CN112469401A - 包含poh衍生物的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于治疗哺乳动物炎症的方法。该方法包括向哺乳动物递送治疗有效量的组合物,该组合物包含与亚油酸缀合的紫苏醇(POH)。
Description
发明领域
本发明涉及POH衍生物。本发明还涉及使用POH衍生物、例如POH氨基甲酸酯治疗癌症的方法。
发明背景
恶性神经胶质瘤是中枢神经系统(CNS)癌症的最常见形式,目前认为基本不能治愈。在多种恶性神经胶质瘤中,间变性星形细胞瘤(III级)和多形性胶质母细胞瘤(GBM;IV级)预后特别差,这是由于它们的侵略性生长和对当前可用治疗的抗性。恶性神经胶质瘤的现有标准治疗包括手术、电离辐射和化学治疗。尽管近来在医学上有了进展,但过去50年在恶性神经胶质瘤的预后上并未看到任何明显改善。Wen等人,Malignant gliomas inadults.New England J Med.359:492-507,2008。Stupp等人,Radiotherapy plusconcomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.New England J Med.352:987-996,2005。
肿瘤(包括恶性神经胶质瘤)对多种类型的化学治疗剂的不良响应通常是由于内在的耐药性所致。此外,最初响应良好的肿瘤获得的耐药性和不希望的副作用是经常阻碍使用化学治疗剂长期治疗的其它问题。因此,为了克服这些问题,已经制备了化学治疗剂的多种类似物。类似物包括新的治疗剂,其是至少两种现有治疗剂的杂合分子。例如,已将顺铂与具有细胞毒性共药的Pt-(II)络合物缀合,或与生物活性穿梭组分(例如卟啉、胆汁酸、激素或促进跨膜转运或细胞内药物聚集的调节剂)缀合。在一组人肿瘤细胞系上测试了用萜醇酯化的(6-氨基甲基烟酸酯)二氯铂(II)络合物。这些络合物中的萜基部分似乎具有跨膜穿梭功能,并且增加了这些缀合物被吸收到多种肿瘤细胞系中的速率和程度。Schobert等人,Monoterpenes as Drug Shuttles:Cytotoxic(6-minomethylnicotinate)dichloridoplatinum(II)Complexes with Potential To Overcome CisplatinResistance.J.Med.Chem.2007,50,1288-1293。
紫苏醇(POH)是一种天然存在的单萜,已表明它是对抗多种癌症包括CNS癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、黑素瘤和结肠癌的有效活性剂。Gould,M.Cancer chemoprevention andtherapy by monoterpenes.Environ Health Perspect.1997年6月,105(Suppl 4):977-979。制备了含有紫苏醇和类视黄醇的杂合分子,以提高诱导细胞凋亡的活性。Das等人,Design and synthesis of potential new apoptosis agents:hybrid compoundscontaining perillyl alcohol and new constrained retinoids.Tetrahedron Letters2010,51,1462-1466。
仍然需要制备紫苏醇衍生物,包括与其它治疗剂缀合的紫苏醇,并且将这种材料用于治疗癌症,例如恶性神经胶质瘤以及其它脑障碍,例如帕金森病和阿尔茨海默病。紫苏醇衍生物可以单独施用,也可以与其它治疗方法(包括放射、标准化学治疗和手术)组合使用。施用也可以通过多种途径进行,包括鼻内、口服、用于肺递送的经口-气管和经皮。
发明概述
本发明提供了包含氨基甲酸紫苏酯的药物组合物。氨基甲酸紫苏酯可以是与治疗剂例如化学治疗剂缀合的紫苏醇。可用于本发明的化学治疗剂包括DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应激诱导剂、铂化合物、抗代谢物、酶抑制剂和受体拮抗剂。在某些实施方案中,治疗剂是二甲基塞来昔布(dimethyl celocoxib)(DMC)、替莫唑胺(temozolomide)(TMZ)或咯利普兰(rolipram)。氨基甲酸紫苏酯可以是4-(双-N,N’-4-异丙烯基环己-1-烯基甲氧基羰基[5-(2,5-二甲基苯基)-3-三氟甲基吡唑-1-基]苯磺酰胺,4-(3-环戊基氧基-4-甲氧基苯基)-2-氧代-吡咯烷-1-甲酸4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯和3-甲基4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羰基)-氨基甲酸-4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯。
本发明的药物组合物可以在放射之前、期间或之后施用。药物组合物可以在化学治疗剂的施用之前、期间或之后施用。药物组合物的施用途径包括吸入、鼻内、口服、静脉内、皮下或肌内施用。
本发明进一步提供了用于治疗哺乳动物疾病的方法,包括将治疗有效量的氨基甲酸紫苏酯递送至哺乳动物的步骤。该方法可以进一步包括用放射治疗哺乳动物的步骤,和/或进一步包括向哺乳动物递送化学治疗剂的步骤。所治疗的疾病可以是癌症,包括神经系统肿瘤,例如胶质母细胞瘤。氨基甲酸紫苏酯的施用途径包括吸入、鼻内、口服、静脉内、皮下或肌内施用。
本发明还提供了用于制备POH氨基甲酸酯的方法,包括使氯甲酸紫苏酯的第一反应物与第二反应物反应的步骤,所述第二反应物可以是二甲基塞来昔布(DMC)、替莫唑胺(TMZ)或咯利普兰。当第二反应物是二甲基塞来昔布时,该反应可以在丙酮和碳酸钾催化剂的存在下进行。当第二反应物是咯利普兰时,该反应可以在四氢呋喃和正丁基锂催化剂的存在下进行。氯甲酸紫苏酯也可以通过使紫苏醇与光气反应来制备。
本发明还提供了用于治疗哺乳动物炎症的方法,包括以下步骤:向哺乳动物递送治疗有效量的组合物,所述组合物包含与亚油酸缀合的紫苏醇(POH)。
附图简述
图1显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明二甲基塞来昔布(DMC)杀伤U87、A172和U251人神经胶质瘤细胞的功效。
图2显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明根据本发明POH-DMC缀合物杀伤U87、A172和U251人神经胶质瘤细胞的功效。
图3显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明替莫唑胺(TMZ)杀伤U87、A172和U251人神经胶质瘤细胞的功效。
图4显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明根据本发明POH-TMZ缀合物杀伤U87、A172和U251人神经胶质瘤细胞的功效。
图5显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明POH-咯利普兰缀合物和咯利普兰杀伤A172人神经胶质瘤细胞的功效。
图6显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明POH-咯利普兰缀合物和咯利普兰杀伤U87人神经胶质瘤细胞的功效。
图7显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明POH-咯利普兰缀合物和咯利普兰杀伤U251人神经胶质瘤细胞的功效。
图8显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明POH-咯利普兰缀合物和咯利普兰杀伤L229人神经胶质瘤细胞的功效。
图9显示丁酰基-POH在小鼠模型中抑制肿瘤生长。图9A显示用丁酰基-POH、具有纯度大于98.5%的纯化的(S)-紫苏醇(“纯化的POH”)、购自Sigma chemicals的POH(“Sigma”)或磷酸盐缓冲液(“PBS”;阴性对照)处理的裸鼠皮下U-87神经胶质瘤的图像。图9B显示了随时间的平均肿瘤生长(总时间期限为60天)。
图10显示集落形成测定(CFA)结果,其表明TMZ和TMZ-POH对TMZ敏感(U251)和TMZ抗性(U251TR)U251细胞的细胞毒性作用。
图11显示集落形成测定(CFA)结果,其表明POH对TMZ敏感(U251)和TMZ抗性(U251TR)U251细胞的细胞毒性作用。
图12显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明POH-TMZ缀合物杀伤U251细胞、U251TR细胞和正常星形胶质细胞的功效。
图13显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明POH-TMZ缀合物杀伤正常星形胶质细胞、脑内皮细胞(BEC;汇合和亚汇合)以及肿瘤脑内皮细胞(TuBEC)的功效。
图14显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明TMZ和POH-TMZ缀合物杀伤USC-04神经胶质瘤癌干细胞的功效。
图15显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明POH杀伤USC-04神经胶质瘤癌干细胞的功效。
图16显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明TMZ和POH-TMZ缀合物杀伤USC-02神经胶质瘤癌干细胞的功效。
图17显示MTT细胞毒性测定的结果,其表明POH杀伤USC-02神经胶质瘤癌干细胞的功效。
图18显示蛋白质印迹,其表明TMZ-POH在TMZ敏感性(“U251-TMZs”)和抗性(“U251-TMZr”)U251神经胶质瘤细胞中诱导ER应激(ERS)。
图19A是小鼠的一部分皮肤上接受asTPA应用7天并且还用甘油/乙醇媒介物处理的小鼠的照片。
图19B是小鼠的一部分皮肤上接受asTPA应用7天并且还用甘油/乙醇媒介物处理的另一个小鼠的照片。
