為這些濃度在>90%細胞毒性範圍中是大致等效(當以CFA測量以及24小時的藥物暴露時間)。

如顯示在第26A圖中(右邊兩條長條)，當藥物維持在培養基中24小時，細胞對15μM TMZ-POH或對30μM TMZ的暴露分別導致大約3%以及8%的群落存活。然而，儘管TMZ-POH在24小時的期間內展開些微更多效能，當細胞暴露更短時間區間時，TMZ展示明顯更強的療效。如第26A圖中所示，對TMZ一個小時的暴露降低群落形成>50%，然而在相同的時間區間內，TMZ-POH降低僅20%；相似地，對TMZ兩個小時的暴露具有比對TMZ-POH多於兩倍的細胞毒性效果(23%存活率比上51%存活率)。如此，TMZ比TMZ-POH作用更快速，其只需要4個小時以到達最大的毒性，然而TMZ-POH在此時間點還沒達到其最大的影響。

本發明人接下來修正此實驗如下。在細胞已經被暴露顯示在第26A圖所示的特定時間的藥物處理下後，本發明人將含有藥物的培養基從細胞移除，且轉移此上清液到新鮮的細胞，其接著暴露24小時。如在第26B圖中所示(右邊兩條長條)，當上清液在先前24小時的培養之後轉移時，不保留細胞毒性活性，即，接受細胞的群落形成能力沒有降低。相比之下，當上清液在先前一小時培養之後轉移時，接受細胞的群落形成能力在接受含有TMZ上清液的細胞中為48%，以及含有TMZ-POH上清液的細胞中為22%。甚至更驚人的是，當轉移後4小時，含有TMZ的上清液已經失去其所有的活性，然而含有TMZ-POH的上清液仍含有近乎其細胞毒性活性的50%(第26B圖)。總結，這些結果演示TNZ-POH維持其細胞毒性效能實質上較TMZ久。

為了排除細胞酵素在TMZ-POH的周轉中的參與，本發明人將TMZ-POH(以及TMZ)在37℃之磷酸鹽緩衝鹽水中培養一個小時(在不存在細胞的情況下)。在此預培養之後，TMZ-POH和TMZ加入細胞24小時，並藉由CFA測定存活率。作為控制組，兩種藥物皆以無在水性溶液中預培養地加入細胞。代表性的CFA顯示在第26C圖中，在其中中間分圖證實兩種藥物皆以大約等效能 濃度使用；即，當直接添加至細胞中時，其降低存活率~95%。然而，在水性溶液中預培養僅一個小時搶占TMZ的細胞毒性效能的50%，但對TMZ-POH的細胞毒性效能則要少得多(剩餘80%；參考右邊分圖)。這些結果確立TMZ-POH比TMZ要更穩定，表示其超過TMZ的增加效能可能是由於較長的半衰期，其可提供擴展造成細胞毒性DNA損害的機會。

本發明人也調查是否TMZ-POH也能夠在體內達到其抗癌效果，以及是否其能夠於表現乳癌細胞蔓延至腦的小鼠腫瘤模型中也達到其抗癌效果。本發明人使用D3H2LN細胞，其為在小鼠內的MDA-MB-231細胞株之有著主動腫瘤生長的生物發光變異型。這些細胞被移植到裸鼠的腦中，且10天之後所有動物為了螢光素酶表現被攝像，以證實產生有效的腫瘤。

動物被區分為三組且每日一次以僅溶媒(控制組)、25mg/kg的TMZ-POH、或25mg/kg的TMZ來治療10天。在這次10天處理期間之後，另一個全身攝像顯示(第27A圖)僅以溶媒治療的所有動物展現更多增加的生物發光輻射率(劇烈顱內腫瘤生長的指示)，一些則明顯地沿著脊柱蔓延。這些動物的大多數也展現神經障礙的行為跡象，且降低體重，其必須是要被安樂死的。與之形成鮮明對比，在TMZ-POH治療組中的所有動物看似茁壯成長，且它們的攝像分析顯示在輻射率中只有小幅變化(第27A圖)。相比之下，所有在TMZ治療組中的所有動物清楚地顯示隨著時間增加的生物發光，指明在整個10天治療期間內腫瘤生長都持續著，並且在某些動物中已經開始包括到脊柱。整體而言，TMZ治療組看似在某種程度上已經表現出比溶媒治療組更佳，但明顯地比以TMZ-POH治療的動物要差。

