CN107418946A - 一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法 - Google Patents

一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，涉及固定化酶制备领域，具体步骤为：首先采用种子溶胀聚合制备单分散多孔聚苯乙烯微球，并在聚苯乙烯种球溶胀时加入适量的邻苯二甲酰化壳聚糖，得到壳聚糖改性的单分散多孔聚苯乙烯微球；然后将其与果胶酶水溶液、缓冲液混合振荡处理，制得固定化果胶酶，该方法制得的固定化果胶酶，酶活性损失小，应用条件范围广，稳定性好，酶不易脱落，重复使用率高。

Description

一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制 备方法
技术领域：
本发明涉及生物酶制剂制备领域，具体的涉及一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法。
背景技术：
果胶酶是由黑曲霉经发酵精制而得的用于催化植物细胞间质即果胶质水解成半乳糖醛酸和果胶酸的一类酶，主要应用于果蔬汁饮料及果酒的榨汁和澄清，对分解果胶物质具有良好的作用。在我国的果汁果酒制造行业，果胶酶的加入可以提高水果蔬菜汁的出汁率及其稳定性，并防止果蔬汁后混浊的发生。但在实际的工业应用中，使用游离酶存在着酶用量大、生产成本高、精制困难等缺点，而固定化酶则可避免这些缺点，扩大应用范围，降低企业的生产成本。
酶固定化就是采用固体材料把酶物质限制或束缚在一定的区域内，但酶仍能够进行自身特有的催化反应，同时可回收和重复利用的一种新兴技术。固定化酶技术是使生物酶得到广泛而有效利用的重要手段，与游离酶相比，固定化酶有更多优势，固定化酶是一种不溶于水的酶，呈现出储存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用等特点，且酶固定化后仍然具有温和、专一和高效的酶催化特性，在许多领域得到迅速发展和广泛应用。酶的固定化方法主要分为物理方法和化学方法两大类。物理法包括物理吸附法、包埋法等，化学法包括交联法、结合法等。物理法固定酶技术的优点是酶本身不参加化学反应，所以整体结构保持不变，酶的催化活性较好，但采用的载体如半透膜等有一定的立体或空间阻碍作用，适用性较差。
对于固定化酶，性能不仅取决于固定化方法，还取决于在固定化中所使用的载体材料，因为载体材料的性能直接影响固定化酶的催化活性。酶的固定化对载体材料的要求很高，理想的载体材料必须要具备良好的化学稳定性、机械强度、热稳定性及对酶的高度亲合性，并保持较高的酶活性等。当然，载体材料的价格也直接影响固定化酶能否真正用到实际生产中。由于理想的酶载体材料难以找到，所以，设计开发和制备性能优异的载体材料己成为固定化酶研究的重点之一。
中国专利(201510763529.3)公开了一种用于固定化酶载体的多孔PS-DVB微球制备方法，所述方法采用分散聚合法制备了粒径为2μm的聚苯乙烯种子，再通过二步种子溶胀法制备出多孔PS-DVB微球。采用该方法制备的多孔微球呈单分散性，具有多孔结构，其表面主要为苯环基团，呈疏水性，可以有效吸附酶，但是其生物相容性较差，用于固定化酶时，使得酶的活性损失较大。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，该方法制备的果胶酶活性损失小，酶不易脱落，可反复使用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水混合搅拌至固体溶解，然后转移至三口烧瓶；
(2)将偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶中，氮气保护下搅拌30min，缓慢升温至65-75℃，回流反应8-11h，反应结束后冷却至室温，离心分离，固体用无水乙醇洗涤，干燥，得到聚苯乙烯种球；
(3)将丙酮、十二烷基苯磺酸钠混合搅拌1-2h后转移至三口烧瓶中，并向三口烧瓶中加入步骤(2)制得的聚苯乙烯种球，混合均匀后加入邻苯二甲酰化壳聚糖，30℃下搅拌7h，得到混合物A；
(4)将苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水混合搅拌均匀后，在500-1000W功率下超声处理1-4h，得到乳化液A；
(5)将上述制得的乳化液A滴加到混合物A中，30-40℃搅拌6h，然后加入聚乙烯醇溶液，滴加完毕后，缓慢升温至75℃，回流反应5-9h，反应结束后，产物依次用乙醇和水洗涤，并用二氯甲烷抽提，得到壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球；
(6)配制果胶酶水溶液，并将其和上述制得的壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球混合，并用缓冲液调其pH至3.5-5.5，室温下振荡30-50min，离心分离，沉淀为固定化果胶酶。
作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水的质量比为1：(0.35-0.55)：35。
作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，聚乙烯醇、偶氮二异丁腈、苯乙烯的质量比为1：(0.07-0.12)：(30-50)。