图20A是小鼠的一部分皮肤上接受asTPA应用7天,并且还用在甘油/乙醇媒介物中的POH-亚油酸缀合物处理的小鼠的照片。
图20B是小鼠的一部分皮肤上接受asTPA应用7天,并且还用在甘油/乙醇媒介物中的POH-亚油酸缀合物处理的小鼠的照片。
发明详述
本发明提供了单萜或倍半萜的衍生物,例如紫苏醇衍生物。本发明还提供了药物组合物,其包含单萜或倍半萜的衍生物,例如紫苏醇衍生物。例如,紫苏醇衍生物可以为氨基甲酸紫苏酯。紫苏醇衍生物可以为与治疗剂例如化学治疗剂缀合的紫苏醇。可以将单萜(或倍半萜)衍生物配制成药物组合物,其中单萜(或倍半萜)衍生物的存在量范围为约0.01%(w/w)至约100%(w/w),约0.1%(w/w)至约80%(w/w),约1%(w/w)至约70%(w/w),约10%(w/w)至约60%(w/w),或约0.1%(w/w)至约20%(w/w)。本发明组合物可以单独施用,或者可以与放射或其它活性剂(例如化学治疗剂)共同施用,以治疗疾病,例如癌症。治疗可以是依次进行的,在施用其它活性剂之前或之后施用单萜(或倍半萜)衍生物。例如,氨基甲酸紫苏酯可用于使癌症患者对放射或化学治疗敏感。可选择的是,可以同时施用活性剂。施用途径可以不同,并且可以包括吸入、鼻内、口服、透皮、静脉内、皮下或肌内注射。本发明还提供了治疗疾病例如癌症的方法,包括将治疗有效量的单萜(或倍半萜)衍生物递送至患者的步骤。
本发明组合物可以包含一种或多种类型的单萜(或倍半萜)衍生物。单萜包括由两个异戊二烯单元组成的萜。单萜可以为线性的(无环的)或包含环。本发明也涵盖单萜的衍生物。单萜可以通过生物化学修饰例如单萜的氧化或重排来产生。单萜和类单萜的实例包括紫苏醇(S(-))和(R(+))、罗勒烯、月桂烯、香叶醇、柠檬醛、香茅醇、香茅醛、芳樟醇、蒎烯、萜品醇、萜品烯、柠檬烯、萜品烯、水芹烯、萜品油烯、萜品烯-4-醇(或茶树油)、蒎烯、萜品醇、萜品烯;衍生自单环萜例如薄荷醇、百里酚和香芹酚的类萜,例如对-伞花烃;双环类单萜,例如樟脑、冰片和桉叶醇。
单萜可以通过碳骨架的结构来区分,并且可以分为无环单萜(例如,月桂烯、(Z)-和(E)-罗勒烯、芳樟醇、香叶醇、橙花醇、香茅醇、月桂烯醇、香叶醛、柠檬醛a、橙花醛、柠檬醛b、香茅醛等),单环单萜(例如柠檬烯、萜品烯、水芹烯、萜品油烯、薄荷醇、葛缕醇等),双环单萜(例如蒎烯、桃金娘烯醇、桃金娘烯醛、马鞭草烷醇、马鞭草烷酮、松香芹醇、蒈烯、桧烯、莰烯、崖柏烯等)和三环单萜(例如三环烯)。参见Encyclopedia of Chemical Technology,第4版第23卷,834-835页。
本发明的倍半萜包括由三个异戊二烯单元组成的萜。倍半萜可以是线性的(无环的)或包含环。本发明还涵盖类倍半萜的衍生物。类倍半萜可以通过生物化学修饰例如倍半萜的氧化或重排产生。倍半萜的实例包括法呢醇、法呢醛、法呢酸和橙花叔醇。
单萜(或倍半萜)的衍生物包括但不限于单萜(或倍半萜)的氨基甲酸酯、酯、醚、醇和醛。单萜(或倍半萜)醇可被衍生为氨基甲酸酯、酯、醚、醛或酸。
氨基甲酸酯是指共有如下官能团的一类化学化合物:
所述官能团基于以氧和氮为侧翼的羰基。R1、R2和R3可以为基团,例如烷基、芳基等,其可以被取代。氮和氧上的R基团可以形成环。R1-OH可以为单萜,例如POH。R2-N-R3部分可以为治疗剂。
氨基甲酸酯可通过使异氰酸酯与醇反应,或使氯甲酸酯与胺反应来合成。氨基甲酸酯可通过使用光气或光气等效物的反应来合成。例如,氨基甲酸酯可通过使光气气体、双光气或固体光气前体例如三光气与两种胺或一种胺和一种醇反应而合成。氨基甲酸酯(也称作尿烷)也可以由脲中间体与醇的反应制得。碳酸二甲酯和碳酸二苯酯也用于制备氨基甲酸酯。可选择的是,氨基甲酸酯可通过醇和/或胺前体与酯取代的碳酸二芳基酯例如碳酸二甲基水杨酯(BMSC)反应而合成。美国专利公开号20100113819。
氨基甲酸酯可以通过下列方法合成:
适合的反应溶剂包括但不限于四氢呋喃、二氯甲烷、二氯乙烷、丙酮和二异丙醚。该反应可以在约-70℃至约80℃或约-65℃至约50℃的温度范围进行。氯甲酸紫苏酯与底物R-NH2的摩尔比范围可以为约1:1至约2:1,约1:1至约1.5:1,约2:1至约1:1,或约1.05:1至约1.1:1。适合的碱包括但不限于有机碱,例如三乙胺、碳酸钾、N,N’-二异丙基乙基胺、丁基锂和叔丁醇钾。
可选择的是,氨基甲酸酯可以通过下列方法合成:
适合的反应溶剂包括但不限于二氯甲烷、二氯乙烷、甲苯、二异丙醚和四氢呋喃。反应可以在约25℃至约110℃,或约30℃至约80℃,或约50℃的温度进行。紫苏醇与底物R-N=C=O的摩尔比范围可以为约1:1至约2:1,约1:1至约1.5:1,约2:1至约1:1,或约1.05:1至约1.1:1。
本发明的单萜(或倍半萜)醇的酯可以衍生自无机酸或有机酸。无机酸包括但不限于磷酸、硫酸和硝酸。有机酸包括但不限于羧酸,例如苯甲酸、脂肪酸、乙酸和丙酸,以及带有至少一个羧酸官能团的任何治疗剂。单萜(或倍半萜)醇的酯的实例包括但不限于羧酸酯(例如苯甲酸酯、脂肪酸酯(例如棕榈酸酯、亚油酸酯、硬脂酸酯、丁酸酯和油酸酯)、乙酸酯、丙酸酯(propionates)(或丙酸酯(propanoates))和甲酸酯)、磷酸酯、硫酸酯和氨基甲酸酯(例如N,N-二甲基氨基羰基)。Wikipedia-Ester.检索自URL:http://en.wikipedia.org/wiki/Ester。
可以在本发明中使用的单萜的特别实例为紫苏醇(通常缩写为POH)。紫苏醇的衍生物包括氨基甲酸紫苏酯、紫苏醇酯、紫苏醛、二氢紫苏酸、紫苏酸、紫苏醛衍生物、二氢紫苏酸酯和紫苏酸酯。紫苏醇的衍生物还可包括其氧化和亲核/亲电子加成衍生物。美国专利公开号20090031455,美国专利号6,133,324和3,957,856。化学文献中报道了紫苏醇衍生物的许多实例(参见附录A:CAS Scifinder搜索输出文件,2010年1月25日检索)。
在某些实施方案中,POH氨基甲酸酯通过包括下列步骤的方法合成:使氯甲酸紫苏酯的第一反应物与第二反应物例如二甲基塞来昔布(DMC)、替莫唑胺(TMZ)和咯利普兰反应。该反应可以在四氢呋喃和碱例如正丁基锂的存在下进行。可以通过使POH与光气反应制备氯甲酸紫苏酯。例如,可以通过使替莫唑胺与草酰氯反应,然后与紫苏醇反应来合成通过氨基甲酸酯键与替莫唑胺缀合的POH。该反应可以在1,2-二氯乙烷的存在下进行。
本发明涵盖的POH氨基甲酸酯包括但不限于4-(双-N,N’-4-异丙烯基环己-1-烯基甲基氧基羰基[5-(2,5-二甲基苯基)-3-三氟甲基吡唑-1-基]苯磺酰胺,4-(3-环戊基氧基-4-甲氧基苯基)-2-氧代-吡咯烷-1-甲酸4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯和(3-甲基4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羰基)氨基甲酸-4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯。生成这些化合物的化学反应的详细信息在下文实施例中描述。
在某些实施方案中,紫苏醇衍生物可以是紫苏醇脂肪酸酯,例如POH的棕榈酸酯和POH的亚油酸酯,其化学结构如下所示。
十六烷酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲酯(POH的棕榈酸酯)
十八-9,12-二烯酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲酯(POH的亚油酸酯)
单萜(或倍半萜)衍生物可以为与治疗剂缀合的单萜(或倍半萜)。本发明涵盖的单萜(或倍半萜)缀合物为具有单萜(或倍半萜)通过化学连接基团共价结合至治疗剂的分子。单萜(或倍半萜)缀合物中单萜(或倍半萜)与治疗剂的摩尔比可以为1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、3:1、4:1或任何其它适合的摩尔比。单萜(或倍半萜)和治疗剂可以通过氨基甲酸酯、酯、醚键或任何其它适合的化学官能团共价连接。当单萜(或倍半萜)和治疗剂通过氨基甲酸酯键缀合时,治疗剂可以是带有至少一个羧酸官能团的任何活性剂,或带有至少一个胺官能团的任何活性剂。在特别的实例中,紫苏醇缀合物是通过由化学连接基团与化学治疗剂共价结合的紫苏醇。
根据本发明,可以与单萜(或倍半萜)缀合的治疗剂包括但不限于化学治疗剂、治疗CNS障碍(包括但不限于原发性退行性神经障碍,例如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、注意缺陷多动障碍或ADHD,心理障碍,精神病和抑郁)的治疗剂,免疫治疗剂,血管生成抑制剂和抗高血压剂。可以与单萜或倍半萜缀合的抗癌剂可以对癌细胞或个体具有一种或多种以下作用:细胞死亡;细胞增殖减少;细胞数量减少;细胞生长抑制;凋亡;坏死;有丝分裂灾难;细胞周期阻滞;细胞大小减小;细胞分裂减少;细胞存活降低;细胞代谢减少;细胞损伤或细胞毒性的标志物;细胞损伤或细胞毒性的间接指标例如肿瘤缩小;个体生存提高;或与不期望的、不需要的或异常的细胞增殖相关的标志物的消失。美国专利公开号20080275057。
本发明还涵盖单萜(或倍半萜)和至少一种治疗剂的混合物和/或共制剂。
化学治疗剂包括但不限于DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应激诱导剂、铂化合物、抗代谢物、长春花生物碱(vincalkaloids)、紫杉烷、埃博霉素、酶抑制剂、受体拮抗剂、酪氨酸激酶抑制剂、硼放射增敏剂(即万珂(velcade))和化学治疗组合疗法。