在缺乏任何進一步藥物治療下照護且觀察所有的動物。如總結在第27B圖的，溶媒治療的動物在第20天是瀕死的且在接下來的四天之內被安樂死(存活率中位數：22天)。TMZ治療的動物在某種程度上存活較久(存活率中位數： 28天)。卓越地，到第36天，當所有TMZ治療的動物已經損滅於疾病，所有TMZ-POH治療的動物仍活著且沒有明顯的痛苦跡象。TMZ-POH治療的動物的存活率中位數大到50天，即，牠們在治療的終止之後還多存活了30天，相比於TMZ治療的動物，其在治療之後僅多存活了8天。總結，這些結果演示TMZ-POH在體外和體內的有力抗癌效果被認為更強於TMZ的抗癌效果。

討論

在10年前完成的第三期試驗里程碑，建立當被加到新診斷神經膠質母細胞瘤的放射線治療(可能的時候加上外科手術)時，烷化劑帝盟多胺顯著的存活率效益。R.Stupp等人，《用於神經膠質母細胞瘤的放射治療加上伴隨物質與佐劑帝盟多胺》(Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma)N Engl J Med 352(2005年)987-996。TMZ延長存活率中位數從12.1到14.6個月，且增加5倍的5年的整體存活率，從1.9%到9.8%。R.Stupp等人，《在隨機化的第三期研究中，放射線治療與伴發物質和佐劑帝盟多胺對上僅放射線治療在存活率上的效果：EORTC-NCIC試驗的5年期分析》(Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study：5-year analysis of the EORTC-NCIC trial)，Lancet Oncol 10(2009年)459-466。總結，這些正向的結果已經鞏固TMZ加上放射線治療作為照護有著GBM的大多數病患的目前標準。如可預期的，也評估這個方式針對抵抗繼發於肺、乳、以及其他顱外位置的原發性腫瘤的顱內轉移癌之活性。然而，幾個在重度預治療病患中的第二期試驗的結果不夠優秀到足以建立這個(給藥)方案作為從像是乳癌的癌症轉移的蔓延到腦的實例的照護標準。本發明人因而欲創造有著抗腦轉移癌的優異活性的TMZ新穎類似物。

在過去，包括TMZ的抗腫瘤的咪唑四嗪(imidazotetrazine)廣泛的分子模型研究，顯示一開始活化的開環反應，其涉及在四嗪環的C-4的親核加成，並不是由在C-8的龐大基團所影響的。J.Arrowsmith，S.A.Jennings，A.S.Clark，M.F.Steven，《抗腫瘤咪唑四嗪，41。抗腫瘤劑米托唑胺和帝盟多胺的共軛作用對胜肽和攜有DNA大溝和小溝結合結構模體的lexitropsins》(Antitumor imidazotetrazines,41.Conjugation of the antitumor agents mitozolomide and temozolomide to peptides and lexitropsins bearing DNA major and minor groove-binding structural motifs)，J Med Chem 45(2002年)5458-5470；A.S.Clark等人，《抗腫瘤咪唑四嗪，32。新穎咪唑四嗪和相關的雙環異環的合成以探針抗腫瘤藥物帝盟多胺的作用的模式》(Antitumor imidazotetrazines.32.Synthesis of novel imidazotetrazinones and related bicyclic heterocycles to probe the mode of action of the antitumor drug temozolomide)，J Med Chem 38(1995年)1493-1504；E.Lunt等人，《抗腫瘤咪唑四嗪，14。6-和8-取代的咪唑[5,1-d]-1,2,3,5-四嗪和8-取代的咪唑[5,1-d]-1,2,3,5-四嗪》(Antitumor imidazotetrazines.14.Synthesis and antitumor activity of 6-and 8-substituted imidazo[5,1-d]-1,2,3,5-tetrazinones and 8-substituted pyrazolo[5,1-d]-1,2,3,5-tetrazinones)，J Med Chem 30(1987年)357-366。因此，不考慮在C-8共軛的標的基團的性質，在活化作用過程中的最後步驟釋放出甲基化在DNA中親核位置的親電子的甲基重氮(methyldiazonium)離子。基於這些早期的結構和生物活性研究，本發明人預期TMZ-POH將維持反應性甲基重氮的釋放，且因而TMZ-POH的細胞毒性活性將涉及DNA甲基化作用，相似於其親代分子TMZ。