作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，丙酮、十二烷基苯磺酸钠、聚苯乙烯种球、邻苯二甲酰化壳聚糖的质量比为(0.8-1.3)：(0.03-0.07)：5:1。
作为上述技术方案的优选，步骤(4)中，苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水的质量比为1：(0.01-0.04)：(0.33-0.5)：6。
作为上述技术方案的优选，步骤(5)中，所述乳液A滴加到混合物A时的滴加速度为(1-1.5)mL/min，乳液A与混合物A的质量比为1：(3-5)。
作为上述技术方案的优选，步骤(5)中，所述聚乙烯醇溶液的质量分数为7％，其与乳液A的质量比为2：(7-13)。
作为上述技术方案的优选，步骤(6)中，所述果胶酶水溶液的质量浓度为5％，其与壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球的质量比为(0.006-0.018)：1。
作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶时的滴加速度为(3-5)mL/min。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用种子溶胀聚合的方法制备单分散的多孔聚苯乙烯微球，在制备聚苯乙烯种子时，采用聚乙烯醇和磷酸钠复配作为分散剂，并合理调节二者的用量，使得制得的种子分散性极好；然后在溶胀的过程中合理调节溶胀剂的用量，且加入了邻苯二甲酰化壳聚糖，得到了壳聚糖改性的单分散多孔聚苯乙烯微球，有效改善了多孔聚苯乙烯微球的生物相容性，使得其在用于固定化酶的载体时，果胶酶的活性损失小，而且本发明合理调节各组分的用量，使得制得的壳聚糖改性的单分散多孔聚苯乙烯微球除了具备良好生物相容性的同时，力学化学稳定性、机械强度、热稳定性也较好；
本发明制得的固定化果胶酶稳定性好，重复使用性能优异，制备成本低。
具体实施方式：
为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明进一步说明，实施例只用于解释本发明，不会对本发明构成任何的限定。
实施例1
一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水混合搅拌至固体溶解，然后转移至三口烧瓶；其中，聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水的质量比为1：0.35：35；
(2)将偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶中，氮气保护下搅拌30min，缓慢升温至65-75℃，回流反应8h，反应结束后冷却至室温，离心分离，固体用无水乙醇洗涤，干燥，得到聚苯乙烯种球；其中，聚乙烯醇、偶氮二异丁腈、苯乙烯的质量比为1：0.07：30，偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶时的滴加速度为3mL/min；
(3)将丙酮、十二烷基苯磺酸钠混合搅拌1h后转移至三口烧瓶中，并向三口烧瓶中加入步骤(2)制得的聚苯乙烯种球，混合均匀后加入邻苯二甲酰化壳聚糖，30℃下搅拌7h，得到混合物A；其中，丙酮、十二烷基苯磺酸钠、聚苯乙烯种球、邻苯二甲酰化壳聚糖的质量比为0.8：0.03：5:1；
(4)将苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水混合搅拌均匀后，在500W功率下超声处理1h，得到乳化液A；其中，苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水的质量比为1：0.01：0.33：6；
(5)将上述制得的乳化液A滴加到混合物A中，30-40℃搅拌6h，然后加入聚乙烯醇溶液，滴加完毕后，缓慢升温至75℃，回流反应5-9h，反应结束后，产物依次用乙醇和水洗涤，并用二氯甲烷抽提，得到壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球；其中，乳液A滴加到混合物A时的滴加速度为1mL/min，乳液A与混合物A的质量比为1：3；聚乙烯醇溶液的质量分数为7％，其与乳液A的质量比为2：7；
(6)配制果胶酶水溶液，并将其和上述制得的壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球混合，并用缓冲液调其pH至3.5-5.5，室温下振荡30min，离心分离，沉淀为固定化果胶酶；其中，果胶酶水溶液的质量浓度为5％，其与壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球的质量比为0.006：1。
实施例2
一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水混合搅拌至固体溶解，然后转移至三口烧瓶；其中，聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水的质量比为1：0.55：35；