DNA烷化剂的非限制性实例是氮芥,例如环磷酰胺(Cyclophosphamide)(异环磷酰胺(Ifosfamide)、曲磷胺(Trofosfamide))、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)(美法仑(Melphalan)、泼尼苯芥(Prednimustine))、苯达莫司汀(Bendamustine)、尿嘧啶氮芥(Uramustine)和雌氮芥(Estramustine);亚硝基脲,例如卡莫司汀(Carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(Lomustine)(司莫司汀(Semustine))、福莫司汀(Fotemustine)、尼莫司汀(Nimustine)、雷莫司汀(Ranimustine)和链脲霉素(Streptozocin);烷基磺酸酯,例如白消安(Busulfan)(甘露舒凡(Mannosulfan)、曲奥舒凡(Treosulfan));氮丙啶,例如卡波醌(Carboquone)、三乙撑亚胺苯醌(Triaziquone)、三乙撑蜜胺(Triethylenemelamine);肼(甲基苄肼(Procarbazine));三氮烯,例如氮烯咪胺(Dacarbazine)和替莫唑胺(Temozolomide)(TMZ);六甲蜜胺(Altretamine)和二溴甘露醇(Mitobronitol)。
拓扑异构酶I抑制剂的非限制性实例包括喜树碱衍生物,包括SN-38、APC、NPC、喜树碱(campothecin)、拓扑替康、依喜替康甲磺酸盐(exatecan mesylate)、9-硝基喜树碱、9-氨基喜树碱、勒托替康(lurtotecan)、鲁比替康(rubitecan)、silatecan、吉马替康(gimatecan)、二氟替康(diflomotecan)、依喜替康(extatecan)、BN-80927、DX-8951f和MAG-CPT,如Pommier Y.(2006)Nat.Rev.Cancer 6(10):789-802和美国专利公开号200510250854中描述的;原小檗碱生物碱(Protoberberine alkaloids)及其衍生物,包括小檗红碱(berberrubine)和甲氧檗因(coralyne),如Li等人(2000)Biochemistry 39(24):7107-7116和Gatto等人(1996)Cancer Res.15(12):2795-2800中描述的;菲咯啉(Phenanthroline)衍生物,包括苯并[i]菲啶(Benzo[i]phenanthridine)、两面针碱(Nitidine)和花椒宁碱(fagaronine),如Makhey等人(2003)Bioorg.Med.Chem.11(8):1809-1820中描述的;Terbenzimidazole及其衍生物,如Xu(1998)Biochemistry 37(10):3558-3566中描述的;和蒽环衍生物,包括阿霉素(Doxorubicin)、柔红霉素(Daunorubicin)和米托蒽醌(Mitoxantrone),如Foglesong等人(1992)Cancer Chemother.Pharmacol.30(2):123-]25,Crow等人(1994)J.Med.Chem.37(19):31913194和Crespi等人(1986)Biochem.Biophys.Res.Commun.136(2):521-8中描述的。拓扑异构酶II抑制剂包括但不限于依托泊苷(Etoposide)和替尼泊苷(Teniposide)。拓扑异构酶I和II双重抑制剂包括但不限于沙因托品(Saintopin)和其它并四苯二酮(Naphthecenediones)、DACA和其它吖啶-4-酰胺、茚托利辛(Intoplicine)和其它苯并吡啶并吲哚(Benzopyridoindoles)、TAS-I03和其它7H-茚并[2,1-c]喹啉-7-酮、吡唑并吖啶(Pyrazoloacridine)、XR 11576和其它苯并吩嗪(Benzophenazines)、XR 5944和其它二聚化合物、7-氧代-7H-二苯并[f,ij]异喹啉和7-氧代-7H-苯并[e]嘧啶和蒽基-氨基酸缀合物,如Denny和Baguley(2003)Curr.Top.Med.Chem.3(3):339-353中描述的。一些活性剂抑制拓扑异构酶II并且具有DNA嵌入活性,例如但不限于蒽环(阿柔比星(Aclarubicin)、柔红霉素、阿霉素、表柔比星(Epirubicin)、伊达比星(Idarubicin)、氨柔比星(Amrubicin)、吡柔比星(Pirarubicin)、戊柔比星(Valrubicin)、佐柔比星(Zorubicin))和蒽二酮(米托蒽醌和匹杉琼(Pixantrone))。
内质网应激诱导剂的实例包括但不限于二甲基-塞来昔布(DMC)、奈非那韦(nelfinavir)、塞来昔布和硼放射增敏剂(即万珂(硼替佐米))。
基于铂的化合物是DNA烷化剂的亚类。此类活性剂的非限制性实例包括顺铂(Cisplatin)、奈达铂(Nedaplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、四硝酸三铂(Triplatintetranitrate)、赛特铂(Satraplatin)、阿罗铂(Aroplatin)、洛铂(Lobaplatin)和JM-216。(参见McKeage等人(1997)J.Clin.Oncol.201:1232-1237,并且通常,参见CHEMOTHERAPYFOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM,CURRENT THERAPY AND NOVEL APPROACHES,in the SeriesBasic and Clinical Oncology,Angioli等人编辑,2004)。
“FOLFOX”是一种用于治疗结肠直肠癌的组合治疗的缩写。它包括5-FU、奥沙利铂和甲酰四氢叶酸(leucovorin)。有关这种治疗的信息,可以得自National CancerInstitute’s web site,cancer.gov,最新访问时间为2008年1月16日。
“FOLFOX/BV”是一种用于治疗结肠直肠癌的组合治疗的缩写。该疗法包括5-FU、奥沙利铂、甲酰四氢叶酸和贝伐珠单抗。此外,“XELOX/BV”是另一种用于治疗结肠直肠癌的组合治疗,其包括5-FU的前药,称作卡培他滨(Capecitabine)(希罗达(Xeloda))与奥沙利铂和贝伐珠单抗的组合。有关这些治疗的信息可以得自National Cancer Institute's website,cancer.gov或得自23the National Comprehensive Cancer Network’s web site,nccn.org,最新访问时间为2008年5月27日。
抗代谢物活性剂的非限制性实例包括基于叶酸的活性剂,即二氢叶酸还原酶抑制剂,例如氨蝶呤(Aminopterin)、甲氨蝶呤(Methotrexate)和培美曲塞(Pemetrexed);胸苷酸合酶抑制剂,例如雷替曲塞(Raltitrexed)、培美曲塞(Pemetrexed);基于嘌呤的活性剂,即腺苷脱氨酶抑制剂,例如喷司他丁(Pentostatin),硫代嘌呤,例如硫鸟嘌呤(Thioguanine)和巯嘌呤(Mercaptopurine),卤化/核糖核苷酸还原酶抑制剂,例如克拉屈滨(Cladribine)、氯法拉滨(Clofarabine)、氟达拉滨(Fludarabine),或鸟嘌呤/鸟苷(guanine/guanosine):硫代嘌呤,例如硫鸟嘌呤;或基于嘧啶的活性剂,即胞嘧啶/胞苷:去甲基化剂,例如阿扎胞苷(Azacitidine)和地西他滨(Decitabine),DNA聚合酶抑制剂,例如阿糖胞苷(Cytarabine),核糖核苷酸还原酶抑制剂,例如吉西他滨(Gemcitabine),或胸腺嘧啶/胸苷:胸苷酸合酶抑制剂,例如氟尿嘧啶(5-FU)。5-FU的等同物包括其前药、类似物及衍生物,例如5’-脱氧-5-氟尿苷(去氧氟尿苷(doxifluroidine))、1-四氢呋喃基-5-氟尿嘧啶(呋氟脲嘧啶(ftorafur))、卡培他滨(Capecitabine)(希罗达(Xeloda))、S-I(MBMS-247616,由替加氟(tegafur)和两种调节剂5-氯-2,4-二羟基吡啶和氧嗪酸钾(potassiumoxonate)组成)、雷替曲噻(ralititrexed)(拓优得(tomudex))、诺拉曲特(nolatrexed)(诺拉曲塞(Thymitaq),AG337)、LY231514和ZD9331,如Papamicheal(1999)The Oncologist 4:478-487中描述的。
长春花生物碱(vincalkaloids)的实例包括但不限于长春花碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春氟宁(Vinflunine)、长春地辛(Vindesine)和长春瑞滨(Vinorelbine)。
紫杉烷的实例包括但不限于多西他赛(docetaxel)、莱龙泰素(Larotaxel)、奥他赛(Ortataxel)、紫杉醇(Paclitaxel)和替司他赛(Tesetaxel)。埃博霉素(epothilone)的实例是伊沙匹隆(iabepilone)。
酶抑制剂的实例包括但不限于法尼基转移酶抑制剂(替吡法尼(Tipifarnib);CDK抑制剂(阿伏昔地(Alvocidib)、塞利西利(Seliciclib));蛋白酶体抑制剂(硼替佐米);磷酸二酯酶抑制剂(阿那格雷(Anagrelide);咯利普兰(rolipram));IMP脱氢酶抑制剂(噻唑呋林(Tiazofurine));和脂氧合酶抑制剂(马索罗酚(Masoprocol))。受体拮抗剂的实例包括但不限于ERA(阿曲生坦(Atrasentan));类视黄醇X受体(蓓萨罗丁(Bexarotene));和性类固醇(睾内酯(Testolactone))。
酪氨酸激酶抑制剂的实例包括但不限于针对如下的抑制剂:ErbB:HER1/EGFR(埃罗替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、凡德他尼(Vandetanib)、舒尼替尼(Sunitinib)、来那替尼(Neratinib));HER2/neu(拉帕替尼、来那替尼);RTK III类:C-kit(阿西替尼(Axitinib)、舒尼替尼、索拉非尼(Sorafenib))、FLT3(来他替尼(Lestaurtinib))、PDGFR(阿西替尼、舒尼替尼、索拉非尼);和VEGFR(凡德他尼、赛马尼布(Semaxanib)、西地尼布(Cediranib)、阿西替尼、索拉非尼);bcr-abl(伊马替尼(Imatinib)、尼洛替尼(Nilotinib)、达沙替尼(Dasatinib));Src(博舒替尼(Bosutinib))和Janus激酶2(来他替尼)。
