CN107419011A - 一种魁蚶微卫星标记Scabrou_A的检测引物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种魁蚶微卫星标记Scabrou_A的检测引物和方法。首先提取魁蚶肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用魁蚶DNA序列中含有的微卫星核心序列设计特异性引物；然后使用该引物对魁蚶不同地理群或魁蚶群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得魁蚶的遗传多态性图谱。本发明可快捷的获得魁蚶遗传标记Scabrou_A的遗传变异图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出魁蚶每个个体的基因型；应用于不同地理群或魁蚶群内个体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。

Description

一种魁蚶微卫星标记Scabrou_A的检测引物和方法
技术领域
本发明属于魁蚶（Scapharca brouhtonii）DNA分子遗传标记技术，涉及一种检测魁蚶微卫星标记Scabrou_A的技术方法，具体是魁蚶微卫星标记Scabrou_A的检测方法。
背景技术
魁蚶（Scapharca brouhtonii）隶属软体动物门（Mollusca），双壳纲（Bivalvia），蚶目（Arcoida），蚶科（Arcidae），毛蚶属（Scapharca），俗称赤贝、血贝、大毛蛤，是一种大型底栖息经济贝类。魁蚶广泛分布于太平洋西部沿岸，日本北海道以南，朝鲜半岛和俄罗斯东南部。在我国，魁蚶主要分布于辽东半岛东南部、山东半岛北部和东部等海区。魁蚶属于大型蚶，成体个大体肥，肉质鲜美，具有很高的经济价值。魁蚶已成为我国最重要的海水养殖品种之一。然而，目前东北亚地区不同地理种群魁蚶的分类学地位存在较大争议。无论是在外部形态上还是线粒体基因组的序列特征上，不同群体魁蚶都显示了较大的差异(Yokogawa 等, 1997；Liu 等, 2013；Liu 等, 2014)。魁蚶养殖业的发展迫切需要了解养殖品种清晰的遗传背景和遗传多样性，以掌握其资源状况，为魁蚶养殖业的发展奠定基础。微卫星标记作为一种共显性遗传标记，可以解决该问题。虽然同工酶标记、RAPD标记及AFLP标记技术也可以用于研究魁蚶的遗传结构及其遗传多样性，然而由于这些标记都属于显性遗传标记，检测效率不如微卫星标记等共显性标记高。另外，同工酶标记的缺点是多态性低， RAPD标记的稳定性不好，AFLP标记操作繁琐，这些都大大限制了它们的应用。而微卫星序列广泛分布于真核生物基因组中，其特点是种类多，等位基因数目多，多态性高，共显性，孟德尔遗传方式，并随机分布于基因组中，而且微卫星标记检测效率高，结果稳定。但由于目前开发的魁蚶微卫星标记多态性不高，限制了其分子遗传学研究的发展，所以迫切需要获取高多态性的微卫星标记以进行魁蚶遗传多样性、个体识别和系谱认证等方面的研究和应用。
参考文献Yokogawa K. Morphological and genetic differences betweenJapanese and Chinese red ark shell Scapharca broughtonii [J]. FisheriesScience, 1997, 63(3): 332-337
Liu YG, Kurokawa T, Sekino M, et al. Complete mitochondrial DNA sequenceof the ark shell Scapharca broughtonii: an ultra-large metazoan mitochondrialgenome [J]. Comparative Biochemistry and Physiology part D, 2013, 8(1): 72-81
Liu YG, Kurokawa T, Sekino M, et al. Tandem repeat arrays in themitochondrial genome as a tool for detecting genetic differences among theark shell Scapharca broughtonii [J]. Marine Ecology-An EvolutionaryPerspective, 2014, 35(3): 273-280。
发明内容
本发明的目的是提供一种高多态性的魁蚶DNA分子遗传标记技术，即魁蚶微卫星标记Scabrou_A的快速检测方法，以弥补已有技术的不足。
本发明的基本构思主要是利用魁蚶DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其两端设计特异性引物并进行PCR检测，从而快速地检测魁蚶每个个体在此微卫星区的遗传变异，获得该引物（微卫星标记Scabrou_A）对魁蚶的多态性图谱，通过图谱直观地检测出每个个体的基因型。基于上述背景现状和实际要求，本发明从魁蚶DNA序列中获取了一个微卫星标记，命名为Scabrou_A，该微卫星标记Scabrou_A可用于魁蚶遗传多样性分析和系谱认证。