(2)将偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶中，氮气保护下搅拌30min，缓慢升温至65-75℃，回流反应11h，反应结束后冷却至室温，离心分离，固体用无水乙醇洗涤，干燥，得到聚苯乙烯种球；其中，聚乙烯醇、偶氮二异丁腈、苯乙烯的质量比为1：0.12：50，偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶时的滴加速度为5mL/min；
(3)将丙酮、十二烷基苯磺酸钠混合搅拌2h后转移至三口烧瓶中，并向三口烧瓶中加入步骤(2)制得的聚苯乙烯种球，混合均匀后加入邻苯二甲酰化壳聚糖，30℃下搅拌7h，得到混合物A；其中，丙酮、十二烷基苯磺酸钠、聚苯乙烯种球、邻苯二甲酰化壳聚糖的质量比为1.3：0.07：5:1；
(4)将苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水混合搅拌均匀后，在1000W功率下超声处理4h，得到乳化液A；其中，苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水的质量比为1：0.04：0.5：6；
(5)将上述制得的乳化液A滴加到混合物A中，30-40℃搅拌6h，然后加入聚乙烯醇溶液，滴加完毕后，缓慢升温至75℃，回流反应9h，反应结束后，产物依次用乙醇和水洗涤，并用二氯甲烷抽提，得到壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球；其中，乳液A滴加到混合物A时的滴加速度为1.5mL/min，乳液A与混合物A的质量比为1：5；聚乙烯醇溶液的质量分数为7％，其与乳液A的质量比为2：13；
(6)配制果胶酶水溶液，并将其和上述制得的壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球混合，并用缓冲液调其pH至3.5-5.5，室温下振荡50min，离心分离，沉淀为固定化果胶酶；其中，果胶酶水溶液的质量浓度为5％，其与壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球的质量比为0.018：1。
实施例3
一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水混合搅拌至固体溶解，然后转移至三口烧瓶；其中，聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水的质量比为1：0.4：35；
(2)将偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶中，氮气保护下搅拌30min，缓慢升温至65-75℃，回流反应9h，反应结束后冷却至室温，离心分离，固体用无水乙醇洗涤，干燥，得到聚苯乙烯种球；其中，聚乙烯醇、偶氮二异丁腈、苯乙烯的质量比为1：0.08：35，偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶时的滴加速度为3.5mL/min；
(3)将丙酮、十二烷基苯磺酸钠混合搅拌1.2h后转移至三口烧瓶中，并向三口烧瓶中加入步骤(2)制得的聚苯乙烯种球，混合均匀后加入邻苯二甲酰化壳聚糖，30℃下搅拌7h，得到混合物A；其中，丙酮、十二烷基苯磺酸钠、聚苯乙烯种球、邻苯二甲酰化壳聚糖的质量比为0.9：0.04：5:1；
(4)将苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水混合搅拌均匀后，在600W功率下超声处理2h，得到乳化液A；其中，苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水的质量比为1：0.02：0.35：6；
(5)将上述制得的乳化液A滴加到混合物A中，30-40℃搅拌6h，然后加入聚乙烯醇溶液，滴加完毕后，缓慢升温至75℃，回流反应6h，反应结束后，产物依次用乙醇和水洗涤，并用二氯甲烷抽提，得到壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球；其中，乳液A滴加到混合物A时的滴加速度为1.1mL/min，乳液A与混合物A的质量比为1：3.5；聚乙烯醇溶液的质量分数为7％，其与乳液A的质量比为2：8；
(6)配制果胶酶水溶液，并将其和上述制得的壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球混合，并用缓冲液调其pH至3.5-5.5，室温下振荡35min，离心分离，沉淀为固定化果胶酶；其中，果胶酶水溶液的质量浓度为5％，其与壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球的质量比为0.008：1。
实施例4
一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水混合搅拌至固体溶解，然后转移至三口烧瓶；其中，聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水的质量比为1：0.45：35；
(2)将偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶中，氮气保护下搅拌30min，缓慢升温至65-75℃，回流反应10h，反应结束后冷却至室温，离心分离，固体用无水乙醇洗涤，干燥，得到聚苯乙烯种球；其中，聚乙烯醇、偶氮二异丁腈、苯乙烯的质量比为1：0.09：40，偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶时的滴加速度为4mL/min；