“拉帕替尼”是EGFR和erbB-2双重抑制剂。已经在许多临床试验中研究了拉帕替尼作为抗癌单一疗法,以及与曲妥珠单抗、卡培他滨、来曲唑、紫杉醇和FOLFIRI(伊立替康、5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸)组合。目前正针对转移性乳腺癌、头颈癌、肺癌、胃癌、肾癌和膀胱癌的口服治疗进行III期试验。
拉帕替尼的化学等同物是小分子或化合物,该小分子或化合物是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或者可选择的是HER-1抑制剂或HER-2抑制剂。已经发现几种TKI具有有效的抗肿瘤活性,并且已经获批准或在临床试验中。这样的实例包括但不限于Zactima(ZD6474)、易瑞沙(吉非替尼)、甲磺酸伊马替尼(STI571;格列卫)、埃罗替尼(OSI-1774;特罗凯(Tarceva))、卡奈替尼(canertinib)(CI 1033)、司马沙尼(semaxinib)(SU5416)、瓦他拉尼碱(vatalanib)(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY 43-9006)、索坦(sutent)(SUI 1248)和来氟米特(lefltmomide)(SU10l)。
PTK/ZK是靶向所有VEGF受体(VEGFR)、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、c-KIT和c-Fms的具有广泛特异性的酪氨酸激酶抑制剂。Drevs(2003)Idrugs 6(8):787-794。PTK/ZK是通过抑制结合VEGF的所有已知受体的活性来阻断血管生成和淋巴管生成的靶向药物,所述受体包括VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)。PTK/ZK的化学名称是1-[4-氯苯胺基]-4-[4-吡啶基甲基]酞嗪琥珀酸盐或1-酞嗪胺(1-Phthalazinamine),N-(4-氯苯基)-4-(4-吡啶基甲基)-丁二酸酯(1:1)。PTK/TK的同义词和类似物称为瓦他拉尼(Vatalanib)、CGP79787D、PTK787/ZK 222584、CGP-79787、DE-00268、PTK-787、PTK787A、VEGFR-TK抑制剂、ZK 222584和ZK。
可以与单萜或倍半萜缀合的化学治疗剂还可以包括安吖啶(amsacrine)、曲贝替定(Trabectedin)、类视黄醇(retinoids)(阿利维A酸(Alitretinoin)、维甲酸(Tretinoin))、三氧化二砷(Arsenic trioxide)、天冬酰胺消耗物(asparagine depleter)(天冬酰胺酶/培门冬酶(Asparaginase/Pegaspargase))、塞来昔布(Celecoxib)、地美可辛(Demecolcine)、伊利司莫(Elesclomol)、依沙芦星(Elsamitrucin)、乙环氧啶(Etoglucid)、氯尼达明(Lonidamine)、硫蒽酮(Lucanthone)、丙脒腙(Mitoguazone)、米托坦(Mitotane)、奥利默森(Oblimersen)、替西罗莫司(Temsirolimus)和伏立诺他(Vorinostat)。
单萜或倍半萜衍生物可以与血管生成抑制剂缀合。血管生成抑制剂的实例包括但不限于血管抑素、血管酶(angiozyme)、抗凝血酶III、AG3340、VEGF抑制剂、巴马司他(batimastat)、贝伐单抗(阿瓦斯丁)、BMS-275291、CAI、2C3、HuMV833血管能抑素(Canstatin)、卡托普利(Captopril)、羧胺三唑(carboxyamidotriazole)、软骨源抑制剂(CDI)、CC-5013、6-O-(氯乙酰基-羰基)-烟霉醇(fumagillol)、COL-3、康普立停(combretastatin)、康普立停A4磷酸盐、达肝素(Dalteparin)、EMD 121974(西仑吉肽(Cilengitide))、内皮抑素(endostatin)、埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)(易瑞沙(Iressa))、染料木素(genistein)、氢溴酸常山酮(halofuginone hydrobromide)、Id1、Id3、IM862、甲磺酸伊马替尼、IMC-IC11诱导蛋白10、干扰素α、白细胞介素12、熏草菌素A(lavendustin A)、LY317615或AE-941、马立马司他(marimastat)、mspin、乙酸甲羟孕酮(medroxpregesterone acetate)、Meth-1、Meth-2、2-甲氧基雌甾二醇(2-ME)、新伐司他(neovastat)、骨桥蛋白裂解产物(oteopontin cleaved product)、PEX、色素上皮生长因子(PEGF)、血小板因子4、催乳素片段、多育曲菌素(proliferin)相关蛋白(PRP)、PTK787/ZK222584、ZD6474、重组人血小板因子4(rPF4)、休眠蛋白(restin)、角鲨胺(squalamine)、SU5416、SU6668、SU11248苏拉明(suramin)、紫杉醇(Taxol)、替康兰(Tecogalan)、沙利度胺(thalidomide)、血小板应答蛋白(thrombospondin)、TNP-470、肌钙蛋白-1(troponin-l)、血管抑制因子(vasostatin)、VEG1、VEGF-Trap和ZD6474。
血管生成抑制剂的非限制性实例还包括酪氨酸激酶抑制剂,例如酪氨酸激酶受体Flt-1(VEGFR1)和Flk-1/KDR(VEGFR2)抑制剂、表皮衍生生长因子抑制剂、成纤维细胞衍生生长因子抑制剂或血小板衍生生长因子抑制剂、MMP(基质金属蛋白酶)抑制剂、整合蛋白阻断剂、戊聚糖多硫酸酯、血管紧张素II拮抗剂、环加氧酶抑制剂(包括非甾体抗炎药(NSAID),例如阿司匹林和布洛芬,以及选择性环加氧酶-2抑制剂,例如塞来昔布和罗非昔布),和甾类抗炎剂(例如皮质类固醇、盐皮质激素、地塞米松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙(methylpred)、倍他米松)。
调节或抑制血管生成并且也可以与单萜或倍半萜缀合的其它治疗剂包括调节或抑制凝血和纤维蛋白溶解系统的活性剂,包括但不限于肝素、低分子量肝素和羧肽酶U抑制剂(也称为活性凝血酶可活化纤维蛋白溶解抑制剂[TAFIa]的抑制剂)。美国专利公开号20090328239。美国专利号7,638,549。
抗高血压剂的非限制性实例包括血管紧张素转化酶抑制剂(例如卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、地拉普利(delapril)等),血管紧张素II拮抗剂(例如坎地沙坦酯(candesartan cilexetil)、坎地沙坦、洛沙坦(losartan)(或Cozaar)、洛沙坦钾、依普罗沙坦(eprosartan)、缬沙坦(valsartan)(或Diovan)、替米沙坦(termisartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、他索沙坦(tasosartan)、奥美沙坦(olmesartan)、奥美沙坦酯(olmesartan medoxomil)等),钙拮抗剂(例如马尼地平(manidipine)、硝苯地平(nifedipine)、氨氯地平(amlodipine)(或Amlodin)、依氟地平(efonidipine)、尼卡地平(nicardipine)等),利尿剂,肾素抑制剂(例如阿利吉仑(aliskiren)等),醛固酮拮抗剂(例如螺内酯(spironolactone)、依普利农(eplerenone)等),β-阻滞剂(例如美托洛尔(metoprolol)(或Toporol)、阿替洛尔(atenolol)、普萘洛尔(propranolol)、卡维地洛(carvedilol)、品多洛尔(pindolol)等),血管扩张剂(例如硝酸盐,可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂或活化剂,前列环素等),血管紧张素疫苗,可乐定(clonidine)等。美国专利公开号20100113780。
可以与单萜(或倍半萜)缀合的其它治疗剂包括但不限于舍曲林(Sertraline)(Zoloft)、托吡酯(Topiramate)(Topamax)、杜洛西汀(Duloxetine)(Cymbalta)、舒马曲坦(Sumatriptan)(Imitrex)、普瑞巴林(Pregabalin)(Lyrica)、拉莫三嗪(Lamotrigine)(Lamictal)、万乃洛韦(Valaciclovir)(Valtrex)、坦索罗辛(Tamsulosin)(Flomax)、齐多夫定(Zidovudine)(Combivir)、拉米夫定(Lamivudine)(Combivir)、依法韦仑(Efavirenz)(Sustiva)、阿巴卡韦(Abacavir)(Epzicom)、洛匹那韦(Lopinavir)(Kaletra)、吡咯列酮(Pioglitazone)(Actos)、去氯雷他定(Desloratidine)(Clarinex)、西替利嗪(Cetirizine)(Zyrtec)、泮托拉唑(Pentoprazole)(Protonix)、兰索拉唑(Lansoprazole)(Prevacid)、瑞贝拉唑(Rebeprazole)(Aciphex)、莫西沙星(Moxifloxacin)(Avelox)、美洛昔康(Meloxicam)(Mobic)、多佐胺(Dorzolamide)(Truspot)、双氯芬酸(Diclofenac)(Voltaren)、依那普利(Enlapril)(Vasotec)、孟鲁司特(Montelukast)(Singulair)、西地那非(Sildenafil)(Viagra)、卡维地洛(Carvedilol)(Coreg)、雷米普利(Ramipril)(Delix)。