本发明是按照以下操作技术方案完成的：首先提取魁蚶肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用魁蚶基因组DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对魁蚶不同地理群或魁蚶群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定每个个体的基因型，获得魁蚶的遗传多态性图谱。
提取魁蚶基因组DNA，将其稀释为100ng/μl，每个PCR反应中加入1μl，反应总体积为25μl。
含有微卫星序列的DNA序列为：
agtatattac caagggagat aattataaac tagttaccat caaaatacaa
aatattgccg aaaaccacta acatgtgcat tatataggtg caagtttaat
aatataagta aggcttgcct ctgtcagcct gcatggatga tatacagtcT
GTATGTATGT ATGTATGTAT GTATGTATGT ATGTATGTAT GTATGTATGT
ATGTATGTAT GTATGTATGT ATGTATGTAT GTAtgggaag atcctgatca
acttaattaa
其中微卫星核心序列为：TGTATGTATGTATGTATGTATGTATGTATGT ATGTATGTATGTATGTATGTATGTATGTATGTATGTATGTATGTATGTATGTA
Scabrou_A微卫星引物序列为：
正链5’- AGTATATTACCAAGGGAGATAAT -3’，
负链5’- TTAATTAAGTTGATCAGGATCTT -3’，使用该引物时的退火温度为55℃。
微卫星核心序列和引物序列是本发明的核心，在魁蚶遗传多样性检测中呈现多态性。
PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括100ng魁蚶基因组DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+ 1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；上述的引物各10pmol；加ddH2O至25μl。使用该引物时设置PCR仪的程序参数为：94℃变性2min；94℃30sec，55℃45sec，72℃40sec,该反应进行35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
PCR产物的检测步骤：将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶中以15W恒功率电泳1.5小时进行分离。电泳结束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，再以0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，用3％的碳酸钠溶液显色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到魁蚶微卫星标记Scabrou_A的多态性图谱。
本发明的有益效果是可快捷的获得魁蚶的Scabrou_A微卫星标记的遗传变异图谱，方法简便。而且，相对于其它分子遗传标记技术而言，微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，所得结果可直观地检测出魁蚶每个个体的基因型；而应用于不同地理群或魁蚶群内个体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。
附图说明
图1是本发明微卫星标记Scabrou_A对魁蚶20个个体的检测图谱 (编号1—20是魁蚶的20个个体)。
具体实施方式
下面通过实施例详细叙述本发明在魁蚶Scabrou_A微卫星核心序列DNA分子遗传标记技术方法。首先提取魁蚶肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用魁蚶DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对魁蚶不同地理群或魁蚶群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定每个个体的基因型，即获得魁蚶的遗传多态性图谱。
1、魁蚶基因组DNA的提取：将100µl魁蚶肌肉加入Eppendorf管中，再加入细胞裂解液 500µl和20mg/ml的蛋白酶K 5µl，轻轻摇匀，37℃过夜。然后在裂解好的样品中加入600µl酚氯︰仿︰异戊醇（25︰24︰1）混合液，晃动20min后12000rpm 离心10min，取上清液。再加入酚︰氯仿︰异戊醇混合液，重复上述操作3次。再取上清液，加入2倍体积冷却的无水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，12000rpm 离心10min，弃去上清液，保留DNA沉淀，再用70％乙醇洗涤该沉淀2次，待乙醇挥发完全后，以TE 缓冲液溶解DNA，并稀释为100ng/μl，4℃保存。
2、微卫星引物的设计：在魁蚶DNA序列基础上，利用微卫星DNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，据此在其两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的微卫星片段。由于微卫星核心序列突变率相对较高，造成微卫星DNA核心序列重复次数的增加或减少，即微卫星DNA序列长度的变化，这是检测微卫星多态性的根源。本发明的微卫星区核心序列两端的特异性引物序列为：正链5’- AGTATATTACCAAGGGAGATAAT -3’，负链5’-TTAATTAAGTTGATCAGGATCTT -3’，使用该引物时的退火温度为55℃。