(3)将丙酮、十二烷基苯磺酸钠混合搅拌1.4h后转移至三口烧瓶中，并向三口烧瓶中加入步骤(2)制得的聚苯乙烯种球，混合均匀后加入邻苯二甲酰化壳聚糖，30℃下搅拌7h，得到混合物A；其中，丙酮、十二烷基苯磺酸钠、聚苯乙烯种球、邻苯二甲酰化壳聚糖的质量比为1.1：0.04：5:1；
(4)将苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水混合搅拌均匀后，在700W功率下超声处理3h，得到乳化液A；其中，苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水的质量比为1：0.03：0.4：6；
(5)将上述制得的乳化液A滴加到混合物A中，30-40℃搅拌6h，然后加入聚乙烯醇溶液，滴加完毕后，缓慢升温至75℃，回流反应7h，反应结束后，产物依次用乙醇和水洗涤，并用二氯甲烷抽提，得到壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球；其中，乳液A滴加到混合物A时的滴加速度为1.2mL/min，乳液A与混合物A的质量比为1：4；聚乙烯醇溶液的质量分数为7％，其与乳液A的质量比为2：10；
(6)配制果胶酶水溶液，并将其和上述制得的壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球混合，并用缓冲液调其pH至3.5-5.5，室温下振荡45min，离心分离，沉淀为固定化果胶酶；其中，果胶酶水溶液的质量浓度为5％，其与壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球的质量比为0.01：1。
实施例5
一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水混合搅拌至固体溶解，然后转移至三口烧瓶；其中，聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水的质量比为1：0.5：35；
(2)将偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶中，氮气保护下搅拌30min，缓慢升温至65-75℃，回流反应10h，反应结束后冷却至室温，离心分离，固体用无水乙醇洗涤，干燥，得到聚苯乙烯种球；其中，聚乙烯醇、偶氮二异丁腈、苯乙烯的质量比为1：0.1：45，偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶时的滴加速度为4.5mL/min；
(3)将丙酮、十二烷基苯磺酸钠混合搅拌1-2h后转移至三口烧瓶中，并向三口烧瓶中加入步骤(2)制得的聚苯乙烯种球，混合均匀后加入邻苯二甲酰化壳聚糖，30℃下搅拌7h，得到混合物A；其中，丙酮、十二烷基苯磺酸钠、聚苯乙烯种球、邻苯二甲酰化壳聚糖的质量比为1.2：0.05：5:1；
(4)将苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水混合搅拌均匀后，在800W功率下超声处理3.5h，得到乳化液A；其中，苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水的质量比为1：0.035：0.45：6；
(5)将上述制得的乳化液A滴加到混合物A中，30-40℃搅拌6h，然后加入聚乙烯醇溶液，滴加完毕后，缓慢升温至75℃，回流反应8h，反应结束后，产物依次用乙醇和水洗涤，并用二氯甲烷抽提，得到壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球；其中，乳液A滴加到混合物A时的滴加速度为1.4mL/min，乳液A与混合物A的质量比为1：3.5；聚乙烯醇溶液的质量分数为7％，其与乳液A的质量比为2：12；
(6)配制果胶酶水溶液，并将其和上述制得的壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球混合，并用缓冲液调其pH至3.5-5.5，室温下振荡45min，离心分离，沉淀为固定化果胶酶；其中，果胶酶水溶液的质量浓度为5％，其与壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球的质量比为0.014：1。
下面对上述制得的固定化果胶酶进行测试；
酶活测试：
用词典酸钠法测定酶活回收率，结果显示：实施例1-5中的固定化酶在60℃时的酶回收率高达98.9％，而游离的果胶酶在60℃时的酶回收率为41.2％。常温下使用10次后的酶回收率高达93.6％，而游离的果胶酶酶回收率为46.8％。

Claims (9)

1.一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水混合搅拌至固体溶解，然后转移至三口烧瓶；
(2)将偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶中，氮气保护下搅拌30min，缓慢升温至65-75℃，回流反应8-11h，反应结束后冷却至室温，离心分离，固体用无水乙醇洗涤，干燥，得到聚苯乙烯种球；
(3)将丙酮、十二烷基苯磺酸钠混合搅拌1-2h后转移至三口烧瓶中，并向三口烧瓶中加入步骤(2)制得的聚苯乙烯种球，混合均匀后加入邻苯二甲酰化壳聚糖，30℃下搅拌7h，得到混合物A；