表1列出了可以与单萜(或倍半萜)缀合的药物活性剂,包括药物活性剂的结构和优选用于缀合的衍生物。
表1
单萜(或倍半萜)衍生物的纯度可以通过气相色谱(GC)或高压液相色谱(HPLC)来测定。用于测定单萜(或倍半萜)衍生物的纯度并且确定杂质的存在的其它技术包括但不限于核磁共振(NMR)光谱、质谱(MS)、GC-MS、红外光谱(IR)和薄层色谱(TLC)。手性纯度可以通过手性GC或旋光度测量值来评估。
单萜(或倍半萜)衍生物可以通过方法例如结晶纯化,或者通过根据衍生物的独特的理化性质(例如溶解性或极性)从杂质中分离单萜(或倍半萜)衍生物来纯化。因此,可以通过本领域已知的适合的分离技术,例如制备型色谱、(分级)蒸馏或(分级)结晶,将单萜(或倍半萜烯)衍生物与单萜(或倍半萜烯)分离。
本发明还提供了使用单萜(或倍半萜)衍生物治疗疾病例如癌症或其它神经系统障碍的方法。单萜(或倍半萜)衍生物可以单独施用,或与放射、手术或化学治疗剂组合施用。单萜或倍半萜衍生物也可以与抗病毒剂、抗炎剂或抗生素共同施用。所述活性剂可以同时或依次施用。单萜(倍半萜)衍生物可以在其它一种或多种活性剂施用之前、期间或之后施用。
单萜或倍半萜衍生物可以与放射治疗组合使用。在一个实施方案中,本发明提供了用放射治疗肿瘤细胞例如恶性神经胶质瘤细胞的方法,其中用有效量的单萜衍生物例如氨基甲酸紫苏酯处理细胞,然后使其暴露于放射。单萜衍生物治疗可以在放射之前、期间和/或之后进行。例如,单萜或倍半萜衍生物可以在放射治疗开始前1周开始连续施用,并且在放射治疗完成后持续2周。美国专利号5,587,402和5,602,184。
在一个实施方案中,本发明提供了用化学治疗治疗肿瘤细胞例如恶性神经胶质瘤细胞的方法,其中用有效量的单萜衍生物例如氨基甲酸紫苏酯处理细胞,然后使其暴露于化学治疗。单萜衍生物治疗可以在化学治疗之前、期间和/或之后进行。
单萜(或倍半萜)衍生物可用于治疗神经系统癌症,例如恶性神经胶质瘤(例如星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤)、视网膜母细胞瘤、毛细胞星形细胞瘤(I级)、脑膜瘤、转移性脑肿瘤、神经母细胞瘤、垂体腺瘤、颅底脑膜瘤和颅底癌。如本文所用,术语“神经系统肿瘤”是指个体具有神经系统细胞的恶性增殖的病症。
可以用本单萜(或倍半萜)衍生物治疗的癌症包括但不限于肺癌、耳鼻喉癌、白血病、结肠癌、黑素瘤、胰腺癌、乳房癌、前列腺癌、乳腺癌、造血系统癌症、卵巢癌、基底细胞癌、胆道癌;膀胱癌;骨癌;乳腺癌;宫颈癌;绒毛膜癌;结肠和直肠癌;结缔组织癌;消化系统癌症;子宫内膜癌;食道癌;眼癌;头颈癌;胃癌;上皮内肿瘤;肾癌;喉癌;白血病包括急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴性白血病;肝癌;淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤;骨髓瘤;纤维瘤、神经母细胞瘤;口腔癌(例如唇、舌、口和咽);卵巢癌;胰腺癌;前列腺癌;视网膜母细胞瘤;横纹肌肉瘤;直肠癌;肾癌;呼吸系统癌症;肉瘤;皮肤癌;胃癌;睾丸癌;甲状腺癌;子宫癌;泌尿系统癌症;以及其它癌症和肉瘤。美国专利号7,601,355。
本发明还提供了治疗CNS障碍的方法,包括但不限于原发性退行性神经障碍,例如阿尔茨海默病、帕金森病、心理障碍、精神病和抑郁。治疗可以由单独使用单萜或倍半萜衍生物或与目前用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病或心理障碍的药物组合使用组成。
本发明还提供了改善免疫调节治疗响应的方法,包括下列步骤:在免疫调节治疗之前或期间,将细胞暴露于有效量的单萜或倍半萜衍生物,例如氨基甲酸紫苏酯。优选的免疫调节剂为细胞因子,例如白介素、淋巴因子、单核因子、干扰素和趋化因子。
本发明组合物可以通过本领域已知的任何方法施用,包括但不限于鼻内、口服、透皮、经眼、腹膜内、吸入、静脉内、ICV、脑池内注射或输注、皮下、植入、阴道、舌下、尿道(例如尿道栓)、皮下、肌内、静脉内、直肠、舌下、粘膜、眼、脊髓、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管和淋巴施用。局部制剂可以是凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、气雾剂等形式;鼻内制剂可以喷雾剂或滴剂形式递送;经皮制剂可以通过透皮贴剂或离子透入法(iontorphoresis)施用;吸入制剂可以利用喷雾器或类似装置递送。组合物还可以采用片剂、丸剂、胶囊剂、半固体、粉末、缓释制剂、溶液剂、混悬剂、酏剂、气雾剂或任何其它适合的组合物的形式。
为了制备这种药物组合物,可以按照常规药物配合技术,将一种或多种单萜(或倍半萜)衍生物与可药用载体、助剂和/或赋形剂混合。可用于本发明组合物的可药用载体涵盖任何标准药物载体,例如磷酸缓冲盐溶液、水和乳液,例如油/水或水/油乳液,以及多种类型的润湿剂。该组合物可以另外含有固体药物赋形剂,例如淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂乳粉等。液体和半固体赋形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇和多种油,该油包括石油、动物、植物或合成来源的那些油,例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。液体载体,特别是对于可注射溶液剂,包括水、盐水、葡萄糖水溶液(aqueous dextrose)和二醇。载体、稳定剂和助剂的实例参见Remington's Pharmaceutical Sciences,E.W.Martin编辑(MackPublishing Company,第18版,1990)。组合物还可以包含稳定剂和防腐剂。
本文中使用的术语“治疗有效量”是足以治疗特定障碍或疾病的量,或者可选择的是,足以获得治疗障碍或疾病的药理学响应的量。确定最有效的施用方式和剂量的方法可以随着用于治疗的组合物、治疗的目的、治疗的靶细胞和治疗的个体而不同。通常可以滴定治疗剂量以优化安全性和有效性。单次或多次施用可以根据治疗医生选择的剂量水平和方式来进行。本领域技术人员可以容易地确定施用活性剂的适合剂量制剂和方法。例如,组合物以约0.01mg/kg至约200mg/kg,约0.1mg/kg至约100mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg施用。当本文所述的化合物与另一种活性剂或疗法共同施用时,有效量可以低于单独使用活性剂时的量。
可以通过将活性剂掺入触变性或胶凝状载体例如纤维素介质,例如甲基纤维素或羟乙基纤维素中来制备透皮制剂,然后将所得制剂包装在适于固定在与穿戴者的皮肤接触的透皮装置中。如果组合物为凝胶形式,则可以将组合物摩擦到患者的膜上,例如,肩膀或上臂和/或上半身的皮肤,优选完整、清洁和干燥的皮肤上,并且在其上维持足以将单萜(或倍半萜)衍生物递送至患者血清的时间期限。凝胶形式的本发明组合物可以包含在管、小袋或计量泵中。这种管或小袋可以包含一个单位剂量或多于一个单位剂量的组合物。计量泵能够分配一个计量剂量的组合物。
本发明还提供了如上所述的用于鼻内施用的组合物。照此,组合物可以进一步包含渗透增强剂。Southall等人,Developments in Nasal Drug Delivery,2000。单萜(或倍半萜)衍生物可以以液体形式例如溶液剂、乳剂、混悬剂、滴剂,或以固体形式例如粉末、凝胶剂或软膏剂,鼻内施用。递送鼻内药物的装置为本领域公知。可以利用包括但不限于以下的装置进行鼻药物递送:鼻内吸入器、鼻内喷雾装置、雾化器、鼻喷雾瓶、单位剂量容器、泵、点滴器、挤压瓶、喷雾器、计量剂量吸入器(MDI)、压力剂量吸入器、吹药器和双向装置。可以计量鼻递送装置以向鼻腔施用精确有效剂量的量。鼻递送装置可用于单一单位递送或多单位递送。在特别实例中,来自Kurve Technology(Bethell,Washington)的ViaNaseElectronic Atomizer可用于本发明(http://www.kurvetech.com)。本发明化合物还可以通过管、导管、注射器、packtail、药棉、鼻塞或通过粘膜下输注来递送。美国专利公开号20090326275、20090291894、20090281522和20090317377。
可以使用标准方法将单萜(或倍半萜)衍生物配制成气雾剂。可以使用或不使用溶剂配制单萜(或倍半萜)衍生物,并且可以使用或不使用载体配制。制剂可以是溶液剂,或可以是含有一种或多种表面活性剂的含水乳剂。例如,可以由含有适合的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、碳氢化合物、压缩空气、氮气、二氧化碳或其它适合气体的加压容器来制备气雾喷雾。可以通过提供阀门来确定剂量单位以递送计量的量。泵送喷雾分配器可以分配计量的剂量或具有特定的粒径或液滴尺寸的剂量。本文中使用的术语“气雾剂”是指处于气体中的细小固体颗粒或液体溶液滴的混悬剂。特别的是,气雾剂包括单萜(或倍半萜)小滴的气载混悬剂,其可以在任何适合的装置例如MDI、喷雾器或弥雾器中生成。气雾剂还包括悬浮在空气或其它载气中的本发明组合物的干粉组合物。Gonda(1990)Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313。Raeburn等人,(1992)Pharmacol.Toxicol.Methods27:143-159。
单萜(或倍半萜)衍生物可以以例如微球形式的粉末通过鼻吹药器递送到鼻腔。单萜(或倍半萜)衍生物可以吸附至固体表面例如载体。粉末或微球可以以干燥的、空气可分散的(air-dispensable)形式施用。粉末或微球可以储存在吹药器的容器中。可选择的是,粉末或微球可以装填成胶囊剂例如明胶胶囊剂,或其它适合于鼻施用的单剂量单元。
药物组合物可以通过在鼻腔中直接放置该组合物来递送到鼻腔,例如以凝胶剂、软膏剂、鼻乳剂、洗剂、乳膏剂、鼻塞、点滴器或生物粘附条的形式。在某些实施方案中,例如为了增强吸收,可能希望延长药物组合物在鼻腔中的停留时间。因此,药物组合物可以任选与生物粘性聚合物、树胶(例如黄原胶)、壳聚糖(例如高纯度阳离子型多糖)、果胶(或可以像凝胶一样稠化或当施加到鼻粘膜时乳化的任何碳水化合物)、微球(例如淀粉、白蛋白、右旋糖酐、环糊精)、明胶、脂质体、卡波姆(carbamer)、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖和/或纤维素(例如甲基或丙基;羟基或羧基;羧甲基或羟丙基)一起配制。