3、PCR扩增：首先加样，加样量如下：魁蚶基因组DNA(100ng／L)，1μl；10×PCRBuffer，2.5μl；Mg2+ (25mmo1／L)，1.5μl；Taq酶(5u／μl)，0.2μl；dNTP(各2.5mmo／L)，1μl；引物(各10pmol／μl)，1μl；加灭菌水至25μl。其次，进行PCR反应，其PCR扩增仪程序参数为：94℃变性2min；94℃30sec，55℃45sec， 72℃40sec，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
4、PCR产物的检测：将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，电泳仪功率为15W，电泳时间为1.5小时左右。电泳结束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，3％的碳酸钠溶液显色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min即可得到魁蚶在Scabrou_A微卫星核心序列的多态性图谱，如图1所示。结果可以看出，魁蚶的20个个体共扩增出17个等位基因，说明微卫星标记Scabrou_A具有很高的多态性，适合进行魁蚶遗传多样性评估、分子生态学、个体识别等方面的研究和应用。
<110> 烟台大学
<120> 一种魁蚶微卫星标记Scabrou_A的检测引物和方法
<160> 1
<210> 1
<211> 260
<212> DNA
<213> 魁蚶（Scapharca brouhtonii）
<220>
<221> repeat_region
<222> (150...(233)
<400> 1
agtatattac caagggagat aattataaac tagttaccat caaaatacaa aatattgccg 1
aaaaccacta acatgtgcat tatataggtg caagtttaat aatataagta aggcttgcct 61
ctgtcagcct gcatggatga tatacagtcT GTATGTATGT ATGTATGTAT GTATGTATGT 121
ATGTATGTAT GTATGTATGT ATGTATGTAT GTATGTATGT ATGTATGTAT GTAtgggaag 181
atcctgatca acttaattaa 241

Claims (5)

1.一种魁蚶微卫星标记Scabrou_A的检测方法，其特征在于，首先提取魁蚶肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用魁蚶DNA序列中含有的微卫星核心序列，使用特异性引物对魁蚶不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定魁蚶不同个体在Scabrou_A核心序列区的基因型。
2.一组魁蚶微卫星标记Scabrou_A的检测引物，其特征在于，所述引物序列为：
正链5’- AGTATATTACCAAGGGAGATAAT -3’，
负链5’-TTAATTAAGTTGATCAGGATCTT-3’，使用该引物时的退火温度为55℃。
3.如权利要求1所述的魁蚶微卫星标记Scabrou_A的检测方法，其特征在于，对不同魁蚶个体的基因组DNA进行的PCR扩增，其加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括100ng魁蚶基因组DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+ 1.5 mmol/L；Taq酶1u；dNTP 0.1mmol/L；权利要求2中所述的特异性引物各10 pmol；最后加ddH2O至25μl；设置PCR仪的程序参数为：94℃变性2min；94℃ 30sec，55℃ 45sec，72℃ 40sec，该反应进行35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
4.如权利要求1所述的魁蚶微卫星标记Scabrou_A的检测方法，其特征在于，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的步骤：将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶中以15W恒功率电泳1.5小时进行分离, 以10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，再以0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，用3％的碳酸钠溶液显色 5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min。
5.权利要求1-4所述的方法在魁蚶群体间遗传多态性图谱构建上的应用。
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