(4)将苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水混合搅拌均匀后，在500-1000W功率下超声处理1-4h，得到乳化液A；
(5)将上述制得的乳化液A滴加到混合物A中，30-40℃搅拌6h，然后加入聚乙烯醇溶液，滴加完毕后，缓慢升温至75℃，回流反应5-9h，反应结束后，产物依次用乙醇和水洗涤，并用二氯甲烷抽提，得到壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球；
(6)配制果胶酶水溶液，并将其和上述制得的壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球混合，并用缓冲液调其pH至3.5-5.5，室温下振荡30-50min，离心分离，沉淀为固定化果胶酶。
2.如权利要求1所述的一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，聚乙烯醇、磷酸钠和去离子水的质量比为1：(0.35-0.55)：35。
3.如权利要求1所述的一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，聚乙烯醇、偶氮二异丁腈、苯乙烯的质量比为1：(0.07-0.12)：(30-50)。
4.如权利要求1所述的一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，丙酮、十二烷基苯磺酸钠、聚苯乙烯种球、邻苯二甲酰化壳聚糖的质量比为(0.8-1.3)：(0.03-0.07)：5:1。
5.如权利要求1所述的一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，苯乙烯、N，N-二乙基苯胺、span80和去离子水的质量比为1：(0.01-0.04)：(0.33-0.5)：6。
6.如权利要求1所述的一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述乳液A滴加到混合物A时的滴加速度为(1-1.5)mL/min，乳液A与混合物A的质量比为1：(3-5)。
7.如权利要求1所述的一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述聚乙烯醇溶液的质量分数为7％，其与乳液A的质量比为2：(7-13)。
8.如权利要求1所述的一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述果胶酶水溶液的质量浓度为5％，其与壳聚糖改性的多孔聚苯乙烯微球的质量比为(0.006-0.018)：1。
9.如权利要求1所述的一种以单分散多孔聚苯乙烯微球为载体的固定化果胶酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述偶氮二异丁腈和苯乙烯混合搅拌后滴加到三口烧瓶时的滴加速度为(3-5)mL/min。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118026568A (zh) * 2024-03-05 2024-05-14 浙江交投丽新矿业有限公司 适用于钢桥面的缓释型抗凝冰聚氨酯混合料、制备方法
CN118026568B (zh) * 2024-03-05 2024-08-27 浙江交投丽新矿业有限公司 适用于钢桥面的缓释型抗凝冰聚氨酯混合料、制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101434673A (zh) * 2008-12-22 2009-05-20 中国科学院长春应用化学研究所 一种单分散多孔聚合物微球的制备方法
CN105524223A (zh) * 2015-11-11 2016-04-27 陕西玉航电子有限公司 一种用于固定化酶载体的多孔ps-dvb微球制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101434673A (zh) * 2008-12-22 2009-05-20 中国科学院长春应用化学研究所 一种单分散多孔聚合物微球的制备方法
CN105524223A (zh) * 2015-11-11 2016-04-27 陕西玉航电子有限公司 一种用于固定化酶载体的多孔ps-dvb微球制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEI Z等: "synthesis and properties of immobilized pectinase onto the macroporous polyacrylamide microspheres", 《J AGRIC CHEM》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118026568A (zh) * 2024-03-05 2024-05-14 浙江交投丽新矿业有限公司 适用于钢桥面的缓释型抗凝冰聚氨酯混合料、制备方法
CN118026568B (zh) * 2024-03-05 2024-08-27 浙江交投丽新矿业有限公司 适用于钢桥面的缓释型抗凝冰聚氨酯混合料、制备方法

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