包含纯化的单萜(或倍半萜)的组合物可以通过口腔吸入进入呼吸道(即肺)施用。
用于可吸入活性剂的典型递送系统包括雾化吸入器、干粉吸入器(DPI)和定量吸入器(MDI)。
喷雾器装置产生高速空气流,使液体形式的治疗剂以雾的形式喷出。该治疗剂配制成液体形式,例如适合大小的颗粒的溶液剂或混悬剂。在一个实施方案中,颗粒是微粉化的。术语“微粉化”定义为具有约90%或更多的直径小于约10μm的颗粒。适合的喷雾器装置是商业上提供的,例如,由PARI GmbH(Starnberg,德国)提供。其它喷雾器装置包括Respimat(Boehringer Ingelheim),以及在例如美国专利号7,568,480和6,123,068及WO97/12687中公开的那些。单萜(或倍半萜)可以配制成水溶液或液体混悬液以用在喷雾器装置中。
DPI装置通常以自由流动的粉末形式施用治疗剂,该粉末可以分散在患者吸气期间的气流中。使用外部能量来源的DPI装置也可以用于本发明。为了得到自由流动的粉末,治疗剂可以与适合的赋形剂(例如乳糖)一起配制。例如,通过将粒径为约1μm至100μm的干燥乳糖与单萜(或倍半萜)的微粉化颗粒混合再干混,可以制得干粉制剂。可选择的是,单萜可以不与赋形剂一起配制。将制剂装入干粉分配器,或装入与干粉递送装置一起使用的吸入盒或胶囊中。商业上提供的DPI装置的实例包括Diskhaler(GlaxoSmithKline,ResearchTriangle Park,N.C.)(参见例如美国专利号5,035,237);Diskus(GlaxoSmithKline)(参见例如美国专利号6,378,519);Turbuhaler(AstraZeneca,Wilmington,Del.)(参见例如美国专利号4,524,769);和Rotahaler(GlaxoSmithKline)(参见例如美国专利号4,353,365)。适合的DPI装置的其它实例在美国专利号5,415,162、5,239,993和5,715,810以及其中的参考文献中描述。
MDI装置通常利用压缩的抛射剂气体释放出定量的治疗剂。用于MDI施用的制剂包括在液化抛射剂中的活性成分的溶液剂或混悬剂。抛射剂的实例包括氢氟烷(HFA),例如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134a)和1,1,1,2,3,3,3-七氟-正丙烷(HFA 227),氯氟碳,例如CCl3F。用于MDI施用的HFA制剂的其它组分包括共溶剂,例如乙醇、戊烷、水;和表面活性剂,例如脱水山梨醇三油酸酯、油酸、卵磷脂和甘油。(参见例如美国专利号5,225,183、EP0717987和WO92/22286)。将制剂装入气溶胶筒,该气溶胶筒构成MDI装置的一部分。美国专利号6,006,745和6,143,227中提供了特别开发与HFA抛射剂一起使用的MDI装置的实例。制备适合制剂和适合于吸入给药的装置的方法的实例参见美国专利号6,268,533、5,983,956和6,221,398,以及WO 99/53901、WO 00/61108、WO 99/55319和WO 00/30614。
为了通过吸入递送,单萜(或倍半萜)衍生物可以包封在脂质体或微胶囊中。脂质体是由双层脂质膜和含水内部组成的囊泡。该脂质膜可以由磷脂构成,该磷脂的实例包括磷脂酰胆碱,例如卵磷脂和溶血卵磷脂;酸性磷脂,例如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油;和鞘磷脂,例如磷脂酰乙醇胺和神经鞘磷脂。可选择的是,可以添加胆固醇。微胶囊是包有包衣材料的颗粒。例如,该包衣材料可以由成膜聚合物、疏水增塑剂、表面活化剂或/和润滑剂含氮聚合物的混合物组成。美国专利号6,313,176和7,563,768。
单萜(或倍半萜)衍生物也可以通过局部应用单独或与其它化学治疗剂组合使用,以治疗局部癌症,例如乳腺癌或黑素瘤。单萜(或倍半萜)衍生物也可以与麻醉剂或止痛剂组合使用,以透皮递送疼痛药物。
本发明还提供了如上所述的用于眼施用的组合物。同样地,该组合物可以进一步包含渗透增强剂。对于眼施用,本文描述的组合物可以配制成溶液剂、乳剂、混悬剂等。多种适用于将化合物施用于眼的载体为本领域已知。特别的非限制性实例在美国专利号6,261,547;6,197,934;6,056,950;5,800,807;5,776,445;5,698,219;5,521,222;5,403,841;5,077,033;4,882,150和4,738,851中描述。
单萜(或倍半萜)衍生物可以单独地或与用于治疗上述疾病的其它药物组合短期或长期给予。本发明组合物可以施用于哺乳动物,优选人。哺乳动物包括但不限于鼠、大鼠、兔、猿、牛、绵羊、猪、狗、猫、农场动物、运动动物(sport animals)、宠物、马和灵长类动物。
本发明还提供了在体外、离体或体内抑制细胞生长的方法,其中使细胞例如癌细胞与有效量的在本文中描述的单萜(或倍半萜)衍生物接触。
病理细胞或组织例如过度增殖的细胞或组织可以通过使该细胞或组织与有效量的本发明组合物接触来处理。该细胞例如癌细胞可以是原发性癌细胞,或可以是能从组织库例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的培养细胞。该病理细胞可以是全身性癌症、神经胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤或来自全身性癌症的CNS转移、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、血液癌症或卵巢癌的细胞。该细胞可以来自于脊椎动物,优选哺乳动物,更优选人。美国专利公开号2004/0087651。Balassiano等人(2002)Intern.J.Mol.Med.10:785-788。Thorne等人(2004)Neuroscience 127:481-496。Fernandes等人(2005)Oncology Reports 13:943-947。Da Fonseca等人(2008)Surgical Neurology 70:259267。Da Fonseca等人(2008)Arch.Immunol.Ther.Exp.56:267-276。Hashizume等人(2008)Neuroncology 10:112-120。
可以使用本领域众所周知的方法来测定本发明组合物的体外功效。例如,可以通过MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓]细胞毒性试验研究本发明的单萜(或倍半萜)和/或治疗剂的细胞毒性。MTT测定法基于代谢活性细胞摄取四唑鎓盐MTT的原理,其中它被代谢成蓝色的甲(formazon)产物,其可以用分光光度法读取。J.of Immunological Methods65:55 63,1983。可以通过集落形成试验研究本发明单萜(或倍半萜)衍生物和/或治疗剂的细胞毒性。可通过ELISA进行抑制VEGF分泌和IL-8分泌的功能测定。可通过标准碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术研究本发明单萜(或倍半萜)衍生物和/或治疗剂对细胞周期的阻断。侵入抑制可以由Boyden室研究。在该测定中,将重构的基膜层Matrigel涂覆在趋化性滤膜上,并且用作Boyden室中细胞迁移的屏障。只有具有侵袭能力的细胞才能穿过Matrigel屏障。其它测定包括但不限于细胞活力测定、凋亡测定和形态学测定。
下面是本发明的实施例,但并不预期作为限定作用。
实施例
实施例1:二甲基塞来昔布双POH氨基甲酸酯(4-(双-N,N’-4-异丙烯基环己-1-烯基甲氧基羰基[5-(2,5-二甲基苯基)-3-三氟甲基吡唑-1-基]苯磺酰胺)的合成
反应方案如下:
历经30分钟,将光气(20%,在甲苯中,13mL,26.2mmol)添加到紫苏醇(2.0克,13.1mmol)和碳酸钾(5.4克,39.1mmol)在干燥甲苯(30mL)中的混合物中,同时维持温度在10℃至15℃。将反应混合物温热至室温,并且在N2中搅拌8.0小时。用水(30mL)猝灭该反应混合物,并且分离有机层。用甲苯(20mL)萃取水层,并且用水(50mL×2)、盐水(15%,30mL)洗涤合并的有机层,并且经硫酸钠(20克)干燥。真空浓缩过滤的有机层,得到氯甲酸紫苏酯,为油状物。重量:2.5克;产率:89%。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ1.5(m,1H),1.7(s,3H),1.8(m,1H),2.0(m,1H),2.2(m,4H),4.7(dd,4H);5.87(m,1H)。
在N2中历经5分钟,将氯甲酸紫苏酯(0.11克,0.55mmol)缓慢添加到二甲基塞来昔布(0.2克,0.50mmol)和碳酸钾(0.13克,1.0mmol)在干燥丙酮(10mL)中的混合物中。将反应混合物加热至回流,并且维持3小时。由于TLC分析表明存在二甲基塞来昔布(>60%),因此再添加1.0当量的氯甲酸紫苏酯,并且再回流5小时。冷却反应混合物,并且真空浓缩丙酮,得到残留物。
将得到的残留物悬浮在水(15mL)中,并且用乙酸乙酯(3×15mL)萃取。用水(20mL),然后用盐水(15%,20mL)洗涤合并的有机层,并且经硫酸钠干燥。真空浓缩过滤的有机层,得到残留物,将其通过柱色谱纯化[柱尺寸:直径:1.5cm,高度:10cm,二氧化硅:230-400目],并且用己烷(100mL)洗脱,然后用己烷/乙酸乙酯的混合物(95:5,100mL)洗脱。合并己烷/乙酸乙酯级分,并且真空浓缩,得到胶状物质。
产物POH氨基甲酸酯显示出120mg重量和31%产率。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ0.9(m,2H),1.4(m,2H),1.7(m,7H*),1.95(m,8H*),2.1(m,4H),2.3(s,3H),4.4(d,2H),4.7(dd,2H),5.6(br d,2H),6.6(s,1H),7.0(br s,1H),7.12(d,1H),7.19(d,1H),7.4(d,2H),7.85(d,2H);MS,m/e:751.8(M+3%),574.3(100%),530.5(45%),396(6%)。*N.B.来自推定的杂质的另外的2H重叠在NMR积分可以忽略。