本發明的數據與上述機制模型一致。在此情況下，本發明人顯示MGMT的存在，其高度特異性地修復O6-甲基鳥嘌呤且提供對抗TMZ強大的保護，最小化TMZ-POH造成的DNA損害(第24D圖)，並且增加對此藥劑的細胞抗 性(第22B圖)。反過來說，O6-BG(MGMT的特異性抑制物)的存在，實質上增加由TMZ-POH引起的DNA損害(第24D圖)並且只在MGMT-陽性的細胞中增加此藥劑的細胞毒性效能(第23A圖至第23C圖)。並且，細胞的TMZ-POH處理導致在MGMT蛋白表現量的下降(第21C圖)，其在TMZ的情況中是完整確立的效果，由於DNA修復的酵素的「自殺」機制的作用，因而來自O6-甲基鳥嘌呤的烷基的接受導致該蛋白的快速降解。

然而本發明人的數據確立由TMZ-POH的DNA烷化為關鍵機制，藉此該藥劑達到它自身的細胞毒性效果，本發明人不能排除其POH部分可貢獻額外的功能的可能性。已知POH會影響幾種細胞內(反應)過程。舉例來說，其顯示抑制端粒酶和鈉鉀幫浦(Na+/K+-ATP酶)的活性[52；53]。以及，其被描述成如造成ras癌蛋白活性的封阻的法尼基轉移酶抑制物，(I.R.等人，《藉由薴烯的代謝作用的蛋白聚異戊二烯化的抑制作用》(Inhibition of protein prenylation by metabolites of limonene)，Biochem Pharmacol 57(1999年)801-809；P.L.Crowell等人，《藉由抗致癌物d-薴烯和其代謝產物引起的21-26-kDa蛋白的異聚異戊二烯化的選擇抑制作用》(Selective inhibition of isoprenylation of 21-26-kDa proteins by the anticarcinogen d-limonene and its metabolites)，J Biol Chem 266(1991年)17679-17685)，雖然此件事曾被質疑(J.Karlson等人，《藉由在體內單萜的腫瘤細胞生長的抑制作用：作用的Ras依賴性機制的證據》(Inhibition of tumor cell growth by monoterpenes in vitro：evidence of a Ras-independent mechanism of action)Anticancer Drugs 7(1996年)422-429；R.J.Ruch等人，《藉由單萜對大鼠肝臟上皮腫瘤細胞的生長抑制作用不涉及Ras細胞膜關聯》(Growth inhibition of rat liver epithelial tumor cells by monoterpenes does not involve Ras plasma membrane association)，Carcinogenesis 15(1994年)787-789.)。重要的是，所有這些情況中，為達到標的活性的50%抑制作用，需要相對地高濃度的POH(大超過100μM)(請參 閱第20A圖)。相比之下，在MGMT-陰性的細胞中，TMZ-POH於1-5μM的範圍內是有活性的(表2)。也注意到的是，當POH與TMZ混合並作為獨立藥劑施加時，此組合無法複製共軛的TMZ-POH的高效能(第20A圖至第20B圖、第24C圖、第25B圖)，指明僅僅存在非共軛的POH是無法提供超過TMZ的額外效能。這些認知，與TMZ-POH對MGMT和O6-BG的顯著敏感性結合，如上所述，減少了涉及除了DNA損害之外功能的可能性。

若POH的共軛作用確實不提供超出僅有TMZ的促凋亡機制，為什麼TMZ-POH明顯比TMZ更有效能？被明確建立的是TMZ(以及其活化的降解產物)在體外和體內以1-2小時的範圍中的半衰期，展現快速的周轉。與這些特徵一致，本發明人發現在培養基中培養4小時之後，已經消耗了近乎百分之百的TMZ的細胞毒性活性(第26A圖至第26C圖)。在相比之下，TMZ-POH展現明顯較長的存活，其在4小時之後大約50%還保存活性(第26A圖至第26C圖)。如此，雖然不希望被任何特定的理論束縛，本發明人提出TMZ-POH的延長存在可提供較強的機會以設置(set)DNA病灶，導致增加的細胞毒性。