实施例2:二甲基塞来昔布双POH氨基甲酸酯(POH-DMC)的体外细胞毒性研究
在单独用二甲基塞来昔布(DMC)处理细胞后,进行首次细胞毒性测定。图1显示了仅用DMC对人恶性神经胶质瘤细胞U87、A172和U251进行MTT细胞毒性测定的结果。
然后用二甲基塞来昔布双POH氨基甲酸酯(POH-DMC)(例如,通过实施例1的方法合成)处理U87、A172和U251细胞,并且进行MTT细胞毒性测定(图2)。结果表明,POH氨基甲酸酯POH-DMC比单独的DMC表现出更好的细胞毒性。
实施例3:替莫唑胺POH氨基甲酸酯(3-甲基4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5四嗪-8-羰基)-氨基甲酸-4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯)的合成
反应方案如下:
历经2分钟,将草酰氯(0.13克,1.0mmol)缓慢添加到替莫唑胺(OChemIncorporation,0.1克,0.5mmol)在1,2-二氯乙烷(10mL)中的混合物中,同时维持温度在10℃在N2中。使反应混合物温至室温,然后加热至回流达3小时。通过真空浓缩除去过量的草酰氯和1,2-二氯乙烷。将所得残留物重新溶解在1,2-二氯乙烷(15mL)中,并且将反应混合物在N2中冷却至10℃。历经5分钟加入紫苏醇(0.086克,0.56mmol)的1,2-二氯乙烷(3mL)溶液。将反应混合物温至室温,并且搅拌14小时。真空浓缩1,2-二氯乙烷,得到残留物,将其与己烷一起研磨。过滤得到的黄色固体,并且用己烷洗涤。重量:170mg;产率:89%。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ1.4-2.2(m,10H),4.06(s,3H),4.6-4.8(m,4H),5.88(br s,1H),8.42(s,1H),9.31(br s,1H);MS,未观察到分子离子峰。m/e:314(100%),286.5(17%),136(12%)。
可选择的是,根据下列方法合成替莫唑胺POH氨基甲酸酯。历经2分钟,将草酰氯(0.13克,1.0mmol)缓慢添加到替莫唑胺(OChem Incorporated,0.1g,0.5mmol)在1,2-二氯乙烷(10mL)中的混合物中,同时维持温度在10℃在N2中。将反应混合物温至室温,然后加热至回流达3小时。通过真空浓缩除去过量的草酰氯和1,2-二氯乙烷。将得到的残留物重新溶解在1,2-二氯乙烷(15mL)中,并且将反应混合物在N2中冷却至10℃。历经5分钟加入紫苏醇(0.086克,0.56mmol)的1,2-二氯乙烷(3mL)溶液。将反应混合物温至室温,并且搅拌14小时。真空浓缩1,2-二氯乙烷,得到残留物,将其通过短硅胶填料柱(柱尺寸:直径:2cm,高度:3cm,硅胶:230-400目)纯化,并且用己烷/乙酸乙酯混合物(1:1,100mL)洗脱。合并己烷/乙酸乙酯级分,并且真空浓缩,得到白色固体残留物,将其与庚烷一起研磨,并且过滤,得到白色固体。重量:170毫克;产率:89%。1H-NMR(400MHz,CDCl3):1.4-2.2(m,10H),4.06(s,3H),4.6-4.8(m,4H),5.88(br s,1H),8.42(s,1H),9.31(br s,1H);MS,未观察到分子离子峰,m/e:314(100%),286.5(17%),136(12%)。
实施例4:替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)的体外细胞毒性研究
在单独用替莫唑胺(TMZ)处理细胞后进行首次细胞毒性试验,替莫唑胺是用于治疗恶性神经胶质瘤的标准烷化剂。图3显示了单独用TMZ对人恶性神经胶质瘤细胞U87、A172和U251进行MTT细胞毒性试验的结果。浓度增加的TMZ对测试的细胞系具有最小的细胞毒性。
然后用替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)(例如,通过实施例3中的方法合成)处理TMZ抗性神经胶质瘤细胞系U87、A172和U251细胞。MTT试验结果(图4)显示,与单独的TMZ相比,POH氨基甲酸酯POH-TMZ对多种人神经胶质瘤细胞的杀伤率高得多。
实施例5:咯利普兰POH氨基甲酸酯(4-(3-环戊基氧基-4-甲氧基苯基)-2-氧代-吡咯烷-1-甲酸4-异丙烯基环己-1-烯基甲酯)的合成
反应方案如下:
历经30分钟,将光气(20%,在甲苯中,13mL,26.2mmol)添加到紫苏醇(2.0克,13.1mmol)和碳酸钾(5.4克,39.1mmol)在干燥甲苯(30mL)中的混合物中,同时维持温度在10℃至15℃。将反应混合物温至室温,并且在N2中搅拌8.0小时。用水(30mL)猝灭反应混合物,并且分离有机层。用甲苯(20mL)萃取水层,并且用水(50mL×2)、盐水(15%,30mL)洗涤合并的有机层,并且经硫酸钠(20克)干燥。真空浓缩过滤的有机层,得到氯甲酸紫苏酯,为油状物。重量:2.5克;产率:89%。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ1.5(m,1H),1.7(s,3H),1.8(m,1H),2.0(m,1H),2.2(m,4H),4.7(dd,4H);5.87(m,1H)。
在N2中历经5分钟,在-72℃,将丁基锂(2.5M,0.18mL,0.45mmol)添加到咯利普兰(GL Synthesis,Inc.,0.1克,0.36mmol)的干燥THF溶液中。在-72℃搅拌反应混合物1.0小时后,历经15分钟加入氯甲酸紫苏酯(溶于4mL THF中),同时维持温度在-72℃。将反应混合物搅拌2.5小时,并且用饱和氯化铵(5mL)猝灭。将反应混合物温至室温,并且用乙酸乙酯(2×15mL)萃取。用水(15mL)、盐水(15%,15mL)洗涤合并的有机层,然后经硫酸钠干燥。浓缩过滤的有机层,得到油状物,通过柱色谱纯化[柱尺寸:直径:1.5cm,高度:10cm,二氧化硅:230-400目],并且用8%乙酸乙酯/己烷的混合物(100mL)洗脱,然后用12%乙酸乙酯/己烷(100mL)洗脱。合并12%乙酸乙酯/己烷级分,并且真空浓缩,得到胶状固体。重量:142mg;产率:86%。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ1.5(m,1H),1.6(m,2H),1.7(s,3H),1.9(m,6H),2.2(m,5H),2.7(m,1H),2.9(m,1H),3.5(m,1H),3.7(m,1H),3.8(s,3H),4.2(m,1H),4.7(m,6H),5.8(br s,1H),6.8(m,3H);MS,m/e:452.1(M+1 53%),274.1(100%),206.0(55%)。
实施例6:咯利普兰POH氨基甲酸酯(POH-咯利普兰)的体外细胞毒性研究
为了比较咯利普兰POH氨基甲酸酯(POH-咯利普兰)(例如,通过实施例5的方法合成)与诱导神经胶质瘤细胞中分化和凋亡的IV型磷酸二酯酶咯利普兰的细胞毒性,用POH-咯利普兰或咯利普兰处理A172、U87、U251和LN229人神经胶质瘤细胞48小时。MTT测定结果如图5至8中所示。对于几种不同的人神经胶质瘤细胞类型中的每一种,与单独的咯利普兰相比,POH-咯利普兰表现出明显更高的杀伤率。图5显示了用于A-172细胞的咯利普兰和POH-咯利普兰浓度增加的MTT测定。单独的咯利普兰显示IC50为约1000uM(1mM)。在POH-咯利普兰的存在下,IC50在浓度低至50uM时达到。图6显示了使用U-87细胞的咯利普兰浓度增加的MTT测定。1000uM时未达到IC50。另一方面,使用POH-咯利普兰在180uM达到IC50。图7显示在170uM对于U251细胞获得了单独的咯利普兰的IC50;在60%达到细胞毒性坪值。POH-咯利普兰在50uM时达到IC50,在100uM时几乎具有100%的细胞毒性。图8显示,即使在100uM时,单独的咯利普兰对LN229细胞的IC50也无法达到。另一方面,POH-咯利普兰的IC50在100uM时达到,在10uM时几乎具有100%的细胞毒性。
实施例7:使用POH脂肪酸衍生物的体内肿瘤生长抑制
在裸鼠皮下神经胶质瘤模型中研究了丁酰基-POH对肿瘤生长的抑制作用。给小鼠注射U-87神经胶质瘤细胞(500,000个细胞/注射),并且使其历经两周形成可触及的结节。一旦形成可触及的结节,则历经8周通过棉签(Q-tip)(1cc/应用/天)对小鼠局部应用多种化合物进行处理,如图9A和9B所示。图9A显示了用丁酰基-POH、具有纯度大于98.5%的纯化的(S)-紫苏醇(“纯化的POH”)、购自Sigma Chemicals的POH或磷酸盐缓冲盐水(PBS;阴性对照)处理的裸鼠皮下U-87神经胶质瘤的图像。图9B显示了历经一段时间肿瘤的平均生长情况(总时间为60天)。丁酰基-POH对肿瘤的生长显示出最大的抑制作用,其次是纯化的POH和Sigma POH。
实施例8:替莫唑胺(TMZ)和替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)对TMZ敏感性和抗性神经胶质瘤细胞的体外细胞毒性研究
在用单独的TMZ、单独的POH和TMZ-POH缀合物处理细胞后进行集落形成测定。如Chen TC等人,Green tea epigallocatechin gallate enhances therapeutic efficacyof temozolomide in orthotopic mouse glioblastoma models.Cancer Lett.2011年3月28日;302(2):100-8所述进行集落形成测定。图10显示了对使用TMZ或TMZ-POH的TMZ敏感性(U251)和TMZ抗性(U251TR)U251细胞进行的集落形成测定的结果。TMZ对TMZ敏感性U251细胞表现出细胞毒性,但对TMZ抗性U251细胞具有最低的细胞毒性。TMZ-POH对TMZ敏感性和TMZ抗性U251细胞均显示出细胞毒性。