然而TMZ-POH的延長半衰期可足以解釋其在體外的較強效能，其仍然需要被確立是否在本發明人的腦轉移模型中，TMZ-POH也貢獻在其實質上的體內效能的增加(第27A圖至第27B圖)。因為TMZ-POH的脂親和性增加超過TMZ的(數據未顯示)，TMZ-POH比TMZ可更有效率地跨越BBB也是有可能的。在TMZ的情況下，已知在腦脊髓液中(cerebrospinal fluid，CSF)達到的藥物量比起在全身性循環，即，血漿，中的藥物量要低80%。因此可想像的是TMZ，儘管其確立治療效益，若可達成僅較高的顱內濃度的話，將發揮更強的活性。在此方面，TMZ-POH可為達到此現象的載體。

滿有趣的是TMZ在本發明人的顱內體內模型中僅展現次佳的活性(第27A圖至第27B圖)。本發明人所使用的乳癌細胞株，MDA-MB-231的變異 型，的確展現對TMZ敏銳的體外敏感性(IC50<10μM)，且因而對TMZ比起大部分在文獻中報導，且排除本發明人平行分析的幾個GBM細胞株(數據未顯示)之MGMT-陰性GBM細胞株還更敏感。此外，所使用的TMZ劑量(25mg/kg)是良好地落在顯示以在GBM小鼠模型中發揮效能活性的劑量的範圍之內，在其中即使5mg/kg也具有顯著的活性。T.C.Chen等人，《綠茶沒食子兒茶素和沒食子酸酯在正位的小鼠神經膠質母細胞瘤模型中帝盟多胺的治療療效》(Green tea epigallocatechin gallate enhances therapeutic efficacy of temozolomide in orthotopic mouse glioblastoma models)，Cancer Lett 302(2011年)100-108。本發明人因而推測此三重陰性231細胞株可能帶有抗TMZ的內生性機制，其只在體內環境下浮現，且可能是當有著腦轉移癌的乳癌病患被以TMZ治療時，被注意到的不起眼回應的反思。雖然本推測在此時仍是假說，明顯的是從本發明人的研究中，本於發明人的顱內腫瘤模型中，TMZ-POH提供比起TMZ遠遠優異的治療效益(第27A圖至第27B圖)，其可用於臨床設置的吉兆。

本發明的範疇不受上文中具體顯示和描述的內容所限制。所屬領域具有通常知識者將體認的是對材料、構造、結構和尺寸的描述實例存在有合適的替代物。在本發明說明書中引用並討論了許多參考文獻，包括專利和各種出版品。提供這些參考文獻的引用和討論僅僅是為了闡明本發明的描述，並非承認任何參考文獻是本文所描述的發明的先前技術。所有在本說明書中引用和討論的參考文獻均藉由將其全部內容引用併入到本文中。所屬領域具有通常知識者將明白在本文中描述的內容的變異型、修飾及其他執行方式並不悖離本發明的精神和範疇。儘管已經顯示和描述了本發明的某些實施例，但對所屬領域具有通常知識者來說是顯而易見的是，可在不悖離本發明的精神和範疇的情況下進行變化和修飾。上述說明書和附圖中所列的事物係以說明的方式提供而不為限制性。

Claims (6)

1. 一種包含紫蘇醇(POH)共軛與帝盟多胺(TMZ)共軛的一化合物於製造治療哺乳類動物內癌症中源自乳癌的腦轉移癌之一藥物的用途。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物係為3-甲基4-氧代-3,4-二氫咪唑[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羰基-胺甲酸-4-異丙烯基環己-1烯-甲基酯(TMZ-POH)。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物是以吸入、鼻內、經口、靜脈內、皮下、或肌內給藥。
4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該化合物是使用從由鼻內吸入器、鼻內噴霧裝置、霧化器、噴霧器、計量劑量吸入器(MDI)、加壓計量吸入器、吸進器、單位計量容器、泵、滴管、鼻腔噴霧瓶、擠壓瓶以及雙方向裝置所組成的群組中挑選的一鼻腔遞送裝置鼻內給藥。
5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物是在放射線之前、放射線期間或放射線之後給藥。
6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物是與其他的化學治療劑一起給藥。