图11显示对使用POH的TMZ敏感性(U251)和TMZ抗性(U251TR)U251细胞进行集落形成测定的结果。POH对TMZ敏感性和TMZ抗性U251细胞均显示出细胞毒性。在集落形成测定中,与单独的POH(图11)相比,POH-TMZ(图10)显示出明显更高的效力。
实施例9:替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)对U251细胞、U251TR细胞和正常星形胶质细胞的体外细胞毒性研究
用TMZ-POH缀合物处理细胞后,进行MTT细胞毒性测定。如Chen TC等人Green teaepigallocatechin gallate enhances therapeutic efficacy of temozolomide inorthotopic mouse glioblastoma models.Cancer Lett.2011年3月28日;302(2):100-8所述,进行MTT细胞毒性测定。图12显示了对TMZ敏感性细胞(U251)、TMZ抗性细胞(U251TR)和正常星形胶质细胞进行的MTT细胞毒性测定的结果。TMZ-POH对TMZ敏感性和TMZ抗性U251细胞均显示出细胞毒性,但对正常的星形胶质细胞没有。
实施例10:替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)对BEC、TuBEC和正常星形胶质细胞的体外细胞毒性研究
用TMZ-POH缀合物处理细胞后,进行MTT细胞毒性测定。如Chen TC等人Green teaepigallocatechin gallate enhances therapeutic efficacy of temozolomide inorthotopic mouse glioblastoma models.Cancer Lett.2011年3月28日;302(2):100-8所述,进行MTT细胞毒性测定。图13显示了对正常星形胶质细胞、脑内皮细胞(BEC;汇合和亚汇合)以及肿瘤脑内皮细胞(TuBEC)进行MTT细胞毒性测定的结果。TMZ-POH不会对正常的星形胶质细胞、汇合的BEC或TuBEC诱导显著的细胞毒性。在亚汇合的BEC中,高浓度的TMZ-POH表现出轻度至中度的细胞毒性。
实施例11:替莫唑胺(TMZ)和替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)对USC-04神经胶质瘤癌干细胞的体外细胞毒性研究
在用单独的TMZ、单独的POH或TMZ-POH缀合物处理细胞后,进行MTT细胞毒性测定。如Chen TC等人,Green tea epigallocatechin gallate enhances therapeuticefficacy of temozolomide in orthotopic mouse glioblastoma models.Cancer Lett.2011年3约28日;302(2):100-8所述,进行MTT细胞毒性测定。图14显示了对USC-04神经胶质瘤癌干细胞进行的MTT细胞毒性测定的结果。随着浓度增加(0-400uM),TMZ不会诱导显著的细胞毒性。TMZ-POH显示在150uM具有IC50的细胞毒性证据。图15显示了对用POH处理的USC-04神经胶质瘤癌干细胞进行MTT细胞毒性测定的结果。随着浓度增加(0-2mM),POH对USC-04表现出细胞毒性。
实施例12:替莫唑胺(TMZ)和替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)对USC-02神经胶质瘤癌干细胞的体外细胞毒性研究
在用单独的TMZ、单独的POH或TMZ-POH缀合物处理细胞后,进行MTT细胞毒性测定。如Chen TC等人Green tea epigallocatechin gallate enhances therapeutic efficacyof temozolomide in orthotopic mouse glioblastoma models.Cancer Lett.2011年3约28日;302(2):100-8所述,进行MTT细胞毒性测定。图16显示了对USC-02神经胶质瘤癌干细胞进行的MTT细胞毒性测定的结果。随着浓度增加(0-400uM),TMZ不会诱导显著的细胞毒性。TMZ-POH在60uM具有IC50的细胞毒性证据。图17显示了用POH处理的USC-02神经胶质瘤癌干细胞的MTT细胞毒性测定结果。随着浓度增加(0-2mM),POH对USC-02表现出细胞毒性。
实施例13:替莫唑胺POH氨基甲酸酯(POH-TMZ)对TMZ敏感性和抗性神经胶质瘤细胞的ER应激的体外研究
用TMZ-POH缀合物处理TMZ敏感性和抗性神经胶质瘤细胞18小时后,进行蛋白质印迹分析。图18显示了蛋白质印迹,其说明了TMZ-POH在TMZ敏感性和抗性U251神经胶质瘤细胞中诱导ER应激(ERS)。在浓度低至60uM的TMZ-POH显示了促凋亡蛋白CHOP的激活。
实施例14:POH-亚油酸缀合物的抗炎作用的小鼠研究
用50微升(μL)POH和亚油酸的缀合物(例如,POH的亚油酰基酯)在甘油:乙醇(90:10)混合物的媒介物中的溶液预处理第一组小鼠。将POH-亚油酸缀合物溶液施用于小鼠的髋部侧翼达3天。第二对照组小鼠仅用甘油:乙醇(90:10)媒介物处理。
预处理后,历经7天,通过每天在小鼠背侧向皮肤上施用12-0-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯(asTPA)(一种已知的刺激剂)的乙醛溶液,对第一和第二组小鼠诱发皮肤炎症。不将asTPA应用于其它对照组。为了促进asTPA的应用,通过吸入异氟烷麻醉小鼠。然后将100微升的asTPA(相当于20微克(μg)TPA)应用于小鼠皮肤上。在asTPA蒸发时,将小鼠放回笼中。
在其中第一组和第二组小鼠接受asTPA应用的7天期间,第一组继续接受POH-亚油酸缀合物和媒介物溶液处理,并且第二组继续接受媒介物处理。在7天的时间期限结束时,给小鼠拍照。
图19A是接受asTPA和媒介物、但未接受POH-亚油酸缀合物处理的第二组的第一只小鼠的照片。图19B是也接受asTPA和媒介物、但未接受POH-亚油酸缀合物处理的第二组的第二只小鼠的照片。如图19A和19B所示,应用了asTPA的小鼠的右髋部的皮肤区域(分别为1902、1904)显然发炎并且干燥。图20A是接受了TPA和POH-亚油酸缀合物/媒介物组合处理的第一组的第一只小鼠的照片。图20B是也接受了TPA和POH-亚油酸缀合物/媒介物的组合处理第一组的第二只小鼠的照片。如图20A和20B所示,应用了asTPA的小鼠右髋部的皮肤区域(分别为2002、2004)没有显示出发炎或剥脱。皮肤在应用部位和周围区域相对光滑,从而提供了与单独的媒介物相比POH-亚油酸缀合物/媒介物组合治疗的功效的证据。
实施例15:POH-亚油酸缀合物的抗炎作用的小鼠研究(可选择的方案)
在用于测试POH-亚油酸作为抗炎剂的有效性的可选择的方案中,将15只小鼠分为五(5)组(i)-(v),每组包含三(3)只小鼠。(iii)至(v)组将接受预处理,而(i)和(ii)组将为阴性和阳性对照组。(iii)组将接受10mg//kg亚油酸的预处理;(iv)组将接受10mg/kg的POH预处理;并且(v)组将接受10mg/kg的亚油酸和POH缀合物(例如,POH的亚油酰基酯)的预处理。所有预处理都将持续3天。
在(ii)、(iii)、(iv)和(v)组中,历经连续7天通过每天将TPA的丙酮溶液(asTPA)皮肤应用于小鼠背部诱发皮肤炎症。应用asTPA通过将第(ii)到(v)组中的小鼠限制在以皮肤暴露口为特征的适应装置中来进行,在该装置上,应用100微升(μL)的asTPA(相当于20微克(μg)的TPA)。
在asTPA应用的7天期间,持续给予(iii)、(iv)和(v)组所述处理。
由两个不知晓给予的处理方案的不同的人以双盲方式观察小鼠组。评估背部皮肤炎症的范围和程度,以计算皮肤炎症的总体宏观评分。
评分系统将被实施。将0到12之间的宏观评分评估为观察到的炎症程度的指标。评分为0表示没有皮肤发炎。评分为1至3,表示轻微发炎;评分为4至6表示中等炎症;评分为7至9表示显著炎症;评分为10至12表示重度炎症。石蜡包埋后,将皮肤样本固定并且保存在防腐剂中,以便使用典型病理学方法进行组织病理学分析。
此外,在最后一次皮肤处理后4小时,将从每只小鼠采集血样。通过心脏穿刺在包含柠檬酸盐作为抗凝剂的试管中采集约0.5mL血液,然后以1500g离心15分钟以采集血清。将血清等分在ependorf管中,并且在-80℃储存,以备进行细胞因子分析。然后将血清样品解冻,此后使用Bio-Plex技术、应用Bio-Rad小鼠3-Plex-A小组试剂盒同时测定三种促炎细胞因子IL-1、IL-6和TNF。
本发明的范围不限于上文中具体给出和描述的内容。本领域技术人员将认识到,所描述的材料、构造、结构和尺寸的实例存在适合的替换物。发明详述中引用并讨论了多个参考文献,包括专利和多个出版物。提供这些参考文献的引用和讨论仅仅为了澄清本发明的描述,并非承认任何参考文献都是本文中所述的本发明的现有技术。所有在本说明书中引用和讨论的参考文献均以其整体引入作为参考。本领域普通技术人员将明白,在本文中描述的内容的变形、修饰及其它实施方式可发生而不背离本发明的精神和范围。虽然已经显示和描述了本发明的某些实施方案,但对本领域技术人员而言显而易见的是,可在不背离本发明的精神和范围的情况下进行改变和修饰。提供上述说明和附图中陈述的主题仅仅为了举例说明而不是作为限制。
Claims (5)
1.用于治疗哺乳动物炎症的方法,包括下列步骤:向哺乳动物递送治疗有效量的组合物,该组合物包含与亚油酸缀合的紫苏醇(POH)。
2.根据权利要求1的方法,其中组合物还包含甘油/乙醇混合物。
3.根据权利要求2的方法,其中甘油/乙醇混合物具有90:10的重量比。
4.根据权利要求1的方法,其中组合物包含POH的亚油酰基酯。
5.根据权利要求1的方法,其中将组合物递送至哺乳动物的皮肤。
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